DE69014193T2

DE69014193T2 - Trockenes analytisches Immunoassay-Element mit monodispergierten Perlen.

Info

Publication number: DE69014193T2
Application number: DE69014193T
Authority: DE
Inventors: Susan Jean Danielson; Glenn Marshall Dappen; Jon Nathan Eikenberry; Linda Ann Mauck; Michael William Sundberg
Original assignee: Eastman Kodak Co
Current assignee: Ortho Clinical Diagnostics Inc
Priority date: 1989-11-30
Filing date: 1990-11-26
Publication date: 1995-06-29
Anticipated expiration: 2010-11-27
Also published as: EP0430371A2; CA2013014A1; EP0430371A3; EP0430371B1; DE69014193D1; JPH081439B2; ATE114190T1; JPH03186761A

Description

Diese Erfindung betrifft die klinische Chemie, ein Element für Immunoassays sowie Verfahren zur Bestimmung eines immunologisch reaktiven Liganden.
Immunoassays, die Vorteile aus natürlichen immunologischen Reaktionen ziehen, haben eine weit verbreitete Anwendung als analytische Techniken in der klinischen Chemie gefunden. Aufgrund der Spezifizität der Reaktionen eignen sie sich in besonders vorteilhafter Weise zur Quantifizierung von biologischen Analyten, die in sehr niedrigen Konzentrationen vorliegen. Zu derartigen Analyten (hier als Liganden bezeichnet) gehören beispielsweise Antikörper, therapeutische Arzneimittel, Narkotika, Enzyme, Hormone, Proteine usw.
Im Falle von kompetitiven Bindungsassays wird ein markiertes Ligandenanalog (hier als Ligandenanalog identifiziert) in eine Wettbewerbsreaktion mit einem nicht markierten Liganden mit einer festen Menge des passenden Bindungsmaterials gebracht (hier als Rezeptor bezeichnet). Unbekannte Konzentrationen des Liganden lassen sich aus dem ermittelten Signal bestimmen, und zwar entweder von dem gebundenen oder nicht gebundenen (d.h. freien) Ligandenanalog. Die Reaktion verläuft wie folgt:
Ligand + Ligandenanalog + Rezeptor Liganden-Rezeptor + Ligandenanalog-Rezeptor.
Zu üblichen Markierungen gehören radioaktive Markierungen, Enzyme, Chromophore, Fluorophore, stabile freie Radikale sowie Enzymkofaktoren, Inhibitoren und allosterische Effektoren.
Die U.S.-Patentschrift 4 670 381 bechreibt ein trockenes analytisches Element für Immunoassays. In diesem Element erfolgt eine Trennung von gebundenen und freien Liganden durch Verwendung einer Kügelchen aufweisenden Ausbreitschicht mit einer Porosität derart, daß die Ausbreitung der Flüssigkeitsproben langsam genug erfolgt, so daß eine Komplexbildung des Liganden und des Ligandenanalog in dem Rezeptor während des Ausbreitens erfolgt. Der Rezeptor kann in der Ausbreitschicht immobolisiert sein. Die Kügelchen liegen im allgemeinen in einer breiten Vielzahl von Größen von 1 bis 200 um vor, obgleich große Kügelchen im Bereich von 20 bis 40 um dominieren. Eine derartige Ausbreitschicht eignet sich für eine Vielzahl von unterschiedlichen Analyten. Die Ursache hierfür liegt darin, daß die Ausbreit-Erfordernisse ähnlich sind.
Das Problem besteht darin, daß derartige Kügelchen nicht immer in Immunoassays geeignet sind. Verschiedene Liganden erfordern unterschiedliche Konzentrationen an Rezeptoren. Sehr große Kügelchen können keine ausreichende Oberfläche in sämtlichen Fällen bieten, um der erforderlichen Rezeptorkonzentration zu entsprechen. Überdies haben die Kügelchen, die im allgemeinen in Ausbreitschichten verwendet werden, nicht die erforderliche Oberflächenqualität und Eigenschaften, an die sich biologisch aktive Materialien, wie beispielsweise Antikörper, leicht binden lassen. Beispielsweise weisen große Kügelchen im allgemeinen keine reaktiven funktionellen Gruppen für die kovalente Immobilisierung von biologisch aktiven Spezies, wie zum Beispiel Antikörper, auf. Selbst wenn die großen Kügelchen mit reaktiven Gruppen für eine kovalente Bindung hergestellt werden, eignen sie sich doch nicht so gut für die Immobilisierung von Antikörpern, wie kleine Kügelchen, aufgrund der Methode ihrer Herstellung. Kügelchen für Ausbreitschichten werden im allgemeinen hergestellt durch Suspensionspolymerisation unter Verwendung einer beschränkten Koaleszenz. Diese Herstellung hat einen negativen Effekt auf die Immobilisierung von Rezeptoren und Liganden. Dieses Verfahren der Herstellung hinterläßt verschiedene restliche Materialien, wie beispielsweise oberflächenaktive Stoffe und Kieselsäurestabilisatoren, auf den Oberflächen der Kügelchen. Die restlichen Materialien inhibieren die Bindung von Rezeptoren an die Kügelchen. Diese restlichen Materialien können ferner zu einer Maskierung des Vorhandenseins von gebundenen Rezeptoren führen. Die maskierten Rzeptoren sind dann für eine Immobilisierung von Liganden ungeeignet.
Die vorliegende Erfindung löst die im vorstehendenen becshriebenen Probleme durch Bereitstellung eines analytischen Elementes für die Durchführung von Immunoassays mit einem Träger und einer Ausbreitschicht, wobei das Element dadurch gekennzeichnet ist, daß es enthält
a) eine erste Population von vergleichsweise großen polymeren Kügelchen mit einem Durchmesser im Bereich von 10 bis 200 um, vorzugsweise 20 bis 40 um, zur Erleichterung einer gleichförmigen Ausbreitung von Flüssigkeiten, die auf das Element aufgebracht werden, und
b) eine zweite Population von vergleichsweise kleinen polymeren Kügelchen mit (i) einem Durchmesser im Bereich von 0,1 bis 5 um; (ii) Rezeptoren, die kovalent an die Kügelchen-Oberfläche durch reaktive Oberflächengruppen gebunden sind; und (iii) Oberflächen, die frei von restlichen oder rückständigen Materialien sind, wie zum Beispiel oberflächenaktiven Verbindungen und kolloidalen Kieselsäurestabilisatoren.
Aus Einfachheitsgründen wird die erste Population von Polymerkügelchen als große Kügelchen bezeichnet und die zweite Population als kleine Kügelchen.
Vorzugsweise sind die polymeren Kügelchen der zweiten Population monodispergiert. Monodispergiert oder monodispers bedeutet, daß die Verteilung der Teilchengrößen von 3 (Sigma) gleich ist oder geringer als 7 % des mittleren Teilchendurchmessers. Die großen Teilchen der Ausbreitschicht sind in typischer Weise polydispergiert (erste Population) und haben sehr unterschiedliche Größen.
Durch die vorliegende Erfindung wird ferner ein Verfahren für die Bestimmung eines immunologisch reaktiven Liganden in einer Flüssigkeit unter Verwendung des obigen Elementes bereitgestellt, das die folgenden Stufen umfaßt:
A. Kontaktieren einer begrenzten Fläche der Ausbreitschicht in Gegenwart eines markierten Ligandenanalog mit einer Probe der Flüssigkeit unter Bildung eines immobilisierten Liganden-Rezeptorkomplexes innerhalb der begrenzten Fläche und Herbeiführung eienr praktisch horizontalen Trennung von nicht komplex gebundenem Liganden von dem immobilisierten Komplex während der Ausbreitung der Flüssigkeit, und
B. Bestimmung des immobilisierten Komplexes nach Ablauf der Stufe A im Zentrum der begrenzten Fläche.
Durch die vorliegende Erfindung wird ferner ein Verfahren zur Bestimmung eines immunologisch aktiven Liganden in einer Flüssigkeit mit einem analytischen Element, wie oben beschrieben, bereitgestellt, das die folgenden Stufen umfaßt:
A. Kontaktieren einer begrenzten Fläche der Ausbreitschicht in Gegenwart eines markierten Ligandenanalog mit einer Probe der Flüssigkeit unter Bildung eines immobilisierten Liganden-Rezeptorkomplexes innerhalb der begrenzten Fläche;
B. Zugabe einer Waschlösung, um eine praktisch horizontale Trennung von nicht komplex gebundenem Liganden von dem immobilisierten Komplex herbeizuführen; und
C. Bestimmung des immobilisierten Komplexes im Zentrum der begrenzten Fläche nach Beendigung der Stufe B.
Die vorliegende Erfindung stellt ein stark verbessertes Element für Immunoassays bereit. Die kleinen Polymerkügelchen liefern den Oberflächenbereich, der erforderlich ist, um die Konzentration des Rezeptors unterzubringen, der für die Durchführung des Immunoassays erforderlich ist. Die Kügelchen werden aus Polymeren hergestellt, welche die funktionellen reaktiven Oberflächengruppen liefern, die dazu erforderlich sind, um Rezeptoren, wie zum Beispiel Antikörper, zu immobilisieren. Überdies sind die Kügelchen frei von Materialien, wie zum Beispiel oberflächenaktiven Verbindungen und Emulgatoren, welche die Bindung von Rezeptoren inhibieren und auch Rezeptoren maskieren.
