TWI521206B - Organic colored microparticles, including their diagnostic kit and in vitro diagnostic methods - Google Patents

Organic colored microparticles, including their diagnostic kit and in vitro diagnostic methods Download PDF

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Description

有機著色微粒子、包含其之診斷藥套組及體外診斷方法
本發明係關於一種來源於有機高分子之有機著色微粒子以及使用其之診斷藥套組及體外診斷方法。
包含高分子之微粒子由於容易控制粒徑、機械強度、粒徑之分佈、形狀、凝聚程度，故被用於各種領域中，例如可列舉色粉、包裝材料之抗黏連材料、絕緣填料、結晶成核劑、層析儀用填充劑、研磨劑等。近年來，亦應用於免疫診斷試劑用載體、液晶顯示器之間隔件、分析設備之校準用標準粒子、多孔膜之檢測用標準粒子等用途中。
包含高分子之微粒子尤其於免疫診斷藥用載體用途中使用量不斷增大，其中，於使用免疫層析方法之診斷(以下亦稱為「免疫層析」)中之使用量不斷增大。首先，可列舉已大量發售有測孕藥般作為准藥品而醫護人員以外之普通人亦可利用之套組作為要因，除此以外，作為腺病毒、輪狀病毒、諾羅病毒等各種病毒，B型、C型各種肝炎檢查，O-157等病原性菌群等各種檢查之POCT(point-of-care-testing，即時檢驗，醫師或其他醫療責任人於患者身旁實施檢查而迅速獲得結果)之手段的需要不斷高漲成為背景。由於近年來流感之流行，可推測今後免疫層析之使用量急遽增加。又，除了免疫診斷藥以外，亦於生化學分析、遺傳學分析等任意之分析反應等各種領域中利用免疫層析。
免疫層析例如係指以下方法：使經包含金屬膠體或來源於聚苯乙烯之著色乳膠之顯色微粒子標記的抗體或抗原(配位基)於層析基材上與檢查對象物質選擇性地反應，形成複合體並且使其展開，繼而，預先於層析基材上之預定檢測位置固定抗原或抗體(與上述配位基特異地結合者)，捕捉展開之複合體，藉此顯色。迄今為止已進行了各種研究，且已確立了簡便之檢查方法，然而由於在醫療現場需要減輕POCT之醫療從事人員之負擔，故期望免疫層析套組之進一步之高感度化、診斷迅速化。
於流感之診斷中，亦有於感染初期之階段中免疫層析不顯示陽性、而第二天檢查時變為陽性之情形。為解決該問題，謀求檢查之更高感度化。又，免疫層析一套組中之A型抗原與B型抗原兩者之同時診斷逐漸變得普遍。如此般存在複數種受檢物之情形時，若能以一次檢查同時檢查複數種檢查對象物質，則診斷變迅速，但為防止誤診而必須提高視覺辨認性。因此，較好的是於檢查對象物質檢測時，使各檢查對象分色顯示(多色顯色化)。於各種病毒之感染症診斷或食品安全性診斷中，亦期望利用一套組之複數種被診斷物之同時診斷，一般認為同樣之分色顯色係有效的。
免疫層析之顯色係來源於標記所用之物質。金屬膠體之情形時，顯色係由對應於其金屬種類之電漿子效應引起，故僅限定於一色。例如，於以下之專利文獻1所記載般之使用金膠體之情形時，僅顯示紅色。於設想複數種項目之同時檢查時，雖可期待於檢測位置方面所作出之努力之程度的效果，但就視覺辨認性、防止誤診之觀點而言不可謂合適。
又，金屬膠體之情形時，配位基之結合方法通常採用被稱作物理吸附之原理。作為配位基之結合方法，可列舉物理吸附、化學鍵結(共價鍵)、離子結合、包括法等。所謂物理吸附，係指利用基材(例如顯色微粒子)與結合材料(例如配位基)之間之疏水性相互作用的結合方法。實際上可想到不僅係疏水性相互作用，而且靜電作用、分子力、其他各種機制亦發揮作用。物理吸附相對於其他結合方法而言操作較容易，故於簡便性或成本方面有利。然而，物理吸附之情況下，亦可能有引起配位基之結合部位不固定、或於界面活性劑之存在下吸附受到阻礙等問題之情形。又，亦有無法結合充分量之配位基之情形。
另一方面，如以下之專利文獻2所揭示，於使用聚苯乙烯等乳膠粒子之情形時，藉由使包含分散染料或油溶染料、顏料之顯色團含於微粒子中而使用，可進行分色。又，通常作為配位基之結合方法，可選擇物理吸附、化學鍵結等任意方法。因此，可避免上述物理吸附之問題。然而，根據專利文獻2之實施例，對粒子之染附量低至6 wt%左右，顯色之強度較弱。因此，於用於免疫層析之情形時，無法獲得明顯之顯色結果，缺乏可靠性。
以下之專利文獻3中，揭示有經纖維素染色之微粒子，但相對於纖維素微粒子量之染料添加量為20 wt%左右，故所得之染色微粒子較淡。對其如以下之專利文獻4般藉由物理吸附或化學鍵結賦予抗體而用於免疫層析，但抗體之結合量不充分，而且微粒子自身之顯色較弱，故無法獲得明顯之顯色結果。
