CN102808036A - 一种海水中重金属镉污染的生物学灵敏检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高效、简捷、灵敏检测海水中重金属镉的生物学方法。具体是将青蛤分别置于含有重金属镉（Cd²⁺）和不含镉（Cd²⁺）的海水中，在96h后解剖获取青蛤肝脏组织，提取其总RNA并反转录为cDNA，根据设计的特异性引物，利用实时荧光定量PCR方法测定实验组青蛤HSP70（热休克蛋白70）基因的表达量与对照组的差别，水体中的重金属镉（Cd²⁺）含量越高则热休克蛋白基因的相对表达量越大，并且可以观察到分析仪器难以检测出的水体中低浓度镉（Cd²⁺）。本发明能够作为一种常规生物技术监测海水中重金属镉的污染程度及不同水域间的差异，它具有分析灵敏度高、对比性强等特点，可以评价重金属镉（Cd²⁺）对水域及生物体的有害风险，避免势态严重而造成不可挽回的损失。

Description

一种海水中重金属镉污染的生物学灵敏检测方法

本申请得到天津市科委应用基础及前沿技术重点项目（12JCZDJC22800）和天津市科委应用基础及前沿技术重点项目（09JCZDJC19300）的资助。

技术领域

本发明属于海洋污染的生物探针监测领域，涉及水生动物分子生物学技术，具体的说是一种新型、高效、灵敏的海水重金属镉的生物学检测方法。

背景技术

近年来，随着我国采矿、冶炼、陶瓷、电镀、颜料及电子工业的迅猛发展，使镉、砷、汞等有害重金属以工业“三废”形式大量排放到自然界，不仅对耕地等土壤环境造成污染，还会随水体的地表及地下径流进入海洋，对近岸水体造成严重污染。其中，我国环渤海区域近岸海域水体重金属镉（Cd²⁺）的污染尤为严重。重金属镉的污染不仅具有范围广，持续时间长，不易在生物体内分解排放和污染后难以发现等特点，且可沿食物链转移进而在人体内富集，对人类健康造成严重危害。因此，重金属镉的污染已经成为全社会普遍关注的热点问题，也是国内外学者面临的重要研究命题之一。

镉（Cd）原子量112.41，在周期表中属ⅡB族元素。镉溶于酸但不溶于碱，其氧化态为Cd^{＋ 1}和Cd^{＋ 2}。镉可形成多种配离子，如Cd(NH₃）、Cd(CN)、CdCl等。镉对动植物毒性较大，被其污染的空气和食物对人体危害严重。早在上世纪中期，日本富山县神通川流域河岸出现的“痛痛病”，即患者出现腰、背、手、脚等关节有针刺般痛感，数年后骨骼严重畸形，骨脆易折，其原因是该河岸的冶炼厂等排放的含镉物质污染了水体，当地居民长期饮用镉污染的河水并食用镉污染水种植的稻米，使镉在体内蓄积而中毒致病。2011年2月，国内许多媒体报道，我国一些矿区残留的重金属镉正通过污染土壤侵入稻米，抽样调查显示中国多地市场上约10％大米镉含量超过国家规定的标准，引起了食品卫生部门的高度重视。许多研究证明，镉对植物体产生毒性的临界值一般高于动物和人体毒害临界值，也就是说，重金属镉对动物及人体的危害比植物更为严重。

许多研究表明，各种海洋动物由于生境和食性的差别，其体内重金属蓄积的种类有所不同。例如以浮游生物为食的鱼类、贝类等体内的砷、镉的含量较高, 以固着藻类和有机质碎屑为食的鱼类和贝类等体内铬、铜的含量较高，以底栖小型动物为食的鱼类和贝类体内锌的含量较高，杂食性动物体内的铅、镍含量高。以上为本发明生物材料的选择提供了基础。

目前，世界各国都十分重视重金属镉污染的环境检测，不断加强对采矿废料、工业废水、生活污水的监测和处理，对于农产品和水产品中的有害物也有严格的卫生检测标准、检测机构和定期监测部门。但是，传统的几种检测手段在灵敏度和稳定性方面有明显不足，最重要的是传统方法没有真正反映出生物体在镉胁迫下其生理、生化反应及代谢调节作用等方面的变化。本发明是基于重金属镉对软体动物青蛤产生毒害情况下，引起青蛤相关基因应激表达而建立的一种快速、灵敏的水体重金属镉的有效监测方法，也可以作为环境监测部门评价水体重金属镉对生物产生毒害的早期观测值。