Das Element und das Bestimmungsverfahren können in hoch automatisierten Analysegeräten verwendet werden.
Die Elemente, die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt werden, eignen sich für die Durchführung beliebiger Immunoassays, einschließlich von Assays, bei denen eine Sandwich-Technik angewandt wird, die beschrieben wird in der Literaturstelle Immuno Chemical Techniques, S. 206-207. Aus Gründen der Kürze jedoch wird hier die Verwendbarkeit der Elemente im Zusammenhang mit einem kompetitiven Immunoassay beschrieben. In diesem letzteren Assay konkurrieren die Spezies, die bestimmt werden sollen, und eine entsprechende markierte Spezies um eine fixierte Menge einer üblichen Reaktionskomponente. Die zu bestimmende Spezies wird hier als Ligand bezeichnet und die markierte Spezies wird als Ligandenanalog bezeichnet. Verbindungen, welche speziell den Liganden und das Ligandenanalog erkennen und unter Bildung von Komplexen mit diesen reagieren, werden hier als Rezeptoren bezeichnet. Der Rezeptor und das Ligandenanalog bilden ein Konjugat-Paar. Beliebige Glieder des Paares können als Rezeptor oder als Ligand wirken.
Das Element kann zur Bestimmung von niedrigen Konzentrationen von immunologisch reaktiven Liganden in einer Flüssigkeit eingesetzt werden, wie beispielsweise einer biologischen Flüssigkeit (zum Beispiel ganzem Blut, Serum, Plasma, Urin, spinaler Flüssigkeit, Suspensionen von menschlichem oder tierischem Gewebe, Fäkalien, Drüsenflüssigkeit, lymphatischen Flüssigkeiten und dergleichen). Die Liganden können in solch niedrigen Konzentrationen, wie 10-15 molaren Konzentrationen, und im allgemeinsten Falle in Konzentrationen von 10&supmin;¹&sup0; bis 10&supmin;&sup4; molar, bestimmt werden.
Zu Liganden, die entweder quantitativ oder qualitativ bestimmt werden können, gehören therapeutische Arzneimittel (zum Beispiel Phenobarbital, Theophyllin, Gentamicin, Chinidin, Phenytoin, Propanolol, Carbamazepin, Tobramycin, Lidocain, Procainamid und dergleichen), natürliche oder synthetische Steroide (zum Beispiel Cortison, Aldosteron, Testosteron, Progesteron, Estriol, usw.), Hormone (zum Beispiel thyroide Hormone, Peptid-Hormone, Insulin usw.), Proteine (zum Beispiel Albumin, IgG, IgM, Ferritin, C-reaktives Protein, Isoenzyme, Apolipoproteine usw.), Antigene, Antikörper, einschließlich monoklonaler Antikörper, sowie andere Spezies, die in natürlicher Weise mit einem Rezeptor reagieren. Diese Erfindung eignet sich insbesondere für die Bestimmung von therapeutischen Arzneimitteln, wie zum Beispiel Digoxin, Phenytoin, Theophyllin oder Phenobarbital und Hormonen, wie zum Beispiel Thyroxin oder Trijodothyronin.
Zu biologisch interessanten Rezeptoren, welche die erforderliche freie Amino- oder Sulfhydrylgruppe für die kovalente Bindung an kleine Polymerkügelchen aufweisen, gehören:
a) Protein A oder Protein G mit einer Affinität für den Fc- Teil der IgG-Antikörper.
b) Avidin oder Avidinkomplexe mit einer Affinität für Biotin oder Biotinkomplexe.
Zu Avidin- und Biotinderivaten, die dazu verwendet werden können, um die Reagentien dieser Erfindung herzustellen, gehören Streptavidin, succinyliertes Avidin, monomeres Avidin, Biocytin (d.h. Biotin-&epsi;-N-lysin), Biocytinhydrazid, Amin- oder Sulfhydrylderivate von 2-Iminobiotin und Biotinyl-&epsi;- aminocaproesäurehydrazid,
Biotinderivate, wie zum Beispiel Biotyn-N-hydroxysuccinimidester, Biotinyl-&epsi;-aminocaproesäure-N-hyrdoxysuccinimidester, Sulfosuccinimidyl-6-(biotinamido)hexanoat, N-Hydroxysuccinimidiminobiotin, Biotinbromoacetylhydrazid, p-Diazobenzoylbiocytin sowie 3-(N-Maleimidopropionyl)biocytin,
c) monoklonale Antikörper, die eine spezifische Affinität für das Antigen aufweisen, demgegenüber sie entwickelt wurden, und ihre Antigene,
d) polyklonale Antikörper und ihre entsprechenden Antigene,
e) Lysin, das eine Affinität für Plasminogen hat,
f) Proteine und andere biologische Makromoleküle, die eine spezifische Affinität fur ein anderes Protein oder biologisches Makromolekül für Interesse haben, wie zum Beispiel Gelatine, die eine Affinität für Fibronectin hat,
g) kleine Moleküle und oligomere Spezies mit einer speziellen Affinität für Oligomere oder makromolekulare biologische Moleküle, zum Beispiel Zucker, Arzneimittel, DNA- Basen, DNA-Oligomere und Hormone,
h) Makromoleküle, die eine Spezifizität für besondere Klassen von biologischen Molekülen haben, wie beispielsweise Concanavalin A, das eine Spezifizität für bestimmte Zukker und Zucker enthaltende Makromoleküle aufweist; Heparin, das eine Affinität für Koagulationsfaktoren, Lipoproteine, Plasmaproteine usw. hat,
i) kleine Moleküle, die eine spezielle Affinität für Klassen von biologischen Molekülen aufweisen, wie zum Beispiel den Farbstoff Cibacron Blue F3G-A und andere proteinspezifische hydrophobe Farbstoffe, die eine Spezifizität für Albumin, Enzyme erfordernde, Adenyl enthaltende Kofaktoren, Koagulationsfaktoren und Interferron aufweisen.
Für den Fachmann ist selbstverständlich, daß je nach dem Gegenstand des Bestimmungsverfahrens Liganden Rezeptoren sein können und Rezeptoren Liganden sein können. Beispielsweise kann ein Ligand mit Phenobarbital an die kleinen Kügelchen gebunden werden, wenn es erwünscht ist, einen Phenobarbital- Antikörper zu bestimmen oder Phenobarbital unter Verwendung eines markierten Phenobarbital-Antikörpers.
Wie bereits erwähnt, weisen die kleinen polymeren Kügelchen auf ihrer Oberfläche Rezeptoren auf. Die Rezeptoren sind an die Kügelchen durch oberflächenreaktive Gruppen gebunden, die direkt oder indirekt reaktiv sind mit freien Aminogruppen, Sulfhydrylgruppen, Carboxygruppen, Aldehyd- oder Ketongruppen der Rezeptoren.
Zu geeigneten oberflächenreaktiven Gruppen gehören:
a) aktive Halogengruppen;
b) aktivierte 2-substituierte Ethylsulfonyl- oder aktivierte Vinylsulfonylgruppen;
c) reaktive Carboxylgruppen;
d) Epoxygruppen;
e) Isocyanatgruppen;
f) Aziridingruppen;
g) Aldehydgruppen;
h) 2-substituierte Ethylcarbonylgruppen; und
i) Succinimidoxycarbonylgruppen.
Die oberflächenreaktiven Gruppen a), b), c) und i) werden bevorzugt eingesetzt.
Für den Fachmann ist offensichtlich, daß je nach dem Gegenstand und der Art einer speziellen Bestimmung, die oberflächenaktiven Gruppen a)-i) Teil des Rezeptors sein können, in welchem Falle die Amino-, Sulfhydryl-, Carboxy- und Aldehydgruppen als oberflächenaktive Gruppen wirken, durch welche der Rezeptor an die kleinen Kügelchen gebunden wird.
Im allgemeinen entsprechen die Polymeren, die zur Herstellung der kleinen Polymerkügelchen verwendet werden, der allgemeinen Struktur:
(A)o (B)p (D)q I
worin bedeuten -A- wiederkehrende Einheiten, die sich von einem oder mehreren hydrophoben, ethylenisch ungesättigten Monomeren ableiten,
-B- wiederkehrende Einheiten, die sich von einem oder mehreren ethylenisch ungesättigten Monomeren ableiten, die die erforderlichen reaktiven Gruppen haben, die direkt oder indirekt mit den freien Amin- oder Sulfhydrylgruppen der Rezeptoren reagieren; und
-D- wiederkehrende Einheiten, die sich von einem oder mehreren ethylenisch ungesättigten Monomeren ableiten, die verschieden sind von jenen, die durch -A- oder -B- dargestellt werden.
In der Formel I steht o für 0 bis 99,9 Mol-%, p für 0,1 bis 100 Mol-% und q für 0 bis 20 Mol-%. Vorzugsweise steht o für 45 bis 99 Mol-%, p für 1 bis 50 Mol-% und q für 0 bis 10 Mol-%.
Die wiederkehrenden Einheiten -A- leiten sich von einem oder mehreren hydrophoben, ethylenisch ungesättigten Monomeren ab. Derartige Monomere sind in Wasser unlöslich. Zu repräsentativen hydrophoben Monomeren gehören, ohne daß eine Beschränkung hierauf erfolgt, Styrol sowie Styrolderivate (zum Beispiel Vinyltoluol, 2,5-Dimethylstyrol, 4-t-Butylstyrol und 2-Chlorostyrol), Acryl- und Methacrylsäureester (zum Beispiel n-Butylacrylat, Propylinethacrylat, Methylacrylat, Ethylmethacrylat, 2-Ethylhexylmethacrylat, N-Phenylacrylamid und Methylmethacrylat), Acrylonitril und Vinylacetat.