[先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]日本專利特公平7-60159號公報
[專利文獻2]日本專利第2955405號說明書
[專利文獻3]國際公開WO2008/084854手冊
[專利文獻4]國際公開WO2009/123148手冊
鑒於上述現狀，本發明之課題在於獲得一種顯色性較高、且可分色之有機著色微粒子，藉由使配位基與其結合並應用於診斷藥、特別是免疫層析，而達成免疫層析套組之高感度化。
本發明者們進行了潛心研究並反覆試驗，結果成功地以纖維素作為起始原料而獲得了染成濃色之微粒子。更令人驚訝的是發現，藉由將纖維素染成濃色，可實現利用物理吸附的配位基的結合，進而，藉由視需要導入反應性活性基，亦可藉由共價鍵結而結合配位基。而且發現，將其作為診斷藥用載體應用於免疫層析時，可實現免疫層析套組之高感度化，從而完成了本發明。
即，本發明如下。
[1]　一種有機著色微粒子，其特徵在於：平均粒徑為10 nm~1000 nm，且顯色強度為1.0~5.0。
[2]　如上述[1]之有機著色微粒子，其中上述有機著色微粒子之重量之10 wt%~80 wt%為著色成分。
[3]　如上述[2]之有機著色微粒子，其中上述著色成分為染料。
[4]　如上述[1]至[3]中任一項之有機著色微粒子，其中上述有機著色微粒子之重量之20 wt%~90 wt%係來源於纖維素。
[5]　如上述[1]至[4]中任一項之有機著色微粒子，其藉由物理吸附而結合有配位基。
[6]　如上述[1]至[5]中任一項之有機著色微粒子，其具有反應性活性基。
[7]　如上述[6]之有機著色微粒子，其中上述反應性活性基具有原子數3以上之間隔基結構。
[8]　如上述[6]或[7]之有機著色微粒子，其中藉由共價鍵結於上述反應性活性基上結合有配位基。
[9]　一種診斷藥套組，其包含如上述[1]至[8]中任一項之有機著色微粒子。
[10]　如上述[9]之診斷藥套組，其係免疫層析套組。
[11]　一種體外診斷方法，其包含使用如上述[1]至[8]中任一項之有機著色微粒子之步驟。
[12]　如上述[11]之體外診斷方法，其係免疫層析方法。
本發明之有機著色微粒子與先前技術之乳膠粒子之顯色性相比較，具有格外顯著地優異之顯色性，且可吸附抗體等配位基，故可應用於免疫層析，藉由選擇性且特異的反應進行捕捉之情形之顯色更明顯，藉此可提供一種高感度之免疫層析套組，進而，由於可進行多色顯色，故於複數種檢查對象之同時測定時有用。又，本發明之有機著色微粒子與配位基之結合方法除了來源於染料之物理吸附以外，亦可選擇化學鍵結等任意方法，故可應用於各種檢查對象物質。因此，本發明可實現誤診較少之早期診斷，對檢查之迅速化作出較大貢獻，可大幅度地擴大免疫層析之應用範圍。
 <平均粒徑>
以下，對本案發明加以詳細說明。
本發明中所謂有機著色微粒子，係指平均粒徑為10 nm~1000 nm、且顯色強度為1.0~5.0之有機著色微粒子。平均粒徑之較好範圍為100 nm~900 nm，更好的是200 nm~800 nm。若平均粒徑超過1000 nm，則有如下傾向：用於免疫層析套組時展開較慢，不利於評價之迅速化，而且容易於展開膜上被捕捉，基底自身顯色，由此導致所期待之檢測部位之顯色變得不明顯。特別是於檢測部位，由於補充試劑之塗佈而展開膜之孔徑變小之情形較多。因此，有於此處標記易被捕捉之傾向、即容易呈假陽性。已無法可靠地作為檢查套組。
<顯色強度>
本發明中所謂顯色強度，係將有機著色微粒子之分散液設定為光路長10 mm，於400 nm~800 nm之範圍內進行使用積分球之可見吸光度測定，減去分散介質之基底成分，由此獲得分散基質自身之吸光度曲線，以分散基質之重量百分比對其最大值(ABS)進行折算，將以0.01 wt%為單位計算出之值定義為顯色強度。藉由使用積分球，可減少粒子之散射光之影響，故所得之值足可作為微粒子之顯色程度之指標，該數值越大可判斷顯色越明顯。本發明之微粒子之顯色強度為1.0以上，越大越好。為增大顯色強度，可使用顯色較高之分散染料或顏料，或選擇增加染色次數等方法。然而，使顯色強度為5.0以上係使用通常之染料之數次染色無法達成，若考慮到經濟性則顯色強度為1.0~5.0，更好的是1.5~5.0，進而好的是2.0~5.0。於顯色強度小於1.0時，顯色較弱，故用於免疫層析套組時檢測部位之視覺辨認性差，有損檢查結果之可靠性。
<有機著色微粒子之素材(材料)>
本發明之有機著色微粒子之素材只要為顯色強度較高且穩定分散者則並無特別限定。可應用利用染料或顏料可實現濃色化之素材，染成濃色且實現強固之染附有助於免疫層析之檢查時、或套組之長期保管之品質穩定化，故較好。為達成強固之染附，例如可使用共價鍵結性之反應染料，作為可藉由反應染料染色者，可列舉來源於纖維素者。包含來源於纖維素者之微粒子具有大量之羥基，故不僅可藉由共價鍵結保持大量之反應性染料，而且可於染成濃色後亦保持在水等中之穩定分散性。因此，作為有機著色微粒子之素材，適合使用纖維素，其種類並無特別限定。可使用再生纖維素、純化纖維素、天然纖維素等。亦可使用局部地經衍生物化之纖維素。較好的是有機著色微粒子之重量之20~90 wt%來源於纖維素。更好的是有機著色微粒子之重量之20~80 wt%來源於纖維素。進而好的是20~70 wt%。
