JPH0510950A - イムノクロマトグラフ法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 確実に所期の操作を行うことができて目視判
定性が優れ、高い検出感度が得られるイムノクロマトグ
ラフ法を提供することを目的とする。 【構成】 試料中の検出すべき被検出物質と結合可能な
固定化試薬を含む少なくとも一つの反応部位を有するク
ロマトグラフ媒体上で、標識微粒子をクロマトグラフ的
に移動させると共に、前記試料を前記反応部位に接触さ
せ、これにより、前記試料中に被検出物質が存在すると
きに前記反応部位において前記固定化試薬に被検出物質
を介して前記標識微粒子が特異的に結合して捕捉される
ことを利用して前記被検出物質を検出するイムノクロマ
トグラフ法において、前記標識微粒子が、合成高分子よ
りなるラテックス粒子を染色して得られる表面荷電量が
負荷電で０．０１〜０．５ｍｅｑ／ｇである標識着色粒
子を、前記被検出物質と結合可能な物質により感作させ
てなる感作着色粒子であることを特徴とする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、抗原あるいは抗体を結
合させる粒子として、染色された合成高分子ラテックス
粒子を用いるイムノクロマトグラフ法に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、抗原−抗体による特異的反応を利
用して特定の抗原または抗体よりなる被検出物質を検出
する免疫測定法としては、試料中の被検出物質を、微粒
子に感作させた抗体または抗原と免疫反応により結合さ
せ、結合によって生じる微粒子の凝集状態を測定する凝
集法が簡便な免疫測定法であり、特に目視判定が可能で
ある点で一般的に用いられている方法である。

【０００３】また、試料中の被検出物質に、放射性同位
元素、酵素または蛍光物質からなる標識物質により標識
した抗体または抗原を免疫反応により結合させ、この結
合した標識物質を測定する放射免疫測定法、酵素免疫測
定法あるいは蛍光免疫測定法も採用されている。

【０００４】これらの免疫測定法では、競合型反応、サ
ンドイッチ型反応が広く使われている。これらのうち、
いわゆるサンドイッチ型反応の測定法として、イムノク
ロマトグラフ法が知られており、その典型例において
は、試料中の抗原よりなる被検出物質を検出するため
に、以下のような操作が行われる。

【０００５】 被検出物質である抗原に対する抗体に
より感作させた微粒子を固相微粒子としてクロマトグラ
フ媒体に固定化することにより、あるいはこの抗体その
ものをクロマトグラフ媒体に直接固定化することによ
り、反応部位を有するクロマトグラフ媒体を調製する。
一方、標識微粒子に被検出物質と特異的に結合可能
な抗体を感作させて感作標識微粒子を調製する。 こ
の感作標識微粒子を、試料と共に、クロマトグラフ媒体
上でクロマトグラフ的に移動させる。

【０００６】以上の操作により、クロマトグラフ媒体に
形成された反応部位において、固定化された抗体が固定
化試薬となり、これに被検出物質である抗原を介して感
作標識微粒子が特異的に結合し、その結果、感作標識微
粒子が反応部位に捕捉されることにより生ずるシグナル
の有無または程度を目視で判定することにより、試料中
の被検出物質の存在の有無または量を測定する。

【０００７】このようなイムノクロマトグラフ法におい
て、標識微粒子を調製するための微粒子としては、従
来、金、白金、銅、酸化鉄などのコロイド状金属粒子ま
たはコロイド状金属酸化物粒子、硫黄などのコロイド状
非金属粒子および染料粒子が用いられている。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、コロイ
ド状金属粒子、コロイド状金属酸化物粒子またはコロイ
ド状非金属粒子を標識微粒子として用いた場合には、そ
の調製条件およびその粒径によって色調が決定されてし
まうため、所望の鮮明な濃い色調の標識微粒子を得るこ
とができない。

【０００９】一方、染料粒子は、その色調および色の濃
さを任意に選択することができるが、水中における分散
安定性が低く、しかも分散安定性の制御がしにくいため
に抗体などによる感作が困難である。また感作された場
合においても得られる標識微粒子が再分散しにくいもの
であるためにクロマトグラフ的な移動が困難であり、更
に再分散された場合においても粒径分布が広いためにク
ロマトグラフ的な移動が均一に達成されない点において
好ましいものではない。

