CN106141199B - 多级纳米金花、其制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种多级结构纳米金花、其制备方法及应用。在一实施例中，该制备方法包括：将氯金酸与聚二烯丙基二甲基氯化铵在水相体系中充分混合，并在室温条件下持续搅拌，至形成的混合溶液呈现黄色，再向获得的黄色混合溶液内加入抗坏血酸，并剧烈搅拌，之后加入纳米金球快速搅拌，而后在室温静置。该制备方法简单易操作，可控性好，产率高，所获多级结构纳米金花表面具有纳米级的尖端凸起和非常大的比表面积。所述纳米金花可作为免疫层析试纸条的金标抗体应用于食品安全、环境、医学诊断等领域，实现对目标物的简便、高灵敏分析检测，例如可以高灵敏的检测大肠杆菌，检测浓度下限达到10³CFU/mL。

Description

多级纳米金花、其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及一种多级结构纳米金花、其制备方法及应用，例如制备基于免疫试纸条的高灵敏检测试剂盒中的应用，属于材料科学及分析检测技术领域。

背景技术

作为纳米颗粒体系中极其重要的一员，纳米金颗粒本身还具有独特的物理化学性能，如良好的生物相容性，使纳米金颗粒在生物标记和生物传感方面得到广泛应用。目前纳米金的制备方法主要有：液相还原法、光化学法、气相蒸发法、种晶生长法、电化学还原法、相转移法、水热法、微波法等。但此类方法大多只能用于合成球形纳米金颗粒，而不适于制备具有特殊形貌，例如具有花球状结构的纳米金颗粒等。因而，为制备这些具有特殊形貌的纳米金颗粒，一般需要另行设计特殊的制备方法，但现有的此类方法大多存在工艺复杂，可控性差，成品率低等不足。另一方面，免疫层析检测结合了色谱分析和免疫反应的特征，具有快速、简便检测分析的有点，广泛应用于食品、环境和生物医学领域的快速初级检测。免疫层析检测中应用最为普遍的一类是胶体金标记侧向试纸条(简称金标试纸条)，典型的金标试纸条包括PVC胶板、样品垫、胶体金结合垫、包被膜和吸水垫。当样品溶液流经试纸条，溶液中待检测物与结合释放垫上的金标抗体结合后一起流动到检测T线固定聚集，通过读取仪检测 T线金标抗体聚集体的光散射强度，定性检测目标分子。结合垫中的胶体金起到识别、富集目标检测物和提供光学检测信号的重要作用，是决定试纸条灵敏度的关键材料之一。常规胶体金试纸条使用纳米金球其光学信号有限，灵敏度不高，因而限制了其实际应用。

多级结构纳米金花颗粒具有纳米级粗糙表面和更大的比表面积，可以结合更多的抗体，更容易捕获目标检测物，从而提高试纸条检测灵敏度。目前已有方法制备的纳米金花比表面积相对较小，多级结构不明显，合成步骤较多，可重复性差。

发明内容

鉴于现有技术的不足，本发明的主要目的在于提供一种多级结构纳米金花。

本发明的另一目的在于提供一种简便、高产率制备所述多级纳米金花的方法。

本发明的又一目的在于提供所述多极纳米金花的应用。

为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：

一种多级结构纳米金花的制备方法，其包括：

将氯金酸与作为稳定剂的阳离子聚电解质在水相体系中充分混合，并在温度为20℃～40 ℃的条件下持续搅拌或振荡，至形成的混合溶液呈现黄色，

向获得的黄色混合溶液内加入还原剂，并剧烈搅拌或振荡10s以上，优选为10s～60s，再加入作为种子的纳米金球，之后将形成的混合反应体系快速搅拌或振荡10s以上，优选为 10s～30s，而后在室温静置2h以上，优选为2h～4h。