<有機著色微粒子之素材之製造方法>
本發明之有機著色微粒子之素材之製造方法並無特別限定。可使用利用濕式粉碎等之力學方法進行分級而獲得所欲平均粒徑之微粒子，本發明中將纖維素溶解於其良溶劑中，使用將水、有機溶劑、氨等混合而成之凝固液，由此製備纖維素微粒子。可藉由凝固液之組成而調整藉由使用該方法而獲得之纖維素微粒子之粒徑。以下，對具體例加以更詳細說明，但並無限定本發明之有機著色微粒子之素材之製造方法之意。
首先，使纖維素短絨溶解於纖維素之良溶劑中。本發明中，良溶劑係使用藉由公知方法製備之銅氨溶液。繼而，作為凝固液，主要使用有機溶劑+水+氨混合系。一邊攪拌該凝固液，一邊添加所製備之銅氨纖維素溶液進行凝固。進而添加硫酸進行中和、再生，由此獲得含有目標纖維素微粒子之漿料。將該漿料稀釋、純化、乾燥，由此可獲得纖維素微粒子分散液或纖維素微粒子。
<著色方法>
本發明中之有機著色微粒子之素材之著色方法亦無特別限定，可使用利用染料之方法、利用顏料之方法等各種方法。其中就可提高顯色強度之觀點而言，較好的是使用染料之方法，可使用直接染料、含金染料、酸性染料、反應染料、鹼性染料、分散染料、硫化染料、植物染料、萘酚染料等各種染色劑。
本發明中於使用纖維素微粒子作為有機著色微粒子之情形時，由於纖維素微粒子之表面積明顯大於纖維之表面積，故可大幅增加染附量，可獲得有機著色微粒子中10 wt%以上為著色成分之微粒子。然而，就顯色性與經濟性之觀點而言，著色成分較好的是有機著色微粒子之10 wt%~80 wt%，更好的是20 wt%~80 wt%，進而好的是30 wt%~80 wt%。進而，本發明中，為可將纖維素微粒子染成濃色且形成長期間穩定即濕潤強韌度優異者，較理想的是藉由共價鍵結進行染附，就此觀點而言，較好的是選擇反應染料。
本發明中之著色成分相對於有機著色微粒子之比例，可根據著色前後之重量變化而計算。本發明中，亦有使用染色作為著色方法且於其過程中使用離心分離，故無法回收所有粒子之情形，該情形時，根據可回收之粒子之重量及染色前之粒子之重量計算著色成分之比例。例如，對1.0 g纖維素微粒子進行染色而獲得2.0 g有機著色微粒子之情形為50 wt%。又，視需要，亦可藉由分離有機著色微粒子與著色成分之操作，例如利用酸或鹼處理之共價鍵之切斷、或使微粒子膨潤、其他最適之清洗操作等分離有機微粒子與著色成分進行計算。
<配位基>
本發明中所謂配位基，係指具有與特定之檢查對象物質選擇性且特異地結合之性質之物質。其種類並無特別限定，例如可列舉抗體、抗原、酵素、基因、激素、細胞、核酸、肽、蛋白質等。
<利用染色之配位基之物理吸附>
本發明中，不僅使用染料將纖維素染成濃色，而且可進行配位基之物理吸附。於僅進行染色而物理吸附性能不充分之情形時，視需要亦可藉由與纖維素的衍生物化組合而調整親水疏水平衡。不僅將纖維素染成濃色而且可進行配位基的物理吸附的理由雖尚且不明，但一般認為其原因在於由於染色而纖維素經疏水化。通常，可藉由以膜等測定接觸角而獲知親水疏水之程度，但奈米微粒子難以測定接觸角。因此，以模型方式將作為平坦纖維素之賽璐玢(cellophane，註冊商標)染成濃色並測定接觸角，結果可確認，未染色之纖維素之接觸角為20~30度左右，相對於此，經充分染色之賽璐玢(註冊商標)之接觸角與染料之染附量成比例，亦達到40~100度。通常之染料具有苯、萘、蒽醌、偶氮等疏水性較強之結構。本發明中可預料到，使於纖維之染色條件下通常無法想到之大量之染料結合於纖維素，結果可達成抗體能進行物理吸附之程度之疏水化。於蛋白質定量法中使用通常之Lowry法對所結合之小鼠IgG抗體進行定量，結果於如本發明之有機著色微粒子般經充分染色之情形時，可確認到抗體之結合。另一方面，若染色強度過低，則有看不出與未染色粒子之差、且抗體結合量較低之傾向。
<利用反應性活性基之配位基之化學鍵結>
本發明中作為配位基之結合方法，不僅可選擇物理吸附，亦可選擇化學鍵結。通常，物理吸附具有操作簡便、成本便宜之優點，但亦被指出可能會產生如下問題。例如，配位基之結合部位並不固定而喪失反應之選擇性，已結合之配位基於界面活性劑之存在下脫離等。因此，為解決該等問題，亦有視狀況不同而採用與配位基形成共價鍵之化學鍵結方式之情形。又，化學鍵結方式中，亦有可使配位基之結合量較物理吸附更多之情形。
<反應性活性基>
本發明中之反應性活性基係用於使配位基進行共價鍵結。作為反應性活性基之代表例，可列舉羧基、胺基、醛基、硫醇基、環氧基、羥基等。種類並無特別限定，較好的是羧基、及胺基。羧基之情形時，可利用碳二醯亞胺與配位基之胺基形成共價鍵。關於導入反應性活性基之時間，可於染色前預先導入，亦可於染色後導入。關於導入之部位，可導入至有機微粒子，亦可導入至染料部分。又，亦可預先使染料之一部分結構為反應性活性基。