【００１０】このように、コロイド状金属粒子、コロイ
ド状金属酸化物粒子、コロイド状非金属粒子あるいは染
料粒子からなる標識微粒子を用いた場合には、イムノク
ロマトグラフ法の反応部位におけるシグナル強度を所望
の強度レベルとすることが困難であり、あるいはシグナ
ルの現れ方が不均一となり、従って正確な目視判定が困
難で高い検出感度を得ることができない、という問題点
がある。

【００１１】本発明は上記のような問題点を解決し、確
実に所期の操作を行うことができて目視判定性が優れ、
従って高い検出感度が得られるイムノクロマトグラフ法
を提供することを目的とする。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明のイムノクロマト
グラフ法は、試料中の検出すべき被検出物質と結合可能
な固定化試薬を含む少なくとも一つの反応部位を有する
クロマトグラフ媒体を用い、このクロマトグラフ媒体上
で標識微粒子を試料と共にまたは試料に引き続いてクロ
マトグラフ的に移動させると共に、前記試料を前記反応
部位に接触させ、これにより、前記試料中に被検出物質
が存在するときに前記反応部位において前記固定化試薬
に被検出物質を介して前記標識微粒子が特異的に結合し
て捕捉されることを利用して前記被検出物質を検出する
イムノクロマトグラフ法において、前記標識微粒子が、
合成高分子よりなるラテックス粒子を染色して得られる
表面荷電量が負荷電で０．０１〜０．５ｍｅｑ／ｇであ
る標識着色粒子を、前記被検出物質と結合可能な物質に
より感作させてなる感作着色粒子であることを特徴とす
る。

【００１３】以上において、標識着色粒子は、ラテック
ス粒子を油溶性染料により染色して得られるものである
こと、特に水系媒体中のラテックス粒子を、油溶性染料
の油性有機溶剤による溶液のエマルジョンにより染色し
て得られるものであることが好ましい。

【００１４】以下、本発明について、検出すべき被検出
物質が抗原である場合について具体的に説明するが、被
検出物質が抗体であっても適用することができること
は、当然である。

【００１５】本発明のイムノクロマトグラフ法において
使用される感作着色粒子は、合成高分子よりなるラテッ
クス粒子を染色して調製される標識着色粒子を被検出物
質と結合可能な物質により感作したものである。

【００１６】前記標識着色粒子は、その表面荷電量が負
荷電で０．０１〜０．５ｍｅｑ／ｇ、好ましくは０．０
１〜０．３ｍｅｑ／ｇ、特に好ましくは０．０１〜０．
２ｍｅｑ／ｇのものである。このような表面荷電状態を
有する標識着色粒子を製造するためには、ラテックス粒
子の合成反応において、当該ラテックス粒子の表面に負
荷電を与える官能基を導入する。このような官能基とし
ては、例えば−ＣＯＯ^- および−ＳＯ₄ ^- が好ましく、
例えばラテックス粒子を、スチレンとアクリル酸の共重
合体、スチレンとメタクリル酸の共重合体またはスチレ
ンとイタコン酸の共重合体よりなるものとする手段によ
り、あるいは重合開始剤として過硫酸塩などを用いる手
段により、上記のような官能基を導入することができ
る。

【００１７】また、ラテックス粒子を合成するための重
合反応系に界面活性剤を添加する手段によって、ラテッ
クス粒子の表面に負荷電を与えることも可能であるが、
この手段により得られるラテックス粒子は、その表面の
界面活性剤が脱離することにより、ラテックス粒子が不
安定となって凝集を生ずることがあり、従って後述する
好ましい染色のための処理を好適に実施することができ
ない場合がある。また、感作着色粒子を調製するため
に、標識着色粒子に抗原または抗体を感作させるとき
に、標識着色粒子表面に残留している界面活性剤により
十分な感作が阻害され、検出感度が低下するおそれがあ
る。

【００１８】なお、染色される前のラテックス粒子の表
面荷電量は、通常、負荷電で０．０１〜０．５ｍｅｑ／
ｇ、好ましくは０．０１〜０．３ｍｅｑ／ｇ、特に好ま
しくは０．０１〜０．２ｍｅｑ／ｇである。

