JP6320711B2 - 油溶性色素含有診断薬用着色ラテックス粒子 - Google Patents
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Description
重量色素量率(%)=油溶性色素量(g)/{油溶性色素量(g)+ラテックス乾燥重量(g)}×100・・・(1)
[2]合成高分子がスチレンおよびスチレンスルホン酸塩、親水性カルボキシモノマーからなる上記[1]に記載の診断薬用着色ラテックス粒子。
[3]油溶性色素が下記式(2)において0.3重量%以上の値をとることができる油溶性色素である上記[1]又は[2]に記載の診断薬用着色ラテックス粒子。
色素溶液の重量%濃度=油溶性色素(g)/{油溶性色素量(g)+水溶性有機溶媒(g)}×100・・・(2)
[4]油溶性色素がフタロシアニン系金属錯体を含む油溶性色素からなる上記[1]〜[3]のいずれかに記載の診断薬用着色ラテックス粒子。
[5]抗原または抗体を化学吸着により担持することを特徴とする上記[1]〜[4]のいずれかに記載の診断薬用着色ラテックス粒子。
[6]上記[1]〜[5]のいずれかに記載の診断薬用着色ラテックス粒子を用いる免疫測定試薬。
粒子径の変動係数(CV値)=粒子径の標準偏差/平均粒子径
重量色素量率(%)=油溶性色素量(g)/{油溶性色素量(g)+ラテックス乾燥重量(g)}×100・・・(1)
ここで、実際の重量色素量率は次のようにして算出する。色素溶液の吸収スペクトルを測定し、色素の最大吸収波長を測定しておく。色素と着色前の粉体化したラテックス粒子粉体を任意の割合で有機溶媒に溶解し、色素の最大吸収波長での吸光度を測定する。色素濃度と吸光度測定値から検量線が作成できる。作製した着色ラテックスを粉体化して秤量し、有機溶媒に溶解させて最大吸収波長での吸光度を測定することで着色ラテックス粒子に含まれる色素量を検量線から算出し重量色素量率とする。
色素溶液の重量%濃度=油溶性色素(g)/{油溶性色素量(g)+水溶性有機溶媒(g)}×100・・・(2)
使用しようとする油溶性色素の上記式(2)の値が0.3重量%以上のものであるか否かは、油溶性色素の水溶性有機溶媒溶液をろ過し、溶解せずにろ取される油溶性色素の重量を測定することにより判定することができる。
色素仕込み量(%)=仕込み油溶性色素量(g)/{仕込み油溶性色素量(g)+ラテックス乾燥重量(g)}×100・・・(3)
本発明で着色されるポリマー系ラテックス粒子はソープフリー乳化重合法を用いて作製した。まず、反応容器にイオン交換水1200mL、モノマーとして、スチレン120mL、メタクリル酸16mLを加え攪拌し、その後、反応容器内を窒素置換した。反応容器内の温度が70℃に達した後、3%(w/v)過硫酸カリウム水溶液13mLを滴下した。3%(w/v)過硫酸カリウム水溶液の滴下から24時間後、反応を停止し、濾過してポリマー系ラテックス粒子懸濁液を得た。
油溶性色素(OIL GREEN 201)2.5gをメタノール397.5gに溶解させたこと(この時、濾紙上には沈渣はなく、すべて色素は溶解していた。)以外は、実施例1と同様に着色ラテックス粒子を得た (色素仕込み量(%)=2.5/(2.5+2.25)×100=53%、色素溶液の重量%濃度=2.5/(2.5+397.5)×100=0.63重量%となる。)。また、同様に、重量色素量率(%)を算出した(表1参照)。
油溶性色素(OIL GREEN 201)1.5gを油溶性色素(OIL BLUE BOM)2.5gに変更しメタノール397.5gに溶解させたこと(この時、濾紙上には沈渣はなく、すべて色素は溶解していた。)以外は、実施例1と同様に着色ラテックス粒子を得た。(色素仕込み量(%)=2.5/(2.5+2.25)×100=53%、色素溶液の重量%濃度=2.5/(2.5+397.5)×100=0.63重量%となる)。また、同様に、重量色素量率(%)を算出した(表1参照)。
油溶性色素(OIL GREEN 201)0.5gをメタノール397.5gに溶解させたこと(この時、濾紙上には沈渣はなく、すべて色素は溶解していた。)以外は、実施例1と同様に着色ラテックス粒子を得た。(色素仕込み量(%)=0.5/(0.5+2.25)×100=18%、色素溶液の重量%濃度=0.5/(0.5+397.5)×100=0.13重量%となる)。また、同様に、重量色素量率(%)を算出した(表1参照)。
油溶性色素(OIL GREEN 201)2.5gをメタノール1987.5gに溶解させたこと(この時、濾紙上には沈渣はなく、すべて色素は溶解していた。)以外は、実施例1と同様に着色ラテックス粒子を得た。(色素仕込み量(%)=2.5/(2.5+2.25)×100=53%、色素溶液の重量%濃度=2.5/(2.5+1987.5)×100=0.13重量%となる)。また、同様に、重量色素量率(%)を算出した(表1参照)。