本發明中之反應性活性基之導入可藉由紅外分光分析裝置確認。例如，於羧基之情形時，若為游離酸型則藉由1730 cm-1左右之吸收可確認。又，於胺基之情形時，若為一級胺基則藉由1600 cm-1左右之吸收可確認。然而，對反應性活性基之導入量進行定量非常困難。其原因在於存在大量之染料成分，利用通常之定量方法無法定量。本發明中藉由紅外分光分析裝置僅判斷可否導入。
<間隔基結構>
本發明中之反應性活性基較好的是具有原子數3以上之間隔基結構。本案發明者們發現，對經高度地濃色化之有機著色微粒子導入反應性活性基並使配位基進行化學鍵結而用於免疫層析時，若具有原子數3以上之間隔基結構，則感度進一步提昇。其理由雖不明確，但例如可想到，由於大量存在之染料之立體阻礙或電荷之影響，而有配位基與檢查對象物質之選擇性之反應受到妨礙之可能性。
所謂間隔基結構，係指存在於反應性活性基與有機著色微粒子之間之原子。又，於間隔基結構分支之情形時，係指主鏈之原子數。例如，通常已知之羧甲基纖維素係纖維素之一部分羥基經羧甲基取代而成者。此時之反應性活性基為羧基，間隔基結構成為-CH2-、即原子數1之間隔基結構。本發明之實施例中，利用以下4種方法導入具有間隔基結構之反應性活性基。將化合物1~4之結構分別示於化1~4中。原本於一部分羥基上亦結合有染料，但省略染料。
<化合物1>
[化1]
使染色纖維素微粒子與5-己烯酸反應而導入羧基。主鏈之原子數、即間隔基結構之原子數成為5。
<化合物2>
[化2]
使染色纖維素微粒子與16-十七烯酸反應而導入羧基。主鏈之原子數、即間隔基結構之原子數成為16。
<化合物3>
[化3]
使染色纖維素微粒子與表氯醇反應而導入環氧基，進而藉由與6-胺基己酸反應而導入羧基。主鏈之原子數、即間隔基結構之原子數成為9。
<化合物4>
[化4]
使染色纖維素微粒子與表氯醇反應而導入環氧基，進而藉由與氨反應而導入一級胺基。主鏈之原子數、即間隔基結構之原子數成為3。
上述間隔基結構最大為原子數16，亦可為更長之間隔基結構。更長之間隔基結構可藉由改變與染色纖維素微粒子反應之化合物而達成，或亦可使用所導入之反應性活性基再延長而獲得。原理上，非常長之間隔基結構亦可導入，但就導入之容易程度、成本之觀點考慮，較好的是原子數3~100，更好的是3~50，進而好的是3~20。
<有機著色微粒子之分散方法>
藉由上述著色方法所得之有機著色微粒子、即染色纖維素微粒子亦可保持分散液之狀態從未經乾燥而直接使用，亦可添加各種試劑、界面活性劑、緩衝劑而實現分散液之穩定。又，視需要亦可進行乾燥，藉此製備成微粒子單體或各種濃度之分散液。本發明中，使染色微粒子分散之液體之種類只要使微粒子溶解或膨潤則並無特別限定。可使用水或各種無機化合物水溶液、醇類、醚類、醛類、酮類、脂肪酸類、胺類、其他有機溶劑。亦可使用將各種化合物以任意比例混合而成之溶劑，進而亦可與和該等溶劑具有相溶性之疏水性溶劑混合使用。
<粒度分佈>
本發明之有機著色微粒子之粒度分佈係藉由以下的式(1)：CV值=(由粒度分佈測定裝置求出之體積粒度分佈之標準偏差)/(由粒度分佈測定裝置求出之體積平均中值徑)×100　式(1)而求出。雖並無特別限定，但若如上述般粒徑過大，則有免疫層析套組中可見基底之顯色、或假陽性之傾向，故粒度分佈以較小為宜，較好的是70%以下。欲減小CV值時，可藉由微粒子製造條件進行調整，亦可於染色前、染色後之各階段中藉由過濾、離心分離等操作將粒子分級。本發明中，亦考慮到經濟性，合適之CV值之範圍為10%~70%，更好的是10%~60%，進而好的是10%~50%。
<免疫層析>
本發明之有機著色微粒子適用於利用免疫層析方法之免疫測定法。
以下，對免疫層析方法之代表例進行說明，但並不限於此，可應用於所有夾心分析。免疫層析方法大致係將包含金屬膠體或來源於聚苯乙烯之著色乳膠之顯色微粒子作為標記，使其預先結合於與作為被檢測物質之抗原或抗體特異地結合之抗體或抗原。另一方面，於層析基材上之預定部位，以線狀塗佈與抗原或抗體特異地反應之抗體或抗原。於檢查時，使上述標記-抗體或抗原與作為被檢測物質之抗原或抗體接觸，形成複合體，使其於層析基材上展開，該複合體可由塗佈成線狀之一次抗體捕捉(夾心分析)。此時，標記物質亦被捕捉，故於預定部位引起顯色。由於可目測判定被檢測物質之有無，故作為簡便之檢查方法而近年來廣泛普及。又，不僅係使用抗原或抗體之免疫反應，藉由使用與被檢測物質引起特異反應之配位基亦可進行各種檢查。除了免疫診斷藥以外，於生化學分析、遺傳學分析等任意分析反應等各種領域中利用免疫層析。
[實施例]
以下，藉由實施例對本發明加以具體說明，但本發明不限定於該等實施例。
首先，對本發明之有機著色微粒子或著色微粒子分散體之測定法加以詳細說明。
只要無特別記載，則所有操作係於25℃之環境下實施。