Das Polymer kann, falls erwünscht, in jeder geeigneten Weise quervernetzt sein. Eine Methode der Quervernetzung besteht darin, kleine Mengen, d.h. bis zu 15 Mol-%, und vorzugsweise von 0,3 bis 5 Mol-%, eines Monomeren mit zwei oder mehreren ethylenisch ungesättigten polymeren Gruppen zuzusetzen. Diese Monomeren werden zu den hydrophoben Monomeren zugesetzt, von denen sich A ableitet. Repräsentative Monomere werden beispielsweise beschrieben in Research Disclosure, Publikation 19551, Juli 1980, S. 304, und zu diesen gehören beispielsweise Divinylbenzol, Ethylendimethacrylat, N,N'-Methylenbisacrylamid, 2,2-Dimethyl-1,3-propylendiacrylat, Allylacrylat, Ethylidyntrimethacrylat und Ethylendiacrylat.
Besonders geeignete Monomere, von denen sich -A- ableitet, sind Styrol, Vinyltoluol, Ethylendimethacrylat, Butylacrylat, Divinylbenzol, 2-Ethylhexylmethacrylat sowie Methylmethacrylat.
Die wiederkehrenden Einheiten -B- weisen eine angefügte oberflächenreaktive Gruppe auf, die leicht mit einer Amin- oder Sulfhydrylgruppe mit oder ohne Verwendung eines intermediären Quervernetzungsmittels reagiert. Die Gruppen B können infolgedessen sich von jedem beliebigen Monomer ableiten, das derartige reaktive Gruppen aufweist. Bevorzugte Monomere sind solche mit beigefügten elektrophilen, oberflächenreaktiven Gruppen a) bis i), wie oben beschrieben.
Eine bevorzugte Klasse von Monomeren, welche die erforderlichen reaktiven Gruppen liefert, umfaßt solche mit einem aktiven Halogenatom, das leicht mit Amin- und Sulfhydrylgruppen reagiert.
Zu Beispielen von Monomeren mit einem aktiven Halogenatom gehören Vinylchloroacetat, Vinylbromoacetat, haloalkylierte Vinylaromaten (zum Beispiel Chloromethylstyrol oder Bromomethylstyrol), Haloalkylacryl- oder Methacrylsäureester (zum Beispiel Chloroethylmethacrylat, 3-Chloro-2-hydroxypropylmethacrylat und 3-Chloropropylacrylat) sowie andere, die dem Fachmann bekannt sind. Die haloalkylierten Vinylaromaten, beispielsweise jene mit aktiven Haloalkylgruppen mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, werden bevorzugt verwendet, wenn das aktive Halogenatom als reaktive Gruppe verwendet wird. Chloromethylstyrol ist sehr geeignet.
Obgleich Monomere mit aktiven Halogenatomen viele Vorteile aufweisen, weisen Monomere mit aktivierten 2-substituierten Ethylsulfonyl- und Vinylsulfonylgruppen zusätzliche Vorteile auf, da Proteine an die Polymere unter milderen Bedingugnen gebunden werden können und sie eine geringere Verfahrenssteuerung während ihrer Herstellung erfordern. Dieses macht die Herstellung effizienter und weniger kostspielig. Eine Anzahl von repräsentativen Monomeren mit den zuletzt genannten Gruppen sind aus dem Stande der Technik bekannt, wozu auch jene gehören, die in den U.S.-Patentschriften 4 161 407 und 4 548 870 beschrieben werden.
Bevorzugte aktivierte 2-substituierte Ethylsulfonyl- und Vinylsulfonylmonomere lassen sich durch die Formel (II) wiedergeben.
worin R für Wasserstoff steht oder substituiertes oder unsubstituiertes Alkyl (im allgemeinen mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, wie zum Beispiel Methyl, Ethyl, Isopropyl oder Hexyl), vorzugsweise steht R für Wasserstoff oder Methyl.
R¹ steht für -CH=CHR² oder -CH&sub2;CH&sub2;X, worin X eine abspaltbare Gruppe ist, die verdrängt wird durch ein Nukleophil oder eliminiert wird in Form von HX durch Behandlung mit einer Base (wie zum Beispiel Halo, Acetoxy, Alkylsulfonyloxy, wie beispielsweise Methylsulfonyloxy, Arylsulfonyloxy, wie zum Beispiel p-Tolylsulfonyloxy, Trialkylammonio, wie beispielsweise ein Trimethylammoniumsalz oder Pyridiniumsalz). R² steht für Wasserstoff, substituiertes oder unsubstituiertes Alkyl (im allgemeinen mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, wie für R definiert) oder substituiertes oder unsubstituiertes Aryl (im allgemeinen mit 6 bis 12 Kernkohlenstoffatomen, wie zum Beispiel Phenyl, Naphthyl, Xylyl oder Tolyl). Vorzugsweise steht R¹ für -CH&sub2;CH&sub2;X. Diese Gruppe, die eine aktivierte 2-substituierte Ethylgruppe ist, kann substituiert sein durch jede beliebige Gruppe, die die Verdrängung der abspaltbaren Gruppe X nicht beeinträchtigt.
L steht für eine verbindende Gruppe, die bestehen kann aus einem substituierten oder unsubstituierten Alkylen mit im allgemeinen 1 bis 20 Kohlenstoffatomen und Heteroatomen in der Kette. Diese Definition von Alkylen bedeutet, daß hierzu auch Alkylengruppen gehören, die unterbrochen werden oder abgeschlossen werden mit Oxygruppen, Thiogruppen, Gruppen der Formel -NR³- [worin R³ steht für Wasserstoff, substituiertes oder unsubstituiertes Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen (zum Beispiel Methyl, Chloromethyl oder 2-Hydroxyethyl) oder substituiertes oder unsubstituiertes Aryl mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen (zum Beispiel Phenyl, Naphthyl oder Xylyl)],
Ester- (-COO-), Amid- (-CONH-), Urylen- (-NH NH-), Sulfonyl- (-SO&sub2;-), Carbonat-, Sulfonamid-, Azo-, Phosphono- oder ähnliche Gruppen. Zu repräsentativen Alkylengruppen gehören Methylen-, Ethylen-, Isobutylen-, Hexamethylen-, Carbonyloxyethoxycarbonyl-, Methylen-bis (iminocarbonyl)-, Carbonyloxydodecylencarbonyloxyethylen-, Carbonyliminomethyleniminocarbonyliminoethylen-, Carbonyliminomethyleniminocarbonylethylenund andere Gruppen, wie sie beschrieben oder vorgeschlagen werden in den U.S.-Patentschriften 4 161 407 und 4 548 870, wie oben erwähnt.
L kann ebenso substituiertes oder unsubstituiertes Arylen mit im allgemeinen 6 bis 12 Kernkohlenstoffatomen darstellen. Zu repräsentativen Arylengruppen gehören Phenylen, Tolylen, Naphthylen und andere, die in den oben erwähnten Patentschriften aufgeführt werden. Auch fallen in diese Definition von L divalente Gruppen, die Kombinationen darstellen aus einer oder mehreren Alkylen- und Arylengruppen, wie oben definiert (wie beispielsweise Arylenalkylen, Alkylenarylenalkylen und andere, die von dem Durchschnittsfachmann leicht ermittelt werden können). Vorzugsweise steht L für substituiertes oder unsubstituiertes Phenylenalkylen, Phenylenalkylen, substituiert durch eine oder mehrere Alkylgruppen (wie für R definiert), Alkoxygruppen (im allgemeinen mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, wie zum Beispiel Methoxy, Propoxy oder Butoxy) oder Halogruppen, oder Carbonyliminomethyleniminocarbonylethylen.
Zu repräsentativen 2-substituierten Ethylsulfonyl- und Vinylsulfonylmonomeren, von denen sich B ableitet, gehören m & p- (2-Chloroethylsulfonylmethyl)styrol, m & p-[2-(p-Tolylsulfonyloxy)ethylsulfonylmethyl]styrol, m & p-Vinylsulfonylmethylstyrol, N-[m & p-(2-Chloroethylsulfonylmethyl)phenyl]acrylamid sowie N-[2-(2-Chloroethylsulfonyl)ethylformamidomethyl]acrylamid. Das zuerst genannte Monomer ist das bevorzugte.
Eine weitere bevorzugte reaktive Gruppe, die angefügt werden kann, um wiederkehrende Einheiten B zu erzeugen, ist die Carboxylgruppe.
Carboxylgruppen können an die Teilchen angefügt werden durch Einarbeitung von Monomeren mit solchen Gruppen, wie beispielsweise Acrylsäure, Methacrylsäure, Itaconsäure, 2-Carboxyethylacrylat, Fumarsäure, Maleinsäure, 2-Carboxyethylmethacrylat, Carboxymethylstyrol, Methacrylamidohexanoesäure, N-(2-Carboxy-1,1-dimethylethyl)acylamid und dergleichen, oder durch weitere chemische Reaktion eines Polymeren mit anderen reaktiven Gruppen, die in Carboxylgruppen überführt werden können (zum Beispiel durch Hydrolyse von Anhydriden, wie beispielsweise Maleinsäureanhydrid, oder durch Oxidation von Oberflächen-Methylolgruppen oder Aldehydendgruppen).
Ein Hilfs-Quervernetzungsmittel wird dazu verwendet, um Proteine kovalent zu binden, beispielsweise Antigenen Antikörper, Haptene usw., über die Carboxylgruppen, da die Carboxygruppen alleine zu langsam mit Amin- und Sulfhydrylgruppen in den meisten praktischen Fällen reagieren. Eine geeignete Klasse von Hilfs-Quervernetzungsmitteln ist die Klasse der gut bekannten Carbodiimide, wie beispielsweise 1-Cyclohexyl- 3-[2-morpholinyl-4-ethyl]carbodiimid-metho-p-toluolsulfonat, das in photographischen Gelatineschichten zur Quervernetzung von Gelatine verwendet wurde, sowie zur Herstellung von diagnostischen Reagentien, wie es in der U.S.-Patentschrift 4 181 636 beschrieben wird.
Zu einer anderen bevorzugten Klasse von Hilfs-Quervernetzungsmitteln gehören die Carbamoyloniumsalze, zum Beispiel solche, die in der U.S.-Patentschrift 4 421 847 beschrieben werden. Zu repräsentativen Carbamoyloniumverbindungen gehören 1-(4- Morpholinocarbonyl)-4-(2-sulfoethyl)pyridiniumhydroxid, inneres Salz, und 1-(4-Morpholinocarbonyl)pyridiniumchlorid.