热休克蛋白HSP70是一种在几乎所有生物应激细胞中都存在、并广泛参与各种保护机体和细胞功能的大分子，其具有稳定新生多肽、帮助蛋白进入内质网和线粒体等重要作用。该蛋白的基因在重金属胁迫下会大量诱导，以表达出应激性蛋白使机体抵御不良环境。鉴于以上特征，该家族蛋白被认为是水体环境环境监测的重要标志物。使用生物标志物作为监测手段的优点如下；首先，它反映的是生物实际的生理状态，监测的是个体免疫应激反应的相关指标变化，这种变化通常要早于有害物在水体中蓄积水平的变化，因而能起到早期预测的作用，这也是生物标志物最重要之处。另外，目前国内水体重金属生物标志物方面的技术仅局限于测量应激蛋白含量及活性。有关利用应激性蛋白基因的表达过程作为重金属镉污染监测方法方面，没有任何正式的相关技术报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有监测技术中利用传统仪器和生化方法测量的缺点与不足，提供一种快速、灵敏的水体重金属镉的高效分子生物学监测方法。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

一种监测海水中重金属镉的热休克蛋白HSP-70荧光PCR反应的特异性引物，其特征在于：

扩增引物

上游引物为：HSP-70-RT-F：5'-CTGCTTACTTCAACGACTCCC-3'；

下游引物为HSP-70-RT-R：5'-CTTTTTGTCAAGACCATAGGC-3'；

作为内参基因的青蛤β-actin基因特异性上下游引物：

β-actin-S：5'-CACCACA ACTGCCGAGAG-3'；

β-actin-A：5'-CCGATAGTGATGA CCTGACC-3'。

2．本发明所述的特异性引物检测海水中重金属镉污染的生物学方法，其特征在于按如下的步骤进行：

（1）以青蛤作为用于重金属镉污染监测的指示生物样品；

（2）样品总RNA提取与纯化：采用通用的RNA提取方法和纯化方法，从青蛤肝脏提取得到纯化的肝脏总RNA；

（3）cDNA第一链合成：以青蛤肝脏中总RNA为模板合成cDNA第一链，反应体系为25μL；

（4）实时荧光PCR检测：以上述合成的cDNA第一链为模板，根据所述的特异性引物和内参引物，进行实时荧光PCR扩增反应，获取各管Ct值；

实时荧光PCR扩增体系设置如下：

试剂	使用量	终浓度
			SYBR® Premix DimerEraser™（2×）荧光PCR混合物	12.5 μl	1×
PCR Forward Primer（10 μM）正向引物	0.75 μl	0.3 μM×1
			PCR Reverse Primer（10 μM）反向引物	0.75 μl	0.3 μM×1
Template（＜100 ng）模板	2 μl	×2
			dH2O 灭菌蒸馏水	9 μl
Total Volume 总体积	25 μl	×3

实时定量荧光PCR扩增参数设置如下：

Hold (初期变性)：Cycle(循环数)：1

95℃ 30秒

3 step PCR (PCR) ：Cycle(循环数)：40

95℃ 5秒

55℃ 30秒

72℃ 30秒

Dissociation (DNA熔解)

