CN112961861B - 苯嗪草酮核酸适配体及筛选和在苯嗪草酮检测上的应用 - Google Patents

苯嗪草酮核酸适配体及筛选和在苯嗪草酮检测上的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112961861B
CN112961861B CN202110254458.XA CN202110254458A CN112961861B CN 112961861 B CN112961861 B CN 112961861B CN 202110254458 A CN202110254458 A CN 202110254458A CN 112961861 B CN112961861 B CN 112961861B
Authority
CN
China
Prior art keywords
metamitron
aptamer
solution
detection
detecting
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110254458.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN112961861A (zh
Inventor
王鲁梅
黄伟文
潘超强
沈国清
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Jiaotong University
Original Assignee
Shanghai Jiaotong University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Jiaotong University filed Critical Shanghai Jiaotong University
Priority to CN202110254458.XA priority Critical patent/CN112961861B/zh
Publication of CN112961861A publication Critical patent/CN112961861A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112961861B publication Critical patent/CN112961861B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1048—SELEX
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/585—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with a particulate label, e.g. coloured latex
    • G01N33/587—Nanoparticles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/16—Aptamers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2430/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving synthetic organic compounds as analytes
    • G01N2430/20—Herbicides, e.g. DDT

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明属于化学物质检测技术领域，尤其是涉及苯嗪草酮核酸适配体及筛选和在苯嗪草酮检测上的应用；具体公开了苯嗪草酮核酸适配体、苯嗪草酮核酸适配体的筛选方法、苯嗪草酮检测用生物传感器及苯嗪草酮检测方法。与现有技术相比，本发明检测方法具有检测限低、灵敏度高、特异性强、可视化快速定性分析、样品预处理简单、仪器要求低、成本低廉的优点。本发明提供的检测方法可用于检测水样中苯嗪草酮的含量，检测的浓度范围是20‑1000nmol/L。

Description

苯嗪草酮核酸适配体及筛选和在苯嗪草酮检测上的应用
技术领域
本发明属于化学物质检测技术领域，尤其是涉及苯嗪草酮核酸适配体及筛选和在苯嗪草酮检测上的应用。
背景技术
苯嗪草酮，是一种典型的三嗪除草剂(Triazine herbicides)，三嗪类除草剂作为预防农田杂草生长的高效除草剂在世界范围内广泛使用，三嗪除草剂作为国际农业上常用的五大除草剂之一，我国从20世纪80年代初开始生产和使用，近年来已经逐渐成为我国农业农田主要除草剂品种之一。高剂量的三嗪除草剂作为灭生性除草剂，主要应用于工厂园区、交通道路、城市景观旁等非农用地除草，低剂量的三嗪除草剂作为选择性除草剂，应用于农业生产除草活动中，由于三嗪类化合物的结构有类似于苯环的结构，具有较高的沸点，化学性质稳定，能够长期存在于环境和作物中，造成环境和食品的污染，三嗪除草剂例如莠去津、西玛津和嗪草酮已被确认是一类环境内分泌干扰物质，具有类似生物激素的活性、较高的毒性持久性和生物积累性，能损害生殖机能或引发恶性肿瘤，长期接触时会导致动物卵巢癌和乳腺癌的发生。作为三嗪除草剂的典型代表之一的苯嗪草酮，对水生无脊椎动物，藻类和高等水生植物有比较强的毒理作用。如今，三嗪除草剂的市场份额仍占据全球农药市场的一定比例，在农业种植业上的应用也比较广泛。因此，除草剂大量的生产与使用必定会带来一系列环境污染的问题，考虑到三嗪除草剂的施用量较大、性质较稳定、残留时间较长，而且具有较高水溶性，使得苯嗪草酮在施用过程中会随着雨水冲刷，地表径流、漂移等方式进入地表水和地下水，可能对土壤、农作物、其他饮用水源造成污染，最终对人类健康和环境造成破坏。鉴于苯嗪草酮在环境中的较高残留性以及对生物的中度毒性，建立一个灵敏、快速的检测分析方法来实现对水环境、食物、血液、尿液中的苯嗪草酮残留的检测十分必要。
目前在环境中除草剂苯嗪草酮残留分析使用的方法主要有液相色谱法、气相色谱法、电化学法、毛细管电泳法、红外吸收光谱法等，但其对于设备，专业知识，检测时间的要求较高，且并不适用于现场快速检测等缺点。这些方法多数样品处理复杂，分析仪器昂贵，一些方法检测灵敏度低。因此，目前的传统检测苯嗪草酮的分析方法存在的局限性，难以实现对苯嗪草酮的快速、实时、有效、简便的定性和定量的分析，因此，研发出一项造价便宜、实时快速、简便易行、高效准确、运行稳定的苯嗪草酮检测技术是当今分析工作者迫切需要解决的问题。