油溶性色素(OIL GREEN 201)0.5gをメタノール79.5gに溶解させたこと(この時、濾紙上には沈渣はなく、すべて色素は溶解していた。)以外は、実施例1と同様に着色ラテックス粒子を得た。(色素仕込み量(%)=0.5/(0.5+2.25)×100=18%、色素溶液の重量%濃度=0.5/(0.5+79.5)×100=0.63重量%となる)。また、同様に、重量色素量率(%)を算出した(表1参照)。
油溶性色素(OIL GREEN 201)1.5gを油溶性色素(OIL GREEN 502(オリエント化学工業社製))0.5gに変更し、メタノール397.5gに溶解させたこと(この時、濾紙上には沈渣はなく、すべて色素は溶解していた。)以外は、実施例1と同様に着色ラテックス粒子を得た。(色素仕込み量(%)=0.5/(0.5+2.25)×100=18%、色素溶液の重量%濃度=0.5/(0.5+397.5)×100=0.13重量%となる)。また、同様に、重量色素量率(%)を算出した(表1参照)。
油溶性色素(OIL GREEN 201)1.5gを油溶性色素(OIL GREEN 502)2.5gに変更し、メタノール397.5gに溶解させたこと以外は、実施例1と同様に着色ラテックス粒子作製を試みた。この時、色素仕込み量(%)=2.5/(2.5+2.25)×100=53%、色素溶液の重量%濃度=2.5/(2.5+397.5)×100=0.63重量%となる。しかし、濾紙上には沈渣が残り、色素溶液は飽和溶解度に達しており、色素仕込み量(%)53%および重量%濃度0.63重量%には至らず、製造途中で凝集し、着色ラテックス粒子を得ることはできなかったので表中重量色素量率を「×」と表記した。また、試薬性能評価を行うことはできなかった(表1参照)。
油溶性色素(OIL GREEN 201)1.5gを油溶性色素(OIL GREEN 502(オリエント化学工業社製))2.5gに変更し、メタノールを397.5gから1987.5gに変更し、溶解させたこと(この時、濾紙上には沈渣はなく、すべて色素は溶解していた。)以外は、実施例1と同様に着色ラテックス粒子を得た。(色素仕込み量(%)=2.5/(2.5+2.25)×100=53%、色素溶液の重量%濃度=2.5/(2.5+1987.5)×100=0.13重量%となる)。また、同様に、重量色素量率(%)を算出した(表1参照)。
<インフルエンザウィルス測定用イムノクロマトグラフ法試薬の作製>
1.青色着色ラテックス粒子標識抗A型インフルエンザウィルス抗体の調製
(1)下記(i)から(iv)を準備し、(i)5mL、(ii)0.2mL及び(iii)0.8mLを加えて攪拌後、これに(iv)を4mL添加し、室温で2時間攪拌した。
(2)上記(1)で得られた溶液を13,000rpmで10分間遠心分離し、上清を除去後、10%スクロース含有2%ウシ血清アルブミン(BSA)水溶液を10mL添加し、さらに2時間攪拌後、13,000rpmで10分間遠心分離し、コンジュゲートを得た。
(3)上記(2)により得られたコンジュゲートに対し、10%スクロース含有2%BSA水溶液を10mL添加しコンジュゲートを懸濁させて、青色着色ラテックス粒子標識抗A型インフルエンザウィルス抗体を得た。
(i)2%青色着色ラテックス粒子を含む20mM MES(pH6.5)緩衝液
(ii)20mM MES(pH6.5)緩衝液
(iii)架橋剤1-ethl-3-[3-(dimethylamino)propyl]carbodiimide(EDC) 15mg/mL
(iv)2.5mg/mL抗A型インフルエンザウィルスモノクロナール抗体を含む20mM MES(pH6.5)緩衝液試薬性能評価において、コンジュゲートの吸光度の測定は、669nm(青色着色ラテックス粒子の最大吸収波長)で測定した。
(1)下記(i)から(iv)を準備し、(i)5mLに、(ii)1.4mL、(iii)1.6mLを加えて攪拌後、(iv)2mLを添加し、室温で2時間攪拌した。
(2)上記(1)で得られた溶液を13,000rpm10分間遠心分離し、上清を除去後、10%スクロース含有2%BSA水溶液を10mL添加し、さらに2時間後、13,000rpmで10分間遠心分離し、コンジュゲートを得た。
(3)上記(2)で得られたコンジュゲートに対し、10%スクロース含有2%BSA水溶液を10mL添加しコンジュゲートを懸濁させて、緑色着色ラテックス粒子標識KLHを得た。
(i)2%緑色着色ラテックス粒子を含む20mM MES(pH6.5)緩衝液
(ii)20mM MES(pH6.5)緩衝液
(iii)架橋剤1-ethl-3-[3-(dimethylamino)propyl]carbodiimide(EDC) 15mg/mL