（5）青蛤肝脏HSP70基因的相对表达量计算：实时荧光PCR完成后，根据仪器自动记录的每管Ct值，使用以下公式计算；

HSP70基因相对表达量=2^{- △△ Ct}；

△Ct=Ct HSP70-Ct β-actin；

△△Ct=(CtHSP70-Ctβ-actin)实验组-(CtHSP70- Ctβ-actin)对照组；

2^{- △△ Ct}计算实验组模板中HSP70基因的量相对于对照组的变化量，取实验均值，即为青蛤肝脏HSP70基因的相对表达量。

本发明更加详细地利用特异性引物监测海水中重金属镉的生物学方法如下：

3．选择贝类—青蛤用于水体重金属污染检测的指示生物样本；青蛤具有分布广，活动范围小，易采集，对重金属镉应激反应明显并且耐受力强等特点。

4．选定青蛤肝脏HSP70基因相对表达量作为监测指标，根据青蛤HSP70cDNA序列设计符合荧光PCR反应特点的特异性上下游引物：

HSP-70-RT-F：5'-CTGCTTACTTCAACGACTCCC-3'；

HSP-70-RT-R：5'-CTTTTTGTCAAGACCATAGGC-3'；

作为内参基因的青蛤β-actin基因特异性上下游引物：

β-actin-S：5'-CACCACA ACTGCCGAGAG-3'；

β-actin-A：5'-CCGATAGTGATGA CCTGACC-3'；

经检测，扩增片段大小适中，且电泳凝胶成像条带单一，适合用于实时定量PCR检测。

5．重金属镉胁迫实验：选出健康青蛤分别饲养于可能含有重金属镉污染的海水中（待测海水）和不含重金属镉的人工海水中，一定时间后解剖青蛤获取其肝脏组织，于液氮中速冻备用。

6．总RNA提取与纯化：采用各种通用（常规）的RNA提取方法和纯化方法，从青蛤肝脏提取得到纯化的肝脏总RNA。

7．cDNA第一链合成：

以纯化的青蛤总RNA作为模板，以Oligo(dT)₁₆为反转录引物，进行cDNA第一链合成，得到的cDNA第一链，作为下述PCR扩增的cDNA模板。

8．实时荧光PCR：

（1）实时荧光PCR采用TaKaRa公司的SYBR ^® Premix DimerEraser^TM (Perfect Real Time)试剂盒，以合成的cDNA第一链为模板，以上述（2）中引物为HSP70扩增引物及β-actin扩增引物，进行实时荧光PCR扩增反应。

实时荧光PCR扩增体系设置如下：

试剂	使用量	终浓度
			SYBR® Premix DimerEraser™（2×）荧光PCR混合物	12.5 μl	×1
PCR Forward Primer（10 μM）正向引物	0.75 μl	0.3 μM×1
			PCR Reverse Primer（10 μM）反向引物	0.75 μl	0.3 μM×1
Template（＜100 ng）模板	2 μl	×2
			dH2O 灭菌蒸馏水	9 μl
Total Volume 总体积	25 μl	×3

实时荧光PCR扩增参数设置如下：

Hold(初期变性)：Cycle(循环数)：1

95℃ 30秒

3 step PCR (PCR) ：Cycle(循环数)：40

95℃ 5秒

55℃ 30秒

72℃ 30秒

Dissociation (DNA熔解)

（2）重金属镉胁迫下青蛤肝脏HSP70基因的相对表达量计算：实时荧光PCR完成后，根据仪器自动记录的每管Ct值，使用以下公式计算：

HSP70基因相对表达量=2^{- △△ Ct}

△Ct=Ct HSP70—Ct β-actin

△△Ct=(CtHSP70—Ctβ-actin)实验组—(CtHSP70— Ctβ-actin)对照组

使用2^{- △△ Ct}计算实验组各时间点模板中HSP70基因相对于对照组(0h)的表达倍数，取实验均值，即为青蛤肝脏HSP70基因的相对表达量。

2^{- △△ Ct}数值代表了受重金属镉胁迫青蛤HSP70基因相对于正常青蛤基因的表达倍数。β-actin是管家基因，在所有类型的细胞中都进行表达，管家基因的表达只受启动序列或启动子与RNA聚合酶相互作用的影响，而不受其他机制调节，受环境因素影响很小，表达水平较为恒定。因此，管家基因常被用做测定目标基因表达量时的参照基因。本实验中在一定范围内的2^{- ΔΔ Ct}数值越大，表明受胁迫青蛤HSP70基因的表达量越高，待测海水中重金属镉含量越大。

本发明与已有技术相比所具有的积极效果在于：

（1）与检测生物体内重金属蓄积分析相比，本发明检测的是生物体内实际的生理异常，监测的是个体免疫应激反应的相关指标变化，这种变化通常要早于有害物在生物体中蓄积水平并产生毒害作用，因而能起到提前预警的作用。

