JP6978489B2

JP6978489B2 - 膜担体、並びにそれを用いた液体試料検査キット及びその製造方法

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Publication number: JP6978489B2
Application number: JP2019510020A
Authority: JP
Inventors: 雄斗秋山; 健次門田
Original assignee: Denka Co Ltd; Denki Kagaku Kogyo KK
Current assignee: Denka Co Ltd
Priority date: 2017-03-28
Filing date: 2018-03-28
Publication date: 2021-12-08
Anticipated expiration: 2038-03-28
Also published as: CN110337589A; US20200011859A1; EP3605099B1; EP3605099A4; US11162938B2; KR20190127665A; ES2912613T3; WO2018181549A1; EP3605099A1; JPWO2018181549A1

Description

本発明は、膜担体、並びにそれを用いた液体試料検査キット及びその製造方法に関する。

近年、抗原抗体反応等を用いることで、感染症への罹患や妊娠、血糖値等を測定する、ＰｏｉｎｔｏｆＣａｒｅＴｅｓｔ（ＰＯＣＴ、臨床現場即時検査）試薬が注目を集めている。ＰＯＣＴ試薬は、例えば、被検者の傍らで行われる検査、あるいは被検者自らが行う検査試薬であり、短時間で結果の判別が可能、使用方法が簡便、安価であるといった特徴を有する。これらの特徴から、症状が軽度の段階での診察や定期診察等に多く使用されており、今後増加することが予想される在宅医療においても重要な診察ツールとなっている。

多くのＰＯＣＴ試薬では、血液等の液体試料を検査キットに導入し、その中に含まれる特定の被検出物質を検出することで判定を行っている。液体試料から特定の被検出物質を検出する方法としてイムノクロマトグラフィ法がよく用いられている。イムノクロマトグラフィ法とは、検査キットの膜担体上に滴下された液体が膜担体上を移動する中で、被検出物質と、液体試料中に浮遊又は溶解した状態にある、液体試料中の被検出物質と特異的に反応する抗体又は抗原を結合した標識粒子（以下、単に、「粒子」ともいう。）とが結合し、更にこれらが検査キット中に固定化された物質（以下、検出物質という）と特異的に結合し、その結果生じた色や質量の変化等を検出するという手法である。検出物質は、試薬（ｒｅａｇｅｎｔ）と言い換えてもよい。

被検出物質を検出する手法として、標識粒子を用いることで生じる色変化を検知するものがよく知られている。標識粒子としては、着色ラテックス粒子、蛍光ラテックス粒子、金属コロイド粒子等が挙げられる。

上記のように標識粒子を用いた検出手法では、標識粒子の粒子径が大きいほど感度が向上することが知られている。特許文献１〜２では、比濁法を利用した免疫診断においてラテックス径が大きいと光散乱強度も大きくなり、高感度になることが示されている。

上記の色変化を光学的に判定するＰＯＣＴ試薬として、ニトロセルロース膜を用いたラテラルフロー型のキットがよく用いられている。ニトロセルロース膜は、微細な孔を多数有しており、その孔の中を液体試料が毛細管力によって移動する。一方、ニトロセルロース膜の孔は、孔径が数μｍ程度と微細なため、使用できる標識粒子の粒子径に上限があった。

更にニトロセルロース膜は天然物由来であり孔径が一様ではないため、展開可能な標識粒子の粒子径を小さめに設定することで、目詰まり等の不具合が生じないようにする一方で感度が更に低下していた。

また、特許文献１〜４では、比濁法において径の異なる２種以上のラテックス粒子を組み合わせて用いることで、定量測定可能な濃度範囲を広げることができることが示されている。

しかし、イムノクロマトグラフィ法では、微細な孔を有するニトロセルロース膜担体を用いていたため、標識粒子の粒子径が制限されており、径の異なる２種以上のラテックス粒子を組み合わせた場合の性能への影響は不明であった。

特許文献５では微細構造を作製することでニトロセルロース膜担体を用いない液体試料検査キットを示しているが、ラテックス径による性能への影響は示していない。

特公昭６３−１４７８３号公報特許第２５８８１７４号公報特許第３５１３０７５号公報特開平１０−１２３１３７号公報国際公開第２０１６／０９８７４０号

本発明は、上記問題を鑑みて、高感度な判定が可能な膜担体の提供を課題とする。

即ち、本発明は、以下の通りである。
（１）流路を備え、流路の底面に微細構造が設けられ、流路上の少なくとも一部には、抗体又は抗原を結合した粒子が配置されており、粒子の粒子径が５００ｎｍ以上１００μｍ以下である、膜担体。
（２）微細構造の隣接した構造間の平均水平距離が、粒子の粒子径の３倍以上かつ３００μｍ以下である、（１）に記載の膜担体。
（３）粒子が、着色ラテックス粒子及び蛍光ラテックス粒子からなる群より選択される１種以上である、（１）又は（２）に記載の膜担体。
（４）膜担体が、液体試料中の被検出物質を検出する検査キット用の膜担体であり、抗体及び抗原が、液体試料中の被検出物質と特異的に反応する、（１）〜（３）の何れかに記載の膜担体。
（５）膜担体が、液体試料中の被検出物質を検出する検知ゾーンを有する、（４）に記載の膜担体。
（６）検知ゾーンは、被検出物質を検出した際に色変化を示す、（５）に記載の膜担体。
（７）（６）に記載の膜担体の検知ゾーンに、被検出物質を保持することによって色変化を生じせしめる検出物質を固定する工程を備える、液体試料検査キットの製造方法。
（８）（１）〜（６）の何れかに記載の膜担体を有する、液体試料検査キット。

