CN109913463A - 一种新型海洋生物污染检测标记物 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种毛蚶热休克蛋白(90)‑‑一种新型海洋生物污染检测标记物，属于分子生物技术领域，该毛蚶热休克蛋白(90)基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，由该核苷酸序列编码的毛蚶热休克蛋白(90)氨基序列如SEQ ID NO.6所示，该毛蚶热休克蛋白(90)用作海洋污染的检测标记物。本发明蚶热休克蛋白(90)基因通过基因克隆技术克隆获得，利用毛蚶热休克蛋白(90)用作新型海洋生物污染检测标记物，该检测标记物特异性强，在分子水平上能够直接以生物体内靶细胞或靶分子为反应终点进行灵敏的生物学反应，对海洋污染物暴露和毒性效应有预警作用。

Description

一种新型海洋生物污染检测标记物

技术领域

本发明涉及分子生物技术领域，尤其是涉及一种新型海洋生物污染检测标记物。

技术背景

我国东海地区海域带处于海洋与陆地的过渡地带，陆地工农业生产、海洋产业开发等排放的废水多在此汇集。其中重金属、石油类(BAP)等污染物易通过吸附等作用结合到悬浮颗粒物或胶体表面而被沉淀富集，会对底栖生物产生较大的影响。有研究表明，生物组织中标志物活性(含量)与环境中污染物含量呈一定相关性，因此，研究东海海域沉积物中污染物的含量变化，能够为筛选生物标志物提供基础数据，同时有利于初步掌握不同区域的污染特征和来源，对于应用生物标志物法评价周围人类活动对海域环境的生态压力有重要作用。

毛蚶(Scapharca subcrenata)俗称毛蛤、麻蚶、瓦楞子，属于软体动物门、瓣鳃纲、翼形亚纲、蚶目、蚶科、毛蚶属，广泛分布于日本、朝鲜、中国沿岸；在中国北起鸭绿江，南至广西均有分布，以莱州湾、渤海湾、辽东湾、海州湾等浅水区的资源尤为丰富。近年来，随着工农业的迅猛发展，近海遭到不同程度的污染，特别是石油工业和海上交通运输业的发展，使得石油成为近海中最主要的污染物，石油污染不仅能使鱼、虾、贝类海产品变味，严重时能产生毒性效应，给海洋生态环境和渔业资源带了严重危害；同时，由于重金属易在底质中蓄积，不易降解，往往被生物富集，对人体健康具有潜在的威胁，重金属污染也是当今世界普遍关注的环境问题之一，特别是1931年日本发生镉中毒以来，镉污染越来越受到人们的重视。

热休克蛋白(HSPs)是一种在进化上高度保守的、广泛存在于原核生物和真核生物细胞中的蛋白质家族。又被称为应激蛋白，对来自于生态环境因素的刺激反应特别敏感，热休克蛋白90是重要的组成型蛋白，HSP90与信号传导途径中的苏氨酸蛋白激酶、酪氨酸蛋白激酶和丝氨酸、类固醇激素受体(包括糖皮质激素受体，肾上腺皮质激素受体，视黄酸受体及孕激素受体等)等分子结合，调节它们之间的生物活性，防止蛋白质的聚集和热变性。HSP90在机体正常状态下就自然存在，受到外界不利环境刺激时表达加强，如缺氧、重金属离子、病毒感染、DNA损伤和自由基等刺激作用后，都可以导致细胞发生热休克反应，诱导热激蛋白的合成。所以，HSP90对污染物的应激反应广泛而敏感，在海洋生态环境的污染预警方面具有潜在的价值，在受到诱导后其表达量会显著变化，在生命活动中有非常重大的作用。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种通过基因克隆技术克隆获得的毛蚶热休克蛋白(90)基因以及由该基因编码得到的毛蚶热休克蛋白(90)。

本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：

本发明还提供一种毛蚶热休克蛋白(90)基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示。

作为优选，毛蚶热休克蛋白(90)基因通过基因克隆技术克隆获得，其包括如下步骤为：

1)总RNA提取；

2)以步骤1获得的总RNA样品作为模板，反转录合成cDNA第一链；

3)利用引物扩增基因核心片段；

4)利用RACE反应扩增获得毛蚶热休克蛋白(90)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，并进行生物信息学分析。