进一步的，所述还原剂包括抗坏血酸或硼氢化钠等，优选为抗坏血酸，但不限于此。

进一步的，所述聚电解质包括聚二烯丙基二甲基氯化铵或壳聚糖季铵盐等，优选为聚二烯丙基二甲基氯化铵，但不限于此。

在一实施方案之中，所述制备方法包括：采用柠檬酸钠还原氯金酸制得所述纳米金球。

在一较佳实施方案之中，所述制备方法包括：在所述混合反应体系中，稳定剂的浓度为 1.8％～35wt％，氯金酸的浓度为1mmol/L～20mmol/L，还原剂的浓度为5mmol/L～0.1mol/L，种子的浓度为2.5×10^-4mmol/L～2.5×10^-2mmol/L。

其中，所述纳米金球的粒径优选为10nm～30nm。

所述多级结构纳米金花的粒径为50nm～300nm，并且所述纳米金花表面具有长约40nm～80nm、宽约10nm～40nm的花瓣型尖端凸起，大幅增加了纳米金花的比表面积和表面粗糙度。

一种金标抗体，其包含所述的多级结构纳米金花以及结合在所述纳米金花上的选定抗体。

所述金标抗体的制备方法包括：将所述的多级结构纳米金花与选定抗体于pH值为7～10 的液相体系中充分混合，并以BSA或者酪蛋白封闭，再除去未标记的选定抗体。

一种试剂盒，其包括：

免疫层析试纸条，其检测垫上分布有彼此不重合的检测线和质控线，所述检测线和质控线分别包含有第一抗体和第二抗体；

以及所述的金标抗体，其中所述选定抗体采用第三抗体；

其中，所述第一抗体仅在有目标物存在的情况下才能与目标物及第三抗体特异性结合，而所述第二抗体无论在有或无目标物存在的情况下均能与第三抗体特异性结合。

作为较佳实施方案之一，所述试剂盒一种大肠杆菌检测试剂盒。

一种检测方法，其包括：

提供所述的试剂盒，

将液态的待检样品与所述金标抗体混合后，再施加至所述试纸条的加样孔中，

以及，以裸眼判读和/或试纸条读取仪检测作为检测手段，对样品内的目标物进行定性和 /或定量判断。

进一步的，所述的检测方法具体可以包括：将金标抗体与液态的待检样品充分混合后，再滴加到试纸条的加样孔中，经设定时间后，以试纸条读取仪检测检测线的光学强度变化，从而定性和/或定量检测待检样品中目标物的含量。

与现有技术相比，本发明的有益效果至少在于：

(1)提供了一种新型的多级结构的纳米金花，其具有纳米级粗糙表面和更大的比表面积，在应用为试纸条的标记抗体时可以结合更多的抗体，更容易捕获目标检测物，从而可大幅提高检测灵敏度；

(2)提供了一种一步法制备多级结构纳米金花的新方法，其操作简便， 纳米金花产率较高，可重复性好；

(3)提供了一种基于所述多级结构纳米金花的检测试剂盒和检测方法，其能显著改善常规试纸条的检测效果，例如，当应用于检测大肠杆菌时，检测限可降低到10³CFU/mL，灵敏度有显著提升。

附图说明

图1是本发明一典型实施方案之中制备的多级结构纳米金花粒子的扫描电镜图；

图2a-图2b是本发明一典型实施方案之中纳米金花表面修饰抗体用于试纸条检测大肠杆菌的示意图；

图3是本发明一典型实施方案之中多级结构纳米金花标记抗体检测不同浓度大肠杆菌的试纸条照片；

图4是本发明一典型实施方案之中纳米金花标记抗体检测不同浓度大肠杆菌的检测线光强度图。

具体实施方式

本发明的一个方面提供了一种多级结构纳米金花粒子(如下简称“多级结构纳米金花”或“纳米金花”)的制备工艺，其主要是以聚电解质作为稳定剂，利用高分子链段的多级构象，使得金纳米粒子在多个成核中心同时生长，从而有效制得多级结构纳米金花，该纳米金花粒子表面具有纳米级的尖端凸起，即表面具有纳米级的粗糙形貌，因而具有更大比表面积。