(1)　粒度(粒徑)分佈：使用日機裝公司製造之Nanotrac粒度分佈測定裝置UPA-EX150測定纖維素微粒子分散體。只要無特別記載，則使用水作為使纖維素微粒子分散之液體，以纖維素微粒子濃度為約0.1 wt%進行測定，累計次數係設定為30次。又，CV值係計算將藉由30次累計所得之體積粒度分佈之標準偏差除以體積平均中值徑所得之值。
(2)　顯色強度：對日本分光製造之JASCO‧V-650附加積分球單元ISV-722而使用，測定纖維素微粒子、及成為比較例之著色聚苯乙烯乳膠及金膠體之吸光度。以微粒子濃度為0.01 wt%~0.1 wt%進行測定。繼而，以微粒子之重量百分比對400 nm~800 nm之可見光範圍之吸光度波峰之最大值(ABS)進行折算，求出以0.01 wt%為單位計算出之值。
(3)　可否導入反應性活性基之確認：將導入有反應性活性基之微粒子分散液乾燥，獲得導入有反應性活性基之微粒子。使用帕金艾爾瑪(Perkin Elmer)製造之紅外分光分析裝置Spectrum 100藉由反射法測定紅外吸收光譜，比較導入前後之吸收光譜。羧基之情形時，以游離酸型之1730 cm-1左右的吸收進行確認，胺基之情形時，以一級胺基之1600 cm-1左右的吸收進行確認。
又，為消除纖維素微粒子分散體、染色纖維素微粒子分散體之凝聚，使用Microfluidics公司製造之油壓式超高壓均質機M-110-E/H。此時之處理壓力為50 MPa，進行於作為高壓部之腔室中通過10次之操作。
[實施例1] <微粒子之製備>
使纖維素短絨溶解於銅氨溶液中，繼而以水及氨稀釋，製備纖維素濃度為0.37 wt%之銅氨纖維素溶液。該溶液之銅濃度為0.13 wt%，氨濃度為1.00 wt%。進而，製備四氫呋喃濃度為90 wt%、水濃度為10 wt%之凝固液。一邊使用磁力攪拌器將凝固液5000 g緩緩攪拌，一邊添加預先製備之纖維素濃度為0.37 wt%之銅氨纖維素溶液500 g。繼續攪拌5秒左右後添加10 wt%之硫酸1000 g進行中和、再生，獲得含有目標纖維素微粒子之漿料26500 g。將所得之漿料以10000 rpm之速度離心分離10分鐘。藉由傾析取出沈澱物，注入去離子水進行攪拌，再次離心分離。反覆進行該操作數次直至pH值達到6.0~7.0為止，其後藉由高壓均質機進行分散處理，獲得纖維素微粒子分散體150 g。再者，所有操作係於25℃之環境下進行。
<微粒子之染色>
繼而，對如上所述般製備之纖維素微粒子進行染色。對於將微粒子濃度調整為1.0 wt%之纖維素微粒子分散體100 g，一邊添加硫酸鈉30 g、作為反應性染料之DyStar股份有限公司製造之Levafix Navy CA Gr.(註冊商標)(以下亦稱為藍色系A)1 g進行攪拌，一邊使用恆溫槽升溫至60℃為止。升溫至60℃後添加碳酸鈉4 g，進行2小時染色。繼而，對所得之粗染色微粒子以氫氧化鈉5 wt%水溶液進行清洗，藉由離心分離加以回收，以純水進行水洗後藉由離心分離加以回收，將上述一系列操作視為1循環，實施同樣之操作共計3循環，獲得染色微粒子。染料成分之比例為有機著色微粒子之重量之49%。
將染色前後之平均粒徑與顯色強度之測定結果示於以下之表1中。
[實施例2] 以同樣之操作將實施例1中獲得之未染色纖維素微粒子染色，但實施共計10循環，獲得染色微粒子。將染色前後之平均粒徑與顯色強度之測定結果示於以下之表1中。 [實施例3]
對實施例1中獲得之未染色纖維素微粒子使用DyStar股份有限公司製造之Levafix Rubine CA Gr.(註冊商標)(以下亦稱為紅色系B)1 g作為反應染料，除此以外，利用與實施例1相同之方法獲得纖維素微粒子、及染色纖維素微粒子。將染色前後之平均粒徑與顯色強度之測定結果示於以下之表1中。
[實施例4]
凝固所用之凝固液係四氫呋喃濃度為95 wt%、水濃度為5 wt%，除此以外，利用與實施例1相同之方法獲得纖維素微粒子、及染色纖維素微粒子。將染色前後之平均粒徑與顯色強度之測定結果示於以下之表1中。
[實施例5]
對實施例4中獲得之未染色纖維素微粒子使用DyStar股份有限公司製造之Levafix Rubine CA Gr.(註冊商標)(紅色系B)1 g作為反應染料，除此以外，利用與實施例1相同之方法獲得纖維素微粒子、及染色纖維素微粒子。將染色前後之平均粒徑與顯色強度之測定結果示於以下之表1中。
[實施例6]
凝固所用之凝固液係丙酮濃度為26.5 wt%、氨濃度為0.20 wt%、水濃度為73.3 wt%，除此以外，利用與實施例1相同之方法獲得纖維素微粒子、及染色纖維素微粒子。將染色前後之平均粒徑與顯色強度之測定結果示於以下之表1中。
[比較例1]
凝固所用之凝固液係四氫呋喃濃度為97 wt%、水濃度為3 wt%，除此以外，利用與實施例1相同之方法獲得纖維素微粒子、及染色纖維素微粒子。將染色前後之平均粒徑與顯色強度之測定結果示於以下之表1中。