发明内容
针对现有技术中苯嗪草酮检测技术存在的缺陷，本发明提供苯嗪草酮核酸适配体及筛选和在苯嗪草酮检测上的应用，具体包括苯嗪草酮核酸适配体、苯嗪草酮核酸适配体的筛选方法、苯嗪草酮检测用生物传感器及苯嗪草酮检测方法。
本发明中以核酸适配体为核心所构建的生物传感器，为今后在复杂的环境介质中定性定量分析苯嗪草酮提供了便捷。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明首先提供一种苯嗪草酮核酸适配体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。具体为：
5’-CGTACGGTCGACGCTAGCTTATCGCGCCCCTAGTAGTGTGGCCTGGGCGTCTAGTCGCTATCCAGCGCTAGCCTGGGCACGTGGAGCTCGGATCC-3’
本发明提供的苯嗪草酮核酸适配体具有以下特性：
(1)高亲和力
所得到的适配体具有高亲和力：16nM；
(2)高特异性
在苯嗪草酮相似物存在时，该适配体对苯嗪草酮表现出良好的选择性。
本发明提供的苯嗪草酮核酸适配体是基于磁珠SELEX法筛选得到的与苯嗪草酮高亲和力、高特异性结合的核酸适配体。
本发明还提供苯嗪草酮核酸适配体的筛选方法，包括以下步骤：
(1)苯嗪草酮和羧基磁珠的偶联：
通过2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯与N,N-二异丙基乙胺在N，N-二甲基甲酰胺溶液体系下催化羧基磁珠的羧基与苯嗪草酮的氨基发生酰胺化反应，形成酰胺键，从而实现苯嗪草酮偶联固定到羧基磁珠上；
(2)采用不对称PCR扩增技术得到次级文库，并通过磁珠SELEX筛选过程，得到与苯嗪草酮高亲和力，高特异性结合的适配体序列：
采用不对称PCR扩增技术，通过设置PCR循环程序和前后引物投入的比例，使筛选回收得到的ssDNA产物得到大量的扩增和富集，以制备筛选过程所需的次级文库，通过磁珠SELEX筛选过程，得到与苯嗪草酮高亲和力，高特异性结合的适配体序列。
在本发明的一个实施方式中，步骤(1)中，所述羧基磁珠可以选用商用产品。
在本发明的一个实施方式中，步骤(1)中，所述苯嗪草酮、羧基磁珠、2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯、N,N-二异丙基乙胺、N，N-二甲基甲酰胺之间的用量关系及操作为：
制备10-10.416mg/ml的2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯在N，N-二甲基甲酰胺体系下的溶液。同时以1：49的比例制备N，N-二异丙基乙胺在N，N-二甲基甲酰胺体系下的溶液，吸打混匀。分别吸取30μL 2-7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯溶液，21.9μL N，N-二异丙基乙胺溶液加入到上述已清洗好的羧基磁珠中，混匀，25℃搅拌1-2h。分别称取苯嗪草酮10mg溶解于1236μL N，N-二甲基甲酰胺，吸取30μL上述苯嗪草酮溶液(嗪草酮溶液)，加入到2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯、N，N-二异丙基乙胺与羧基磁珠混合的羧基磁珠溶液中，吸打混匀，放置摇床内，设置摇床条件为100-200rpm，25℃，反应24h。反应结束后，小心吸取上清并收集，再次用N，N-二甲基甲酰胺溶液清洗磁珠5次，随后使用结合缓冲液清洗5次，最后将偶联好的羧基磁珠悬浮在100μL结合缓冲液，置于4℃冷藏保存待用。
在本发明的一个实施方式中，步骤(1)中苯嗪草酮和羧基磁珠的偶联具体方法包括以下步骤：
(1.1)、取羧基磁珠，使用N，N-二甲基甲酰胺对羧基磁珠进行多次超声清洗；
(1.2)、称取2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯溶解于N，N-二甲基甲酰胺中，称取N,N-二异丙基乙胺溶解于N，N-二甲基甲酰胺中；
分别吸取2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯溶液，N，N-二异丙基乙胺溶液加入到已清洗好的羧基磁珠中，混匀，搅拌，得到2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯、N，N-二异丙基乙胺与羧基磁珠混合的羧基磁珠溶液；
称取苯嗪草酮溶解于N，N-二甲基甲酰胺，得到苯嗪草酮溶液，称取苯嗪草酮溶液，加入到2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯、N，N-二异丙基乙胺与羧基磁珠混合的羧基磁珠溶液中，吸打混匀，进行反应，反应结束后，得到与苯嗪草酮相偶联的羧基磁珠，吸取上清并收集，再次用DMF溶液清洗与苯嗪草酮相偶联的羧基磁珠多次，随后使用结合缓冲液清洗多次，最后将与苯嗪草酮相偶联的羧基磁珠悬浮在结合缓冲液，冷藏保存待用。
在本发明的一个实施方式中，步骤(1.2)中，反应的条件为：100-200rpm，25-30℃，反应12-24h。
在本发明的一个实施方式中，步骤(2)采用不对称PCR扩增技术得到次级文库，并通过磁珠SELEX筛选过程，得到与苯嗪草酮高亲和力，高特异性结合的适配体序列包括以下步骤：
(2.1)、称取ssDNA文库，加入结合缓冲液，吸打混匀，放置于95℃条件下变性6min，随后迅速转移置冰块上10min，最后在室温25℃条件下静置5min；
(2.2)、称取与苯嗪草酮相偶联的羧基磁珠，加入结合缓冲液，使用结合缓冲液对与苯嗪草酮相偶联的羧基磁珠溶液进行多次清洗；
(2.3)、将做过预处理的ssDNA文库与预处理好的靶标物与苯嗪草酮相偶联的羧基磁珠溶液相混合，进行反应；
(2.4)、孵育结束后，吸取出上清液，加入结合缓冲液，对磁珠溶液进行清洗；
(2.5)、筛选体系中加入洗脱缓冲液，进行洗脱，使ssDNA从磁珠上洗脱下来，收集洗脱液；
(2.6)、采用乙醇沉淀法，浓缩提纯收集得到的洗脱液中的ssDNA：