在一较为典型的实施例之中，一种纳米金花的制备方法可以包括如下步骤：

1)柠檬酸钠还原氯金酸制备粒径为10nm～30nm的纳米金球粒子，将其作为制备纳米金花粒子的种子。

2)将氯金酸加入聚二烯丙基二甲基氯化铵(PDDA)水溶液中，25℃下搅拌15分钟以上，至溶液呈现黄色，然后将抗坏血酸水溶液快速加入上述黄色溶液中，剧烈搅拌30秒以上，加入前述的纳米金球种子，快速搅拌10秒以上，室温下静置4小时以上。

本发明的另一方面提供了所述多级纳米金花粒子的用途。例如，将其作为免疫层析试纸条的金标抗体，而应用于生物、化学检测领域。

进一步的，作为其中的典型应用方案之一，可以在所述纳米金花上连接特定的抗体而形成金标抗体，并与试纸条，例如免疫层析试纸条而组合形成试剂盒，用于检测目标物。

其中，抗体，例如大肠杆菌的特异性单抗可以借助静电作用力而修饰于纳米金花粒子表面。其中，利用纳米金花粒子的多级结构和纳米级表面凸起，可以修饰更多的抗体，更容易捕获、富集目标物，例如大肠杆菌细胞，从而提高试纸条检测目标物的灵敏度。

在本发明中所采用的试纸条可以包括依次设置的过滤垫、样本垫和检测垫，所述样本垫的边缘部与过滤垫及检测垫相互接触或重合，所述检测垫上分布有彼此不重合的检测线和质控线，所述检测线和质控线可分别包含有所述的第一抗体和第二抗体。

进一步，本发明的试剂盒在应用时，其中目标物与所述金标抗体以及检测线上对应的第一抗体是利用抗原抗体之间的特异性结合的原理呈夹心模式结合，因而，所述试剂盒对于某些生物、化学物质的检测都是适用的，特别适合于以双抗夹心模式检测的大分子蛋白质、细胞等物质。

进一步，所述试纸条还可包括依次分布的过滤垫、样本垫、检测垫和吸水垫，所述检测垫与吸水垫的边缘部相互接触或重合。

如本领域技术人员所知晓的，在前述试纸条中，各组成部分的功能大致如下：

过滤垫，主要用于初步过滤样品基质；

样本垫，样本垫经特定处理液处理，具有一定的pH缓冲作用，用于调节待检物的pH以及协助待检物和金标抗体在试纸条上的流动；

检测垫，检测垫表面分布有彼此不重合的检测线和质控线。

进一步的，所述试纸条还可包括：吸水纸，用于吸收多余的金标抗体金以及未参加反应的液体样品等。

进一步的，所述过滤垫可采用聚酯膜，检测垫采用硝酸纤维膜，但均不限于此。

在一实施例中，可以将聚酯垫、样本垫、检测垫、吸水纸依次重叠组装成所述试纸条。

本发明的又一个方面提供了一种检测系统，包括：

所述的试剂盒，

以及，检测设备，用以监测在所述试纸条上施加待检样品与金标抗体的混合物前后，于所述试纸条的质控线和检测线处的信号变化情况，特别是光学信号变化情况，从而实现对待检样品中目标物的定性和/或定量判断。

进一步的，所述检测设备包括试纸条读取仪。

本发明的再一个方面提供了一种检测方法，其包括：

提供所述的试剂盒，

将液态的待检样品与所述金标抗体混合后，再施加至所述试纸条上，

以及，以裸眼判读和/或试纸条读取仪检测作为检测手段，对样品内的目标物进行定性和 /或定量判断。

进一步的，所述的检测方法具体可包括：

将金标抗体与液态的待检样品充分混合后，再滴加到试纸条的样本垫上，经设定时间后，通过裸眼观察试纸条上检测线和质控线的颜色变化，定性分析待检样品中是否存在目标物，或者以试纸条读取仪记录T、C值和T/C值，并与预先建立的标准曲线对照，从而定量检测待检样品中目标物的含量。