Zu anderen Monomeren, die in die Polymeren eingearbeitet werden können, um die erforderlichen reaktiven Gruppen zu erzeugen, gehören Monomere mit Epoxygruppen (zum Beispiel Glycidylacrylat, Glycidylmethacrylat, Vinylglycidylether oder Methallylglycidylether), Monomere mit Isocyanatgruppen (zum Beispiel Isocyanatoethylacrylat, Isocyanatoethylmethacrylat oder α,α-Dimethylmetaisopropenylbenzylisocyanat), Monomere mit einer Aziridingruppe [wie beispielsweise Vinylcarbamoylaziridin, N-Methacryloylaziridin, N-Acryloylaziridin und 2-(1- Aziridinyl)ethylacrylat], Monomere mit Aldehydgruppen (wie beispielsweise Vinylbenzaldehyd oder Acrolein) oder 2-substituierte Ethylcarbonylgruppen enthaltende Monomere (wie beispielsweise 2-Chloroethylacrylat, 2-Chloroethylmethacrylat, 2-Methylsulfonyloxyethylmethacrylat und 2-p-Tolylsulfonyloxyethylacrylat).
D steht für wiederkehrende Einheiten, die sich von einem oder von mehreren ethylenisch ungesättigten Monomeren ableiten, die verschieden sind von jenen, die durch A oder B dargestellt werden. Derartige Monomere können ionische oder andere hydrophile Gruppen aufweisen, die zur Dispersionsstabilität der anfallenden Teilchen in wäßriger Lösung beitragen oder welche die biologische Aktivität eines immobilisierten Liganden beeinflussen. Zu geeigneten ionischen Monomeren gehören, ohne daß eine Beschränkung hierauf erfolgt, Natrium-2-acrylamido-2-methylpropansulfonat, Natrium- 3-acryloyloxypropansulfonat, Natriumacrylat, Natriummethacrylat und Natriumstyrolsulfonat, wie auch andere bekannte Sulfonate, Sulfate, Carboxylate, ihre Salze oder Anhydride und zu geeigneten nicht ionischen polaren Monomeren gehören 2-Hydroxyethylacrylat, 2,3-Dihydroxypropylacrylat, Acrylamid, 2-Hydroxyethylmethacrylat, N-Isopropylacrylamid, 2- Hydroxypropylmethacrylat, Acrylonitril sowie N-Isobutoxymethylacrylamid. Bevorzugte Monomere sind Natrium-2-acrylamido-2-methylpropansulfonat, Natriumacrylat, Natrium-3- acryloyloxypropansulfonat, Natriummethacrylat, 2-Hydroxyethylacrylat, 2,3-Dihydroxypropylacrylat, Acrylamid, N-Isopropylacrylamid sowie Acrylonitril.
Die kleinen Polymerteilchen können homogene Teilchen sein, die ganz aus dem gleichen Polymer bestehen können oder es kann sich um Teilchen handeln, die aus mehr als nur einem Polymer zusammengesetzt sind, wie beispielsweise den Pfropf- Copolymeren, wie sie beispielsweise beschrieben werden in der U.S.-Patentschrift 3 700 609, und sie können bestehen aus Kern-Hüllenpolymeren, wie sie beispielsweise becshrieben werden in der U.S.-Patentschrift 4 401 765. Dies ist vorteilhaft, wenn beliebige der wiederkehrenden Einheiten des Polymeren, das sich an der Teilchenoberfläche befinden muß, wie jene, welche die reaktiven Gruppen aufweisen oder Gruppen, die zu einer Dispersionsstabilität beitragen, kostspielig sind. Ein Polymerteilchen kann aus vergleichsweise nicht kostspieligen Monomeren hergestellt werden oder Monomeren, die einen Auftrieb regulieren, wobei eine Polymerisation dann fortgeführt wird, um eine Hülle aus einem unterschiedlichen Polymeren hinzuzufügen, das die erforderlichen Oberflächengruppen aufweist.
Die kleinen Polymerkügelchen können hergestellt werden unter Anwendung von Emulsions-Polymerisationstechniken (einschließlich chargenweiser, halbkontinuierlicher und kontinuierlicher Verfahren). Die Emulsions-Polymerisation wird bevorzugt angewandt, da sie dazu angewandt werden kann, um im allgemeinen kleinere Teilchen herzustellen ohne Verwendung von oberflächenaktiven Mitteln oder Emulgatoren, wie es beispielsweise beschrieben wird in der U.S.-Patentschrift 4 415 700 (wie oben erwähnt) und in der Literaturstelle Research Disclosure, Publikation 15963 (Juli 1977). Die Literaturstelle Research Disclosure ist eine Publikation, erhältlich von der Firma Kenneth Mason Publications, Ltd., The Old Harbourmaster's, 8 North Street, Emsworth, Hampshire P010 7DD, England.
Eine stufenweise Emulsions-Polymerisation kann dazu angewandt werden, um Kern-Hüllenpolymere herzustellen, die aus zwei unterschiedlichen Polymeren aufgebaut sind. Die Emulsionspolymerisation des Kernes wird durchgeführt, bis sie praktisch beendet ist durch kontinuierliche Zugabe von Reaktionskomponenten in ein Reaktionsgefäß unter Standardbedingungen. Monomere und Katalysatoren, die zur Herstellung des Hüllenpolymeren benötigt werden, werden dann kontinuierlich in das Reaktionsgefäß gegeben, das den Latex des Kernpolymeren enthält. Auf diese Weise weist die Hülle eine definierte bekannte Zusammensetzung auf und besteht nicht aus einer Mischung aus Kern- und Hüllenmonomeren.
Zu repräsentativen Polymeren, die für diese Erfindung geeignet sind, gehören die folgenden: Poly(m & p-chloromethylstyrol), Poly(styrol-co-m & p-chloromethylstyrol-co-2-hydroxyethylacrylat) (molares Verhältnis 67:30:3), Poly(styrol- co-m & p-chloroethylsulfonylmethylstyrol) (molares Verhältnis 95,5:4,5), Poly{styrol-co-N-[m & p-(2-chloroethylsulfonylmethyl)phenyl]acrylamid} (molares Verhältnis 99,3:0,7), Poly(m & p-chloromethylstyrol-co-methacrylsäure) (molares Verhältnis 95:5, 98:2 sowie 99,8:0.2), Poly(styrol-co-m & p- chloroethylsulfonylmethylstyrol-co-methacrylsäure) (molares Verhältnis 93,5:4,5:2), Poly{styrol-co-N-[m & p-(2-chloroethylsulfonylmethyl)pheny]acrylamid-co-methacrylsäure} (molares Verhältnis 97,3:0,7:2), Poly(styrol-co-m & p-chloromethylstyrol) (molares Verhältnis 70:30), Poly(styrol-co- vinylbenzylchlorid-co-acrylsäure) (molares Verhältnis 85:10 :-5), Poly(styrol-co-acrylsäure) (molares Verhältnis 99:1), Poly(styrol-co-methacrylsäure) (molares Verhältnis 90:10), Poly(styrol-co-acrylsäure-co-m & p-divinylbenzol) (molares Verhältnis 89:10:1), Poly (styrol-co-2-carboxyethylacrylat) (molares Verhältnis 90:10), Poly(methylmethacrylat-co-acrylsäure) (molares Verhältnis 70:30), Poly(styrol-co-m & p-vinylbenzaldehyd) (molares Verhältnis 95:5) sowie Poly(styrol- co-m & p-vinylbenzaldehyd-co-methacrylsäure) (molares Verhältnis 93:5:2).
Die Rezeptoren sind kovalent an die Teilchen über die reaktiven Oberflächengruppen a) bis i) gebunden, die im vorstehenden beschrieben wurden. Die Gruppen sind direkt oder indirekt reaktiv mit freien nukleophilen Aminogruppen und Sulfhydrylgruppen der biologischen Rezeptoren.
In den Fällen, in denen die biologische Spezies ein Protein ist, das enthält oder modifiziert worden ist, um elektrophile Gruppen zu enthalten (Carboxy, Aldehyd, usw.) können die Polymerteilchen reaktive nukleophile Oberflächengruppen aufweisen, wie beispielsweise Amingruppen, Sulfhydrylgruppen usw.
Ein allgemeines Verfahren zur Anbindung von Rezeptoren an die kleinen Polymerkügelchen schließt eine kovalente Anbindung des ausgewählten Rezeptors an die Kügelchen ein unter Verwendung allgemein bekannter Reaktionen. Mit vielen abstehenden Gruppen, wie beispielsweise Haloalkyl, 2- substituiertem aktiviertem Methylsulfonyl und Vinylsulfonyl kann der Rezeptor direkt an die Kügelchen gebunden werden. Im allgemeinen werden die Kügelchen mit dem Rezeptor in einer wäßrigen, abgepufferten Lösung (pH-Wert im allgemeinen bei 5 bis 10) und bei einer Konzentration von 0,1 bis 40 Gew.-% Polymerteilchen (vorzugsweise 0,1 bis 10 Gew.-%) vermischt. Die Menge an Rezeptor liegt in einem Verhältnis zum Polymer von 0,1:1000 bis 1:10 und vorzugsweise bei 1:100 bis 1:10. Die Mischung erfolgt bei einer Temperatur im Bereich von 5 bis 50ºC und vorzugsweise bei 5 bis 40ºC, 0,5 bis 48 Stunden lang. Jeder geeignete Puffer kann verwendet werden.
In manchen Fällen müssen die abstehenden reaktiven Gruppen an der äußeren Oberfläche modifiziert oder aktiviert werden, um eine kovalente Anbindung des Liganden herbeizuführen. Beispielsweise müssen Carboxylgruppen aktiviert werden unter Anwendung der bekannten Carbodiimid- oder Carbamoylonium-Chemie, wie oben beschrieben.
In anderen Fällen kann eine Epoxygruppe an der äußeren Oberfläche hydrolysiert werden unter Erzeugung einer Diolverbindung, die mit Cyanogenbromid reagieren kann, das als ein Kupplungsmittel für Amingruppen in der immunologischen Spezies reagiert. Aldehyde können direkt mit Aminen unter Bildung einer Schiff'schen Base reagieren, die danach unter Bildung einer kovalenten Bindung reduziert werden kann. Alternativ kann der Aldehyd zu einer Säure oxidiert werden und die oben angegebene Chemie für Carboxylgruppen kann dazu verwendet werden, um eine Amidbindung zu erzeugen.