[實施例7]
對比較例1中獲得之染色纖維素微粒子使用日本Millipore股份有限公司製造之孔徑0.8 μ之來源於硝基纖維素之過濾膜進行過濾，採集濾液。將平均粒徑與顯色強度之測定結果示於以下之表1中。
[實施例8]
以與實施例1相同之操作將實施例1中獲得之未染色纖維素微粒子染色，但進行僅1循環之染色，獲得染色微粒子。將染色前後之平均粒徑與顯色強度之測定結果示於以下之表1中。
[實施例9]
對於實施例1中獲得之未染色纖維素微粒子，使硫酸鈉為15 g，使作為反應染料之DyStar股份有限公司製造之Levafix Rubine CA Gr.(註冊商標)(紅色系B)為0.5 g，除此以外，利用與實施例1相同之操作進行染色，但進行僅1循環之染色，獲得染色微粒子。將染色前後之平均粒徑與顯色強度之測定結果示於以下之表1中。
[比較例2]
對於實施例1中獲得之未染色纖維素微粒子，使硫酸鈉為6 g，使作為反應性染料之DyStar股份有限公司製造之Levafix Navy CA Gr.(註冊商標)(藍色系A)為0.2 g，除此以外，進行與實施例8相同之操作，獲得染色微粒子。將染色後之平均粒徑與顯色強度之測定結果示於以下之表1中。
[比較例3]
對於實施例6中獲得之未染色纖維素微粒子，使硫酸鈉為6 g，使反應性染料為DyStar股份有限公司製造Remazol Black B HI-GRAN. 150(註冊商標)(以下亦稱為藍色系C)為0.2 g，除此以外，進行與實施例8相同之操作，獲得染色微粒子。將染色前後之平均粒徑與顯色強度之測定結果示於以下之表1中。
[比較例4]
對作為染色聚苯乙烯乳膠粒子之BangsLaboratories公司製造之DS02B(PrimaryBlue(註冊商標)，平均粒徑為0.47 μm)之顯色強度進行測定。將結果示於以下之表1中。
[比較例5]
將對平均粒徑為0.04 μm之金膠體粒子之顯色強度進行測定之結果示於以下之表1中。
<性能評價1>
使用實施例1~比較例5之染色、著色或顯色粒子，製作免疫層析用之套組，實施性能評價。
<利用物理吸附之抗體結合染色微粒子之製備>
藉由磷酸緩衝液(以下稱為「PBS」)，以固體成分濃度達到1重量%之方式將實施例1~比較例4中獲得之染色或著色微粒子稀釋調整，將所得之1重量染色粒子磷酸緩衝液懸濁液1 ml、與以PBS將對人類絨毛膜性腺激素(以下稱為「hCG」)的來源於小鼠之單株抗體(MedixBiochemica公司製造之#5014抗hCG抗體)稀釋至100 μg/ml所得之抗體稀釋液1 ml採集至Eppendorf離心沈降管中，於室溫下振盪2小時，使單株抗體與染色粒子結合，繼而使用以0.1重量%之濃度含有牛血清蛋白(以下稱為BSA)之PBS離心清洗3次，以最終成為2 ml之方式進行再分散，藉此獲得抗體結合染色微粒子分散液。
<抗體結合金膠體之製備>
使濃度0.01重量%之氯化金水溶液200 ml沸騰，於其中添加濃度1重量%之檸檬酸鈉水溶液，進行加熱沸騰直至溶液的顏色由淡黃色變為紫色~紅色為止，製備比較例5所示之平均粒徑為0.04 μm之金膠體粒子之分散液。繼而，於所得之金膠體分散液中添加50 mM磷酸二氫鉀溶液將pH值調整為8，於其中以於金膠體粒子分散液每1 ml中為10 μg之比例添加對hCG之單株抗體，於其10 ml中添加濃度30重量%之BSA(牛血清蛋白)0.1 ml，進行離心沈降處理，去除上清液，使用以0.1重量%之濃度含有BSA之PBS藉由3次離心沈降處理進行清洗，並進行再分散，藉此獲得抗體結合金膠體粒子分散液。
<層析基材(薄膜)之製備>
於市售之薄膜過濾器(Millipore公司製造之HF120，25 mm×300 mm)之距離其中一端(以下，該其中一端為條帶之下端，另一端為條帶之上端)7 mm之位置，使用液體噴射裝置與展開方向垂直、即與薄膜長邊平行地以寬度成為約1 mm之方式噴射印刷測試線用之抗體。更詳細而言，作為測試線抗體，使用來源於小鼠之抗hα-次單元抗體(MedixBiochemica公司製造之#6601)，以PBS調整為0.5 mg/ml，以成為1.0 μL/cm之方式進行噴霧。又，同樣地於距離下端12 mm之位置，以1 mm之寬度噴射印刷對照線用之抗體。更詳細而言，作為對照線，使用來源於家兔之抗小鼠抗體(Daco公司製造之Z0259)，以PBS調整為0.5 mg/ml，以成為1.0 μL/cm之方式進行噴霧。將各抗體噴霧後，乾燥1小時，然後使用含有乳酪蛋白之硼酸緩衝液進行遮蔽，使用含有蔗糖之Tris-HCl緩衝液進行清洗，於室溫下定著一夜，藉此製備層析用薄膜。
<層析評價樣品製作>
對於所得之使用各實施例、比較例記載之染色粒子之層析用薄膜，使20×300 mm之濾紙性之吸收墊以距離上端5 mm之間重疊之方式與長邊彼此接觸，然後使用剪切機以5 mm寬為單位進行切斷，由此製作樣品。單純計算可製成60個樣品。
<層析評價>