进一步优选，步骤3中引物的序列为：

M1-F：5'-CGTAGGTGCGGATATGTCCAT-3'，

M2-R：5'-GCTTGACAGCCAATTGGTCT-3'。

步骤4中RACE反应过程中获得的5’RACE序列如SEQ ID NO.4所示， 3’RACE序列如SEQ ID NO.5所示。

本发明还提供一种毛蚶热休克蛋白(90)，由上述毛蚶热休克蛋白(90)基因编码。

本发明的目的之二在于提供一种利用毛蚶热休克蛋白(90)用作新型海洋生物污染检测标记物，该检测标记物特异性强，在分子水平上能够直接以生物体内靶细胞或靶分子为反应终点进行灵敏的生物学反应，对海洋污染物暴露和毒性效应有预警作用。

本发明还提供一种新型海洋生物污染检测标记物，上述毛蚶热休克蛋白(90) 用作海洋污染的检测标记物。

作为优选，检测标记物监测海洋污染情况的方法为：选择毛蚶作为检测海洋污染的生物样本，通过对受到污染区域毛蚶的解刨提取肌肉和肝脏中的RNA，反转录成DNA，用荧光定量技术检测毛蚶热休克蛋白(90)基因在肌肉和肝脏中的相对表达量，检测海洋污染程度。本发明利用毛蚶热休克蛋白(90)用作海洋污染的检测标记物，该检测标记物特异性强，通过检测毛蚶热休克蛋白(90) 基因在肌肉和肝脏中的相对表达量，检测海洋污染程度，在分子水平上能够直接以生物体内靶细胞或靶分子为反应终点进行灵敏的生物学反应，对海洋污染物暴露和毒性效应有预警作用，同时因毛蚶热休克蛋白(90)基因具有较强的应激敏感性、易于检测分析，也可以用于毛蚶的人工养殖，及时发现病害以及水质恶化，减少经济损失。

进一步优选，荧光定量技术用引物为：

HSP90-F：5'-CGCAATGTTGAGTCGCTCGGC-3'，

HSP90-R：5'-GCCTAGTTGTCAAGTAGTCC-3'；

actin-real-F1：5'-TGCCATTCAGGCCGTATTGT-3'，

actin-real-R1：5'-CCGGCAAGATCCAACCTCAT-3'。

进一步优选，毛蚶热休克蛋白(90)基因在肌肉和肝脏中的相对表达量的值越大，海洋污染程度越大，反之，相对表达量的值越小，海洋污染程度越小。重金属、壬基酚单一及联合暴露能够引起毛蚶发生氧化应激，从而诱导肌肉和肝脏组织中毛蚶热休克蛋白(90)基因水平上升，进而能够引起肌肉和肝脏组织中的热休克蛋白的过表达，提高其中毛蚶热休克蛋白(90)的含量，利用该变化可以有效地检测海洋污染。

本发明还提供一种新型海洋生物污染检测标记物在海洋中壬基酚和/或铜和/ 或镉检测或监控中的应用。

与现有技术相比，本发明的优点在于：1)本发明首次通过基因克隆技术克隆毛蚶热休克蛋白(90)的基因核心片段获得毛蚶热休克蛋白(90)，其生物信息学分析发现在毛蚶的血细胞和腮中毛蚶热休克蛋白(90)基因的相对表达量最高，可以用于检测海洋污染；2)本发明PCR反应体系能够提高rTaq酶的保真性和活性、减少碱基的堆积，使rTaq酶更容易作用于模板，提高PCR扩增的得到目标产物，提高引物和模板的结合度，保证扩增反应的特异性、提高PCR扩增效率；3)本发明利用毛蚶热休克蛋白(90)用作海洋污染的检测标记物，该检测标记物特异性强，在分子水平上能够直接以生物体内靶细胞或靶分子为反应终点进行灵敏的生物学反应，对海洋污染物暴露和毒性效应有预警作用。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：