本発明の膜担体によれば、高感度な検査を実施できる。

本発明による実施形態の一例であり、検査キットの模式的な上面図である。本発明による実施形態の一例であり、膜担体の模式的な上面図である。（ａ）は、本発明による実施形態の一例であり、微細構造の俯瞰図（上面図）であり、（ｂ）は、（ａ）に示す微細構造を構成する凸部の斜視図である。（ａ）は、本発明による実施形態の一例であり、微細構造の俯瞰図（上面図）であり、（ｂ）は、（ａ）に示す微細構造を構成する凸部の斜視図である。（ａ）は、本発明による実施形態の一例であり、微細構造の俯瞰図（上面図）であり、（ｂ）は、（ａ）に示す微細構造を構成する凸部の斜視図である。（ａ）は、本発明による実施形態の一例であり、微細構造の俯瞰図（上面図）であり、（ｂ）は、（ａ）に示す微細構造を構成する凸部の斜視図である。本発明による実施形態の一例であり、微細構造を有する膜担体の断面図である。（ａ）は、本発明による実施形態の一例であり、微細構造の俯瞰図（上面図）であり、（ｂ）は、（ａ）に示す微細構造を有する膜担体の断面図である。

以下、本発明の実施形態について説明する。

膜担体は、一実施形態において、液体試料中の被検出物質を検出する液体試料検査キット用の膜担体である。

ここで、被検出物質としては、何ら限定されるものではなく、各種病原体、各種臨床マーカー等、抗体又は抗原と抗原抗体反応することが可能ないかなる物質であってもよい。被検出物質の具体例として、インフルエンザウイルス、ノロウイルス、アデノウイルス、ＲＳウイルス、ＨＡＶ、ＨＢｓ、ＨＩＶ等のウイルス抗原、ＭＲＳＡ、Ａ群溶連菌、Ｂ群溶連菌、レジオネラ属菌等の細菌抗原、細菌等が産生する毒素、マイコプラズマ、クラミジア・トラコマティス、ヒト絨毛性ゴナドトロピン等のホルモン、Ｃ反応性タンパク質、ミオグロビン、心筋トロポニン、各種腫瘍マーカー、農薬、環境ホルモン、梅毒ＴＰ抗体（ＴＰＡｂ）、ピロリ抗体等を例示できるが、これらに限定されるものではない。被検出物質が、特に、インフルエンザウイルス、ノロウイルス、Ｃ反応性タンパク質、ミオグロビン及び心筋トロポニンのような検出と治療措置に急を要する項目の場合にはその有用性が特に大きい。被検出物質は、単独で免疫反応を誘起できる抗原であってもよいし、単独では免疫反応を誘起できないが抗体と抗原抗体反応により結合した場合に免疫反応を誘起できるハプテンであってもよい。被検出物質は、通常、液体試料中で浮遊又は溶解した状態にある。液体試料は、例えば、上記被検出物質を緩衝液に浮遊又は溶解させた試料であってよい。

本実施形態に係る液体試料検査キット（以下、単に「検査キット」ともいう）は、液体試料中の被検出物質を検出する。図１は、検査キットの模式的な上面図である。例えば、図１に示すように、検査キット１８は、膜担体３と、膜担体３を収容する筐体１８ａと、を備える。膜担体３は、その表面に、液体試料が滴下される滴下ゾーン３ｘと、液体試料中の被検出物質を検出するための検知ゾーン３ｙと、を有している。滴下ゾーン３ｘは、筐体１８ａの第一開口部１８ｂにおいて露出している。検知ゾーン３ｙは、筐体１８ａの第二開口部１８ｃにおいて露出している。

図２は、膜担体３の模式的な上面図である。図２に示すように、膜担体３は、液体試料を輸送する少なくとも一つの流路２、及び被検出物質と反応し得るように膜担体上に設けられた標識体（図示せず、詳細は後述）を備えている。標識体は、粒子と、該粒子に結合した抗体又は抗原と、から構成される。抗体及び抗原は、それぞれ液体試料中の被検出物質と特異的に反応する抗体及び抗原であってよい。標識体は、膜担体３の流路２上の少なくとも一部に設けられていてよい。流路２の底面には、微細構造が設けられている（図示せず、詳細は後述）。微細構造は、少なくとも滴下ゾーン３ｘと検知ゾーン３ｙとの間に位置する。膜担体３の表面全体にわたり、微細構造が設けられていてもよい。膜担体３の表面全体が、液体試料の流路２であってよい。微細構造は、毛細管作用を生じせしめる。微細構造の毛細管作用により、液体試料は、微細構造を介して、滴下ゾーン３ｘから検知ゾーン３ｙへ（輸送方向ｄに沿って）輸送される。輸送される過程で、液体試料中の被検出物質と、標識体とが結合する。標識体が結合した被検出物質が検知ゾーン３ｙにおいて検出されると、検知ゾーン３ｙの色が変化する。

膜担体３の全体の形状は、特に限定されないが、例えば、四角形等の多角形、円形、又は楕円形であってよい。膜担体３が四角形である場合、膜担体３の縦幅（短手方向の長さ）Ｌ１は、例えば、２ｍｍ以上１００ｍｍ以下であってよく、膜担体３の横幅（長手方向の長さ）Ｌ２は、例えば、２ｍｍ以上１００ｍｍ以下であってよい。微細構造の高さを除く膜担体の厚みは、例えば、０．１ｍｍ以上１０ｍｍ以下であってよい。

図３〜６及び８は、それぞれ、本実施形態における、流路の底面に設けられた微細構造及びそれを構成する凸部の一例を示す。図３〜６中、（ａ）は、それぞれ微細構造の俯瞰図（上面図）であり、（ｂ）は、それぞれ（ａ）に示す微細構造を構成する凸部の斜視図である。図３〜６及び８に示すように、微細構造７は、凸部８の総体である。つまり、膜担体３は、液体試料の流路２の底面に相当する平坦部９と、平坦部９から突出する複数の凸部８と、を備える。毛細管作用により、複数の凸部８の間の空間が、液体試料を膜担体３の表面に沿って輸送する流路２として機能する。換言すれば、毛細管作用により、微細構造７における空隙が、液体試料を膜担体３の表面に沿って輸送する流路２として機能する。複数の凸部８は、規則的に、又は、並進対称的に、膜担体３の表面上に並んでいてよい。