【００１９】本発明における標識着色粒子は、その粒径
が０．０５〜０．５μｍの範囲にあることが好ましく、
特に好ましくは０．０５〜０．３μｍの範囲である。粒
径が０．５μｍより大きい標識着色粒子によれば、得ら
れる感作着色粒子１個の有するシグナル強度が大きくな
る点では好ましいが、クロマトグラフ媒体における感作
着色粒子の移動が遅いものとなる。一方、粒径が０．０
５μｍより小さい標識着色粒子を用いた場合には、得ら
れる感作着色粒子の分散性が低くなるおそれがある。

【００２０】標識着色粒子の粒径は、均一なクロマトグ
ラフ的な移動が得られることから、粒径のＣＶ値（標準
偏差／平均値）が１０％以下、特に５％以下であること
が望ましいが、合成高分子よりなるラテックス粒子は、
通常、粒径が十分均一なものが比較的容易に得られる。
従って、このようなラテックス粒子を用いることによ
り、好適な標識着色粒子を得ることができる。

【００２１】好ましい染色ための処理法としては、有機
溶剤に対する溶解度が高い油溶性染料、例えばトルエン
に対する溶解度が１ｇ／１００ｍｌ以上、好ましくは５
ｇ／１００ｍｌ以上である油溶性染料を有機溶剤に溶解
させて得られる染料溶液を、例えば界面活性剤の存在下
において水系媒体中に微分散させて水中油型の染料エマ
ルジョンを調製し、この染料エマルジョンを染色すべき
ラテックス粒子のエマルジョンに混合する方法（以下
「染料エマルジョン法」という）を用いることができ
る。

【００２２】この染料エマルジョン法によれば、鮮明な
濃い色調の標識着色粒子が得られる。従って、このよう
な染色のための処理法を同じラテックス粒子に数回繰り
返すことによって、より鮮明な色調の標識着色粒子を得
ることができる。このような標識着色粒子を用いること
により、感作着色粒子の有する１個当りのシグナルが強
くなり、感作着色粒子の使用量が少なくても目視判定性
がより向上し、試料中の被検出物質をより高い感度で検
出することが可能となる。また、感作着色粒子の使用量
が少なければ、非特異的な結合が生ずる割合が低いため
にＳ／Ｎ比が大きくなり、この点においても検出感度の
向上を図ることができる。

【００２３】更に、この染料エマルジョン法によれば、
使用するラテックス粒子の表面状態が大きく変動するこ
とがなく染色することができ、従って確実に表面荷電量
が負荷電で０．０１〜０．５ｍｅｑ／ｇである標識着色
粒子を得ることができる。

【００２４】なお、染料エマルジョン法に用いられる油
溶性染料としては、特に濃く染色できる点でアゾ系染料
が好ましく、またアントラキノン、ナフトキノンなどの
キノン系染料も用いることができ、具体的には、ソルベ
ントレッド２３、ソルベントレッド２７、ソルベントレ
ッド１１１、ソルベントブルー１１１などおよびこれら
の混合物を挙げることができる。

【００２５】油溶性染料を用いてラテックス粒子を染色
するための他の方法としては、油溶性染料の有機溶剤溶
液をそのままラテックス粒子のエマルジョンに加え、油
溶性染料の拡散を利用してラテックス粒子を染色する方
法を採用することもできる。

【００２６】本発明に用いる標識着色粒子の鮮明度は、
乾燥された当該標識着色粒子をマンセルの色素系で表す
と、明度Ｌ^* が４０以下、下記数１で表される彩度Ｃ^*
が４５以上、色相角度Ｈ°が２４０度（青色）〜６０度
（オレンジ色）であることが好ましく、特に明度Ｌ^* が
３５以下、彩度Ｃ^* が５５以上、色相角度Ｈ°が２７０
度（青色）〜４５度（オレンジ色）であることが好まし
い。

【００２７】

【数１】

【００２８】このような標識着色粒子において、乾燥さ
れた当該標識着色粒子についての分光測色計による、赤
色を示す波長６５０ｎｍの光の反射率と、オレンジ色を
示す波長５５０ｎｍの光の反射率との比（６５０ｎｍの
反射率／５５０ｎｍの反射率）の値が１０以上であるこ
とが、実用上良好な目視判定性が確実に得られる点で、
特に好ましい。