实施例1：

一种毛蚶热休克蛋白(90)基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

毛蚶热休克蛋白(90)基因通过基因克隆技术克隆获得，其包括如下步骤为：

1)总RNA提取：以毛蚶作为材料，提取各组织总RNA；

取无RNA酶的2ml EP管，用的枪头加入500ul Trizol，用酒精泡过的镊子夹取脑组织样品溶于Trizol液体中，电动匀浆器研磨直到组织完全溶解于液体中，补满Trizol到1mL，4℃，12000rpm，10min离心，取上清液放进1.5mL EP 管中，不能吸到杂质，然后加入200ul的氯仿，剧烈震荡，室温静置5分钟，4℃， 12000rpm，15min离心，取三层中的最上层液体到新的1.5mL EP管中，加入500ul 异丙醇，室温10min或-20℃过夜，然在4℃、12000rpm下离心10min，除去上清液，白色片状物即RNA，再加入1mL的75％的乙醇，吹吸混匀，静置5min，然后在4℃，7500rpm下离心5min，除去上清液，干燥10min后加入20ul DEPC 水，保存至-20℃备用；

2)以步骤1获得的总RNA样品作为模板，使用M-MLV反转录试剂盒进行 cDNA的反转录合成，获得cDNA第一链；

0.2ml离心管中加入以下反应体系：总RNA 5.0ul、Oligo DT 1.0ul，混匀后离心，并置于PCR仪内，设置温度为70℃，反应10min后立即取出，冰浴2min 结束，然后加入RNA处理物6.0ul、5×M-MLV Buffer 2.0ul、DEPC处理水1.0ul、 dNTP Mixture(10mM)0.5ul、RRI(40u/ul)0.25ul、M-MLV(200u/ul)0.25ul，混匀后离心，于PCR仪内设定反应条件为42℃60min，70℃15min，结束后迅速取出冰浴15min，保存至-20℃备用；

3)利用引物扩增基因核心片段；

根据NCBI数据库中贻贝毛蚶热休克蛋白(90)基因的序列，分析氨基酸序列的保守区，使用primer5.0软件设计简并引物从而扩增出毛蚶热休克蛋白(90) 的核心序列，分别进行PCR扩增反应得到不同长度的产物片段，对存在目的条带的PCR产物进行纯化回收；

4)基于获得的毛蚶热休克蛋白(90)基因序列，根据所得的目的序列进行了RACE引物的设计，利用RACE技术扩增得到5’端和3’端序列以及ORF区的验证序列，将获得的PCR反应产物连接至PMD18-T载体并转至DH5&感受态细胞中，涂板后挑取单克隆培养，菌液PCR验证后送测序公司进行序列测定，获得毛蚶热休克蛋白(90)如SEQ ID NO.1所示的基因序列，将获得的基因序列，利用分子生物学Expasy在线软件进行氨基酸序列的翻译，获得对应蛋白质的氨基酸序列生物信息学分析。

其中，步骤3中引物的序列为：

M1-F：5'-CGTAGGTGCGGATATGTCCAT-3'，

M2-R：5'-GCTTGACAGCCAATTGGTCT-3'。

毛蚶热休克蛋白(90)基因核心片段PCR扩增步骤中PCR反应体系总体积 25.0μl，其中ddH₂O 15.5μl、10×PCR buffer 2.5μl、20mM MgCl₂ 2.5μl、2.5mM dNTP 1.0μl、10μM引物各1.0μl、10μM Sp-sCAP-F 1.0μl、cDNA 1.0μl、rTaq酶0.47μl。