上記の微細構造７を構成する複数の凸部８の形状は、自由に選択することができる。凸部８の形状としては、例えば、円錐、多角錐、円錐台、多角錐台、円柱、多角柱、半球、半楕円体等が挙げられる。例えば、図３に示すように、凸部８ａの形状は、円錐であってよい。例えば、図４に示すように、凸部８ｂの形状は、四角錐であってもよい。例えば、図５に示すように、凸部８ｃの形状は、六角錐であってもよい。例えば、図６に示すように、凸部８ｄの形状は、横置きの三角柱（三角柱における一側面（四角形の面）が平坦部９に接するように置かれた三角柱）であってもよい。例えば、図８に示すように、凸部８ｅの形状は、円柱であってもよい。微細構造７を俯瞰した（上面から見た）際に膜担体３の全表面を視認でき、被検出物質が検出された際の色変化を光学的手法で確認しやすい点で、これらの中では、円錐や多角錐等の錐体構造が凸部８の形状として適している。

微細構造７を構成する凸部８の形状は、幾何学的に正確な形状である必要はなく、角部が丸みを帯びている形状や表面に微細な凹凸が存在する形状等であってもよい。

上記微細構造７を構成する凸部８の底面１０の径４は、１０μｍ以上１０００μｍ以下であってよく、より好ましくは１５μｍ以上１０００μｍ以下である。凸部８の底面１０の径４は、複数の凸部８間においてこの範囲で変化していてもよい（互いに異なっていてもよい）。凸部８の底面１０の径４が１０μｍ以上である場合、微細構造７を形成するためのモールドの微細加工費が安くなり、面積の大きい膜担体３の表面に無数の微細構造７を均一に作製しやすい。従って、底面１０の径４が１０μｍ以上の凸部８で構成される微細構造は、より実用的である。凸部８の底面１０の径が１０μｍ以上である場合、液体試料を移動させるのに必要な毛細管力がより強まる傾向がある。凸部８の底面１０の径４が１０００μｍ以下である場合、モールドの作製時に金属部材から削りだす金属の体積を低減でき、モールド及び膜担体３の作製費用を抑制できる。凸部８の底面１０の径が１０００μｍ以下である場合、膜担体３における流路２の面積を小さくできるため、液体試料検査キット１８の小型化が図られ、液体試料検査キット１８自体の輸送に有利となる。

凸部８の底面１０の径４は、凸部８の底面１０における代表長さとして定義される。底面１０における代表長さは、底面１０の形状が円の場合は直径、三角形又は四角形の場合は最も短い一辺の長さ、五角形以上の多角形の場合は最も長い対角線の長さ、それ以外の形状の場合は底面１０における最大の長さとする。

図７は、図３に示す微細構造７ａを有する膜担体のＶＩＩ−ＶＩＩ線に沿った矢視断面図である。図３及び図７に示すように、凸部８ａの形状が円錐である場合、凸部８ａの底面１０ａの径４ａは、円錐の底面（円）の直径である。図４に示すように、凸部８ｂの形状が正四角錐である場合、凸部８ｂの底面１０ｂの径４ｂは、底面（正四角形）１０ｂの辺の長さである。図５に示すように、凸部８ｃの形状が正六角錐である場合、凸部８ｃの底面１０ｃの径４ｃは、底面（正六角形）１０ｃの中心を通る対角線の長さ（最も長い対角線の長さ）である。図６に示すように、凸部８ｄの形状が横置きの三角柱である場合、凸部８ｄの底面１０ｄの径４ｄは、底面（長方形）１０ｄの最も短い一辺の長さ（図６では、液体試料の輸送方向ｄと直交する方向の長さ）である。図８（ｂ）は、図８（ａ）に示す微細構造７ｅを有する膜担体のＡ−Ａ線に沿った矢視断面図である。図８に示すように、凸部８ｅの形状が円柱である場合、凸部８ｅの底面の径４ｅは、円柱の底面（円）の直径である。

上記微細構造７を構成する凸部８の高さ６は、好ましくは１０μｍ以上５００μｍ以下であり、より好ましくは１５μｍ以上５００μｍである。凸部８の高さ６は、複数の凸部８間においてこの範囲で変化していてもよい（互いに異なっていてもよい）。凸部８の高さ６が１０μｍ以上である場合、流路２の体積が大きくなり、液体試料がより短時間で展開可能となる。凸部８の高さ６が５００μｍ以下である場合、微細構造７を作製する時間とコストを低減でき、微細構造７の作製がより容易となる。

凸部８の高さ６は、平坦部９に直交する方向における凸部８の最大長さとして定義される。図３及び図７に示すように、凸部８ａの形状が円錐である場合、凸部８ａの高さ６ａは、平坦部９に直交する方向における凸部８ａの最大長さ（円錐の高さ）である。図４に示すように、凸部８ｂの形状が四角錐である場合、凸部８ｂの高さ６ｂは、平坦部９に直交する方向における凸部８ｂの最大長さ（四角錐の高さ）である。図５に示すように、凸部８ｃの形状が六角錐である場合、凸部８ｃの高さ６ｃは、平坦部９に直交する方向における凸部８ｃの最大長さ（六角錐の高さ）である。図６に示すように、凸部８ｄの形状が横置きの三角柱である場合、凸部８ｄの高さ６ｄは、平坦部９に直交する方向における凸部８ｄの最大長さ（横置きの三角柱の高さ）である。図８に示すように、凸部８ｅが円柱である場合、凸部８ｅの高さ６ｅは、平坦部９に直交する方向における凸部８ｅの最大長さ（円柱の高さ）である。