【００２９】本発明に用いる標識着色粒子は、特定の表
面荷電量であることによって、感作着色粒子を得るため
の感作において高い分散安定性が得られ、従って凝集を
伴わずに所期の感作を確実に行うことができる。

【００３０】なお、本発明の効果を更に向上させるため
に、標識着色粒子表面のゼータ電位を−２０〜−６０ｍ
Ｖとすることが望ましい。

【００３１】このような標識着色粒子を用いることによ
って、イムノクロマトグラフ法において確実に所期の操
作を行うことができて目視判定性が優れ、試料中の被検
出物を高い感度で検出することができる。

【００３２】以上のようにして得られる標識着色粒子
が、検出すべき被検出物質に特異的に結合する物質によ
って感作されることにより、感作着色粒子が調製され、
例えば被検出物質が抗原である場合には当該抗原に対す
る抗体により、標識着色粒子を一般的な方法で感作させ
ればよい。

【００３３】本発明のイムノクロマトグラフ法は、上記
のようにして得られる感作着色粒子を用いて、典型的に
は、次のようにして実施される。

【００３４】 被検出物質である抗原に対する固定化
試薬である抗体の溶液を、クロマトグラフ媒体に固定化
する手段、当該抗体により感作された固相ラテックス粒
子よりなる固定化試薬を、クロマトグラフ媒体に固定化
する手段などにより、適宜のクロマトグラフ媒体の適宜
の位置に反応部位を形成する。

【００３５】ここに用いられるクロマトグラフ媒体は、
感作着色粒子が安定にまた良好にクロマトグラフ的に移
動して十分な展開がなされ、反応部位に確実に到達し得
るよう、感作着色粒子の粒径より大きなポアサイズを有
することが必要であり、具体的には例えばガラスやシリ
カなどの無機繊維からなる濾紙をクロマトグラフ媒体と
して使用することができる。ニトロセルロースのような
変性セルロースからなる濾紙も使用することができる
が、単なるセルロースからなる濾紙はセルロース分子な
どに感作着色粒子が捕捉されやすく、シグナルが不鮮明
となる場合がある。

【００３６】 感作着色粒子と試料とを接触させ、こ
の感作着色粒子を反応部位を有する上記のクロマトグラ
フ媒体上でクロマトグラフ的に移動させる。具体的に
は、感作着色粒子の分散液と試料液とを混合し、この混
合液にクロマトグラフ媒体の一端を接触させることによ
り、当該混合液を、それが十分に反応部位に到達するよ
う展開させればよい。ここにおける混合液中の感作着色
粒子の濃度は、通常０．０００１〜０．０５重量％であ
る。

【００３７】これにより、試料中に被検出物質である抗
原が含有される場合には、感作着色粒子に試料中の抗原
が特異反応により結合すると共に、抗原がクロマトグラ
フ媒体の反応部位における固定化試薬である抗体に結合
する結果、感作着色粒子が反応部位に捕捉される。

【００３８】上記のように感作着色粒子に試料を接触
させる代わりに、クロマトグラフ媒体の反応部位とクロ
マトグラフ媒体の試料を接触させる部位との間に感作着
色粒子を予め保持し乾燥させておき、その状態で試料を
クロマトグラフ媒体と接触させ、毛細管現象により試料
と感作着色粒子をクロマトグラフ媒体上で移動させるよ
うにしてもよい。この際、感作着色粒子は、クロマトグ
ラフ媒体に接している別の多孔性素材中に保持させ乾燥
させてもよい。この場合にも、試料中に被検出物質であ
る抗原が含有される場合には、上記と同様に、クロマト
グラフ媒体の反応部位に感作着色粒子が捕捉される。

【００３９】而して、ここに使用される感作着色粒子
は、標識着色粒子よりなるものであるため、反応部位の
形状に従って標識着色粒子の色が現れる。従って、この
発色シグナルの有無あるいは更に色の濃さを目視により
判定することにより、試料中における被検出物質である
抗原の存在の有無、量などが検出される。