吸取洗脱液，加入醋酸钠溶液，加入-20℃预冷的乙醇，充分混匀，放置于-20℃冰箱里反应，随后在离心处理，再用乙醇洗涤沉淀，得到ssDNA，最后溶于超纯水中；
(2.7)、通过超微量分光光度计测量回收得到的溶液中ssDNA浓度，并计算筛选效率，筛选效率以回收浓度/投入浓度来计算；
(2.8)、以纯化后的ssDNA溶液作为模板，进行不对称PCR扩增，随后取PCR反应液进行3％琼脂糖凝胶电泳，并置于凝胶成像分析系统下观察，若出现正确的目的条带，通过对该PCR产物进行浓度测定，计算出作为下一轮文库所需的量，投入到下一轮的筛选循环中；
(2.9)、重复步骤(2.1)-(2.8)，历经多轮，送样测序，得到苯嗪草酮核酸适配体。
在本发明的一个实施方式中，步骤(2.1)所述的ssDNA文库：为生工生物工程(上海)股份有限公司所合成的单链DNA，其序列为：5’-CGTACGGTCGACGCTAGC-N60-CACGTGGAGCTCGGATCC-3’。
在本发明的一个实施方式中，步骤(2.1)、(2.2)中所述的结合缓冲液，其配置方法为：准确称取NaCl 1.461g、Tris-HCl 0.788g、MgCl2·6H2O 0.102g、KCl 0.093g、CaCl20.028g于烧杯中，加入100mL超纯水溶解，吸取Tween 20 50μL加入，随后加入超纯水至220mL，使用NaOH溶液调节pH至7.6补充溶液至250mL；或采用等比例配制的溶液。
在本发明的一个实施方式中，步骤(2.5)中所述的洗脱缓冲液，其配置方法为：准确秤取Tris-HCl 0.631g、EDTA·2Na·2H2O 0.372g、Urea 21.02g于烧杯中，加入50mL超纯水溶解，移液枪吸取Tween 20 20μL加入，随后加入超纯水至80mL，使用NaOH调节pH至8.0补充溶液至100mL；或采用等比例配制的溶液。
在本发明的一个实施方式中，步骤(2.8)中PCR反应的反应体系按以下方法配制：
不对称PCR反应体系为50μL，引物投入比例为上游引物：下游引物＝1:100；所设置的PCR的反应体系为ssDNA模板3μL，上游引物0.5μM 1μL，下游引物500μM 1μL，2×HiFiTaqPCR StarMix with Dye 25μL以及超纯水22μL。
在本发明的一个实施方式中，步骤(2.8)中，进行不对称PCR扩增时，上游引物序列：5’-GGATCCGAGCTCCACGTG-3’，序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物序列：5’-CGTACGGTCGACGCTAGC-3’，序列如SEQ ID NO.3所示。
在本发明的一个实施方式中，步骤(2.8)中，进行不对称PCR扩增时，PCR循环程序为95℃预变性5min，历经35个循环，95℃变性50s，57℃退火50s，72℃延伸50s，循环结束后72℃延伸5min。
本发明还提供苯嗪草酮核酸适配体的应用，包括所述苯嗪草酮核酸适配体在制备苯嗪草酮检测试剂、苯嗪草酮检测试剂盒或苯嗪草酮检测生物传感器上的应用。
本发明还提供苯嗪草酮核酸适配体的应用，包括所述苯嗪草酮核酸适配体在制备苯嗪草酮捕获、分离或纯化试剂上的应用。
本发明还提供苯嗪草酮核酸适配体的应用，包括所述苯嗪草酮核酸适配体在开发苯嗪草酮检测方法上的应用。
本发明还提供一种苯嗪草酮检测用生物传感器，所述生物传感器以苯嗪草酮核酸适配体为生物识别元件，所述苯嗪草酮核酸适配体核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。具体为：
5’-CGTACGGTCGACGCTAGCTTATCGCGCCCCTAGTAGTGTGGCCTGGGCGTCTAGTCGCTATCCAGCGCTAGCCTGGGCACGTGGAGCTCGGATCC-3’。
在本发明的一个实施方式中，所述生物传感器为荧光法生物传感器或电化学法生物传感器。
本发明还提供一种苯嗪草酮检测方法，基于所述苯嗪草酮核酸适配体进行。本发明苯嗪草酮检测方法能够解决现有技术中检测苯嗪草酮的方法存在的机器昂贵、操作复杂、周期较长的缺点以及不稳定性等技术问题。
本发明苯嗪草酮检测方法，包括以下步骤：
A、准备苯嗪草酮核酸适配体，所述苯嗪草酮核酸适配体核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示；
B、在一定量所述苯嗪草酮核酸适配体溶液中加入纳米金溶液，混匀孵育，使得所述苯嗪草酮核酸适配体包裹在纳米金的表面，再加入待测苯嗪草酮的水溶液和3-丙磺酸缓冲液，混匀孵育，加入氯化钠溶液，混匀后在520nm和650nm波长处测定紫外吸收强度(A650和A520)，依据紫外吸收强度计算A650/A520的大小来判断待测溶液中苯嗪草酮的含量。
在本发明的一个实施方式中，步骤(A)中所述苯嗪草酮核酸适配体配置为500nM的母液。
在本发明的一个实施方式中，步骤(B)中所述的氯化钠配制成浓度为2mol/L的母液；
在本发明的一个实施方式中，步骤(B)中所述的3-丙磺酸缓冲液可以采用常规实验方法来配置。
在本发明的一个实施方式中，步骤(B)中1M NaOH溶液可以采用常规实验方法来配置。
在本发明的一个实施方式中，步骤(B)所述的纳米金可以采用常规方法制备得到。
在检测体系中对加入NaCl，核酸适配体的终浓度及检测体系的pH,温度进行梯度优化后得到最优的检测条件：NaCl最优终浓度为120nM，核酸适配体最优终浓度为16nM，检测体系最优pH为7，检测体系最优温度为25℃。
本发明的原理是当体系中存在苯嗪草酮时，包裹在纳米金上的适配体会与苯嗪草酮特异性结合，从而释放出游离的纳米金，加入氯化钠盐溶液之后，游离的纳米金产生聚集。分散和聚集的纳米金显示不同的颜色并具有不同的紫外吸收峰。AuNPs呈分散状态时，溶液夜色为红色，在520nm处有最大吸收峰，产生较小的吸光度A650/A520比值，AuNPs发生聚集时，溶液颜色由红色变为蓝色，导致溶液的最强吸收峰转移至650nm，吸光度A650/A520比值增大。并且体系中苯嗪草酮的含量与A650/A520比值呈正比关系。
在各种信号表达的方法中，比色法是一种简单、快速、灵敏的检测方法。本发明提供了一种操作简单、灵敏度高、选择性好、成本低且高效的苯嗪草酮的检测方法。