隣接した微細構造間の平均水平距離は、微細構造が、錐体、半球、半楕円体等のように隣接した微細構造間（例えば、凸部８の間）の水平距離が凸部８の高さによって変化するものである場合、図３〜７に示すように、隣接した微細構造間の最も離れた水平距離（最近接中心間距離でもある）５Ａと、隣接した微細構造間の最も近い水平距離５Ｂとの平均値（５Ａ＋５Ｂ）／２である。

また、隣接した微細構造間の平均水平距離は、微細構造が柱体のように隣接した微細構造間の水平距離が高さによって変化しないものである場合、図８（凸部８が円柱体）の隣接した微細構造間の隙間の距離５Ｃに示すように、各微細構造（各凸部８）の隙間の距離５Ｃである。

隣接した微細構造間の平均水平距離は、粒子の粒子径に対して、３倍以上、又は４倍以上であってよく、６００倍以下、又は５００倍以下であってもよい。隣接した微細構造間の平均水平距離が粒子の粒子径の３倍以上である場合、粒子の抵抗による液体試料の流れが滞りキットとして使用できなくなるリスクがより抑制される。

隣接した微細構造間の平均水平距離は、１．５μｍ以上、２．０μｍ以上、又は２．５μｍ以上であってよく、３００μｍ以下、２５０μｍ以下、又は２００μｍ以下であってもよい。隣接した微細構造間の平均水平距離が３００μｍ以下である場合、液体試料と流路との接触面積の減少による毛細管力の減少が抑制され、液体試料を移動させることができないリスクがより抑制される。

隣接した微細構造間の平均水平距離は、粒子の粒子径の３倍以上であり、かつ３００μｍ以下であることが好ましく、粒子の粒子径の４倍以上であり、かつ３００μｍ以下であることがより好ましい。

本実施形態の液体試料検査キット１８の微細構造７及び膜担体３は、熱可塑性プラスチックからなっていてよい。換言すれば、熱可塑性プラスチックからなる膜状の基材を加工することにより、微細構造７を有する膜担体３を作製することができる。加工方法としては、例えば、熱インプリント、ＵＶインプリント、射出成型、エッチング、フォトリソグラフィー、機械切削、レーザー加工等が挙げられる。この中でも安価に精密な加工を施す手法として、熱可塑性プラスチックに対する熱インプリントが適している。熱可塑性プラスチックとしてはポリエステル系樹脂、ポリオレフィン系樹脂、ポリスチレン系樹脂、ポリカーボネート系樹脂、フッ素系樹脂及びアクリル系樹脂等が挙げられ、具体的にはポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）等様々な種類のものを用いることができる。

インプリントや射出成型といった金型を用いた加工方法の場合、錐体は、底面に比べ上部が細くなっているため、同底面の柱体を作製するよりも金型作製時に削り出す体積は少なくて済み、金型を安価に作製することができる。この場合、液体試料中の被検出物質の検出をより安価に行うことが可能となる。

標識体は、粒子と、該粒子に結合した抗体又は抗原と、から構成される。標識体は、抗体又は抗原を介して、被検出物質に結合することができる。

標識体は、検知ゾーン３ｙの上流側（滴下ゾーン３ｘと検知ゾーン３ｙとの間（滴下ゾーン３ｘも含む））の流路上の少なくとも一部に設けられていてよい。標識体は、滴下ゾーン３ｘの少なくとも一部に設けられていてよく、滴下ゾーン３ｘの全体にわたり設けられていてもよい。また、標識体は、検査キット１８に使用される部材と共に流路２に設けられていてもよい。被検出物質と反応（結合）した標識体は、検出物質により（検出物質が被検出物質と反応（結合）することにより）検知ゾーン３ｙに保持される。これにより、検知ゾーン３ｙにおける色変化（標識体による呈色）が生じる。

抗体又は抗原は、結合性断片であってもよい。結合性断片とは、被検出物質と特異的に結合することができる断片をいい、例えば、抗体の抗原結合性断片又は抗原の抗体結合性断片をいう。

粒子としては、例えば、コロイド粒子、ラテックス粒子等が挙げられる。粒子は、磁性又は蛍光発光性を有してもよい。コロイド粒子としては、金コロイド粒子、白金コロイド粒子の金属コロイド粒子等が挙げられる。粒子は、粒径制御、分散安定性及び結合容易性の点で、好ましくはラテックス粒子である。ラテックス粒子の材料としては特に限定されないが、ポリスチレンが好ましい。

粒子は、視認性の点で、好ましくは着色粒子又は蛍光粒子であり、より好ましくは着色粒子である。着色粒子は、肉眼で色が検出可能なものであればよい。蛍光粒子は、蛍光物質を含有すればよい。粒子は、着色ラテックス粒子又は蛍光ラテックス粒子であってよい。粒子が着色ラテックス粒子である場合、上述の色変化が、目視により好適に判定される。また、粒子が蛍光ラテックス粒子である場合、上述の色変化が、蛍光強度の測定により好適に判定される。

粒子の粒子径は、５００ｎｍ以上１００μｍ以下である。粒子の粒子径は、６００ｎｍ以上、８００ｎｍ以上、１μｍ以上、１．２μｍ以上、１．５μｍ以上、２μｍ以上、又は２．５μｍ以上であってもよく、８０μｍ以下、６０μｍ以下、５０μｍ以下、２０μｍ以下、１０μｍ以下、５μｍ以下であってもよい。粒子の粒子径は、好ましくは、６００ｎｍ以上８０μｍ以下、８００ｎｍ以上６０μｍ以下、１μｍ以上５０μｍ以下、１．２μｍ以上２０μｍ以下、又は２μｍ以上１０μｍ以下である。５００ｎｍより小さい場合は、粒子が検知ゾーン３ｙで固定化された際の色変化が小さく、検出感度が低くなる可能性がある。１００μｍよりも大きい場合は、粒子の抵抗により液体試料の流れが滞りキットとして使用できなくなる可能性がある。