（2）与生化手段检测生物体内标志性蛋白物（热休克蛋白、金属硫蛋白等）相比，本发明以青蛤的HSP70的基因相对表达量作为监测指标，其免疫应答体系中的HSP70基因对重金属镉污染更为敏感，在镉胁迫下会先期超量表达，不但早于有害物诱导的标志性蛋白含量的变化，并且经过多次重复试验均表明即使水体中重金属含量很低，其基因表达变化仍然十分显著，技术手段具有先进和灵敏度高的特点。

（3）本发明采用的实时荧光RT-PCR技术可以在调控转录水平上对基因表达进行检测，而实时定量荧光PCR技术全部由自动化仪器收集荧光信号，不但大大提高了监测的灵敏度，避免了因下游生理功能受阻、蛋白表达量受影响而导致的数据差异。并且实时荧光PCR技术使用的是全封闭反应，能有效避免环境因素造成的实验误差，有效消除检测系统自身形成的偏差，保证了结果的可靠性和重复性。

附图说明：

图1为青蛤总RNA电泳图；

图2为 安全浓度（0.201mg/L）下青蛤HSP70基因的表达量；

图3为极低镉离子浓度（0.1μg/L）下青蛤HSP70基因相对表达量。

下面结合实施例说明本发明的实施案例，不限制本发明，本领域的专业人员按照本发明的精神可以对其进行改进和变化，所述的这些改进和变化都应视为在本发明的范围内，本发明的范围和实质由权利要求来限定。所用到的各种试剂均有市售。

实施例 1

海水中镉离子（Cd²⁺）对青蛤安全浓度下HSP70基因的表达测定

1．重金属镉胁迫安全浓度实验

安全浓度是指在污染物的持续作用下，生物可以正常存活、生长、繁殖的最高毒物浓度。目前比较普遍使用的计算安全浓度公式为：

安全浓度=半致死浓度×应用系数，即SC=LC50×f (周永欣等，1983)。

应用系数f的选择与毒物毒性、理化性质是否稳定、能否在生物体内积累等因素作为参考，一般在0.01~0.1范围进行选取。此浓度下实验生物最大限度接受有毒物质的胁迫下能够正常生存，不影响生物体的生命体征。本实验室通过Cd²⁺胁迫青蛤的急性毒性试验（张丽岩等，2010），计算出重金属镉（Cd²⁺）对青蛤的半致死浓度（20.09mg/L）和安全浓度（0.201mg/L），以上数据作为Cd²⁺胁迫青蛤基因表达实验的离子浓度参数。

青蛤选取形态指标没有显著差异的成熟个体,其壳长平均值为(29.32±1.53)mm, 壳高平均值为(29.17±1.64)mm, 壳宽平均值为(18.12±0.42)mm，样品暂养于人工海水中(海水密度1.020-1.040g/cm³,水温20-23℃, 盐度28-31, pH 7.0), 持续曝气, 每天投喂5‰的小球藻, 暂养一周后进行胁迫试验。

在养殖箱配制含镉离子的海水，使其终浓度为急性毒性试验中测定镉离子对青蛤安全浓度0.201mg/L；水温16-18℃，24h换水一次，换水率50%，静水实验，实验期间不投喂。设置两组平行实验，同时设置空白对照组，每组投放青蛤60只。分别于处理前（0h）及处理后6h，12h，24h，48h，96h取样，然后解剖青蛤获取其肝脏组织，于液氮中速冻备用。