【００４０】以上においては、種々の形態が可能であ
る。例えばクロマトグラフ媒体に形成される反応部位の
数は複数であってもよく、またこの場合に各反応部位に
係る固定化試薬は種類の異なるものであってもよい。

【００４１】また、被検出物質と結合可能な固定化試薬
を含む本来の反応部位の他に、当該被検出物質とは結合
しないが感作着色粒子と結合可能な固定化試薬を含む確
認用反応部位を形成したクロマトグラフ媒体を用いるこ
ともできる。この場合においては、被検出物質が存在す
るときには勿論本来の反応部位にシグナルが現れるが、
確認用反応部位は当該被検出物質の存在の有無にかかわ
らずシグナルが現れるので、被検出物質が存在しないこ
とを積極的に確認することができる。具体的には、マウ
ス抗体を標識着色粒子に感作する場合には、このマウス
抗体を別種の動物に免疫して得られる抗マウス抗体を確
認用反応部位の形成のための固定化試薬として用いれば
よい。そして、クロマトグラフ媒体において、本来の反
応部位を例えば縦方向に伸びるパターン「Ｉ」として形
成し、確認用反応部位を例えば横方向に伸びるパターン
「−」として形成しておくと、試料中に被検出物質であ
る抗原が存在するときには「＋」のパターンのシグナル
が現れ、一方、抗原が存在しないときには「−」のパタ
ーンがシグナルとして現れる。従って、このパターンに
よってきわめて明確に検出すべき被検出物質の有無が表
示される。特に被検出物質の存在にかかわらずに現れる
「−」の表示は、同時に感作着色粒子が反応部位に到達
して所期のイムノクロマトグラフが確実に実行されたこ
とを示す。

【００４２】

【実施例】以下、本発明の実施例について説明するが、
本発明がこれらによって限定されるものではない。な
お、以下におけるラテックス粒子および標識着色粒子の
表面負荷電量は、「ポテンショグラフＥ５３６型」（メ
トラー社製）により測定したものである。

【００４３】〔実施例１〕 ＜標識着色粒子の調製（染料エマルジョン法）＞赤色の
油溶性染料「ソルベントレッド２７」（２０℃における
トルエンへの溶解度８．５ｇ／１００ｍｌ）の濃度２．
５重量％のトルエン溶液よりなる染料溶液１重量部に、
濃度０．２５重量％のドデシル硫酸ナトリウム水溶液
５．７重量部を加え、超音波分散機「ＵＳ３００型」
（日本精機製作所社製）で染料溶液を分散させて赤色染
料エマルジョンを調製した。

【００４４】一方、青色の油溶性染料「ソルベントブル
ー１１１」（２０℃におけるトルエンへの溶解度６．１
ｇ／１００ｍｌ）を用いて上記と同様の操作により青色
染料エマルジョンを調製した。

【００４５】上記赤色染料エマルジョンョンの４２ｇ
を、モノマーとしてスチレン９５重量部およびメタクリ
ル酸５重量部を用い、過硫酸カリウムを重合開始剤とし
てソープフリー重合により得られた、粒径０．２７０μ
ｍ、表面負荷電量０．１１４ｍｅｑＣＯＯ^- ／ｇのラテ
ックス粒子による固形分１０重量％のエマルジョン１０
０ｇに加えて２４時間攪拌し、その後水蒸気蒸留によっ
てトルエンを除去し、蒸留水を用いて遠心沈降処理によ
り洗浄することによってドデシル硫酸ナトリウムと過剰
の染料を除去し、これにより表面負荷電量０．１１５ｍ
ｅｑＣＯＯ^- ／ｇの赤色の標識着色粒子Ｉ−の懸濁液
を得た。また、赤色染料エマルジョンの量を８４ｇおよ
び１６８ｇに変更したほかは同様の操作を繰り返すこと
により、表面負荷電量０．１２０ｍｅｑＣＯＯ^- ／ｇの
赤色の標識着色粒子Ｉ−の懸濁液および表面負荷電量
０．１２６ｍｅｑＣＯＯ^- ／ｇの赤色の標識着色粒子Ｉ
−の懸濁液を得た。