步骤4中RACE反应过程中获得的5’RACE序列如SEQ ID NO.4所示， 3’RACE序列如SEQ ID NO.5所示。

一种毛蚶热休克蛋白(90)，由上述毛蚶热休克蛋白(90)基因编码。

一种新型海洋生物污染检测标记物，上述毛蚶热休克蛋白(90)用作海洋污染的检测标记物。检测标记物监测海洋污染情况的方法为：选择毛蚶作为检测海洋污染的生物样本，通过对受到污染区域毛蚶的解刨提取肌肉和肝脏中的RNA，反转录成DNA，用荧光定量技术检测毛蚶热休克蛋白(90)基因在肌肉和肝脏中的相对表达量，检测海洋污染程度。利用毛蚶热休克蛋白(90)用作海洋污染的检测标记物，该检测标记物特异性强，通过检测毛蚶热休克蛋白(90)基因在肌肉和肝脏中的相对表达量，检测海洋污染程度，在分子水平上能够直接以生物体内靶细胞或靶分子为反应终点进行灵敏的生物学反应，对海洋污染物暴露和毒性效应有预警作用，同时因毛蚶热休克蛋白(90)基因具有较强的应激敏感性、易于检测分析，也可以用于毛蚶的人工养殖，及时发现病害以及水质恶化，减少经济损失。

其中，荧光定量技术用引物为：

HSP90-F：5'-CGCAATGTTGAGTCGCTCGGC-3'，

HSP90-R：5'-GCCTAGTTGTCAAGTAGTCC-3'；

actin-real-F1：5'-TGCCATTCAGGCCGTATTGT-3'，

actin-real-R1：5'-CCGGCAAGATCCAACCTCAT-3'。

荧光定量技术反应体系共20μL：7.6μL ddH2O、0.4μL 20μM Forward Primer、 0.4μL 20μM Reverse Primer、10μL 2×SYBR Premix Ex Taq、1.6μL cDNA模板。反应采用两步法进行(ABI-7500型荧光定量PCR仪)，即95℃预变性1min，95℃变性10S，60℃延伸45S，共40个循环，反应结束后，温度从55℃缓慢升到95℃，制备熔解曲线。实验设置无模板对照和阴性对照，每个反应3个重复。

毛蚶热休克蛋白(90)基因在肌肉和肝脏中的相对表达量的计算方法为：

标准曲线，Ct值等由ABI 7500Real Time PCR仪自带的ABI 7500Real Time PCRSystem Detection软件自带完成。所有基因的相对表达量按照2^-△△CT的方法计算，利用SPSS13.0进行单因子显著性差异分析(ANOVA)，分别标记显著差异(P＜0.05)和特别显著性差异(P＜0.05)，使用Excel 2010软件，进行数据的统计和分析，使用软件sigma PlotⅠ2.5来制作相关柱形图。

毛蚶热休克蛋白(90)基因在肌肉和肝脏中的相对表达量的值越大，海洋污染程度越大，反之，相对表达量的值越小，海洋污染程度越小。重金属、壬基酚单一及联合暴露能够引起毛蚶发生氧化应激，从而诱导肌肉和肝脏组织中毛蚶热休克蛋白(90)基因水平上升，进而能够引起肌肉和肝脏组织中的热休克蛋白的过表达，提高其中毛蚶热休克蛋白(90)的含量，利用该变化可以有效地检测海洋污染。

一种新型海洋生物污染检测标记物在海洋中壬基酚和/或铜和/或镉检测或监控中的应用。

实施例2：

为了提高检测标记物的检测灵敏度和特异性，进一步的优化方案为：

荧光定量技术反应用采用，探针为：

GAGGATGACAGCGGATCTCCTGACGGACCTTCAGAGACCGTAGAT，该探针的熔点温度较高，可以识别出单个碱基的错配，增加反应的灵敏度和特异性。

实施例2：

为了提高检测标记物的检测灵敏度和特异性，进一步的优化方案为：

荧光定量技术反应采用探针，其序列为：

GAGGATGACAGCGGATCTCCTGACGGACCTTCAGAGACCGTAGAT，该探针的熔点温度较高，可以识别出单个碱基的错配，增加反应的灵敏度和特异性。

实施例3：

采用15天龄毛蚶作为监测水污染的生物样本，将毛蚶分成2组，分为无污染对照组与待测水域组，将毛蚶分别放入无污染水体和待测水域水体中饲养，每组3个平行进行，饲养7天后，每个平行取3个样品测定，每组测定3x3＝9个数据，将每组9个数据数理统计后得到各组毛蚶的结果。