粒子径は、動的光散乱法により測定される粒子の直径を意味する。動的光散乱法については、例えば、特許第５１４７０１１号公報及びベックマン・コールター社のホームページ（「動的光散乱法の測定原理」、<URL: https://beckman.jp/column/particle/m_principle/>）に記載されている。

より高感度の検査を可能とする点から、粒子は、粒子径の異なる粒子を組み合わせることが好ましい。この理由を、本発明者等は、以下のとおりと推察する。粒子径によって微細構造に接触した際の検出物質との接触面積が異なるため、抗原抗体反応に要する時間が異なる。反応時間は液体試料の流速によって影響を受け、更に流速は流路中の底面からの高さによって変化する。粒子径によって検出物質と反応しやすい流速が異なるため、微細構造に付着しやすい高さが異なる。その結果、複数種の粒子を微細構造に展開すると、構造の上部に付着しやすいものと下部に付着しやすいものとに分かれるため、１種のみの粒子を展開した際よりも総付着面積が多くなる。そのため被検出物質を検出しやすくなり感度が向上する。

粒子径が異なる複数種の粒子を使用することが好ましく、粒子径が異なる２種の粒子を使用することがより好ましい。粒子径が異なる２種の粒子を使用する場合、粒子径が小さい方の粒子をＰ１、粒子径が大きい方の粒子をＰ２としたときに、その質量比（Ｐ１／Ｐ２）が、好ましくは１０／９０〜９０／１０であり、より好ましくは３０／７０〜７０／３０であり、更に好ましくは５０／５０である。

以上説明したとおり、膜担体３は、膜担体３の一面上に設けられた微細構造７と、微細構造７により形成された、液体試料を輸送する流路２と、被検出物質と反応し得るように膜担体３上に設けられ、粒子及び該粒子に結合した抗体又は抗原を有する標識体と、を備え、粒子の粒子径が、５００ｎｍ以上１００μｍ以下である。膜担体３は、液体試料中の被検出物質を検出する液体試料検査キット１８用の膜担体３であってよい。

本実施形態に係る液体試料検査キット１８では、膜担体３が有する検知ゾーン３ｙは、被検出物質を検出された際に色変化を示す。色変化は、光学的手法で確認可能な色変化であってよい。

上記光学的手法としては、主に目視による判定と蛍光強度を測定する手法の２つが挙げられる。目視によって判定する場合には、検知前と検知後の色をＣＩＥ１９７６Ｌ^＊ａ^＊ｂ^＊色空間の表色系で測定した際の、２つの色刺激間の色差（ＪＩＳＺ８７８１−４：２０１３に記載のΔＥ）が０．５以上となるような色変化が生じることが好ましい。この色差が０．５以上であると、色の違いを目視で確認することが容易になる。蛍光強度を測定して判定する場合には、検知ゾーン３ｙでの蛍光強度（Ｆｌ１）と、検知ゾーン３ｙに隣接する上流域および下流域での蛍光強度（Ｆｌ２）との比（Ｆｌ１／Ｆｌ２）＝１０／１以上となるような色変化が生じることが好ましい。この比が１０／１以上であると、シグナルとノイズの分離が容易になる。

本実施形態の液体試料検査キット１８に検知ゾーン３ｙを作製するためには、一実施形態において、流路２の少なくとも一部に、検出物質が固定化されている。つまり、検知ゾーン３ｙには、被検出物質を検出する検出物質が固定されている。検知ゾーン３ｙにおける色変化は、被検出物質が検出物質により（検出物質と反応して）検知ゾーン３ｙに保持されることによって生じる。

言い換えれば、液体試料検査キット１８の製造方法は、検知ゾーン３ｙに、被検出物質を検知ゾーン３ｙに保持することによって色変化を生じせしめる検出物質を固定する工程を備えている。検知ゾーン３ｙに検出物質（試薬）をより効率よく固定化できる点から、膜担体３における検知ゾーン３ｙを設ける箇所に予め表面処理を施していてよい。

上記表面処理の方法としては、何ら限定されるものではなく、例えばＵＶ照射、ＵＶ／オゾン処理、各種プラズマ処理、３−ＡｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌｔｒｉｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅやＧｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅによる表面修飾等の種々の方法を用いることができる。

本実施形態において、上記検出物質（試薬）としては、例えば、抗体が挙げられる。抗体は、被検出物質と抗原抗体反応する抗体であり、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。

検知ゾーン３ｙにおける色変化は、粒子と該粒子に結合した抗体又は抗原とを有する標識体によって生じるものであってよい。色変化は、例えば、標識体が、検出物質により（検出物質と反応（結合）して）検知ゾーン３ｙに保持されて呈色することによって生じる。

本実施形態の一側面に係る液体試料の検査方法は、検査キット１８を用いる検査方法である。

検査キット１８を用いる、液体試料の検査方法は、液体試料と、液体試料中の被検出物質と特異的に結合する標識体とを混合して混合液体試料（混合済み液体試料）を調製し、被検出物質と標識体とを互いに結合させる工程と、混合液体試料を膜担体３に設けられた滴下ゾーン３ｘに滴下する工程と、微細構造７により、混合液体試料を滴下ゾーン３ｘから検知ゾーン３ｙへ輸送する工程と、検知ゾーン３ｙにおける色変化（標識体の呈色）を検知する工程と、を備えてよい。