【００４６】一方、上記青色染料エマルジョンを１６８
ｇ用い、ほかは標識着色粒子Ｉ−を調製するのと同様
の操作で、表面負荷電量０．１１９ｍｅｑＣＯＯ^- ／ｇ
の青色の標識着色粒子Ｉ−の懸濁液を得た。

【００４７】上記標識着色粒子Ｉ−〜Ｉ−の懸濁液
の各々をガラス板上に塗布して乾燥させ、その光の反射
率を、分光測色計「ＣＭ−１０００型」（ミノルタカメ
ラ社製）を用いて測定した。また、明度Ｌ^* 、彩度Ｃ^*
および色相角度Ｈ°を色彩色差計「ＣＲ−２２１型」
（ミノルタカメラ社製）を用いて測定した。結果を表１
に示す。

【００４８】

【表１】 注１） 標識着色粒子Ｉ−〜Ｉ−における「反射率の比」
は、赤色を示す波長６５０ｎｍの光の反射率と、オレン
ジ色を示す波長５５０ｎｍの光の反射率との比（６５０
ｎｍの反射率／５５０ｎｍの反射率）であり（以下、表
３において同じ）、この比の値が大きい程赤色が濃く観
察される。 注２） 標識着色粒子Ｉ−における「反射率の比」は、青色を
示す波長４５０ｎｍの光の反射率と、オレンジ色を示す
波長５５０ｎｍの光の反射率との比（４５０ｎｍの反射
率／５５０ｎｍの反射率）であり、この比の値が大きい
程青色が濃く観察される。 注３） 「ＣＩＥ１９７６Ｌ^* ａ^* ｂ^* 表色系立体」における明
度を示す。この値が大きいほど白に近い（以下、表３に
おいて同じ）。 注４） 「ＣＩＥ１９７６Ｌ^* ａ^* ｂ^* 表色系色度図」における
あざやかさ（上記数１で表される。）を示す。この値が
大きいほどあざやかである（以下、表３において同
じ）。 注５） 「ＣＩＥ１９７６Ｌ^* ａ^* ｂ^* 表色系色度図」における
色相角度、すなわち色調を示す（以下、表３において同
じ）。

【００４９】＜感作着色粒子の調製＞標識着色粒子Ｉ−
の懸濁液をリン酸緩衝液（以下「ＰＢＳ」という）に
より固形分濃度が１重量％となるよう希釈して得られる
標識着色粒子の分散液の１ｍｌと、ヒト絨毛性ゴナドト
ロピン（以下「ＨＣＧ」という）に対するモノクローナ
ル抗体をＰＢＳで１００μｇ／ｍｌとなるよう希釈して
得られる抗体希釈液１ｍｌとをエッペンドルフ遠沈管に
採り、室温で２時間振盪して標識着色粒子Ｉ−にモノ
クローナル抗体を感作させ、次いで濃度０．１重量％の
ウシ血清アルブミン（以下「ＢＳＡ」という）を含有す
るＰＢＳを用いて３回遠心沈降処理によって洗浄し、最
終的に２ｍｌとなるよう再懸濁させることにより、感作
着色粒子Ｉ−の懸濁液を得た。また、標識着色粒子Ｉ
−、Ｉ−およびＩ−の各懸濁液を用い、上記と同
様の操作を行って感作着色粒子Ｉ−〜Ｉ−の懸濁液
を得た。

【００５０】＜クロマトグラフ媒体の調製＞モノマーと
してスチレン９９．９重量部およびメタクリル酸０．１
重量部を用い、過硫酸カリウムを重合開始剤としてソー
プフリー重合により得られたラテックス粒子のエマルジ
ョンを固形分濃度が０．６重量％となるようＰＢＳによ
り希釈し、その１ｍｌと、ＨＣＧに対するウサギ抗体を
濃度が１００μｇ／ｍｌとなるようＰＢＳにより希釈し
て得られたウサギ抗体希釈液１ｍｌとをエッペンドルフ
遠沈管に採り、室温で２時間振盪してラテックス粒子に
ウサギ抗体を感作させ、次いで濃度０．１重量％のＢＳ
Ａを含有するＰＢＳを用いて３回遠心沈降処理によって
洗浄し、最終的に２ｍｌとなるよう再懸濁させることに
より、固相ラテックス粒子を調製した。次いで、ガラス
繊維濾紙よりなる幅１００ｍｍ、長さ８０ｍｍの濾紙片
の一端から１５ｍｍの位置に、上記固相ラテックス粒子
の２０μｌを、自動薄層クロマトグラフサンプラー「リ
ノマートIV」（ＣＡＭＡＧ社製）を用いて窒素雰囲気中
で塗布し、冷蔵庫中で乾燥することにより、反応部位を
有するクロマトグラフ媒体を調製した。