(iv)0.5mg/mL KLHを含む20mM MES(pH6.5)緩衝液
試薬性能評価において、コンジュゲートの吸光度の測定は、678nm(緑色着色ラテックス粒子の最大吸収波長)で測定した。
上記1.および上記2.で調製したコンジュゲートを青色6.4 OD/mL、緑色6.5 OD/mLとなるように、0.5%カゼイン及び10%スクロース含有トリス緩衝液(pH8.5)と混合してコンジュゲート溶液を作製した。次に、22.0mm×254mm×0.56mm(幅×長さ×厚さ)のグラスファイバー製パッド(Lydall社製)にイムノクロマトグラフ法用のディスペンサー「XYZ3050」(BIO DOT社製)を用いて該コンジュゲート溶液を10μl/cmで滲みこませた。その後、ドライオーブン内で70℃、30分間加温して乾燥させ、コンジュゲート塗布パッドとした。また、界面活性剤(例えば、エマルゲン150(花王社製)、アミート320(花王社製))などを添加する場合には、前記コンジュゲート溶液に必要量を添加後、同様の操作を行えばよい。
25.0mm×254mm×0.235mm(短辺×長辺×厚さ)のニトロセルロース膜(Sartorius社製)に、0.75mg/mLに調製した前記青色着色ラテックス粒子標識抗A型インフルエンザウィルス抗体とはエピトープを異にする抗A型インフルエンザウィルス抗体、0.75mg/mLに調製した抗KLH抗体、及び2.5%スクロースを含む10mMリン酸緩衝液(pH 7.2)を、幅約1mmのライン状に塗布した。塗布は、イムノクロマトグラフ法用のディスペンサー「XYZ3050」(BIO DOT社製)を用い、吐出量を1uL/cmとなるように設定した。ライン塗布後のニトロセルロース膜をドライオーブン内で70℃、45分間乾燥させ、抗インフルエンザウィルス抗体固定化膜とした。
プラスチック製粘着シートに上記抗インフルエンザウィルス抗体固定化膜を貼り、上記3.で作製したコンジュゲート塗布パッドを配置装着し、反対側の端には吸収パッド(Whatman社製、740-E)を配置装着した。最後に、抗体固定化膜および吸収パッドを被覆するように上面にポリエステルフィルムを配置装着し、ラミネートした。このように各構成要素を重ね合わせた構造物を4mm幅に切断し、テストストリップを作成した。該テストストリップの該寸は、4mm×98mm(幅×長さ)であり、イムノクロマトテストストリップの形態にした。
200mM 塩化カリウム、150mM L-アルギニン、0.5% Brij35、0.25% BSA、及び0.05% プロクリン(登録商標)950を含む50mM トリス緩衝液(pH8.5)を検体抽出液とした。
a.鼻腔吸引検体の場合
鼻腔吸引液に綿棒1本を浸し、検体をしみこませた綿棒を320uLのPBSへ入れて、検体成分をPBSへ溶解させて試薬性能評価のサンプルとした。
b.鼻腔拭い検体の場合
綿棒2本で鼻腔を拭い、綿棒を320uLのPBSへ溶解させて試薬性能評価のサンプルとした。
サンプルに上記5.で作製したテストストリップを浸し、10分後にAライン、コントロールラインの発色強度を測定し、試薬性能評価とした。発色強度測定には、青、緑の各色の発色見本から0.25を単位として0.25〜4.0の数値をつけたカラーチャートを用い、n=3で測定した。重量色素量率が20%以上の着色ラテックス粒子の場合、試薬性能評価が2.8以上であるならば、免疫凝集法において目視判定や検出感度に優れたものである。好ましくは、3.0以上である。
Claims (5)
- 合成高分子からなる粒子を油溶性色素で着色した着色ラテックス粒子において、下記式(1)により算出された値が20%以上であり、油溶性色素がフタロシアニン系金属錯体を含む油溶性色素からなる診断薬用着色ラテックス粒子。
重量色素量率(%)=油溶性色素量(g)/{油溶性色素量(g)+ラテックス乾燥重量(g)}×100・・・(1) - 合成高分子がスチレンおよびスチレンスルホン酸塩、親水性カルボキシモノマーからなる請求項1記載の診断薬用着色ラテックス粒子。
- 油溶性色素が下記式(2)において0.3重量%以上の値をとることができる油溶性色素である請求項1又は2記載の診断薬用着色ラテックス粒子。
色素溶液の重量%濃度=油溶性色素(g)/{油溶性色素量(g)+水溶性有機溶媒(g)}×100・・・(2) - 抗原または抗体を化学吸着により担持することを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載の診断薬用着色ラテックス粒子。
- 上記請求項1〜4のいずれかに記載の診断薬用着色ラテックス粒子を用いる免疫測定試薬。
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