利用实施例1步骤测量毛蚶热休克蛋白(90)在血细胞和腮中的相对表达量。检测结果：对照组在肌肉和肝脏的相对表达量值分别为2.84和2.78，待测组在肌肉和肝脏的相对表达量值分别为3.41和3.22，结果显示对照组的相对表达量值小于待测组的值，所以待测水域已经受到了污染，需及早进行水域治理，而化学的方法测试只能单一测试一种污染源，如测试镉浓度一般采用原子分光光度计法测试，原子分光光度计法先做标准曲线，然后制作样品再测试样品的吸光度后，在标准曲线上找去相应浓度，该方法误差大，并且只适合较大浓度测试，微量级浓度无法测试出；壬基酚也是一般采用气质联用法测试，该方法成本高，误差相对本发明来说也较大。本实施例所提到的空白组为所使用的试剂盒的空白对照，目的是为了减小误差。

本发明操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。

以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 浙江海洋大学

<120> 一种新型海洋生物污染检测标记物

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2614

<212> DNA

<213> 毛蚶(Scapharca subcrenata)

<400> 1

ctttttgtca agcgtggtca caagaaccgg cacgctgcat aacatcacaa gctaccatca 60

agaataacaa ccttaaaaca gcattatgcc agaagaaaat cagaccatgg atgaaggaga 120

agttgagacc tttgcctttc aggcagagat tgctcagttg atgagcttga ttatcaacac 180

tttctactcc aacaaagaaa tctttcttag agagttgata tccaattctt ctgatgcttt 240

agacaagatc cgatatgaaa gcttgacgga tccatctcgt ttggacagtg gcaaagacct 300

ctacattaaa attatcccaa acaaagaaga acacacattg accatcattg atacaggaat 360

tggtatgacc aaagctgacc tggtcaacaa cttgggaacc atcgctaaat ctggtacaaa 420

ggcttttatg gaagctttac aggccggagc cgacatctct atgattggtc agtttggtgt 480

aggtttctac tctgcctatt tggttgctga tagagtcgtc gtggagacca agaataacga 540

cgatgaacaa tacatctggg aatcctcagc tggtggatcc tttactgttc gttcaaccaa 600

caatcctgaa ttgacacgtg gaacaaagat cacactccac atcaaagaag atcagacgga 660

atacattgaa gaaaaacgta tcaaggacgt agttaagaaa cacagtcagt ttattggcta 720

tccaatcaaa ttgttggtag agaaggaacg cgacaaggaa gtatcagatg atgaggaaga 780

agaggaagag aaaaaggaag aaggtgatga ggaaaagaaa gaagatgacg agaaaccaaa 840

agtagaggac cttgatgaag acgaagatga tgaagagaag aagaaagaca agaaaaagaa 900

gaagaaaatc aaggaaaaat acaatgaaga tgaggaattg aacaaaacta aacccatctg 960

gacaagaaac tcggatgata ttactacaga ggaatatgga gaattttaca aatcccttac 1020

aaatgactgg gaagatcatt tggctgtgaa acacttctct gttgagggac agttggaatt 1080

cagagcactc ttgtttgtac caaggagagc tccatttgac ttgtttgaaa acaaaaagaa 1140

gaaaaataac atcaaattgt atgtaaggag agtattcatc atggacaact gtgaggaatt 1200

gattccagag tacttgaact ttattaaagg tgttgtagat tctgaggatc tacctctaaa 1260

catttccaga gaaatgctcc aacagagcaa aatcttgaaa gtcatcagga aaaatttagt 1320