【００５１】＜ＨＣＧ含有試料の調製＞ＨＣＧ含有液
「ゴナトロピン５０００」（帝国臓器製薬社製）を、濃
度０．１重量％のＢＳＡを含有するＰＢＳにより希釈し
て、１ｍｌ中のＨＣＧ濃度がそれぞれ１００ｍＩＵ、５
０ｍＩＵおよび２５ｍＩＵのＨＣＧ含有試料を調製し
た。

【００５２】＜クロマトグラフ処理＞感作着色粒子の各
懸濁液を固形分濃度が０．０００５重量％となるよう、
濃度０．１重量％のＢＳＡ溶液と０．００１重量％のポ
リオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートを
含有するＰＢＳによって希釈し、この感作着色粒子希釈
液の各１５０μｌに、上記のＨＣＧ含有試料の各々の１
５０μｌまたはブランクとして濃度０．１重量％のＢＳ
Ａを含有するＰＢＳ１５０μｌを加えて攪拌し、得られ
た混合液に、幅１０ｍｍに切断した上記のクロマトグラ
フ媒体の固相ラテックス粒子を塗布した側の一端を下に
して当該下端を５ｍｍだけ浸漬し、当該混合液を展開さ
せた。５分間の経過後、反応部位における感作着色粒子
からの赤色シグナルを目視で比較した。シグナル強度の
結果を表２に示す。

【００５３】〔比較例１〕 ＜金コロイド粒子の調製＞濃度０．０１重量％の塩化金
水溶液２００ｍｌを沸騰させ、これに濃度１重量％のク
エン酸ナトリウム水溶液を加え、溶液の色が薄い黄色か
ら紫色乃至赤色に変わるまで加熱沸騰を行って、平均粒
径が０．０３μｍの金コロイド粒子Ａ−の分散液を調
製した。

【００５４】＜感作標識粒子の調製＞金濃度が０．０１
重量％である上記の金コロイド粒子Ａ−の分散液に炭
酸カリウム溶液を加えてｐＨを７．６に調整し、これに
ＨＣＧに対するモノクローナル抗体を、金コロイド粒子
分散液１ｍｌ当り１０μｇとなる割合で加え、その１０
ｍｌに濃度３０重量％のＢＳＡを０．１ｍｌ加え、遠心
沈降処理して上澄液を除去し、ＢＳＡを濃度０．１重量
％で含有するＰＢＳを用いて３回遠心沈降処理により洗
浄し、再分散させることにより、モノクローナル抗体感
作金コロイド粒子Ａ−の分散液を調製した。

【００５５】＜クロマトグラフ処理＞実施例１の感作着
色粒子の代わりに上記のモノクローナル抗体感作金コロ
イド粒子Ａ−を用いたほかは、実施例１と同様にして
イムノクロマトグラフ測定を行った。シグナル強度の結
果を表２に示す。