2.总RNA的提取和纯化

（1）取50～100mg青蛤肝脏组织，置于装有1ml，4℃预冷Trizol试剂（美国invitrogen公司）的EP管中，冰上充分研磨使细胞裂解；

（2）加入0.2ml氯仿。盖紧管盖，用力摇匀，12000rpm，4℃ 离心15分钟；

（3）将水相移至新管中，加入等体积异丙醇。样品在室温环境中放置5分钟，12000rpm，4℃ 离心15分钟；

（4）去掉上清。加1ml75％的乙醇并混匀样品，12000rpm，4℃ 离心15分钟，重复一次。

（5）小心去掉上清，干燥5-10分钟，加入20ul左右RNase-free水。室温放置1小时使RNA溶解。

（6）琼脂糖电泳检查RNA的完整程度。真核细胞核糖体RNA应有28S、18S、5S组分，表明总RNA没有降解（图1）。

3．实时荧光PCR检测目的基因

（1）引物设计

根据青蛤HSP70cDNA序列设计符合荧光PCR反应特点的特异性上下游引物

HSP-70-RT-F：5'-CTGCTTACTTCAACGACTCCC-3'；

HSP-70-RT-R：5'-CTTTTTGTCAAGACCATAGGC-3'；

以及作为内参基因的青蛤β-actin基因特异性上下游引物：

β-actin-S：5'-CACCACA ACTGCCGAGAG-3'；

β-actin-A：5'-CCGATAGTGATGA CCTGACC-3'。

经检测，扩增片段大小适中，且电泳凝胶成像条带单一，适合用于实时定量PCR检测。

（2）cDNA模板的合成

A. 将步骤4所得总RNA用DNase消化残余的DNA：

总RNA 8.0μL

Rnase 抑制剂（RNA酶抑制剂，Promega公司） 0.6μL

RNase-Free DNase （无RNA酶的DNA酶，Promega公司） 1.0μL

5×M-MLV buffer （5×M-MLV反转录酶缓冲液，TaKaRa公司） 2.4μL

37℃反应30 min后，每个反应体系中加1μL DNase Stop solution（DNA酶反应终止液，Promega公司），65℃，10 min灭活DNase（DNA酶）。

B．RNA变性：

在已完成反应的PCR管中加入：

2×Oligo dT 2.5μL

70℃热变性5 min，冰浴2 min。

C．反转录

在已完成变性反应的PCR管中依次加入：

5×M-MLV buffer （5×M-MLV反转录酶缓冲液，TaKaRa公司） 2.6μL

dNTP (2.5mM each) （脱氧核苷三磷酸(含脱氧核糖，上海生工公司） 5.0μL

M-MLV反转录酶 （TaKaRa公司） 1.0μL

Rnase抑制剂（RNA酶抑制剂，TaKaRa公司） 0.5μL

RNase-Free water （无RNA酶超纯水，上海生工公司） 至25μL

混匀，稍离心。42℃反转录1 h，95℃ 5min灭活反转录酶。

（3）实时荧光定量PCR检测：

A．实时荧光PCR采用TaKaRa公司的SYBR ^® Premix DimerEraser^TM (Perfect Real Time)试剂盒，以合成的cDNA第一链为模板，

以HSP-70-RT-F：5'-CTGCTTACTTCAACGACTCCC-3'；

HSP-70-RT-R：5'-CTTTTTGTCAAGACCATAGGC-3' 为HSP70基因扩增引物；

以β-actin-S：5'-CACCACA ACTGCCGAGAG-3'；

β-actin-A：5'-CCGATAGTGATGA CCTGACC-3'；

以β-actin基因扩增引物，进行实时荧光PCR扩增反应，获取各管Ct值。

实时荧光PCR扩增体系设置如下：

试剂	使用量	终浓度
			SYBR® Premix DimerEraser™（2×）荧光PCR混合物	12.5 μl	1×
PCR Forward Primer（10 μM）正向引物	0.75 μl	0.3 μM×1
			PCR Reverse Primer（10 μM）反向引物	0.75 μl	0.3 μM×1
Template（＜100 ng）模板	2 μl	×2
			dH2O 灭菌蒸馏水	9 μl
Total Volume 总体积	25 μl	×3

实时荧光PCR扩增参数设置如下：

Hold（初期变性） ：Cycle(循环数)：1

95℃ 30秒

3 Step PCR（PCR扩增） ：Cycle（循环数）：40

95℃ 5秒

55℃ 30秒

72℃ 30秒

Dissociation（DNA熔解)