caagaagtgt ttggaattgt ttgaggaaat tgctgaagac aaagataact tcaagaaatt 1380

ctatgaacaa tttggaaaaa atatcaagct cggaatccat gaagacagca caaacagaaa 1440

gaaacttgca gatatgttac gttatcactc ttcacaatct ggtgatgaac tgacatcatt 1500

gaaggattac gtgtccagaa tgaaggaaaa ccagaaatgc atttactaca tcacaggaga 1560

aagcagagat gtagtacaga actccgcttt tgttgagaga gttaaaaaga ggggaatgga 1620

agtgatatac atggttgacc ccattgatga atacgcagta cagcagttga aggaatatga 1680

tggaaaaact ctgacatctg tcacaaagga aggattggaa ctgccagaag atgaagatga 1740

gaagaaacga tttgaggaag ccaaagcaca gttagaggga ctctgtaaaa caatgaaaga 1800

aattcttgac aaaaaagtag aaaaggttgc tgtatcaaac cgtttggtaa catcaccatg 1860

ctgtattgta acaagtcagt atggttggtc tgccaatatg gaaagaatca tgaaagcaca 1920

agctctacga gattccagca ccatgggtta tatggctgca aagaaacatc ttgaaatcaa 1980

tcctgaccat cctattatta catctctgaa agagaaagtt gatgctgaca aaaacgacaa 2040

gtctgttaaa gatttggtat tgcttctgtt tgaaacctcc cttctatctt ctggattcac 2100

attagaggaa ccaggtgtac atgccagcag aatccacaga atgattaaac ttggacttgg 2160

aattgatgag gatgacagcg gatctcctga cggaccttca gagaccgtag atgaaatgcc 2220

accattggaa ggagacgagg atgacgcttc cagaatggaa gaagttgatt aaatcaatta 2280

atttatagag actatgaaca accgcataac ttaccttgaa aatgtaaatt aagactgtgt 2340

tgtagtcatt cattttttgt tgcttaaatt aaaaagagca tttattttca ttaaagacat 2400

taccttcatt acagaaatta tcatcgatgg acagacggac catgcattcg ttttaaattg 2460

catttttttt acttttccat gttttaattt actgtgattt tttttatttt ggcatatgtt 2520

gttaacgtgt cattggagaa aaaaaaaaaa gaaaaaacct tacaataaaa aaaagaaaaa 2580

ttgttttaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 2614

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgtaggtgcg gatatgtcca t 21

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcttgacagc caattggtct 20

<210> 4

<211> 281

<212> DNA

<213> 毛蚶(Scapharca subcrenata)

<400> 4

ggccacgcgt cgactagtac gggggggggg gggggggggg gctttttgtc aagcgtggtc 60

acaagaaccg gcacgctgca taacatcaca agctaccatc aagaataaca accttaaaac 120

agcattatgc cagaagaaaa tcagaccatg gatgaaggag aagttgagac ctttgccttt 180

caggcagaga ttgctcagtt gatgagcttg attatcaaca ctttctactc caacaaagaa 240

atctttctta gagagttgat atccaattct tctgatgctt t 281

<210> 5

<211> 1435

<212> DNA

<213> 毛蚶(Scapharca subcrenata)