また、例えば、上記検査方法は、液体試料を、膜担体３の表面のうち滴下ゾーン３ｘに滴下する工程と、膜担体３の表面に形成されている微細構造７（複数の凸部８）が奏する毛細管作用により、微細構造７を介して、液体試料を滴下ゾーン３ｘから検知ゾーン３ｙへ輸送する工程と、輸送過程において、液体試料中の被検出物質を、上記の抗体又は抗原を介して標識体と結合させ、更に、被検出物質を、検知ゾーン３ｙに固定された試薬と結合させて、検知ゾーン３ｙにおける色変化を検知する（色変化の有無を光学的に判定する）工程と、を備えてよい。

上記の検査方法の被検出物質と標識体とを互いに結合させる工程では、液体試料と標識体とを混合する方法は特に制限されない。例えば標識体の入れられた容器に液体試料を添加する方法でもよいし、例えば標識体をふくむ液体と液体試料とを混合してもよい。また例えば液体試料の入れられた容器の滴下口にフィルターを挟み、そのフィルター中に標識体を固定化していてもよい。

以下、本実施形態を具体的に説明するが、本実施形態はこれらの実験例に限定されるものではない。

［実験例１］
＜モールドの準備＞
モールドは、レーザー加工及び機械切削によって作製した。このモールドはアルミ合金Ａ５０５２製である。この金型の中心部には、径（直径）が２５μｍ、最近接中心間距離（最も離れた水平距離）が３０μｍ、隣接した微細構造間の最も近い水平距離（最も近い水平距離）が５μｍ、平均距離が１７．５μｍ、深さが３０μｍの円錐型の凹部が、図３のような三角配列形式で３ｃｍ×３ｃｍの範囲に加工されている。
上記のモールドの凹凸面に対し、転写した際のモールドと熱可塑性プラスチックの剥離を容易かつ確実にするため、離型処理を施した。離型処理の手法は、ダイキン工業株式会社製オプツールＨＤ−２１００ＴＨに約１分浸し、乾燥させたのち、一晩静置することで行った。

＜微細構造の転写＞
上記のようにして得られたモールドを用いて、熱可塑性プラスチックに微細構造を転写した。熱可塑性プラスチックとしては、ポリスチレン（デンカ株式会社製デンカスチレンシート、膜厚３００μｍ）を用いた。加工方法として熱インプリントを用い、装置はＳＣＩＶＡＸ社製Ｘ−３００を用いた。成形温度は１２０℃、印加圧力は５．５ＭＰａとし、１０分間転写を行った。転写後は、圧力を印加したまま熱可塑性プラスチックとモールドを８０℃まで冷却し、その後圧力を除くことで、膜担体を作製した。
作製した膜担体において、最も離れた水平距離、最も近い水平距離、平均距離、凸部の直径、凸部の高さを表１に示す。凸部は円錐である。微細構造（凸部）の高さを除く膜担体の厚みは、０．２ｍｍである。

＜検知ゾーンの作製＞
上記のように作製した膜担体の下端から０．６ｃｍと１．０ｃｍの位置に、抗Ａ型インフルエンザＮＰ抗体浮遊液、並びに抗Ｂ型インフルエンザＮＰ抗体浮遊液を各々３ｃｍ塗布し（塗布量は各３μＬ）、温風下で良く乾燥させ、検出物質を固定化した。

＜標識物質のセット＞
精製抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体（上記と別の抗体）及び精製抗Ｂ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体（上記と別の抗体）を使用した。抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体に粒子径０．２μｍの赤色ラテックス粒子（ＳＣ−０４２−Ｒポリスチレンラテックス粒子着色ラテックス粒子ＪＳＲライフサイエンス社製）を共有結合で標識し、糖、界面活性剤及びタンパク質を含むトリス緩衝液にラテックス粒子の濃度が０．０２５質量体積％（ｗ／ｖ％）になるように懸濁し、超音波処理を行って充分に分散浮遊させた抗Ａ型標識体を調製した。同様に抗Ｂ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体に青色ラテックス粒子を標識した抗Ｂ型標識体を調製した。

抗Ａ型標識体と抗Ｂ型標識体とを混合し、大きさが３ｃｍ×１ｃｍのガラス繊維(３３ＧＬＡＳＳＮＯ．１０５３９７６６Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ製)に１平方センチメートルあたり５０μＬになる量を塗布し、温風下で良く乾燥させ、標識体パッドを作製した。その後作製した膜担体の端部２ｍｍだけ標識物質パッドを重ね、カッターで幅５ｍｍの短冊に裁断して一体化された液体試料検査キットを作製した。

＜検知評価＞
上記のように作製された液体試料検査キットの端部に、液体試料を１００μＬ滴下した。液体試料は、希釈溶液としてデンカ生研株式会社製クイックナビ―Ｆｌｕに付属している検体浮遊液を用いた。Ａ型インフルエンザウイルスＡ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／３２／９２（Ｈ３Ｎ２）の希釈倍率を２×１０^４から大きくしていった際、試験開始１０分後に着色ラインの有無を目視できなくなる希釈倍率（Ａ型目視判定可能な限界倍率）を求めた。その希釈倍率の１／２の希釈倍率で検査した際に、試験開始してから着色ラインの色の濃さが安定するまでの時間（Ａ型の濃さが安定するまでの時間）を検出時間として求めた。その結果を表１〜２に示す。

上記のように作製された液体試料検査キットの端部に、液体試料を１００μＬ滴下した。液体試料は、希釈溶液としてデンカ生研社製クイックナビ―Ｆｌｕに付属している検体浮遊液を用いた。Ｂ型インフルエンザウイルスＢ／Ｓｈａｎｇｄｏｎｇ／７／９７の希釈倍率を２×１０^３から大きくしていった際、試験開始１０分後に着色ラインの有無を目視できなくなる希釈倍率（Ｂ型目視判定可能な限界倍率）を求めた。その希釈倍率の１／２の希釈倍率で検査した際に、試験開始してから着色ラインの色の濃さが安定するまでの時間（Ｂ型の濃さが安定するまでの時間）を検出時間として求めた。その結果を表１に示す。