B．重金属镉胁迫下青蛤肝脏HSP70基因的相对表达量计算：实时荧光PCR完成后，根据仪器自动记录的每管Ct值，使用以下公式计算：

HSP70基因相对表达量=2^{- △△ Ct}

△Ct=Ct HSP70—Ct β-actin

△△Ct=(CtHSP70—Ctβ-actin)实验组—(CtHSP70— Ctβ-actin)对照组；

使用2^{- △△ Ct}计算实验组各时间点模板中HSP70基因相对于对照组(0h)的表达倍数，取实验均值，即为青蛤肝脏HSP70基因的相对表达量（图2）。

2^{- △△ Ct}数值代表了受重金属镉胁迫青蛤HSP70基因相对于健康青蛤基因的表达倍数。β-actin是看家基因，在所有类型的细胞中都进行表达，看家基因的表达只受启动序列或启动子与RNA聚合酶相互作用的影响，而不受其他机制调节，受环境因素影响很小，表达水平较为恒定。因此，看家基因常被用做测定目标基因表达量时的参照基因。

由图2所示数据可得，在含有安全浓度0.20mg/L的镉离子的海水中饲养青蛤，其肝脏内热休克蛋白70 mRNA的含量明显增加，并且这种变化与刺激时间在一定范围内呈正相关。其中24小时内，HSP70 mRNA表达量上升速度较快，24h至96h区间基本保持持平，维持在8.35-8.92倍之间。结果显示，青蛤体内热休克蛋白70 mRNA的含量与镉离子胁迫时间和浓度均成正相关，青蛤在安全浓度（0.20mg/L）镉离子的海水中，HSP70 mRNA的表达量明显增加，并且随刺激时间延长而逐渐升高明显。

实施例 2

对比试验：常规水体金属离子检测往往采用光谱技术来完成，如ICP 电感耦合等离子体发射光谱等。这些分析技术虽能对元素含量进行较准确的定量测定，但存在着前期投入较大、运转费用高等弊端。更为重要的是，这些方法测定的仅是样品中总的元素的含量，并不能测出其价态、存在形式和对生物的损伤等指标。而对金属元素而言，其对生物造成危害的存在形式往往是溶解在水体中的化合态，而常规的定量分析手段难以对这项数据进行分析，这不利于对水体污染对生物影响程度的有效分析和评估。另外，如果某些重金属元素在水体中含量较低时，其测量样本时需要根据实际情况对样品进行浓缩或稀释，不但增加了数据的误差，并且费时费力还增加了成本，因为在极低浓度下一般仪器无法直接读出数据。本发明最突出的特点在于除了对水体中较高浓度的镉（Cd²⁺）有较灵敏的检测反应，而且在水体中重金属镉（Cd²⁺）含量极低的情况下，其表达变化亦十分显著，能显示水体中痕量级的重金属镉（Cd²⁺）的存在，为进一步进行定量分析提供快速，灵敏的前期监测数据。

本实验以国家海洋局公布的2009年渤海湾海水中镉（Cd²⁺）0.1μg/L浓度人工配制胁迫浓度，利用实时荧光PCR技术检测观察青蛤的HSP70基因的表达情况。

1. 海水中极低镉（Cd²⁺）浓度对青蛤的胁迫表达实验

青蛤暂养方法、时间同于实例1中步骤1。水温16-18℃，24h换水一次，换水率50%，静水实验，实验期间不投喂。设置两组平行实验，均具有空白对照组，每组投放青蛤60只。分别于处理前（0h）及处理后6h，12h，24h，48h，96h取样，然后解剖青蛤获取其肝脏组织，于液氮中速冻备用。

在养殖箱配制含镉（Cd²⁺）离子海水，使其终浓度为渤海湾水质调查报告（2009年）中公布的海水实际镉离子浓度0.1μg/L（注*该浓度海水样本如果不进行浓缩而使用一般仪器分析无法检出，而需要对海水样本大量采集，浓缩处理后进行测定）。

2. 总RNA的提取和纯化：采取同实例2中一致的方法提取各实验组样本总RNA备用。

3．实时荧光PCR检测目的基因

采用与上述实例1中一致的方法，进行cDNA模板的转录和实时荧光定量PCR的检测，数据处理后得结果，由图3可得，在渤海湾实际监测得到的镉Cd²⁺（0.1μg/L）浓度海水中饲养的青蛤，其肝脏内热休克蛋白HSP70的mRNA含量与刺激时间在96h内均呈明显的正相关，暂养6h后青蛤HSP70相对表达量即达到对照组的3倍以上，而96h后HSP70基因的表达量达到空白样的5.8倍，说明青蛤的HSP70在机体免疫防御系统中起着重要的作用，其表达量在如此低浓度镉Cd²⁺胁迫下会出现显著的基因表达。特别值得指出，此浓度的镉离子在ICP光电直读光谱仪下不能检测出，可见本发明具有高效、快速、灵敏的特征。