Jeder beliebige reaktive, eine Amin- oder Sulfhydrylgruppe enthaltende Rezeptor kann an die monodispersen oder monodispergierten polymeren Kügelchen gebunden werden, solange der Rezeptor eine reaktive Amin- bzw. Sulfhydrylgruppe aufweist, die mit den reaktiven Gruppen an dem Polymer reagiert oder mit dem Zwischenprodukt, das durch die Reaktion eines Carbodiimides oder einer Carbamoyloniumverbindung mit Carboxylgruppen an den Teilchen gebildet wurde, in welchem Falle das Polymer reaktive Carboxylgruppen aufweist.
Die kleinen Polymerkügelchen, die reaktive Gruppen aufweisen, die leicht direkt mit den Amin- oder Sulfhydrylgruppen an den Rezeptoren reagieren, werden in einfacher Weise mit den Rezeptoren vermischt, und zwar in einem geeigneten Puffer, sofern erforderlich, worauf sie miteinander reagieren gelassen werden.
Die Anbindung des Rezeptors an die Carboxylgruppen enthaltenden monodispersen Polymerteilchen jedoch wird in zwei Stufen durchgeführt, wobei die erste Stufe das Inkontaktbringen einer wäßrigen Suspension von den Teilchen mit einer Carbodiimid- oder einer Carbamoylammoniumverbindung einschließt unter Erzeugung von reaktiven intermediären Polymerteilchen mit intermediären reaktiven Gruppen anstelle der Carboxylgruppen. Diese Stufe wird bei einem geeigneten pH-Wert durchgeführt unter Verwendung geeigneter Säuren oder Puffer, um den gewünschten pH-Wert herbeizuführen. Im allgemeinen liegt der pH-Wert bei weniger als 6, doch ist dies nicht kritisch, solange die Reaktion ablaufen kann. In mehr üblicher Weise liegt der pH-Wert zwischen 3,5 und 7. Das molare Verhältnis von Carbodiimid- oder Carbamoyloniumverbindung zu den Carboxylgruppen auf der Oberfläche der Teilchen liegt bei 10:1 bis 500:1.
In der zweiten Stufe des Verfahrens wird das reaktive intermediäre Produkt, das in der ersten Stufe erzeugt wurde, in Kontakt gebracht mit einem reaktiven Amin- oder Sulfhydrylgruppen enthaltenden Rezeptor. Eine kovalente Bindung wird direkt zwischen den Teilchen und dem Rezeptor erzeugt. Das Gewichtsverhältnis von Rezeptor zu polymeren Teilchen liegt im allgemeinen bei 1:1000 bis 1:1 und vorzugsweise bei 1:100 bis 1:10.
Die poröse Ausbreitschicht weist eine geeignete Porosität auf in Anpassung an eine Testprobe (beispielsweise 1 bis 100 ul), verdünnt oder unverdünnt. Vorzugsweise ist die Ausbreitschicht isotrop porös, wobei diese Eigenschaft herbeigeführt wird durch Zwischenräume zwischen den Teilchen der Zone. Unter isotrop porös ist gemeint, daß die Ausbreitschicht die aufgebrachte Flüssigkeit gleichförmig radial über die Schicht ausbreitet.
Geeignete Ausbreitschichten werden beschrieben in den U.S.- Patentschriften 4 670 381; 4 258 001 und 4 430 436. Besonders geeignete Ausbreitschichten sind solche mit einer teilchenförmigen Struktur, erzeugt aus organo-polymeren Teilchen und einem polymeren Klebstoff für diese Teilchen, wie sie beschrieben werden in der U.S.-Patentschrift 4 258 001. Die Aufrechterhaltung der teilchenförmigen Integrität der organopolymeren Teilchen in der teilchenförmigen Struktur mit dem polymeren Klebstoff verhindert die Koaleszenz und das Einfließen der Teilchen in die Poren, und die Konzentration des Klebstoffes an diesen Teilchenoberflächen der Struktur, der angrenzt an benachbarte Teilchen, gewährleistet, daß der Klebstoff nicht in die Poren fließt und diese verschließt. Die Dicke der beschriebenen teilchenförmigen Struktur kann variiert werden, je nach der Größe der organo-polymeren Teilchen. Für eine optimale Flüssigkeitsausbreitung liegt die Teilchenbeschichtung im allgemeinen im Bereich von 25 bis 200 g/m².
Die wärmestabilen, organo-polymeren Teilchen, die für die Ausbreitschicht geeignet sind, sind im allgemeinen sphärische Teilchen mit einer Teilchengröße im Bereich von 20 bis 40 um im Durchmesser. Diese sind die großen Teilchen der ersten Population der polymeren Kügelchen.
Die Teilchen können aufgebaut sein aus einer großen Vielzahl von organischen Polymeren, einschließlich natürlich vorkommenden Polymeren, wie auch synthetischen Polymeren mit den erforderlichen Eigenschaften. Bevorzugt jedoch sind sie aus einem oder mehreren Additionspolymeren aufgebaut, die in den vorerwähnten Patentschriften beschrieben werden.
Zu besonders geeigneten Additionspolymeren gehören jene, die in Tabelle I der U.S.-Patentschrift 4 258 001 aufgelistet sind. Die in Klammern stehenden Nummern in der Tabelle repräsentieren das Gewichtsverhältnis der Monomeren in der Monomermischung, die zur Herstellung des Polymeren eingesetzt wurde. Poly(vinyltoluol-co-p-t-butylstyrol-co-methacrylsäure) [61:37:2], Poly(styrol-co-n-butylacrylat) [75:25] und Polystyrol sind bevorzugte Polymere. Die organo-polymeren Teilchen können andere Zusätze enthalten, falls dies erwünscht ist, wie sie aus dem Stande der Technik bekannt sind.
Der polymere Klebstoff, der für diese Erfindung geeignet ist, bindet die organo-polymeren Teilchen aneinander, unter Bildung eines kohärenten, dreidimensionalen Gitters in der Ausbreitschicht. Die Details dieses Klebstoffes finden sich ebenfalls in der U.S.-Patentschrift 4 258 001. Im allgemeinen ist der Klebstoff aufgebaut aus einem organischen Polymer, das sich von dem speziellen Polymer unterscheidet, das in den Teilchen enthalten ist, obgleich der Klebstoff in ganz üblicher Weise ein Polymer aufweist, das viele wiederkehrende Einheiten aufweist, die identisch oder ähnlich sind einigen, die in der Polymerzusammensetzung der Teilchen vorliegen.
Zu besonders geeigneten Additionspolymeren gehören jene, die in Tabelle II der U.S.-Patentschrift 4 258 001 und in der U.S.-Patentschrift 4 283 491 aufgelistet sind. Die in Klammern stehenden Zahlen in diesen Tabellen stellen das Gewichtsverhältnis der Monomeren in der Monomermischung dar, die zur Herstellung des Polymeren eingesetzt wurde. Bevorzugte Klebstoffpolymere sind Poly(methylacrylat-co- 2-acetoacetoxyethylmethacrylat-co-2-acrylamido-2-methylpropansulfonsäure) [88:7:5]; Poly(N-vinyl-2-pyrrolidon); Poly(n-buty-acrylat-co-styrol-co-2-acrylamido-2-methylpropansulfonsäure, Natriumsalz) [75:20:5]; sowie Poly(methylacrylat-co-2-acrylamido-2-methylpropansulfonsäure, Natriumsalz-co-acetoacetoxyethylmethacrylat) [95:2:3].
Verfahren zur Herstellung der teilchenförmigen Strukturen mit den oben beschriebenen Teilchen und Klebstoffen finden sich in den oben erwähnten Patentschriften.
Die Ausbreitschicht des Elementes wird von einem geeigneten Träger getragen. Ein solcher Träger kann bestehen aus einem beliebigen geeigneten, dimensionsstabilen und vorzugsweise nicht porösen und transparenten Material (d.h. einem für Strahlung durchlässigen Material), das elektromagnetische Strahlung einer Wellenlänge zwischen 200 und 900 nm durchläßt. Ein Träger der Wahl für ein spezielles Element sollte verträglich sein mit der beabsichtigten Art der Bestimmung (Reflektion, Transmission oder Fluoreszenz-Spektroskopie). Zu geeigneten Trägermaterialien gehören Polystyrol, Polyester [zum Beispiel Poly(ethylenterephthalat)], Polycarbonate, Celluloseester (zum Beispiel Celluloseacetat), usw.
Das Element kann eine oder mehrere Schichten aufweisen, beispielsweise separate oder kombinierte Reagens/Ausbreitschichten und eine Gelatine-Pufferschicht, die andere notwendige Additive, Kupplungsenzyme usw. enthält. Die großen und kleinen polymeren Kügelchen können entweder in der gleichen oder in verschiedenen Schichten aufgetragen werden. Die kleinen Kügelchen können vor, gleichzeitig mit oder nach den großen Kügelchen aufgetragen oder aufgeschichtet werden.
Die Reagensschicht oder die Ausbreitschicht des Elementes kann die Indikator-Zusammensetzung aufweisen mit einem oder mehreren Reagentien, die in einem oder mehreren synthetischen oder natürlichen Bindemittelmaterialien dispergiert sind, wie zum Beispiel Gelatine oder anderen, natürlich vorkommenden Kolloiden, Homopolymeren und Copolymeren, wie zum Beispiel Poly(acrylamid), Poly(vinylpyrrolidon), Poly(N-isopropylacrylamid), Poly(acrylamid-co-N-vinyl-2- pyrrolidon) und ähnlichen Copolymeren.