展開試驗中使用之含有hCG之試樣係如以下般製備。
藉由以1重量%之濃度含有BSA之PBS稀釋hCG，而含有hCG濃度分別為100、10、0 mIU/ml之hCG。於該試樣液中，浸漬上述所得之5 mm寬套組樣品之距離下端2 mm，使試樣液展開。經過10分鐘後，目測觀察薄膜過濾器上之反應部位(標記印刷部)之顯色。作為評價基準，對測試線處不可見顯色之情形使用(-)、可見顯色之情形使用(+)、清晰可見顯色之情形使用(++)、可見較強之顯色之情形使用(+++)。將評價結果示於以下之表2中。
所有實施例、比較例中，可見對照線之顯色。hCG濃度為100 mIU/ml時，實施例1~9及比較例1、4、5中可見測試線之顯色。又，即便於hCG濃度稀薄至10 mIU/ml之濃度下，實施例1~9以及比較例1及比較例5中亦可見測試線之顯色。
比較例1中，特別於抗原濃度較高之側，可見由於基底之顯色而表觀感度下降之現象。又，可見即便試樣中無hCG亦顯色之傾向、即假陽性。實施例7中，使用將比較例1之粒子加以過濾者，結果雖殘留有基底之顯色，但看不到假陽性，故可認為若粒徑過大則會產生假陽性。粒徑過大之情形不適於診斷藥套組。實施例1~9中看不到假陽性，故實施例1~9可謂高感度。
另一方面，比較例2~4中由於染料之顯色強度較小，故於hCG濃度10 mIU/ml時無法檢測到顯色。因此可理解，若使用本發明之有機著色微粒子，則與聚苯乙烯乳膠相比較成為高感度。
又，與比較例5之金膠體之比較中亦可理解表現出同等程度或其以上之感度。即，藉由使用本發明之有機著色微粒子，無論是藍色系還是紅色系均可實現高感度診斷。
<反應性活性基之導入>
繼而，對實施例1中獲得之染色微粒子進行羧基或胺基等反應性活性基之導入。
[實施例10]
於實施例1中所獲得之藍色染色微粒子分散液之一部分中添加純水、異丙醇(和光純藥公司製造，特級試劑)，以分散介質之異丙醇：水之比成為85：15、且分散介質中之粒子濃度成為0.50 wt%之方式調整。將所得之染色纖維素微粒子分散液20 g與轉子一起放入至試管中，安裝玻璃製回流管。一邊使約10℃之自來水回流進行冷卻，一邊以纖維素微粒子分散液達到50℃之方式使用水浴加熱30分鐘。再者，加熱係一邊使用磁力攪拌器緩緩攪拌一邊進行。其後，一邊攪拌一邊添加40 wt%之苛性鈉溶液74 mg，進而繼續攪拌30分鐘，其後添加氯乙酸鈉(和光純藥公司製造)216 mg。繼續進行3小時之攪拌及回流，進行羧基之導入。經過3小時後，停止水浴之加熱，利用冰水冷卻茄形燒瓶，以反應後漿料之溫度達到20℃之方式冷卻。冷卻後一邊繼續攪拌，一邊添加10 wt%鹽酸1.0 g使反應後漿料之PH為酸性。與微粒子之清洗同樣地使用離心分離機，反覆進行數次傾析-利用去離子水之稀釋，使PH為6.0~7.0，進而藉由高壓均質機進行分散處理，獲得羧基化染色微粒子分散液。將對所得之分散液之一部分測定平均粒徑與顯色強度之結果示於以下之表3中。
[實施例11]
於實施例1中獲得之藍色染色微粒子分散液之一部分中添加純水、丙酮(和光純藥公司製造，特級試劑)，以分散介質之丙酮：水之比成為1：1、且分散介質中之粒子濃度成為1.0 wt%之方式調整。將所得之染色纖維素微粒子分散液10.0 g與轉子一起放入至玻璃製試管中，安裝玻璃製回流管。一邊使約10℃之自來水回流進行冷卻，一邊以纖維素微粒子分散液達到40℃之方式利用水浴加熱30分鐘。再者，加熱係一邊使用磁力攪拌器緩緩攪拌一邊進行。其後，添加5-己烯酸(和光純藥公司製造)705 mg、硝酸二銨鈰(和光純藥公司製造)677 mg、1 mol/L硝酸(和光純藥公司製造)617 ml。繼續進行3小時之攪拌及回流，進行羧基之導入。反應後之處理與實施例10相同，獲得羧基化染色微粒子分散液。將對所得分散液之一部分測定平均粒徑與顯色強度之結果示於以下之表3中。
[實施例12]
除了為進行羧基化而添加之反應劑為16-十七烯酸(和光純藥公司製造)1654 g以外，利用與實施例11相同之方法獲得羧基化染色微粒子分散液。將對所得分散液之一部分測定平均粒徑與顯色強度之結果示於以下之表3中。
[實施例13]
於實施例1中獲得之藍色染色微粒子分散液之一部分中添加純水，以分散介質中之粒子濃度成為1.0 wt%之方式進行調整。將所得之染色微粒子分散液10.0 g與轉子一起放入至玻璃製試管中，安裝玻璃製回流管。一邊使約10℃之自來水回流進行冷卻，一邊以纖維素微粒子分散液成為35℃之方式利用水浴加熱30分鐘。再者，加熱係一邊使用磁力攪拌器緩緩攪拌一邊進行。其後，添加表氯醇(和光純藥公司製造)571 g，繼續進行30分鐘之攪拌及回流，進行環氧基之導入。其後，將水浴之溫度升溫至50℃，添加6-胺基己酸(和光純藥公司製造)810 g，繼續進行1小時之攪拌及回流，進行羧基之導入。反應後之處理與實施例10相同，獲得羧基化染色微粒子分散液。將對所得之分散液之一部分測定平均粒徑與顯色強度之結果示於以下之表3中。
