CN111544604A - 一种利用海水青鱂幼鱼评价化合物神经毒性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种利用海水青鱂幼鱼评价化合物神经毒性的方法，通过待测化合物的暴露实验、视觉运动检测、视觉运动相关基因的检测、神经毒性评估和神经毒性分级等步骤，实现对待测化合物的快速检测。本发明整个初步评估周期仅需要8天（其中化合物暴露7天，神经毒性检测1天），大大缩短了评价化合物神经毒性的时间。
Description
技术领域
本发明属于生物检测领域，具体涉及一种利用海水青鱂幼鱼评价化合物神经毒性的方法。
背景技术
海水青鱂（Oryzias melastigma）主要分布在中国，韩国，日本及印度海域。由于海水青鱂小巧的体型、较短的生长周期、较高的繁殖率以及较宽的盐度范围等特点，被国际生命科学学会健康和环境科学研究所（HESI）认定为毒理学研究的重要工具。除此之外，海水青鱂幼体具有对环境变化较为敏感的特点，被广泛应用于毒性检测、环境变化及生态毒理学等研究中。
随着世界各国对生态环境和人类健康越来越重视，在许多新型化合物投入大量生成使用之前，需要进行严格的生态风险评估。新型化合物对生物体的神经毒性是生态风险评估中一个至关重要的指标。如果新型化合物对生物具有较大的神经毒性，极有可能在大量使用后威胁环境生态系统，甚至威胁到人类健康。目前为止，神经毒性的评估方法大多过程繁琐且实验周期较长，难以对化合物进行神经毒性的初步评估。因此，迫切需要一种快速高效初步评价化合物神经毒性的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用海水青鱂幼鱼对化合物进行神经毒性的快速高效初步评价化的方法。整个初步评估周期仅需要8天（其中化合物暴露7天，神经毒性检测1天）。
为实现上述目的，采用以下技术方案：
1.暴露溶液的制备：将商品化海盐溶解于爆气后的自来水中，配制出盐度为30‰的洁净海水。称量适量待测试化合物，溶解于洁净海水中并搅拌均匀，使得终浓度为1-1000 μmol/L。
2.待测化合物的暴露实验：准备灭菌过的100mm玻璃培养皿，向其中加入5mL的洁净海水（对照组）、含有待测化合物的海水（实验组）。选取健康活泼的14日龄海水青鱂幼鱼，置于上述玻璃培养皿中，每个培养皿中的幼鱼数量为10尾。随后进行长达7日的暴露实验，暴露期间室温控制在28℃，光照周期为12h：12h，每个培养皿中每日投喂初孵化丰年虫10-15只。
3.视觉运动检测：准备96孔板一个，向每孔中加入300 μL的洁净海水。待7天的暴露试验结束后，使用塑料吸管小心吸取幼鱼置于96孔培养皿中，每孔中1尾幼鱼。幼鱼分配完毕后，将96孔板置于Noldus Daniovision运动轨迹记录仪内。基于此方法，能同时检测最多96尾幼鱼的运动轨迹。设置仪器内光照系统：进行150lux的光照处理10分钟，快速调节至小于6lux黑暗处理10分钟，重复该过程1次。记录每尾幼鱼在共1小时检测中的游动轨迹和运动时间（图1）。
4.视觉运动相关基因的检测：待视觉运动检测结束后，立刻从96孔板中小心吸取幼鱼置于1.5mL离心管中，对幼鱼进行总RNA提取和cDNA反转录。使用以下视觉运动相关基因的引物进行荧光定量PCR分析（表1）。记录每个基因的相对表达量。
表1. 用于检测海水青鱂幼鱼视觉运动相关基因的引物序列
5.神经毒性评估：从视觉运动能力和视觉运动相关基因两方面进行评估。
（1）视觉运动能力：统计光照条件下，每尾鱼运动的总距离和总时间，将对照组和实验组进行统计学分析（Student's t test）；同理，统计并分析黑暗条件下，海水青鱂幼鱼运动的总距离和总时间。若实验组幼鱼运动的总距离和总时间比对照组高出或低于25%，且显著性分析结果为显著（p<0.05），则评价为待测试化合物对幼鱼视觉运动能力有影响；若运动的总距离和总时间相差超过50%，则评价为幼鱼视觉运动能力有严重影响。此外，根据每分钟的幼鱼的移动距离，绘制散点图，分析光照切换到黑暗瞬间的差别，即第11分钟和第31分钟。若在第11分钟和第31分钟，实验组幼鱼运动的距离和对照组具有显著性差异，则评价为待测试化合物对幼鱼视觉运动能力有影响。