进一步的，前述标准曲线可通过业界悉知的方式建立，例如，可以通过下列方法获得，即：制备一系列不同浓度的目标物的标准样品，依照前述检测方法，分别获得和记录与不同浓度标准样品对应的T、C值和T/C值，并探知检测结果与样品浓度存在的数学关系，从而建立标准曲线。

其中，T、C值分别为试纸条读取仪测得的检测线(T线)和和质控线(C线)的检测值，例如吸光度值等，这应是本领域技术人员依据常识及本说明书可很容易且明确的知悉的。

即以检测大肠杆菌为例，本发明中，可以在所述纳米金花表面修饰大肠杆菌特异性抗体，再用于试纸条高灵敏检测大肠杆菌。

在一较为典型的实施例之中，一种多级结构纳米金花标记抗体用于免疫层析试纸条高灵敏检测大肠杆菌的方法可以包括：

1)纳米金花的表面修饰过程。请参阅图2a，可以将纳米金花水溶液室温下搅拌10分钟，用碳酸钾水溶液调节纳米金花粒子溶液pH≈8，搅拌10分钟。将大肠杆菌单抗(murineanti-E. coli O157:H7mAb)水溶液加入纳米金花水溶液，室温搅拌1小时，然后加入封闭剂牛血清蛋白水溶液，室温搅拌30分钟。将标记号的好的纳米金花抗体离心分离，重新分散在磷酸盐缓冲液中备用。

2)待检样本的提取。将食品待检测样本粉碎，分散在水溶液中，过滤后收集滤液，离心浓缩分散在磷酸盐缓冲液中备用。

3)将纳米金花标记抗体与待检测浓缩溶液在Elisa酶标板中混合，静置3分钟。然后将上述混合溶液直接滴入免疫层析试纸条的加样孔中，静置10分钟后，用试纸条读取仪检测试纸条检测线(T线)的光学强度，以获得检测大肠杆菌的结果。

显然的，在该典型实施例采用的试纸条中，亦包含检测线和质控线，其中检测线和质控线中可分别包含由大肠杆菌免疫获得的多抗和能与所有单抗特异性结合的二抗等，其结构和工作原理等可参阅图2b。

以下进一步结合一更为具体的实施例及附图对本发明的技术方案作更为详细的解释说明。

实施例1：

(1)制备多级结构纳米金花颗粒：纳米金花的合成是根据纳米晶种的再生长法，主要有如下步骤：

第一，金纳米晶种的合成：将100毫升、2.5×10^-4摩尔/升的氯金酸水溶液加热到120℃，加入10毫升、1％的柠檬酸钠水溶液，搅拌30分钟后，溶液变为酒红色，停止加热冷却到室温，备用。

第二，多级结构纳米金花生长液的配置：取0.4毫升、24毫摩尔/升的氯金酸水溶液加入35％的聚二烯丙基二甲基氯化铵(PDDA)水溶液中，室温搅拌15分钟。然后加入0.8毫升、0.1 摩尔/升的抗坏血酸水溶液，搅拌30秒，至溶液变成无色通明。

第三，纳米晶种生长成纳米金花：0.1毫升的纳米晶种溶液快速滴加上述第二步配置的生长液中，搅拌均匀，静置6小时，至溶液变成橙色，表明生成了纳米金花，其尺寸和形貌可参阅图1。

其中，通过调控PDDA和氯金酸水溶液浓度可以控制纳米金花的形貌，而纳米金花的微观形貌可通过扫描电镜等检测。

(2)纳米金花标记抗体的制备：

将2毫升前述步骤三获得的纳米金花水溶液搅拌10分钟，加入碳酸钾水溶液调节pH值 >8，搅拌稳定10分钟。再加入0.5毫升、4.5微克/毫升大肠杆菌单抗水溶液，搅拌1小时。之后加入0.4毫升、5％的牛血清蛋白，搅拌30分钟。最后，将标记后的纳米金花粒子(即金标抗体) 离心分离，重新分散在0.4毫升磷酸盐缓冲液(pH≈7.4)中，备用。