表１中の検出時間は、Ａ型の濃さが安定するまでの時間と、Ｂ型の濃さが安定するまでの時間との平均値を意味する。

目視判定可能な限界倍率に基づく総合評価は、以下の基準に基づいて評価した。結果を表１に示す。
Ａ：目視判定可能な限界倍率が７×１０^３以上かつ検出時間が７分以下であるもの。
Ｂ：Ａ、Ｃ及びＤに該当しないもの。
Ｃ：目視判定可能な限界倍率が３×１０^３より大きく４×１０^３以下、又は検出時間が１０分以上であるもの。
Ｄ：目視判定可能な限界倍率が３×１０^３以下であるもの。

［実験例２］
実験例１における微細構造を、ラテックス粒子径を２００μｍとした以外は、実験例１と同様の条件で実験を行った。作製した膜担体において、凸部は円錐であり、最も離れた水平距離、最も近い水平距離、平均距離、凸部の直径、及び凸部の高さを表に示す。

［実験例３］
実験例１におけるラテックス粒子径を０．５μｍとした以外は、実験例１と同様の条件で実験を行った。作製した膜担体において、凸部は円錐であり、最も離れた水平距離、最も近い水平距離、平均距離、凸部の直径、及び凸部の高さを表に示す。

［実験例４］
実験例１におけるラテックス粒子径を１μｍとした以外は、実験例１と同様の条件で実験を行った。作製した膜担体において、凸部は円錐であり、最も離れた水平距離、最も近い水平距離、平均距離、凸部の直径、及び凸部の高さを表に示す。

［実験例５］
実験例１におけるラテックス粒子径を５μｍとした以外は、実験例１と同様の条件で実験を行った。作製した膜担体において、凸部は円錐であり、最も離れた水平距離、最も近い水平距離、平均距離、凸部の直径、及び凸部の高さを表に示す。

［実験例６］
実験例１における微細構造を、径が８０μｍ、最も離れた水平距離が１００μｍ、最も近い水平距離が２０μｍ、平均距離が６０μｍ、深さが１００μｍの円錐型の凹部とし、更にラテックス粒子径を１μｍとした以外は、実験例１と同様の条件で実験を行った。作製した膜担体において、凸部は円錐であり、最も離れた水平距離、最も近い水平距離、平均距離、凸部の直径、及び凸部の高さを表に示す。

［実験例７］
実験例１における微細構造を、径が８０μｍ、最も離れた水平距離が１００μｍ、最も近い水平距離が２０μｍ、平均距離が６０μｍ、深さが１００μｍの円錐型の凹部とし、更にラテックス粒子径を５μｍとした以外は、実験例１と同様の条件で実験を行った。作製した膜担体において、凸部は円錐であり、最も離れた水平距離、最も近い水平距離、平均距離、凸部の直径、及び凸部の高さを表に示す。

［実験例８］
実験例１における微細構造を、径が８０μｍ、最も離れた水平距離が１００μｍ、最も近い水平距離が２０μｍ、平均距離が６０μｍ、深さが１００μｍの円錐型の凹部とし、更にラテックス粒子径を２０μｍとした以外は、実験例１と同様の条件で実験を行った。作製した膜担体において、凸部は円錐であり、最も離れた水平距離、最も近い水平距離、平均距離、凸部の直径、及び凸部の高さを表に示す。

［実験例９］
実験例１における微細構造を、径が３００μｍ、最も離れた水平距離が４５０μｍ、最も近い水平距離が１５０μｍ、平均距離が３００μｍ、深さが４５０μｍの円錐型の凹部とし、更にラテックス粒子径を５μｍとした以外は、実験例１と同様の条件で実験を行った。作製した膜担体において、凸部は円錐であり、最も離れた水平距離、最も近い水平距離、平均距離、凸部の直径、及び凸部の高さを表に示す。

［実験例１０］
実験例１における微細構造を、径が３００μｍ、最も離れた水平距離が４５０μｍ、最も近い水平距離が１５０μｍ、平均距離が３００μｍ、深さが４５０μｍの円錐型の凹部とし、更にラテックス粒子径を２０μｍとした以外は、実験例１と同様の条件で実験を行った。作製した膜担体において、凸部は円錐であり、最も離れた水平距離、最も近い水平距離、平均距離、凸部の直径、及び凸部の高さを表に示す。

［実験例１１］
実験例１における微細構造を、径が３００μｍ、最も離れた水平距離が４５０μｍ、最も近い水平距離が１５０μｍ、平均距離が３００μｍ、深さが４５０μｍの円錐型の凹部とし、更にラテックス粒子径を１００μｍとした以外は、実験例１と同様の条件で実験を行った。作製した膜担体において、凸部は円錐であり、最も離れた水平距離、最も近い水平距離、平均距離、凸部の直径、及び凸部の高さを表に示す。

［実験例１２］
実験例１において、粒子径０．５μｍのラテックス粒子を０．０２５ｗ／ｖ％懸濁させた溶液と粒子径１μｍのラテックス粒子を０．０２５ｗ／ｖ％懸濁させた溶液を等量混合し、その溶液を用いて標識体パッドを作製した以外は、実験例１と同様の条件で実験を行った。作製した膜担体において、凸部は円錐であり、最も離れた水平距離、最も近い水平距離、平均距離、凸部の直径、及び凸部の高さを表に示す。