（2）视觉运动相关基因：对比实验组和对照组幼鱼中bmp4，six3，pax6，rx3，rh1，rh2，lws，sws1和sws2基因的表达量的差异，并进行统计学分析（Student's t test）。若9个待测基因中，有1个或1个以上的基因表达量出现显著性差异，则评价待测试化合物对幼鱼视觉运动相关基因有影响。
6.神经毒性分级：根据视觉运动能力和视觉运动相关基因两方面的评估结果，对待测化合物的神经毒性进行分级：1）对视觉运动能力和视觉运动相关基因均没有影响，评价为：无神经毒性；2）对视觉运动能力和视觉运动相关基因其中之一具有影响，评价为：轻微神经毒性；3）对视觉运动能力具有影响，且对视觉运动相关基因具有影响，评价为：一般神经毒性；4）对视觉运动能力具有严重影响，且对视觉运动相关基因具有影响，评价为：严重神经毒性。
本发明的优点在于：
1. 本发明的视觉运动检测和视觉相关基因检测方法，能够同时对最多96尾海水青鱂幼鱼进行检测。通过一次检验，能够对多种化合物的神经毒性同时进行评估。
2. 本发明的评估方法耗时短，整个初步评估周期仅需要8天（其中化合物暴露7天，神经毒性检测1天）。
3. 本发明的评估方法成本较低，对受试动物的利用率高。在对青鱂幼鱼进行视觉运动检测后，直接用于下一步的视觉相关基因的检测，间接减少了对受试动物量的要求。
4. 本发明的评估结果准确且科学，不仅从宏观的行为学角度，还从微观的分子生物学角度，进行综合性的评估。准确性详见实施例1。
附图说明
图1 海水青鱂幼鱼的视觉行为检测（红色为运动轨迹）。
图2 TPhP和PS对海水青鱂幼鱼移动时间和移动距离的影响。
图3 TPhP和PS对海水青鱂幼鱼每分钟移动距离的影响。
图4. TPhP和PS对海水青鱂幼鱼视觉运动相关基因的影响。
具体实施方式
实施例1
目前研究表明，磷酸三苯酯（TPhP）具有神经毒性，聚苯乙烯颗粒（PS）不具有神经毒性。我们采用本发明的方法，对TPhP和PS的神经毒性进行验证性评估，验证本发明的可靠性。
1.TPhP和PS暴露溶液的制备：将商品化海盐溶解于爆气后的自来水中，配制出盐度为30‰的洁净海水。称量适量的TPhP和PS，溶解于洁净海水中并搅拌均匀，使得TPhP的终浓度为0.1 mg/L，PS的终浓度为20 μg/L。
2.TPhP和PS的暴露实验：准备灭菌过的100mm玻璃培养皿，向其中加入5mL的洁净海水（对照组）、含有0.1 mg/L TPhP的海水以及含有20 μg/L PS的海水。选取健康活泼的14日龄海水青鱂幼鱼共80尾，置于上述玻璃培养皿中，每个培养皿中的幼鱼数量为10尾。随后进行长达7日的暴露实验，暴露期间室温控制在28℃，每个培养皿中每日投喂初孵化丰年虫10-15只。
3.视觉运动检测：准备96孔板一个，向每孔中加入300 μL的洁净海水。待7天的暴露试验结束后，使用塑料吸管小心吸取幼鱼置于96孔培养皿中，每孔中1尾幼鱼。幼鱼分配完毕后，将96孔板置于Noldus Daniovision运动轨迹记录仪内。基于此方法，能同时检测最多96尾幼鱼的运动轨迹。设置仪器内光照系统：进行150lux的光照处理10分钟，快速调节至黑暗处理（小于6lux）10分钟，重复该过程1次。记录每尾幼鱼在共1小时检测中的游动轨迹和运动时间。
4.视觉运动相关基因的检测：待视觉运动检测结束后，立刻从96孔板中小心吸取幼鱼置于1.5mL离心管中，对幼鱼进行总RNA提取和cDNA反转录。使用以下视觉运动相关基因的引物进行荧光定量PCR分析。
荧光定量PCR反应体系为10uL：荧光定量PCR预混液 5µL，双蒸水 2µL，上游引物（100µM） 1µL，下游引物（100µM） 1µL，海水青鱂幼鱼cDNA 1µL。条件为：1）95℃5分钟的预变性；2）95℃ 30秒，60℃ 20秒，72℃ 20秒循环40次，并于每个循环结束后记录荧光值；3）60℃逐渐升温至95℃，并持续记录荧光值。根据荧光定量PCR结果，采用2-△△Ct 的方法，以β-actin基因为内参进行相对定量分析，计算获得每个基因的相对表达量。
用于检测海水青鱂幼鱼视觉运动相关基因的引物序列