<400> 5

aatcatgcga ctgtgaggat tgattccaga gtacttgaac tttattaaag gtgttgtaga 60

ttctgaggat ctacctctaa acatttccag agaaatgctc caacagagca aaatcttgaa 120

agtcatcagg aaaaatttag tcaagaagtg tttggaattg tttgaggaaa ttgctgaaga 180

caaagataac ttcaagaaat tctatgaaca atttggaaaa aatatcaagc tcggaatcca 240

tgaagacagc acaaacagaa agaaacttgc agatatgtta cgttatcact cttcacaatc 300

tggtgatgaa ctgacatcat tgaaggatta cgtgtccaga atgaaggaaa accagaaatg 360

catttactac atcacaggag aaagcagaga tgtagtacag aactccgctt ttgttgagag 420

agttaaaaag aggggaatgg aagtgatata catggttgac cccattgatg aatacgcagt 480

acagcagttg aaggaatatg atggaaaaac tctgacatct gtcacaaagg aaggattgga 540

actgccagaa gatgaagatg agaagaaacg atttgaggaa gccaaagcac agttagaggg 600

actctgtaaa acaatgaaag aaattcttga caaaaaagta gaaaaggttg ctgtatcaaa 660

ccgtttggta acatcaccat gctgtattgt aacaagtcag tatggttggt ctgccaatat 720

ggaaagaatc atgaaagcac aagctctacg agattccagc accatgggtt atatggctgc 780

aaagaaacat cttgaaatca atcctgacca tcctattatt acatctctga aagagaaagt 840

tgatgctgac aaaaacgaca agtctgttaa agatttggta ttgcttctgt ttgaaacctc 900

ccttctatct tctggattca cattagagga accaggtgta catgccagca gaatccacag 960

aatgattaaa cttggacttg gaattgatga ggatgacagc ggatctcctg acggaccttc 1020

agagaccgta gatgaaatgc caccattgga aggagacgag gatgacgctt ccagaatgga 1080

agaagttgat taaatcaatt aatttataga gactatgaac aaccgcataa cttaccttga 1140

aaatgtaaat taagactgtg ttgtagtcat tcattttttg ttgcttaaat taaaaagagc 1200

atttattttc attaaagaca ttaccttcat tacagaaatt atcatcgatg gacagacgga 1260

ccatgcattc gttttaaatt gcattttttt tacttttcca tgttttaatt tactgtgatt 1320

ttttttattt tggcatatgt tgttaacgtg tcattggaga aaaaaaaaaa agaaaaaacc 1380

ttacaataaa aaaaagaaaa attgttttaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 1435

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cgcaatgttg agtcgctcgg c 21

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gcctagttgt caagtagtcc 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tgccattcag gccgtattgt 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ccggcaagat ccaacctcat 20

Claims (10)

1.毛蚶热休克蛋白(90)基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的毛蚶热休克蛋白(90)基因，其特征在于：所述毛蚶热休克蛋白(90)基因通过基因克隆技术克隆获得，其包括如下步骤为：

1)总RNA提取；

2)以步骤1获得的总RNA样品作为模板，反转录合成cDNA第一链；

3)利用引物扩增基因核心片段；

4)利用RACE反应扩增获得毛蚶热休克蛋白(90)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，并进行生物信息学分析。

3.根据权利要求2所述的毛蚶热休克蛋白(90)基因，其特征在于：所述步骤3中引物的序列为：

M1-F：5'-CGTAGGTGCGGATATGTCCAT-3'，

M2-R：5'-GCTTGACAGCCAATTGGTCT-3'。

4.根据权利要求2所述的毛蚶热休克蛋白(90)基因，其特征在于：所述步骤4中RACE反应过程中获得的5’RACE序列如SEQ ID NO.4所示，3’RACE序列如SEQ ID NO.5所示。

5.毛蚶热休克蛋白(90)，其特征在于：由权利要求1-4任一项所述的毛蚶热休克蛋白(90)基因编码。

6.一种新型海洋生物污染检测标记物，其特征在于：权利要求5所述的毛蚶热休克蛋白(90)用作海洋污染的检测标记物。

7.根据权利要求6所述的一种新型海洋生物污染检测标记物，其特征在于：所述检测标记物监测海洋污染情况的方法为：选择毛蚶作为检测海洋污染的生物样本，通过对受到污染区域毛蚶的解刨提取肌肉和肝脏中的RNA，反转录成DNA，用荧光定量技术检测毛蚶热休克蛋白(90)基因在肌肉和肝脏中的相对表达量，检测海洋污染程度。

8.根据权利要求7所述的一种新型海洋生物污染检测标记物，其特征在于：所述荧光定量技术用引物为：

HSP90-F：5'-CGCAATGTTGAGTCGCTCGGC-3'，

HSP90-R：5'-GCCTAGTTGTCAAGTAGTCC-3'；

actin-real-F1：5'-TGCCATTCAGGCCGTATTGT-3'，

actin-real-R1：5'-CCGGCAAGATCCAACCTCAT-3'。

9.根据权利要求6或7或8所述的一种新型海洋生物污染检测标记物，其特征在于：所述毛蚶热休克蛋白(90)基因在肌肉和肝脏中的相对表达量的值越大，海洋污染程度越大，反之，相对表达量的值越小，海洋污染程度越小。

10.权利要求6或7或8或9所述的一种新型海洋生物污染检测标记物在海洋中壬基酚和/或铜和/或镉检测或监控中的应用。