热休克蛋白HSP家族蛋白曾被认为是海洋环境监测的重要标志物，而本发明中所涉及的青蛤应激蛋白HSP70基因定量表达技术，应该属于第二代分子生物学环境监测新技术。鉴于青蛤体内HSP70基因对环境中的重金属镉Cd²⁺的含量极为敏感，因此，本发明具有检出灵敏和快速的特点。本专利内容能够直接转化为生物监测探头，用于评估海洋水体污染情况及其对生物体的危害程度，对于海洋环境保护、近岸渔业和水产品的增养殖等产业有着重要的应用价值。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津师范大学

<120> 一种海水中重金属镉污染的生物学灵敏检测方法

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 热休克蛋白HSP-70

<400> 1

ctgcttacttcaacgactccc 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 热休克蛋白HSP-70

<400> 2

ctttttgtcaagaccataggc 21

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 青蛤β-actin基因

<400> 3

caccacaactgccgagag 18

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 青蛤β-actin基因

<400> 4

ccgatagtgatgacctgacc 20

Claims (2)

1.一种用于监测海水中重金属镉污染的热休克蛋白HSP-70实时荧光定量PCR反应的特异性引物，其特征在于：

上游引物为：HSP-70-RT-F：5'-CTGCTTACTTCAACGACTCCC-3'；

下游引物为：HSP-70-RT-R：5'-CTTTTTGTCAAGACCATAGGC-3'；

作为内参基因的青蛤β-actin基因特异性上下游引物为：

β-actin-S：5'-CACCACAACTGCCGAGAG-3'；

β-actin-A：5'-CCGATAGTGATGACCTGACC-3'。

2.一种采用权利要求1所述特异性PCR引物检测海水中重金属镉的生物学方法，其特征在于按如下步骤进行；

（1）以青蛤作为用于重金属镉污染监测的指示生物样本；

（2）样本总RNA提取与纯化：采用通用的RNA提取方法和纯化方法，从青蛤肝脏提取得到纯化的肝脏总RNA；

（3）cDNA第一链合成：以青蛤肝脏中总RNA为模板合成cDNA第一链，反应体系为25μL；

（4）实时荧光PCR检测：以上述合成的cDNA第一链为模板，根据所述的特异性引物和内参引物，进行实时荧光PCR扩增反应，获取各管Ct值（Cycle threshold指每个反应管内的荧光信号达到设定阈值所经历的循环数）；

实时荧光PCR扩增体系设置如下：

试剂 使用量 终浓度 SYBR® Premix DimerEraser™（2×）荧光PCR混合物 12.5 μl ×1 PCR Forward Primer（10 μM）正向引物 0.75 μl 0.3 μM×1 PCR Reverse Primer（10 μM）反向引物 0.75 μl 0.3 μM×1 Template（＜100 ng）模板 2 μl ×2 dH₂O 灭菌蒸馏水 9 μl Total Volume 总体积 25 μl ×3

实时定量荧光PCR扩增参数设置如下；

Hold（初期变性）：Cycle（循环数）：1

95℃ 30秒

3 Step PCR（扩增）：Cycle（循环数）：40

95℃ 5秒

55℃ 30秒

72℃ 30秒

Dissociation；

（5）青蛤肝脏HSP70基因的相对表达量计算：实时荧光PCR完成后，根据仪器自动记录的每管Ct值，使用以下公式计算；

HSP70基因相对表达量=2^{- △△ Ct}；

△Ct=Ct HSP70-Ct β-actin；

△△Ct=(CtHSP70-Ctβ-actin)实验组-(CtHSP70- Ctβ-actin)对照组；

2^{- △△ Ct}计算实验组模板中HSP70基因的量相对于对照组的变化量，取实验均值，即为青蛤肝脏HSP70基因的相对表达量。

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