5.神经毒性评估：从视觉运动能力和视觉运动相关基因两方面进行评估。（1）视觉运动能力：统计光照条件下，每尾鱼运动的总距离和总时间，将对照组和实验组进行统计学分析（Student's t test）；同理，统计并分析黑暗条件下，海水青鱂幼鱼运动的总距离和总时间。结果显示：TPhP能显著降低海水青鱂幼鱼的移动时间和移动距离，且差距超过50%，对幼鱼视觉运动具有严重影响；而PS对幼鱼的移动时间和移动距离没有影响，表明对幼鱼视觉运动无影响（图2）。此外，根据每分钟的幼鱼的移动距离和时间，绘制散点图，分析光照结束进入黑暗时的显著性差异（即第11分钟和第31分钟）。结果表明，在光照切换到黑暗的瞬间（第11分钟和31分钟），TPhP使得幼鱼移动距离显著减少，说明对视觉运动具有影响；PS没有改变幼鱼移动距离，说明对视觉运动无影响（图3）。（2）视觉运动相关基因：对比实验组和对照组幼鱼中bmp4，six3，pax6，rx3，rh1，rh2，lws，sws1和sws2基因的表达量的差异，结果显示：TPhP显著性改变了bmp4和sws2基因的表达量，说明对视觉运动相关基因有影响；PS则没有改变9个基因中任何一个基因的表达量，说明对视觉运动相关基因没有影响（图4）。
6.神经毒性分级：根据视觉运动能力和视觉运动相关基因两方面的评估结果，对TPhP和PS的神经毒性进行分级：TPhP对视觉运动能力具有严重影响，且对视觉运动相关基因具有影响，评价为：严重神经毒性；PS对视觉运动能力和视觉运动相关基因均没有影响，评价为：无神经毒性。此结果与目前对TPhP和PS神经毒性的研究相一致，说明本发明方法评价具有可靠性。
整个初步评估周期仅需要8天（其中化合物暴露7天，神经毒性检测1天）。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 闽江学院
<120> 一种利用海水青鱂幼鱼评价化合物神经毒性的方法
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
aacctcctgt ggacctgatg 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
agcaaggatc atgaccacca 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
ttcttctgcc ccatcaccat 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
aggcggtagt ccttgttctc 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
ctcagctgct agtcaccctt 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
cgaaaagcag gagggaatgg 20
Claims (2)
1.一种利用海水青鱂幼鱼评价化合物神经毒性的方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）暴露溶液的制备：将商品化海盐溶解于爆气后的自来水中，配制出盐度为30‰的洁净海水，称量适量待测试化合物，溶解于洁净海水中并搅拌均匀，使得终浓度为1-1000 μmol/L；
（2）待测化合物的暴露实验：准备灭菌过的100mm玻璃培养皿，向其中加入5mL的洁净海水的对照组、含有待测化合物的海水的实验组；选取健康活泼的14日龄海水青鱂幼鱼，置于上述玻璃培养皿中，每个培养皿中的幼鱼数量为10尾；随后进行长达7日的暴露实验，暴露期间室温控制在28℃，光照周期为12h：12h，每个培养皿中每日投喂初孵化丰年虫10-15只；
（3）视觉运动检测：准备96孔板一个，向每孔中加入300 μL的洁净海水；待7天的暴露试验结束后，使用塑料吸管小心吸取幼鱼置于96孔培养皿中，每孔中1尾幼鱼，幼鱼分配完毕后，将96孔板置于Noldus Daniovision运动轨迹记录仪内；设置仪器内光照系统：进行150lux的光照处理10分钟，快速调节至小于6lux黑暗处理10分钟，重复该过程1次；记录每尾幼鱼在共1小时检测中的游动轨迹和运动时间；
（4）视觉运动相关基因的检测：待视觉运动检测结束后，立刻从96孔板中小心吸取幼鱼置于1.5mL离心管中，对幼鱼进行总RNA提取和cDNA反转录；使用以下视觉运动相关基因的引物进行荧光定量PCR分析；记录每个基因的相对表达量；
（5）神经毒性评估：从视觉运动能力和视觉运动相关基因两方面进行评估：