[實施例14]
除了環氧基之導入後添加之反應劑為25 wt%氨水(和光純藥公司製造)840 g以外，與實施例13同樣地獲得胺基化染色微粒子分散液。將對所得分散液之一部分測定平均粒徑與顯色強度之結果示於以下之表3中。
<利用紅外分光分析裝置之反應性活性基之確認>
使實施例10~14中獲得之羧基化及胺基化染色微粒子分散液乾燥，調整羧基化及胺基化染色微粒子，藉由紅外分光分析裝置確認反應性活性基之導入。羧基化染色微粒子於1730 cm-1左右吸收增加，胺基化染色微粒子於1600 cm-1左右吸收增加，可確認成功地導入了反應性活性基。
<性能評價2>
使抗體與實施例10~14之導入有反應性活性基之染色微粒子進行化學鍵結，其後製作免疫層析用之套組，實施性能評價。
<利用化學鍵結之抗體結合染色微粒子之製備1>
使用2-啉基乙磺酸(和光純藥公司製造)、苛性鈉、純水，製備pH值為5.2且濃度為50 mM之2-啉基乙磺酸緩衝液(以下稱為「MES」)，進而使1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二醯亞胺鹽酸鹽(和光純藥公司製造，以下稱為碳二醯亞胺)溶解於MES緩衝液中，以碳二醯亞胺濃度達到20 wt%之方式調整。使用離心分離機使實施例10~13中獲得之羧基化染色微粒子沈降後，再分散於上述MES緩衝液中，以固體成分濃度成為1重量%之方式調整濃度，獲得羧基化染色微粒子MES緩衝液分散體。對羧基化染色微粒子MES緩衝液分散體10 g添加20 wt%之碳二醯亞胺溶液1 g，使用恆溫振盪槽於25度之環境下反應1小時，反應結束後以10,000 rpm之速度進行30分鐘離心分離。藉由傾析取出沈澱物，添加磷酸緩衝液進行攪拌，使碳二醯亞胺活性化染色微粒子分散於磷酸緩衝液中。與微粒子之清洗同樣地使用離心分離機，反覆進行3次傾析-利用磷酸緩衝液之稀釋，去除未反應之碳二醯亞胺。使用所得之碳二醯亞胺活性化染色微粒子，以與利用物理吸附之抗體結合染色微粒子之製備相同之順序製備利用化學鍵結之抗體結合染色微粒子。
<利用化學鍵結之抗體結合染色微粒子之製備2>
使用離心分離機使胺基化染色微粒子分散液沈降後，再分散於上述磷酸緩衝液中，以固體成分濃度達到1重量%之方式調整濃度，獲得胺基化染色微粒子磷酸緩衝液分散體。對胺基化染色微粒子PBS緩衝液分散體10 g添加25%戊二醛溶液(和光純藥公司製造)1 g，使用恆溫振盪槽於37度之環境下反應2小時，反應結束後以10,000 rpm之速度進行30分鐘離心分離。藉由傾析取出沈澱物，添加磷酸緩衝液進行攪拌，使戊二醛活性化染色微粒子分散於磷酸緩衝液中。與微粒子之清洗同樣地使用離心分離機，反覆進行3次傾析-利用磷酸緩衝液之稀釋，去除未反應之戊二醛。使用所得之戊二醛活性化染色微粒子，以與利用物理吸附之抗體結合染色微粒子之製備相同之順序製備利用化學鍵結之抗體結合染色微粒子。以0.1重量%之濃度添加牛血清蛋白前添加1 g之甘胺酸，由此去除未反應之醛。
<層析評價>
將實施例10~14中獲得之利用化學鍵結之抗體結合染色微粒子、與由實施例1所得之利用物理吸附之抗體結合染色微粒子作為免疫層析用微粒子進行評價。
評價是以與上述相同之順序，以hCG濃度分別為10、1、0 mIU/ml三個水準進行。將評價結果示於以下之表4中。
實施例11~14之利用化學鍵結之抗體結合微粒子即便於hCG濃度為1 mIU/ml時亦可見顯色。該等均係反應性活性基所具有之間隔件之原子數為3以上。相對於此，實施例1之利用物理吸附之抗體結合染色微粒子、及實施例9之利用間隔件之原子數為1之化學鍵結之抗體結合微粒子於hCG濃度為1 mIU/ml時看不到顯色。根據該等結果可知，本發明之有機微粒子亦可藉由化學鍵結承載配位基。
[產業上之可利用性]
本發明之有機著色微粒子作為免疫診斷、免疫層析儀用之標記而有用，可合適地應用於能進行迅速評價之高感度之免疫層析套組。

Claims (7)

  1. 一種有機著色微粒子，其特徵在於：平均粒徑為10nm~1000nm，且顯色強度為1.0~5.0，上述有機著色微粒子之重量之20wt%~90wt%係來源於纖維素，上述有機著色微粒子之重量之10wt%~80wt%為著色成分，且上述著色成分係藉由與纖維素共價鍵結而可染著之反應染料。
  2. 如請求項1之有機著色微粒子，其藉由物理吸附而結合有配位基。
  3. 如請求項1之有機著色微粒子，其具有反應性活性基。
  4. 如請求項3之有機著色微粒子，其中上述反應性活性基具有原子數3以上之間隔基結構。
  5. 如請求項3之有機著色微粒子，其中藉由共價鍵結於上述反應性活性基上結合有配位基。
  6. 一種診斷藥套組，其含有如請求項1至5中任一項之有機著色微粒子。
  7. 如請求項6之診斷藥套組，其係免疫層析套組。
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