本发明提供了一种除草剂苯嗪草酮的核酸适配体及一种快速检测方法。通过建立磁珠SELEX体系，投入初始适配体文库，进行孵育，分离，洗脱，PCR循环过程，经过多轮筛选得到对靶标分子苯嗪草酮具有高亲和力的核酸适配体，并基于该核酸适配体构建NaCl高效聚集纳米金的比色方法来实现对除草剂苯嗪草酮的检测。通过将筛选所得到的苯嗪草酮的适配体与纳米金溶液混合，使得苯嗪草酮适配体包裹在纳米金的表面，当体系中存在苯嗪草酮时，包裹在纳米金上的适配体会与苯嗪草酮特异性结合，从而释放出游离的纳米金，加入氯化钠盐溶液之后，游离的纳米金产生聚集。分散和聚集的纳米金显示不同的颜色并具有不同的紫外吸收峰。AuNPs呈分散状态时，溶液夜色为红色，在520nm处有最大吸收峰，产生较小的吸光度A650/A520比值，AuNPs发生聚集时，溶液颜色由红色变为蓝色，导致溶液的最强吸收峰转移至650nm，吸光度A650/A520比值增大。并且体系中苯嗪草酮的含量与A650/A520比值呈正比关系。该检测方法具有检测限低、灵敏度高、特异性强、可视化快速定性分析、样品预处理简单、仪器要求低、成本低廉的优点。
和已有对苯嗪草酮的检测技术相比，本发明技术进步是显著的。本发明提供的检测方法不需要大型仪器设备，成本低，检测灵敏度高，选择性好，操作简单且高效，可用于检测水样中苯嗪草酮的含量，检测的浓度范围是20-1000nmol/L，线性拟合直线方程为Y＝0.00030875X+0.03813，最低检测限为0.51nM。线性方程中X代表检测样本中苯嗪草酮的浓度(nM)，Y代表样本A650/A520比值。
附图说明
图1：磁珠SELEX法筛选苯嗪草酮核酸适配体原理示意图；
图2：基于NaCl的纳米金比色法检测苯嗪草酮原理示意图；
图3：不对称PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；
图4：变性后不对称PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；
图5：SELEX的筛选ssDNA回收效率；
图6：苯嗪草酮核酸适配体的解离常数Kd值测定；
图7：不同条件下纳米金的动态纳米粒径分析(A)和透射电镜分析(B)；
图8：NaCl浓度的优化结果示意图；
图9：核酸适配体浓度的优化结果示意图；
图10：反应体系pH的优化结果示意图；
图11：反应体系温度的优化结果示意图；
图12：苯嗪草酮检测体系的灵敏度结果示意图；
图13：苯嗪草酮检测体系的特异性结果示意图。
具体实施方式
本发明首先提供磁珠SELEX法筛选苯嗪草酮核酸适配体的方法，包括以下步骤：
(1)苯嗪草酮和羧基磁珠的偶联：
通过2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯与N,N-二异丙基乙胺在N，N-二甲基甲酰胺溶液体系下催化羧基磁珠的羧基与苯嗪草酮的氨基发生酰胺化反应，形成酰胺键，从而实现苯嗪草酮偶联固定到羧基磁珠上；
(2)采用不对称PCR扩增技术得到次级文库，并通过磁珠SELEX筛选过程，得到与苯嗪草酮高亲和力，高特异性结合的适配体序列：
采用不对称PCR扩增技术，通过设置PCR循环程序和前后引物投入的比例，使筛选回收得到的ssDNA产物得到大量的扩增和富集，以制备筛选过程所需的次级文库，通过磁珠SELEX筛选过程，得到与苯嗪草酮高亲和力，高特异性结合的适配体序列。
在本发明的一个实施方式中，步骤(1)的方法包括以下步骤：
(1.1)、取羧基磁珠，使用N，N-二甲基甲酰胺对羧基磁珠进行多次超声清洗；
(1.2)、称取2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯溶解于N，N-二甲基甲酰胺中，称取N,N-二异丙基乙胺溶解于N，N-二甲基甲酰胺中；
分别吸取2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯溶液，N，N-二异丙基乙胺溶液加入到已清洗好的羧基磁珠中，混匀，搅拌，得到2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯、N，N-二异丙基乙胺与羧基磁珠混合的羧基磁珠溶液；
称取苯嗪草酮溶解于N，N-二甲基甲酰胺，得到苯嗪草酮溶液，称取苯嗪草酮溶液，加入到2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯、N，N-二异丙基乙胺与羧基磁珠混合的羧基磁珠溶液中，吸打混匀，进行反应，反应结束后，得到与苯嗪草酮相偶联的羧基磁珠，吸取上清并收集，再次用DMF溶液清洗与苯嗪草酮相偶联的羧基磁珠多次，随后使用结合缓冲液清洗多次，最后将与苯嗪草酮相偶联的羧基磁珠悬浮在结合缓冲液，冷藏保存待用。
在本发明的一个实施方式中，步骤(1.2)中，反应的条件为：160rpm，25℃，反应24h。
在本发明的一个实施方式中，步骤(2)采用不对称PCR扩增技术得到次级文库，并通过磁珠SELEX筛选过程，得到与苯嗪草酮高亲和力，高特异性结合的适配体序列包括以下步骤：
(2.1)、称取ssDNA文库，加入结合缓冲液，吸打混匀，放置于95℃条件下变性6min，随后迅速转移置冰块上10min，最后在室温25℃条件下静置5min；
(2.2)、称取与苯嗪草酮相偶联的羧基磁珠，加入结合缓冲液，使用结合缓冲液对与苯嗪草酮相偶联的羧基磁珠溶液进行多次清洗；
(2.3)、将做过预处理的ssDNA文库与预处理好的靶标物与苯嗪草酮相偶联的羧基磁珠溶液相混合，进行反应；
(2.4)、孵育结束后，吸取出上清液，加入结合缓冲液，对磁珠溶液进行清洗；
(2.5)、筛选体系中加入洗脱缓冲液，进行洗脱，使ssDNA从磁珠上洗脱下来，收集洗脱液；
(2.6)、采用乙醇沉淀法，浓缩提纯收集得到的洗脱液中的ssDNA：
吸取洗脱液，加入醋酸钠溶液，加入-20℃预冷的乙醇，充分混匀，放置于-20℃冰箱里反应，随后在离心处理，再用乙醇洗涤沉淀，得到ssDNA，最后溶于超纯水中；
(2.7)、通过超微量分光光度计测量回收得到的溶液中ssDNA浓度，并计算筛选效率，筛选效率以回收浓度/投入浓度来计算；
(2.8)、以纯化后的ssDNA溶液作为模板，进行不对称PCR扩增，随后取PCR反应液进行3％琼脂糖凝胶电泳，并置于凝胶成像分析系统下观察，若出现正确的目的条带，通过对该PCR产物进行浓度测定，计算出作为下一轮文库所需的量，投入到下一轮的筛选循环中；
(2.9)、重复步骤(2.1)-(2.8)，历经多轮，送样测序，得到苯嗪草酮核酸适配体。