Das Element kann ferner gegebenenfalls andere Schichten aufweisen, zum Beispiel die Haftung verbessernde Schichten, Strahlung blockierende Schichten usw., falls dies erwünscht ist. Sämtliche Schichten des Elementes stehen in fluidem Kontakt miteinander, was bedeutet, daß Fluide und Reagentien sowie nicht komplex gebundene Reaktionsprodukte in den Fluiden durch übereinander angeordnete Bereiche benachbarter Schichten gelangen können.
Zusätzliche Schichten können ebenfalls verwendet werden, wie beispielsweise die Haftung verbessernde Schichten, Zwischenschichten usw. Diese Schichten können ebenfalls Reagentien für die Bestimmung aufweisen, falls dies erwünscht ist.
Das Bestimmungsverfahren kann durchgeführt werden unter Verwendung beliebiger geeigneter Markierungen, die an den Liganden angefügt werden können, um ein Ligandenanalog zu erzeugen. Zu geeigneten Markierungen gehören radioaktive Markierungen, Farbstoffe, fluoreszierende Stoffe, Enzyme, Enzymsubstrate, Enzyminhibitoren, allosterische Effektoren, Kofaktoren und andere bekannte Enzymmodulatoren. Enzyme, wie zum Beispiel Glucoseoxidase, Peroxidase, alkalische Phosphatase und Galactosidase, sind bevorzugte Markierungen.
Wird eine Enzymmarkierung angewandt, so liegt das Substrat für das Enzym in dem Element vor oder wird diesem in der Waschflüssigkeit zugeführt. Das Substrat kann dem Element vor oder gleichzeitig mit der Flüssigkeitsprobe zugeführt werden oder nach Beendigung der Bindungsreaktion. Es liegt im Bereich des Könnens des Durchschnittsfachmanns auf dem Gebiet der klinischen Chemie, ein geeignetes Substrat für eine bestimmte Markierung zu bestimmen. Das Substrat kann ein Material sein, auf das die Enzymmarkierung direkt einwirkt, oder ein Material, das einer Reihe von Reaktionen unterliegt, wozu die enzymatische Reaktion der Markierung gehört. Besteht beispielsweise die Enzymmarkierung aus Peroxidase, dann ist das Substrat Wasserstoffperoxid. Bei Verwendung von Glucoseoxidase beispielsweise liegt das Substrat Glucose im allgemeinen in der Reagensschicht vor oder wird in der Waschflüssigkeit zugeführt, derart, daß 0,01 Mole/m², vorzugsweise 0,01 bis 0,1 Mole/m², anfallen. Ein Durchschnittsfachmann weiß, wie die Menge an teilchenförmigem Substrat für die Menge an Enzymmarkierung, die bei der Bestimmung angewandt wird, einzustellen ist.
Wenn bestimmte Markierungen verwendet werden, wie beispielsweise Enzyme, Kofaktoren, Enzymsubstrate oder Enzymmodulatoren, dann enthält die Reagensschicht eine Indikator-Zusammensetzung mit einem oder mehreren Reagentien, welche eine bestimmbare Spezies als Folge der Reaktion der Markierung liefern. Vorzugsweise besteht die Indikator-Zusammensetzung aus einer colorimetrischen Indikator-Zusammensetzung, die eine colorimetrisch bestimmbare Spezies bildet, als Ergebnis einer enzymatischen Reaktion eines mit einem Enzym markierten Ligandenanalog mit einem Substrat. Die Indikator-Zusammensetzung kann aus einer einzelnen Verbindung bestehen, die durch enzymatische Reaktion einen bestimmbaren Farbstoff liefert oder sie kann aus einer Kombination von Reagentien bestehen, die den Farbstoff erzeugen. Wird beispielsweise Glucose als Substrat verwendet und Glucoseoxidase als Enzymmarkierung, dann kann die colorimetrische Indikator-Zusammensetzung einen Kuppler enthalten und eine oxidierbare Verbindung, die unter Erzeugung eines Farbstoffes reagieren. Alternativ kann die Zusammensetzung einen Leucofarbstoff aufweisen und Peroxidase oder eine andere geeignete peroxidative Verbindung, die einen bestimmbaren Farbstoff als Folge der Bildung von Wasserstoffperoxid erzeugen, das erzeugt wird, wenn Glucoseoxidase Glucose in Gluconsäure überführt. Geeignete Leucofarbstoffe sind aus dem Stande der Technik bekannt und zu ihnen gehören beispielsweise jene, die in der U.S.-Patentschrift 4 089 747 und in der EP-Publikation 0 162 685 beschrieben werden. Die Bestimmung der speziellen Mengen der colorimetrischen Indikator-Zusammensetzung und die Auswahl ihrer verschiedenen Komponenten liegen im Bereich des Könnens des Fachmanns.
Die Schichten des Elementes können eine Vielzahl von anderen wünschenswerten, jedoch gegebenenfalls zu verwendenden Komponenten enthalten, wozu gehören oberflächenaktive Stoffe, Dickungsmittel, Puffer, Härtungsmittel, Antioxidantien, Kupplerlösungsmittel und andere Materialien, die aus dem Stande der Technik bekannt sind. Die Bestimmung der Mengen dieser Komponenten liegt ebenfalls im Bereich des Könnens eines Fachmanns.
Die Ligandenanalogen, die in der Praxis dieser Erfindung verwendet werden, können unter Verwendung bekannter Ausgangsmaterialien und bekannter Verfahren hergestellt oder aus dem Handel bezogen werden. Im allgemeinen ist der Ligandenrest des Analogs an die Markierung (beispielsweise einen Enzymrest oder einen fluoreszierenden Rest) über eine kovalente Bindung gebunden.
Das Bestimmungsverfahren oder Immunoassay kann manuell oder automatisiert durchgeführt werden. Im allgemeinen wird die Menge eines Liganden in einer Flüssigkeit bestimmt durch Abnahme des Elementes von einer Vorratsrolle, einem Chippaket oder einer anderen Quelle und ein begrenzter Bereich der Ausbreitschicht wird physikalisch mit einer Probe der Flüssigkeit von 1 bis 100 ul in Kontakt gebracht. Der begrenzte Bereich, der zur Kontaktierung verwendet wird, beträgt im allgemeinen nicht mehr als 100 mm².
Wird das Ligandenanalog nicht während der Herstellung in das Element eingeführt, so kann es mit der Testprobe vermischt werden gleichzeitig mit oder vor dem Kontakt mit dem Element.
Nach dem Aufbringen der Probe wird das Element im Falle einer jeden Ausführungsform einer beliebigen Konditionierung unterworfen, wie zum Beispiel einer Inkubation, einer Erhitzung oder dergleichen, die wünschenswert sein kann, um die Gewinnung des Testergebnisses zu beschleunigen oder in anderer Weise zu erleichtern.
Die Menge an Ligand wird bestimmt, indem das Element durch eine geeignete Vorrichtung geführt wird für die Bestimmung des komplex gebundenen Ligandenanalogs direkt oder die bestimmbare Spezies bildet sich als Ergebnis einer enzymatischen Reaktion von einer Enzymmarkierung und einem Substrat. Beispielsweise kann die Spezies mit einer geeigneten radiometrischen, fluorometrischen oder spektrophotometrischen Vorrichtung unter Anwendung allgemein bekannter Verfahren bestimmt werden. Im Falle einer enzymatischen Reaktion wird das erhaltene Produkt bestimmt durch Messung von beispielsweise der Reflektions- oder Transmissionsdichte oder der Fluoreszenz im Zentrum der begrenzten Fläche, die mit der Testprobe in Kontakt gebracht worden ist. Die Fläche, die im Falle vom kompetitiven Assays bestimmt wird, weist im allgemeinen einen Durchmesser von 3 bis 5 mm auf. Die Menge an Ligand in der Flüssigkeitsprobe ist umgekehrt proportional zur Menge der gemessenen Markierung im Zentrum der begrenzten Fläche. Im Falle einer bevorzugten Ausführungsform ist eine besondere Waschstufe erforderlich, um komplex gebundenen Liganden von nicht komplex gebundenem Liganden zu trennen. Im allgemeinen wird die Messung der Markierung nach 5 bis 180 Sekunden nach dem Probenkontakt und der Ausbreitung oder Zuführung der Waschflüssigkeit durchgeführt.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Nützlichkeit der vorliegenden Erfindung. In diesen Beispielen enthalten die monodispersen Kern/Hüllen-Polymerkügelchen Polystyrol, copolymerisiert mit verschiedenen anderen Monomeren, wie zum Beispiel m+p-Vinylbenzylchlorid, m+ p-(2-Chloroethylsulfonylmethyl)styrol, Acrylsäure, Methacrylsäure, o,m+ p-Divinylbenzole und Ethylenglykoldimethacrylat. Spezielle monodisperse Kügelchen mit ihren Mol-%-Zusammensetzungen waren:
1. Ein Kern aus Poly(styrol-co-o,m+p-divinylbenzolen) (99,4:0,6) und eine Hülle aus Poly(styrol-co-m+p-)- 2-chloroethylsulfonylmethylstyrol-co-o,m+ p-divinylbenzol) (99,8:1,2); geeignet für Digoxin und Phenytoin.
2. Ein Kern aus Poly(styrol-co-ethylenglykoldimethacrylat (99:1) sowie eine Hülle aus Poly(styrol-co-m+p- (2-chloroethylsulfonylmethyl) styrol-co-ethylenglykoldimethacrylat) (93,5/4,5/1); geeignet für Digoxin und Thyroxin.
Die größeren Kügelchen der Ausbreitschicht bestanden aus Poly(m+p-vinyltoluol-co-methacrylsäure). Der Größenbereich lag bei etwa 20 um bis etwa 40 um.
Der Klebstoff bestand aus Poly(methylacrylat-co-2-acrylamido-2-methylpropansulfonsäure, Natriumsalz-co-2-acetoacetoxyethylmethacrylat) (94,9:2,1:3).