［実験例１３］
実験例１において、粒子径１μｍのラテックス粒子を０．０２５ｗ／ｖ％懸濁させた溶液と粒子径５μｍのラテックス粒子を０．０２５ｗ／ｖ％懸濁させた溶液を等量混合し、その溶液を用いて標識体パッドを作製し、更に微細構造を、径が８０μｍ、最も離れた水平距離が１００μｍ、最も近い水平距離が２０μｍ、平均距離が６０μｍ、深さが１００μｍの円錐型の凹部とした以外は、実験例１と同様の条件で実験を行った。作製した膜担体において、凸部は円錐であり、最も離れた水平距離、最も近い水平距離、平均距離、凸部の直径、及び凸部の高さを表に示す。

［実験例１４］
実験例１において、粒子径５μｍのラテックス粒子を０．０２５ｗ／ｖ％懸濁させた溶液と粒子径２０μｍのラテックス粒子を０．０２５ｗ／ｖ％懸濁させた溶液を等量混合し、その溶液を用いて標識体パッドを作製し、更に微細構造を、径が３００μｍ、最も離れた水平距離が４５０μｍ、最も近い水平距離が１５０μｍ、平均距離が３００μｍ、深さが４５０μｍの円錐型の凹部とした以外は、実験例１と同様の条件で実験を行った。作製した膜担体において、凸部は円錐であり、最も離れた水平距離、最も近い水平距離、平均距離、凸部の直径、及び凸部の高さを表に示す。
［実験例１５］
実験例１におけるラテックス粒子径を０．４μｍとした以外は、実験例１と同様の条件で実験を行った。作製した膜担体において、凸部は円錐であり、最も離れた水平距離、最も近い水平距離、平均距離、凸部の直径、及び凸部の高さを表に示す。

［実験例１６〜２７］
用いる粒子を着色ラテックス粒子から蛍光ラテックス粒子（ｍｉｃｒｏｍｅｒ−Ｆ蛍光ラテックス粒子材料ポリスチレンコアフロント社製）に変更し、試験開始１０分後に着色ラインの有無をイムノクロマトリーダ（Ｃ１１７８７浜松ホトニクス社製）で読み取りできなくなる倍率（蛍光判定可能な限界倍率）、即ち、Ｓ／Ｎ比が１０以下を示す倍率を求めた。これ以外の内容は実験例３〜１４と同様に行った。作製した膜担体において、最も離れた水平距離、最も近い水平距離、平均距離、蛍光ラテックス粒子の粒子径（蛍光ラテックス粒子径）、凸部の直径、及び凸部の高さを表２に示す。

蛍光判定可能な倍率に基づく総合評価は、以下の基準に基づいて評価した。結果を表２に示す。
Ａ：蛍光判定可能倍率が５×１０^４以上のもの。
Ｂ：Ａ及びＣに該当しないもの。
Ｃ：蛍光判定可能倍率が１×１０^４以上２×１０^４以下のもの。

表１〜２の結果から、本実施形態による液体試料検査キットは、流路中の微細構造のサイズとそれに応じた標識体を展開することで、高感度な検査が実施可能であることが示された。粒子の粒子径が小さい場合、限界倍率が小さくなり、感度が小さい（実験例１、実験例１５）。粒子の粒子径が大きい場合、標識体を展開できず、検査が出来ない（実験例２）。

本実施形態は、被検出物質が検出されたことが光学的に確認可能なイムノクロマトグラフィ法において、高感度な判定が可能な検査キットの提供を課題とする。本実施形態の液体試料検査キットは、高感度な検査を安価に実施することができるため、使い捨て可能なＰＯＣＴ試薬に有用である。

２流路
３微細構造が設けられた膜担体
３ｘ滴下ゾーン
３ｙ検知ゾーン
４，４ａ，４ｂ，４ｃ，４ｄ，４ｅ凸部の底面における代表長さ（凸部の底面の径）
５Ａ隣接した微細構造間の最も離れた水平距離（最近接中心間距離）
５Ｂ隣接した微細構造間の最も近い水平距離（最近接微細構造間距離）
５Ｃ隣接した微細構造間の隙間の距離
６，６ａ，６ｂ，６ｃ，６ｄ凸部の高さ
７，７ａ，７ｂ，７ｃ，７ｄ，７ｅ微細構造
８，８ａ，８ｂ，８ｃ，８ｄ，８ｅ凸部
９平坦部
１０，１０ａ，１０ｂ，１０ｃ，１０ｄ凸部の底面
１８液体試料用の検査キット
１８ａ筐体
１８ｂ第一開口部
１８ｃ第二開口部
ｄ液体試料の流れる方向（輸送方向）

Claims

流路を備え、
前記流路の底面に微細構造が設けられ、
前記微細構造が、液体試料の輸送方向に沿って並んでいる複数の凸部を有し、
前記流路上の少なくとも一部には、抗体又は抗原を結合した粒子が配置されており、前記粒子の粒子径が１μｍ以上１００μｍ以下であり、
前記粒子が、着色ラテックス粒子及び蛍光ラテックス粒子からなる群より選択される１種以上である、膜担体。
前記微細構造の隣接した構造間の平均水平距離が、前記粒子の粒子径の３倍以上かつ３００μｍ以下である、請求項１に記載の膜担体。
前記膜担体が、液体試料中の被検出物質を検出する検査キット用の膜担体であり、
前記抗体及び前記抗原が、前記液体試料中の被検出物質と特異的に反応する、請求項１又は２に記載の膜担体。
前記膜担体が、前記液体試料中の被検出物質を検出する検知ゾーンを有する、請求項３に記載の膜担体。
前記検知ゾーンは、前記被検出物質を検出した際に色変化を示す、請求項４に記載の膜担体。
請求項５に記載の膜担体の前記検知ゾーンに、前記被検出物質を保持することによって前記色変化を生じせしめる検出物質を固定する工程を備える、液体試料検査キットの製造方法。
請求項１〜５の何れか一項に記載の膜担体を有する、液体試料検査キット。