本发明磁珠SELEX法筛选苯嗪草酮核酸适配体原理示意图如图1所示。
本发明还提供一种苯嗪草酮检测方法，基于苯嗪草酮核酸适配体进行。包括以下步骤：
A、准备苯嗪草酮核酸适配体，所述苯嗪草酮核酸适配体核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示；
B、在一定量所述苯嗪草酮核酸适配体溶液中加入纳米金溶液，混匀孵育，使得所述苯嗪草酮核酸适配体包裹在纳米金的表面，再加入待测苯嗪草酮的水溶液和3-丙磺酸缓冲液，混匀孵育，加入氯化钠溶液，混匀后在520nm和650nm波长处测定紫外吸收强度(A650和A520)，依据紫外吸收强度计算A650/A520的大小来判断待测溶液中苯嗪草酮的含量。
基于NaCl的纳米金比色法检测苯嗪草酮原理示意图如图2所示。
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
本实施例提供苯嗪草酮核酸适配体的筛选与获得方法，包括以下步骤：
A.移液枪吸取100μL羧基磁珠于1.5mL离心管中，放置在磁性分离架上，静置2min，小心吸取上清液并弃去。随后取出离心管，加入100μL超纯水，吸打混匀，放置在磁性分离架上，静置2min，小心吸取上清液并弃去。离心管加入100μLN，N-二甲基甲酰胺溶液，吸打混匀，放入超声震荡仪中超声清洗20min，再重复该步骤，使用N，N-二甲基甲酰胺对羧基磁珠进行清洗，5次清洗后，小心吸取上清液并弃去。
B.分子分析天平称取2mg2-7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯溶解于0.219mLN，N-二甲基甲酰胺，移液枪吸取20μLN，N-二异丙基乙胺溶解于980μLN，N-二甲基甲酰胺，吸打混匀。分别吸取30μL2-7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯溶液，21.9μLN，N-二异丙基乙胺溶液加入到上述已清洗好的羧基磁珠中，混匀，25℃搅拌2h。电子分析天平分别称取苯嗪草酮10mg溶解于1236μLN，N-二甲基甲酰胺，移液枪吸取30μL上述苯嗪草酮溶液(嗪草酮溶液)，加入到2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯、N，N-二异丙基乙胺与羧基磁珠混合的羧基磁珠溶液中，吸打混匀，放置摇床内，设置摇床条件为160rpm，25℃，反应24h。反应结束后，小心吸取上清并收集，再次用DMF溶液清洗磁珠5次，随后使用结合缓冲液清洗5次，最后将偶联好的羧基磁珠悬浮在100μL结合缓冲液，置于4℃冷藏保存待用。
C.移液枪吸取500pmol的ssDNA文库于1.5mL离心管中，加入200μL结合缓冲液，吸打混匀。放置于95℃条件下变性6min，随后迅速转移置冰块上10min，最后在室温25℃条件下静置5min。
D.吸取与嗪草酮相偶联的羧基磁珠(B步骤所制备)100μL于1.5mL离心管中，加入200μL结合缓冲液，吸打混匀，放置在磁性分离架上，静置2min，小心吸取上清。使用结合缓冲液对磁珠溶液进行重复5的清洗，最后一步，弃去上清液。
E.将步骤(C)中做过预处理的ssDNA文库与步骤(D)预处理好的靶标物嗪草酮包被的磁珠溶液相混合，随后置于摇床上反应30min，摇床条件为160rpm，25℃。
F.孵育结束后，小心吸取出上清液。随后加入200μL结合缓冲液，通过磁性分离架，对磁珠溶液进行5次的清洗，最后一步，弃去结合缓冲液。
G.筛选体系中加入200μL洗脱缓冲液，在80℃的水浴条件下进行洗脱，使ssDNA从磁珠上洗脱下来，将离心管置于置于磁性分离架上，收集洗脱液。
H.重复步骤(G)4次，收集洗脱液，并将所有洗脱液合并。
I.采用乙醇沉淀法，浓缩提纯收集得到的洗脱液中的ssDNA。吸取400μL洗脱液于2mL离心管中，加入40μL醋酸钠溶液(3M，PH＝5.2)，充分混匀。加入1mL-20℃预冷的乙醇，充分混匀，放置于-20℃冰箱里30min。随后在12000rpm，4℃条件下离心10min，小心吸取上清液(包括管壁上的液滴)并弃去。再加入1.5mL 70％的乙醇，洗涤沉淀，在12000rpm，4℃条件下离心2min，小心吸取上清液(包括管壁上的液滴)并弃去，重复该洗涤过程两次。将得到白色沉淀，置于25℃无菌培养箱中晾干，最后溶于20μL超纯水中。
J.通过NanoDrop 2000超微量分光光度计测量回收得到的溶液中ssDNA浓度，并计算筛选效率(回收浓度/投入浓度)。
K.以纯化后的ssDNA溶液作为模板，进行不对称PCR扩增，随后取5μL PCR反应液进行3％琼脂糖凝胶电泳，并置于凝胶成像分析系统下观察，若出现正确的目的条带，可通过对该PCR产物进行浓度测定，计算出作为下一轮文库所需的量，投入到下一轮的筛选循环中。
L.重复步骤C-K，历经10轮左右，送样测序。
本实施例中，所述羧基磁珠选用生工生物工程(上海)股份有限公司的商用产品，(货号：D110550-0100)。
步骤C所述的ssDNA文库：为生工合成的单链DNA，其序列为：5’-CGTACGGTCGACGCTAGC-N60-CACGTGGAGCTCGGATCC-3’。
步骤D所述的结合缓冲溶液，其配置方法为：准确称取NaCl 1.461g、Tris-HCl0.788g、MgCl2·6H2O 0.102g、KCl 0.093g、CaCl2 0.028g于烧杯中，加入100mL超纯水溶解，移液枪吸取Tween 20 50μL加入，随后加入超纯水至220mL，使用NaOH溶液调节pH至7.6补充溶液至250mL。
步骤G所述的结合缓冲溶液，其配置方法为：准确秤取Tris-HCl 0.631g、EDTA·2Na·2H2O 0.372g、Urea 21.02g于烧杯中，加入50mL超纯水溶解，移液枪吸取Tween 20 20μL加入，随后加入超纯水至80mL，使用NaOH调节pH至8.0补充溶液至100mL。
步骤I所述的醋酸钠溶液，其配置方法为：称取三水醋酸钠81.6g于烧杯中，加入100mL超纯水溶解，使用冰醋酸调节pH至5.2，再补充超纯水至200mL。
进一步步骤I所述的70％的乙醇溶液，其配置方法为：300mL的乙醇溶液，加入700mL的超纯水，使总体积为1000mL。