Materialien

DMSO (Dimethylsulfoxid)
TEA (Triethanolaminpuffer)
MOPS (3-[N-Morpholino]propansulfonsäurepuffer)
ALP (alkalische Phosphatase)
ANS (8-Anilino-1-naphthalinsulfonsäure).
Die Waschlösung für Thyroxin und Phenytoin enthielt p-Nitrophenylphosphatsubstrat (15 mM) in 2-Amino-2-methyl-1-propanol (1,5 M, pH-Wert 10,3).
Ein Thyroxin-ALP-Konjugat wurde hergestellt nach dem Verfahren von M. Ito & Mitarbeitern, veröffentlicht in Clin. Chem., 30, S. 1682-1685 (1984).
Ein Phenytoin-ALP-Konjugat wurde hergestellt nach dem Verfahren von B. F. Erlanger & Mitarbeitern, veröffentlicht in J. Biol. Chem., 234, S. 1090 (1959), unter Verwendung von 5,5-Diphenylhydantoin-3-(omega-valeriansäure).
Andere Materialien bestanden aus:
Dem oberflächenaktiven Mittel Zonyl FSN (DuPont, Wilmington, Delaware, U.S.A.);
dem oberflächenaktiven Mittel Triton X-100 (Rohm & Haas, Philadelphia, Pennsylvania, U.S.A.); und
die restlichen Verbindungen wurden erhalten von der Firma Eastman Kodak Company (Rochester, New York, U.S.A.) oder wurden hergestellt unter Verwendung bekannter Ausgangsmaterialien und Verfahren.
Wie im Zusammenhang mit dieser Beschreibung und in den Ansprüchen angegeben, stellt I.E. die Internationale Einheit für die Enzymaktivität dar, wobei eine I.E. definiert ist als die Menge der Enzymaktivität, die erforderlich ist, um die Umwandlung von 1 uMol Substrat pro Minute unter standardisierten pH- und Temperaturbedingungen für das Enzym zu katalysieren.
Die wasserlösliche Polymerschicht in dem Element ist aufgebaut aus jedem beliebigen wasserlöslichen Polymer. Bevorzugte Polymere sind Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon, Polyacrylamid, Poly(acrylamid-co-N-vinyl-2-pyrrolidon) oder Gelatine oder jede beliebige Kombination von diesen Polymeren.