1）视觉运动能力：统计光照条件下，每尾鱼运动的总距离和总时间，将对照组和实验组进行统计学分析；同理，统计并分析黑暗条件下，海水青鱂幼鱼运动的总距离和总时间；当实验组幼鱼运动的总距离和总时间比对照组高出或低于25%，且显著性分析结果为显著（p<0.05），则评价为待测试化合物对幼鱼视觉运动能力有影响；当实验组幼鱼运动的总距离和总时间比对照组高出或低于50%，且显著性分析结果为显著（p<0.05），则评价为幼鱼视觉运动能力有严重影响；此外，根据每分钟幼鱼的移动距离，绘制散点图，分析光照切换到黑暗瞬间的差别，即第11分钟和第31分钟；当在第11分钟和第31分钟，实验组幼鱼运动的距离和对照组具有显著性差异，则评价为待测试化合物对幼鱼视觉运动能力有影响；
2）视觉运动相关基因：对比实验组和对照组幼鱼中bmp4、six3、pax6、rx3、rh1、rh2、lws、sws1和sws2基因的表达量差异，并进行统计学分析，当9个待测基因中，有1个或1个以上的基因表达量出现显著性差异，则评价待测试化合物对幼鱼视觉运动相关基因有影响；
（6）神经毒性分级：根据视觉运动能力和视觉运动相关基因两方面的评估结果，对待测化合物的神经毒性进行分级：1）对视觉运动能力和视觉运动相关基因均没有影响，评价为：无神经毒性；2）对视觉运动能力和视觉运动相关基因其中之一具有影响，评价为：轻微神经毒性；3）对视觉运动能力具有影响，且对视觉运动相关基因具有影响，评价为：一般神经毒性；4）对视觉运动能力具有严重影响，且对视觉运动相关基因具有影响，评价为：严重神经毒性。
2.根据权利要求1所述的一种利用海水青鱂幼鱼评价化合物神经毒性的方法，其特征在于：所述视觉运动相关基因的引物具体如下：
bmp4：上游引物：TACGCCCTCTTCTGGTTACC，下游引物：CTATCCAGTCGTTCCAGCCT；
six3：上游引物：GACTGACCCCGACTCAAGTG，下游引物：CCGAGTCACTGTCCGTTACT；
pax6：上游引物：CAACTCCATCAGCTCGAACG，下游引物：GCTAGTCTTTCTCGCGCAAA；
rx3：上游引物：ACCCAAATGAAGAAAGCGCA，下游引物：TCCTCTCTGCTGTACACGTC；
rh1：上游引物：TGACTACTACACCCGTGCAG，下游引物：CCAAGAAGCCGATGACCATG；
rh2：上游引物：ACCTATGGCAGCCTTGTGAT，下游引物：AGAAGAAGGAAGGGATGGCC；
lws：上游引物：AACCTCCTGTGGACCTGATG，下游引物：AGCAAGGATCATGACCACCA；
sws1：上游引物：TTCTTCTGCCCCATCACCAT，下游引物：AGGCGGTAGTCCTTGTTCTC；
sws2：上游引物：CTCAGCTGCTAGTCACCCTT，下游引物：CGAAAAGCAGGAGGGAATGG。
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Cited By (2)
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| CN112293306A (zh) * | 2020-11-09 | 2021-02-02 | 闽江学院 | 一种制备无菌海水青鱂仔鱼的方法 |
| CN115747343A (zh) * | 2022-11-14 | 2023-03-07 | 吉林大学 | 一种基于青鳉鱼胚胎生物标志物的水质安全诊断方法 |
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| CN205038199U (zh) * | 2015-08-25 | 2016-02-17 | 国家海洋环境监测中心 | 海水青鳉急性毒性测试试剂盒 |
| CN106338590A (zh) * | 2016-09-22 | 2017-01-18 | 首都师范大学 | 一种基于计算机视觉监测鱼类生命体征的水质监测方法 |
| CN109633140A (zh) * | 2018-12-19 | 2019-04-16 | 中国环境科学研究院 | 一种利用斑马鱼评价全氟化合物神经发育毒性的方法 |
-
2020
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