步骤K所述的PCR反应的反应体系按以下方法配制：不对称PCR反应体系为50μL，引物投入比例为上游引物：下游引物＝1:100(上游引物序列：5’-GGATCCGAGCTCCACGTG-3’、下游引物序列：5’-CGTACGGTCGACGCTAGC-3’)。所设置的PCR的反应体系为ssDNA模板3μL，上游引物(0.5μM)1μL，下游引物(500μM)1μL，2×HiFiTaq PCR StarMix with Dye 25μL以及超纯水22μL。进一步PCR循环程序为95℃预变性5min，历经35个循环，95℃变性50s，57℃退火50s，72℃延伸50s，循环结束后72℃延伸5min。
本实施例中，不对称PCR产物琼脂糖凝胶电泳图如图3所示，变性后不对称PCR产物琼脂糖凝胶电泳图如图4所示。本实施例中，SELEX的筛选ssDNA回收效率如图5所示，苯嗪草酮核酸适配体的解离常数Kd值测定如图6所示。
用上述磁珠SELEX技术所得到的核酸适配体，其碱基序列为5’-CGTACGGTCGACGCTAGCTTATCGCGCCCCTAGTAGTGTGGCCTGGGCGTCTAGTCGCTATCCAGCGCTAGCCTGGGCACGTGGAGCTCGGATCC-3’。
该核酸适配体具有以下特性：
(1)高亲和力
所得到的适配体具有高亲和力：16nM；
(2)高特异性
在苯嗪草酮相似物存在时，该适配体对苯嗪草酮表现出良好的选择性。
本实施例中，苯嗪草酮核酸适配体为一段功能核苷酸序列，该序列由上海生工合成，将合成的核酸适配体离心之后加入合成报告中所述超纯水，振荡混匀，配制成500nM的母液。
实施例2
本实施例提供苯嗪草酮检测方法，包括以下步骤：
A、利用实施例1所得苯嗪草酮核酸适配体，配置为500nM的母液。
B、在一定量所述苯嗪草酮核酸适配体溶液中加入纳米金溶液，混匀孵育，使得所述苯嗪草酮核酸适配体包裹在纳米金的表面，再加入待测苯嗪草酮的水溶液和3-丙磺酸缓冲液，混匀孵育，加入氯化钠溶液，混匀后在520nm和650nm波长处测定紫外吸收强度(A650和A520)，依据紫外吸收强度计算A650/A520的大小来判断待测溶液中苯嗪草酮的含量，且ΔF值＝A650/A520。
本实施例中，步骤(B)中所述的氯化钠配制成浓度为2mol/L的母液；
步骤(B)中所述的3-丙磺酸缓冲液配置方法为：准确称取1.0463g 3-吗啉丙磺酸固体于烧杯中，加入400mL超纯水溶解，使用1M NaOH溶液调节缓冲液pH至7.0，随后转移置100mL容量瓶并定容。置于具塞广口瓶中，常温保存。
步骤(B)中1M NaOH溶液配置方案为：称取4.000g氢氧化钠固体于烧杯中，加入超纯水溶解，转移置100mL容量瓶并定容，即可得到1M氢氧化钠溶液，常温保存。
步骤(B)所述的纳米金通过以下方法制备：在100mL煮沸的质量百分比浓度为0.01％的氯金酸溶液中，加入3.5mL质量百分比浓度为1％的柠檬酸三钠溶液，搅拌30分钟，移除加热装置后继续搅拌混合物10分钟，最后，使溶液达到室温并且使用0.2μm超滤膜过滤，然后储存在恒温为4℃的黑色玻璃瓶中备用。
本实施例中，具体检测苯嗪草酮的方法，还包括以下步骤：
(1)首先移液枪吸取将16μL核酸适配体溶液(500nM)于1.5mL离心管中，加入待检测的含苯嗪草酮溶液，使苯嗪草酮在体系中的终浓度为在1000nM以下，吸打混匀，随后加入3-丙磺酸缓冲液(pH＝7)补充体系溶液体积至270μL，置于25℃恒温孵育器，反应30min。之后，加入200μL AuNPs溶液，吸打混匀，25℃恒温孵育30min。最后，加入30μL NaCl溶液(2M)，吸打混匀，25℃恒温孵育10min。孵育结束后，移液枪移取200μL反应液于96孔酶标板中，通过酶标仪分别测定溶液在650nm和520nm处的吸光度值(A650和A520)。
(2)根据计算所得的ΔF值，查标准曲线，可以求得样品中苯嗪草酮含量。
不同条件下纳米金的动态纳米粒径分析(A)和透射电镜分析(B)如图7所示，可以看出，分散和聚集的纳米金显示不同的颜色并具有不同的紫外吸收峰。AuNPs呈分散状态时，溶液夜色为红色，在520nm处有最大吸收峰，产生较小的吸光度A650/A520比值，AuNPs发生聚集时，溶液颜色由红色变为蓝色，导致溶液的最强吸收峰转移至650nm，吸光度A650/A520比值增大。并且体系中苯嗪草酮的含量与A650/A520比值呈正比关系。
实施例3
基于实施例2的方法，本实施例优化体系中氯化钠浓度
移液枪吸取200μL 3-丙磺酸缓冲液(PH为7.0)于1.5mL离心管中，加入200μLAuNPs，随后分别加入体积梯度为体积为0，5，10，15，20，25，30，35，40，45μL的2M NaCl标准溶液，最后使用3-丙磺酸缓冲液补充体系总体积为500μL，其中NaCl溶液在体系内的终浓度分别为0，20，40，60，80，100，120，140，160，180mM。在25℃下，孵育30min。孵育结束后，移液枪吸取200μL反应液于96孔微量酶标板中，使用酶标仪分别测定样品溶液520nm和650nm波长下的吸光度值。以上实验重复三次。计算出吸光度比值A650/A520，并以A650/A520为纵坐标，NaCl终浓度为横坐标建立工作曲线。能使吸光度比值A650/A520达到最高点，即AuNPs的聚集程度达到最大，且后续的值不再增长的NaCl浓度即为最优的浓度。如图8所示。
实施例4
基于实施例2的方法，本实施例优化体系中适配体浓度
核酸适配体浓度的优化实验需设置两组实验，分别为：实验组(A)体系中存在1μM靶标分子苯嗪草酮，空白组(A0)体系中不存在苯嗪草酮，两组的区别仅在于靶标物质的有无。具体步骤为：首先，移液枪吸取200μL3-丙磺酸缓冲液于1.5mL离心管中，加入1μM苯嗪草酮(对照组用相同体积3-丙磺酸缓冲液代替)，随后加入0，4，6，8，10，12，14，16μL的500nM核酸适配体溶液，其终浓度分别为0，4，6，8，10，12，14，16nM，25℃孵育30min。接着加入200μLAuNPs溶液，25℃孵育30min。最后加入优化浓度的NaCl溶液，25℃孵育10min。移液枪吸取200μL反应液于96孔微量酶标板中，使用酶标仪分别测定样品溶液520nm和650nm波长下的吸光度值。以上实验重复3次。分别计算得到实验组和空白组的A650/A520，以及它们的差值ΔA＝A-A0，以A，A0，ΔA为纵坐标，核酸适配体的终浓度为横坐标建立工作曲线。能使吸光度比值ΔA达到最高点，即实验组能够获得最大灵敏度的临界点，该核酸适配体浓度即为最优的浓度。如图9所示。