【００５６】

【表２】 − ：反応部位の発色が認められない ＋ ：反応部位の発色が認められる ＋＋：反応部位の発色がはっきり認められる ＋＋＋：反応部位の発色が強く認められる

【００５７】〔実施例２〕油溶性染料「ソルベントレッ
ド１１１」（２０℃におけるトルエンへの溶解度１ｇ／
１００ｍｌ）を用い、これを濃度が０．２１重量％とな
るようトルエンに溶解して染料溶液を調製した。実施例
１と同じラテックス粒子のエマルジョン１００ｇに、上
記の染料溶液２４ｇを加えて２４時間攪拌し、その後水
蒸気蒸留によってトルエンを除去し、蒸留水を用いて遠
心沈降処理により洗浄して表面負荷電量０．１０５ｍｅ
ｑＣＯＯ^- ／ｇの赤色の標識着色粒子II−の懸濁液を
得た。また、濃度が０．４２重量％および０．８４重量
％の染料溶液を用いたほかは同様の操作を繰り返すこと
により、表面負荷電量０．１１５ｍｅｑＣＯＯ^- ／ｇの
赤色の標識着色粒子II−の懸濁液および表面負荷電量
０．１４０ｍｅｑＣＯＯ^- ／ｇの赤色の標識着色粒子II
−の懸濁液を得た。上記の標識着色粒子II−〜II−
の懸濁液の各々について、実施例１と同様にして光の
反射率、明度Ｌ^* 、彩度Ｃ^* および色相角度Ｈ°を測定
した。結果を表３に示す。

【００５８】

【表３】

【００５９】上記標識着色粒子II−〜II−の各懸濁
液を用いて実施例１と同様にして感作着色粒子II−〜
II−の懸濁液を得た。この感作着色粒子II−〜II−
の各懸濁液を用いたほかは、実施例１と同様にしてＨ
ＣＧイムノクロマトグラフ測定を行った。シグナル強度
の結果を表４に示す。

【００６０】

【表４】 − ：反応部位の発色が認められない ± ：反応部位にわずかの発色が認められる ＋ ：反応部位の発色が認められる ＋＋：反応部位の発色がはっきり認められる ＋＋＋：反応部位の発色が強く認められる

【００６１】〔比較例２〕モノマーとしてスチレンを用
い、過硫酸カリウムを重合開始剤としてソープフリー重
合により得られた、粒径０．２５６μｍ、表面負荷電量
が検出限界（０．００１ｍｅｑ／ｇ）以下のラテックス
粒子のエマルジョンを用いたほかは、赤色の標識着色粒
子Ｉ−と同様にして赤色の標識着色粒子III の懸濁液
を調製したが、この標識着色粒子III の表面負荷電量は
検出限界以下であり、感作後の遠心沈降処理による洗浄
の際の再分散が不良で凝集塊が残存した。そして、得ら
れた標識着色粒子III を用いて実施例１と同様にＨＣＧ
イムノクロマトグラフ測定を行ったところ、ＨＣＧを含
有しない試料に対しても「＋」と判定されるシグナルが
現れ、イムノクロマトグラフ法には使用できないもので
あった。

【００６２】

【発明の効果】本発明の方法によれば、標識微粒子とし
て、合成高分子よりなるラテックス粒子を染色して得ら
れる表面荷電量が負荷電で特定の範囲の標識着色粒子を
用いるので、良好な着色状態が得られると共に確実に良
好な特性を有する感作着色粒子が得られ、その結果、確
実に所期のイムノクロマトグラフ操作を行うことができ
て目視判定性が優れ、従って試料中の被検出物質を高い
感度で検出することができる。特に本発明の方法は、妊
娠診断に好適に適用することができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 西原 亨 大阪府大阪市生野区巽西１丁目８番１号 ロート製薬株式会社内 (72)発明者 木下 昌彦 大阪府大阪市生野区巽西１丁目８番１号 ロート製薬株式会社内

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 【請求項１】 試料中の検出すべき被検出物質と結合可
   能な固定化試薬を含む少なくとも一つの反応部位を有す
   るクロマトグラフ媒体を用い、 このクロマトグラフ媒体上で標識微粒子を試料と共にま
   たは試料に引き続いてクロマトグラフ的に移動させると
   共に、前記試料を前記反応部位に接触させ、 これにより、前記試料中に被検出物質が存在するときに
   前記反応部位において前記固定化試薬に被検出物質を介
   して前記標識微粒子が特異的に結合して捕捉されること
   を利用して前記被検出物質を検出するイムノクロマトグ
   ラフ法において、 前記標識微粒子が、合成高分子よりなるラテックス粒子
   を染色して得られる表面荷電量が負荷電で０．０１〜
   ０．５ｍｅｑ／ｇである標識着色粒子を、前記被検出物
   質と結合可能な物質により感作させてなる感作着色粒子
   であることを特徴とするイムノクロマトグラフ法。