Beispiel 1 - Assay für Thyroxin T&sub4;)

Dieses Beispiel veranschaulicht einen kompetitiven Immunoassay für T&sub4; unter Verwendung eines dreischichtigen Elementes sowie einer separaten Waschstufe. Die folgende Elementstruktur ist für die Bestimmung von T&sub4; geeignet. Beschichtungsstärke (g/m²) bevorzugte Bereiche Ausbreitschicht Haftschicht Gelatineschicht kleine Kügelchen mit T&sub4;- Antikörpern als Rezeptoren große Kügelchen Polyvinylpyrrolidon TX-100 Klebstoff Acrylamid-co-N-vinyl- 2-pyrolidon (50:50) gehärtete Gelatine
Hergestellt wurde eine Reihe von T&sub4;-Standards unter Veränderung der Konzentration von 2 x 10&supmin;&sup5;M bis 2 x 10&supmin;¹&sup0;M in dem Puffer, der unten beschrieben wird, ausgehend von einer 1 x 10&supmin;³M T&sub4;-Ausgangslösung in DMSO. Der Puffer bestand aus einer mit Phosphat abgepufferten Salzlösung eines pH-Wertes von 7,4 und Rinderserumalbumin (1 %) sowie ANS (8,7 x 10&supmin;&sup4; M). Eine T&sub4;-ALP-Konjugatlösung wurde mit einer Konzentration von 1,0 x 10&supmin;&sup8;M hergestellt. Die T&sub4;-Lösungen und T&sub4;-ALP-Lösung wurden miteinander im Verhältnis 1:1 vermischt, so daß die Endkonzentration von T&sub4;-ALP 5 x 10&supmin;&sup9;M betrug.
10 Mikroliter-Anteile wurden auf das T&sub4;-Element aufgetröpfelt. Nach 5 Minuten bei 37ºC wurde eine Waschlösung (10 ul) aufgebracht, um nicht gebundenes T&sub4;-ALP aus dem Zentrum des Elementes fortzuwaschen. Nach einer Minute wurde der ΔDR- Wert 30 Sekunden lang im Zentrum des Elementes bei 37ºC und 400 nm gemessen. Die Williams-Clapper-Gleichung [J. Optical Soc. Am., 43, S. 595 (1953)] wurde dazu angewandt, um die DT-Werte zu errechnen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengestellt. Tabelle 2 T&sub4; Konz. Verhältnis (ΔDT/Min.)
Dieses Beispiel zeigt eine verbesserte Veränderung des Verhältnisses als Funktion der Grade von T&sub4;, die gemessen wurden.

Beispiel 2 - Assay für Phenytoin

Das folgende Element eignet sich für die Bestimmung von Phenytoin. Beschichtungsstärke (g/m²) bevorzugte Bereiche Ausbreitschicht Haftschicht Gelatineschicht kleine Kügelchen (0,7 um) mit kovalent gebundenen Phenytoin- Antikörper-Rezeptoren große Kügelchen (30 um) Polyvinylpyrrolidon Triton X-100 Bindemittel Gelatine Zonyl FSN Phenytoin-ALP Konjugat gehärtete Gelatine
Dieses Beispiel veranschaulicht einen kompetitiven Radial- Wasch-Immunoassay für Phenytoin unter Verwendung eines dreischichtigen Elementes. Hergestellt wurde eine erste Reihe von wäßrigen Lösungen mit Phenytoin-Standards in 0,15 M Natriumchlorid (NaCl) und 0,1 % Rinderserumalbumin (BSA). Die Konzentration von Phenytoin variierte von 2 x 10&supmin;&sup9;M bis 2 x 10&supmin;&sup4;M. Diese Lösungen wurden vermischt mit (1:1) Pufferlösung (0,02M MOPS, pH-Wert 7, 0,15M NaCl und 2 % BSA). Eine zweite Reihe von wäßrigen Lösungen wurde, wie oben beschrieben, hergestellt und vermischt (1:1) mit Pufferlösung, die 10nM Phenytoin-alkalisches Phosphatasekonjugat enthielt.
Die erste Reihe von Phenytoinstandards (10 ul-Anteile) wurde auf die Elemente aufgetröpfelt, die das einverleibte Konjugat enthielten. Die zweite Reihe von Phenytoinstandards (10 ul-Anteile) wurde auf Elemente aufgetröpfelt, die kein einverleibtes Konjugat enthielten. Nach einer Inkubationsdauer von 5 Minuten bei 37ºC wurde die Waschlösung (10 ul) auf die Elemente aufgebracht, um das ungebundene Konjugat aus dem Zentrum des Spots wegzuwaschen. Nach einer Minute bei 37ºC wurde die Veränderung der Reflektionsdichte (ΔDR) bei 400 mm über einen Zeitraum von 30 Sekunden in dem Zentrum des Spots gemessen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengestellt. Tabelle 3 Verhältnis (ΔDR/Min) Phenytoin-Konz. (molar) aufgetragenes Konjugat aufgetröpfeltes Konjugat

Claims

1. Analytisches Element für Immunoassays mit einem Träger und einer Ausbreitschicht, dadurch gekennzeichnet, daß das Element aufweist:

a) eine erste Population von großen polymeren Kügelchen mit einem Durchmesser im Bereich von 10 bis 200 um zur Erleichterung einer gleichförmigen Ausbreitung von Flüssigkeit, die auf das Element aufgebracht wird; und

b) eine zweite Population von kleinen polymeren Teilchen mit (i) einem Durchmesser im Bereich von 0,1 bis 5 um; (ii) Rezeptoren, die kovalent an die Oberfläche der Kügelchen durch reaktive Oberflächengruppen gebunden sind; und (iii) Oberflächen, die frei von restlichen Materialien sind.

2. Element nach Anspruch 1 mit einer Reagenzschicht mit einer Indikator-Zusammensetzung.

3. Element nach Anspruch 1 oder 2, in dem der Rezeptor ein Protein ist.

4. Element nach Anspruch 3, in dem der Rezeptor ein Antikörper ist.

5. Element nach Anspruch 4, in dem der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.

6. Element nach Anspruch 4 oder 5, in dem der Antikörper gegen ein Protein gerichtet ist.

7. Element nach Anspruch 4 oder 5, in dem der Antikörper gegen ein Glied gerichtet ist, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Digoxin, Thyroxin und Phenytoin.

8. Element nach Anspruch 4 oder 5, in dem der Antikörper gegen ein Glied gerichtet ist, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Phenobarbital, Theophyllin, Gentamicin, Carbamazepin und Tobramycin.

9. Element nach Anspruch 1 oder 2, in dem der Rezeptor ein Glied ist, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Digoxin, Thyroxin und Phenytoin.

10. Element nach Anspruch 1 oder 2, in dem der Rezeptor ein Hapten umfaßt, das ausgewählt ist aus der Gruppe von Phenobarbital, Theophyllin, Gentamicin, Carbamazepin und Tobramycin.

11. Element nach einem der vorstehenden Ansprüche, in dem die Ausbreitschicht eine erste und zweite Population aus polymeren Kügelchen aufweist.

12. Element nach Anspruch 11, in dem die Ausbreitschicht umfaßt a) Reagenzien für eine Indikator-Zusammensetzung; b) eine teilchenförmige Struktur mit der ersten Population von polymeren Kügelchen, die aneinander durch Oberflächenbereiche von benachbarten Kügelchen gebunden sind, unter Ausbildung eines kohärenten, dreidimensionalen Gitters, das praktisch nicht-quellbar in einer wäßrigen Flüssigkeit ist; und c) die zweite Population von polymeren Kügelchen.

13. Element nach einem der Ansprüche 1 bis 10, in dem die zweite Population der polymeren Kügelchen sich in einer Schicht oberhalb oder unterhalb der Ausbreitschicht befindet.

14. Verfahren zur Bestimmung eines immunologisch reaktiven Liganden in einer Flüssigkeit mit einem analytischen Element nach einem der vorstehenden Ansprüche, mit den Stufen:

A. Kontaktieren, in Gegenwart eines markierten Liganden- Analogen, einer begrenzten Fläche der Ausbreitschicht mit einer Probe der Flüssigkeit unter Bildung eines immobilisierten Liganden-Rezeptor-Komplexes innerhalb des begrenzten Bereiches, und um eine horizontale Trennung der nicht komplex gebundenen Liganden von dem immobilisierten Komplex während der Flüssigkeits-Ausbreitung zu bewirken, und

B. Bestimmung des immobilisierten Komplexes in dem Zentrum der begrenzten Fläche nach Vervollständigung der Stufe A.

15. Verfahren zur Bestimmung eines immunologisch reaktiven Liganden in einer Flüssigkeit mit einem analytischen Element nach einem der Ansprüche 1 bis 13 mit den Stufen:

A. Kontaktieren, in Gegenwart eines markierten Liganden- Analogen, einer begrenzten Fläche der Ausbreitschicht mit einer Probe der Flüssigkeit unter Bildung eines immobilisierten Liganden-Rezeptor-Komplexes innerhalb der begrenzten Fläche;

B. Zugabe einer Waschlösung, um eine praktisch horizontale Trennung von nicht komplex gebundenem Liganden von dem immobilisierten Komplex zu bewirken; und

C. Bestimmung des immobilisierten Komplexes in dem Zentrum der begrenzten Fläche nach Vervollständigung der Stufe B.