实施例5
基于实施例2的方法，本实施例优化体系pH
将实例3中检测体系的3-丙磺酸缓冲液的pH分别设置为3、4、5、6、7，随后体系中加入已优化浓度的核酸适配体和苯嗪草酮，实验步骤和判定方法与实例3相同。选取能够使ΔA达到最大值的pH值作为检测体系的最优pH。如图10所示。
实施例6
基于实施例2的方法，本实施例优化体系温度
将反应体系的孵育温度分别设置为20℃、25℃、30℃、35℃、40℃，实验步骤和判定方法同实例3。ΔA达到最大值对应的温度即作为检测体系的最优温度。如图11所示。
实施例7
本实施例提供一种利用纳米金比色法检测苯嗪草酮的方法，具体步骤如下：
(1)首先移液枪吸取将16μL核酸适配体溶液(500nM)于1.5mL离心管中，加入加入体积分别为0、2、4、6、8、10、20、30、40、50、100μL的苯嗪草酮溶液(10μM)，吸打混匀，随后加入MOPS缓冲液(pH＝7)补充体系溶液体积至270μL，置于25℃恒温孵育器，反应30min。之后，加入200μL AuNPs溶液，吸打混匀，25℃恒温孵育30min。最后，加入30μL NaCl溶液(2M)，吸打混匀，25℃恒温孵育10min。孵育结束后，移液枪移取200μL反应液于96孔酶标板中，通过酶标仪分别测定溶液在650nm和520nm处的吸光度值(A650和A520)。
(2)以不同浓度苯嗪草酮与对应增强的A650/A520作图，绘制标准曲线。如图12所示。
(3)制备样品检测体系：取10μL待测样品，加入到步骤(1)方法制备的检测体系离心管中替代(1)中的苯嗪草酮溶液。按上述步骤处理后测定A650/A520。
(4)根据计算所得的A650/A520值，查标准曲线，可以求得样品中苯嗪草酮含量。
(5)验证：用本发明方法测定含苯嗪草酮浓度分别为100nmol/L、200nmol/L、和300nmol/L的水样(自来水，河水，湖水)各一份，得到的平均回收率范围为100.49％-107.83％，从而证明了本方法的可靠性。如表1-表3所示。
(6)采用本发明的方法测定水样中苯嗪草酮的浓度范围为20-1000nmol/L，线性拟合直线方程为Y＝0.00030875X+0.03813，最低检测限为0.51nM。线性方程中X代表检测样本中苯嗪草酮的浓度(nM)，Y代表样本A650/A520比值，最低检测限为0.51nmol/L。
表1自来水样中的加标回收
Figure BDA0002967443520000161
表2河水水样中的加标回收
Figure BDA0002967443520000162
表3湖水水样中的加标回收
Figure BDA0002967443520000171
实施例8
本实施例提供苯嗪草酮的特异性实验
在反应体系的特异性探究实验中，选用了五氯硝基苯、氟虫腈、腐霉利、噻唑酮、氟氯氰菊酯、哒螨灵、甲霜灵、异菌脲、丁草胺市面上常见的以及在农业生产活动中被广泛使用的农药。具体实验步骤如下：移液枪吸取将16μL核酸适配体溶液(500nM)于1.5mL离心管中，加入体积分别为50μL的苯嗪草酮溶液(10μM)，使苯嗪草酮在体系中的终浓度为1μM，吸打混匀，随后加入3-丙磺酸缓冲液(pH＝7)补充体系溶液体积至270μL，25℃恒温孵育30min。之后，加入200μL AuNPs溶液，吸打混匀，25℃恒温孵育30min。最后，加入30μL NaCl溶液(2M)，吸打混匀，25℃恒温孵育10min。移液枪移取200μL反应液于96孔酶标板中，通过酶标仪分别测定溶液的A650和A520，对检测体系的特异性进行评价。将体系中的10μM苯嗪草酮溶液替换成同浓度的干扰物，其余与上述实验步骤相同，测定各反应液的A650和A520，记录溶液的颜色变化。同时设置空白组，以超纯水代替靶标分子，通过比较各个样品溶液对应的吸光度比值ΔA，对检测体系进行特异性评价。如图13所示。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 上海交通大学
<120> 苯嗪草酮核酸适配体及筛选和在苯嗪草酮检测上的应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 95
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgtacggtcg acgctagctt atcgcgcccc tagtagtgtg gcctgggcgt ctagtcgcta 60
tccagcgcta gcctgggcac gtggagctcg gatcc 95
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggatccgagc tccacgtg 18
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgtacggtcg acgctagc 18

Claims (5)

1.一种苯嗪草酮核酸适配体，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述苯嗪草酮核酸适配体的应用，其特征在于，所述苯嗪草酮核酸适配体在制备苯嗪草酮检测试剂、苯嗪草酮检测试剂盒或苯嗪草酮检测生物传感器上的应用；
或者所述苯嗪草酮核酸适配体在制备苯嗪草酮捕获、分离或纯化试剂上的应用；
或者所述苯嗪草酮核酸适配体在开发苯嗪草酮检测方法上的应用。
3.一种苯嗪草酮检测用生物传感器，其特征在于，所述生物传感器以苯嗪草酮核酸适配体为生物识别元件，所述苯嗪草酮核酸适配体核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述生物传感器为基于NaCl的纳米金比色法检测苯嗪草酮的生物传感器。
4.一种非疾病诊断目的的苯嗪草酮检测方法，其特征在于，基于权利要求1所述苯嗪草酮核酸适配体进行，包括以下步骤：
A、准备苯嗪草酮核酸适配体，所述苯嗪草酮核酸适配体核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
B、在一定量所述苯嗪草酮核酸适配体溶液中加入纳米金溶液，混匀孵育，使得所述苯嗪草酮核酸适配体包裹在纳米金的表面，再加入待测苯嗪草酮的水溶液和3-丙磺酸缓冲液，混匀孵育，加入氯化钠溶液，混匀后在520 nm和650 nm波长处测定紫外吸收强度A650和A520，依据紫外吸收强度计算A650/A520的大小来判断待测溶液中苯嗪草酮的含量。