(3)金标抗体用于试纸条检测大肠杆菌：

将金标抗体与不同浓度(0、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷CFU/mL)的大肠杆菌样品溶液混合，静置3分钟。参阅图3，随后直接转移到常规免疫试纸条的加样孔中，10分钟后检测样品溶液全部流过试纸条，用试纸条读取仪测试检测线处纳米金花聚集体的光散射强度。参阅图4，可以看到，利用该金标抗体，可以实现对大肠杆菌的高灵敏检测，检测浓度下限达到10³CFU/mL。

采用本发明的技术方案，可以制备新型免疫层析试纸条，用于食品安全、环境、医学诊断等领域的简便、高灵敏分析检测。

应当指出，以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所作出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种多级结构纳米金花，其特征在于，所述多级结构纳米金花的粒径为50nm～300nm，表面具有长40nm～80nm、宽10nm～40nm的花瓣型尖端凸起，并且所述多级结构纳米金花的的制备方法包括：

将氯金酸与作为稳定剂的阳离子聚电解质等在水相体系中充分混合，并在20℃～40℃温度下持续搅拌或振荡，直至混合溶液呈现黄色；

向获得的黄色混合溶液内加入还原剂，并剧烈搅拌或振荡10s以上，再加入作为种子的纳米金球，之后将形成的混合反应体系快速搅拌或振荡10s以上，而后在室温静置2h以上；

其中，所述还原剂选自抗坏血酸或硼氢化钠，所述阳离子聚电解质选自聚二烯丙基二甲基氯化铵或壳聚糖季铵盐。

2.根据权利要求1所述的多级结构纳米金花，其特征在于，所述的制备方法包括：采用柠檬酸钠还原氯金酸制得所述纳米金球。

3.根据权利要求1所述的多级结构纳米金花，其特征在于，所述的制备方法包括：在所述混合反应体系中，稳定剂的浓度为1.8％～35wt％，氯金酸的浓度为1mmol/L～20mmol/L，还原剂的浓度为5mmol/L～0.1mol/L，种子的浓度为2.5×10^-4mmol/L～2.5×10^-2mmol/L。

4.根据权利要求1或3所述的多级结构纳米金花，其特征在于：所述纳米金球的粒径为10nm～30nm。

5.一种金标抗体，其特征在于包含权利要求1-4中任一项所述的多级结构纳米金花以及结合在所述纳米金花上的选定抗体。

6.如权利要求5所述金标抗体的制备方法，其特征在于包括：将权利要求1-4中任一项所述的多级结构纳米金花与选定抗体于pH值为7～9的液相体系中充分混合，并以BSA或者酪蛋白封闭，再除去未标记的选定抗体。

7.一种试剂盒，其特征在于包括：

免疫层析试纸条，其检测垫上分布有彼此不重合的检测线和质控线，所述检测线和质控线分别包含有第一抗体和第二抗体；

以及，权利要求5所述的金标抗体，其中所述选定抗体采用第三抗体；

其中，所述第一抗体仅在有目标物存在的情况下才能与目标物及第三抗体特异性结合，而所述第二抗体无论在有或无目标物存在的情况下均能与第三抗体特异性结合。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒是大肠杆菌检测试剂盒。

9.一种检测方法，其特征在于包括：

提供权利要求7或8所述的试剂盒，

将液态的待检样品与所述金标抗体混合后，再施加至所述试纸条的加样孔中，

以及，以裸眼判读和/或试纸条读取仪检测作为检测手段，对样品内的目标物进行定性和/或定量判断。

10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于具体包括：将金标抗体与液态的待检样品充分混合后，再滴加到试纸条的加样孔中，经设定时间后，以试纸条读取仪检测检测线的光学强度变化，从而定性和/或定量检测待检样品中目标物的含量。