5.根据权利要求4所述一种非疾病诊断目的的苯嗪草酮检测方法，其特征在于，NaCl终浓度为120 nM，核酸适配体终浓度为16 nM，检测体系pH为7，检测体系温度为25℃。
CN202110254458.XA 2021-03-09 2021-03-09 苯嗪草酮核酸适配体及筛选和在苯嗪草酮检测上的应用 Active CN112961861B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110254458.XA CN112961861B (zh) 2021-03-09 2021-03-09 苯嗪草酮核酸适配体及筛选和在苯嗪草酮检测上的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110254458.XA CN112961861B (zh) 2021-03-09 2021-03-09 苯嗪草酮核酸适配体及筛选和在苯嗪草酮检测上的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112961861A CN112961861A (zh) 2021-06-15
CN112961861B true CN112961861B (zh) 2022-12-23

Family

ID=76277525

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110254458.XA Active CN112961861B (zh) 2021-03-09 2021-03-09 苯嗪草酮核酸适配体及筛选和在苯嗪草酮检测上的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112961861B (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113549625B (zh) * 2021-07-27 2022-08-09 昆明理工大学 与腐霉利特异性结合的核酸适配体Pr-A06及其应用
CN113549626B (zh) * 2021-07-27 2022-08-09 昆明理工大学 与腐霉利特异性结合的核酸适配体Pr-A08及其应用
CN113999853B (zh) * 2021-11-06 2024-03-22 中国海洋大学 可结合扑草净的核酸适配体及其应用
CN114280286A (zh) * 2021-12-16 2022-04-05 上海交通大学云南（大理）研究院 基于核酸适配体的sybr green i荧光法检测苯嗪草酮的方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109115705A (zh) * 2018-08-31 2019-01-01 上海应用技术大学 一种利用核酸适配体与pdda组装纳米粒子检测牛奶中环丙氨嗪的方法
CN110567952B (zh) * 2019-09-29 2021-05-11 上海应用技术大学 一种基于核酸适配体修饰纳米金的环丙氨嗪检测方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN112961861A (zh) 2021-06-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112961861B (zh) 苯嗪草酮核酸适配体及筛选和在苯嗪草酮检测上的应用
JP3270722B2 (ja) 細菌の検出方法及び検出装置
CN101570783B (zh) 水产品中9种致病性微生物检测试剂盒及检测方法
CN105548109B (zh) 一种重金属镉的荧光检测体系以及检测方法
CN106568951B (zh) 基于核酸适配体的大肠杆菌o157：h7胶体金试纸条及检测方法
US20100279322A1 (en) Direct detection of intracellular fluorescently tagged cells in solution
CN107389636A (zh) 一种可在癌细胞中检测内源性谷胱甘肽的水溶性荧光传感器的制备及应用
CN110308289A (zh) 氨基糖苷类抗生素多残留同时快速荧光检测试剂及应用
CN113444773B (zh) 一种基于液相芯片检测蜱虫病原体核酸的方法及试剂盒
CN106916823A (zh) 副溶血性弧菌的核酸适配体及其应用以及检测副溶血性弧菌的试剂盒和方法
CN104155273A (zh) 一种基于荧光和比色双重检测体系测定腺苷的方法
CN101551382A (zh) 细胞活力检测试剂盒及其制备方法、应用
CN109797154B (zh) 一种与百草枯特异性结合的核酸适配体pq-15及其应用
CN108318692A (zh) 基于核酸适配体结构开关检测卡那霉素
Xie et al. Selection and colorimetric application of ssDNA aptamers against metamitron based on magnetic bead-SELEX
CN111426667A (zh) 一种基于量子点-核酸适配体-氧化石墨烯建立的对β-乳球蛋白检测的荧光方法
CN106141199B (zh) 多级纳米金花、其制备方法及应用
CN108375563A (zh) 一种磷光探针选择性检测凝血酶的方法
CN107955006A (zh) 一种氨基喹啉改性的氮参杂石墨烯量子点及其制备方法与制备组氨酸荧光检测试剂上的应用
CN107604051A (zh) 一种利用藻毒素产毒基因研究氯离子和硫酸根对微囊藻毒素生成影响的方法
CN101086498A (zh) 瓜类细菌性果实腐斑病免疫磁珠及制备方法
CN113073100A (zh) 奈替米星核酸适配体及筛选和在奈替米星检测上的应用
CN106480015A (zh) 一种高效提取沉积物中胞外dna的方法
CN101560562B (zh) 一种检测土拉菌的基因液相芯片及其检测方法
CN111961463A (zh) 一种多功能荧光传感器及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant