DE69523666T2 - Immunoassay-Element mit Polymeren mit Vanadium IV (V(+4)) Ionen - Google Patents

Immunoassay-Element mit Polymeren mit Vanadium IV (V(+4)) Ionen

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DE69523666T2
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Calvin R. Messing
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54386—Analytical elements

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Description

    Bereich der Erfindung
  • Diese Erfindung betrifft ein Immunassay-Element und dessen Verwendung in einem Immunassay.
    • Hintergrund der Erfindung
  • Immunassays, die den Vorteil natürlicher immunologischer Reaktion nutzen, haben eine weit verbreitete Verwendung als analytische Techniken in der klinischen Chemie gefunden. Aufgrund der Spezifität der Reaktionen sind sie besonders vorteilhaft bei der Quantifizierung von biologischen Analyten die in sehr geringen Konzentrationen in biologischen Flüssigkeiten vorhanden sind. Solche Analyten schließen zum Beispiel Antigene, Antikörper, therapeutische Wirkstoffe, Narkotika, Enzyme, Hormone, Proteine usw. ein.
  • Der Analyt, der das Ziel des Tests ist, wird hier als der Ligand bezeichnet, und der markierte Analyt wird hier als der markierte Ligand bezeichnet (einschließlich immunkompetente Derivate und Analoga von solchem Ligand). Verbindungen, die spezifisch den Liganden und den markierten Liganden erkennen und reagieren, um Komplexe mit ihm zu bilden, werden hier als Rezeptoren bezeichnet. Der Rezeptor und der Ligand oder markierte Ligand bilden ein Konjugatpaar. Jedes Mitglied des Paares kann als ein Rezeptor oder ein Ligand fungieren.
  • In kompetetiven Bindungs-Immunassays wird ein markierter Ligand in Kompetition mit einem unmarkierten Liganden um eine Reaktion mit einer fixierten Menge des geeigneten Rezeptors plaziert. Unbekannte Konzentrationen des Liganden können von dem gemessenen Signal des entweder gebundenen oder nicht gebundenen (d. h. freien) markierten Liganden bestimmt werden.
  • Die Reaktion schreitet wie folgt fort:
  • Ligand + markierter Ligand + Rezeptor < =>
  • Ligand-Rezeptor + markierter Ligand-Rezeptor.
  • Immunassay-analytische Elemente sind bekannt. Im allgemeinen umfassen solche Elemente Rezeptoren, wie zum Beispiel Antikörper für einen Liganden, die in einer bestimmten Lage immobilisiert sind. Zusätzlich enthält das Element gewöhnlicherweise ein Reagenzsystem, das durch Interaktion mit einer gebundenen oder nicht gebundenen Spezies zu einem Signal führt, das mit der Konzentration von Ligand in einer Probe korreliert werden kann. Bei der Verwendung wird die Probe manuell mit einem Enzym-markierten Liganden kombiniert und auf das Element aufgetragen. Nach einer Zeit wird eine Lösung, die ein Substrat für den markierten Liganden enthält, auf die Partikel-Lage aufgetragen. Die Reaktion mit dem Substrat wird durch die Enzymmarkierung katalysiert, um so ein Reaktionsprodukt zu bilden, das letztendlich die Entwicklung eines Farbsignals verursacht. Die Reflektionsdichte der Farbe kann mit der Konzentration des Liganden in der Probe korreliert werden. Ähnliche Signalentwicklungssysteme sind für andere bekannte konventionelle Markierung bekannt, wie zum Beispiel radioaktive Marker, Chromophore, Fluorophore, stabile freie Radikale und Enzym- Cofaktoren, Inhibitoren und allosterische Effektoren.
  • Multilayer-Immunassay-Elemente sind Dünnschichtelemente, die die oben beschriebenen Immunassay-Prinzipien anwenden, um Analyten in Serumproben zu messen. Bei diesen Elementen ist die Rate der Farbbildung invers mit der Menge des vorhandenen Analyten korreliert. Ebenso ist die Rate der Farbbildung direkt proportional mit der Aktivität des Wirkstoffmarkierten Enzyms, das an die immobilisierten Antikörper gebunden ist. Um eine stabile Kalibrierung des Immunassays beizubehalten, darf nichts von der Enzymaktivität (gemessenen Rate) in jeder der Scheiben während der angegebenen Kalibrierungsperiode verloren gehen.
  • Häufig werden Immunassay-Elemente an Käufer in Plastik-"Magazinen" geliefert, die 50 getrennte Elemente enthalten, von denen ein Element nach dem anderen, wenn benötigt, entfernt werden kann. Die Elemente sind eines auf dem anderen gestapelt, so daß die unteren 49 Elemente in dem Magazin alle ihre oberen Oberflächen durch das darüberliegende Element abgedeckt aufweisen. Jedoch weist das oben liegende Element in dem Stapel keine solche Abdeckung auf und dadurch ist die Oberfläche dieses Elements Umweltfaktoren ausgesetzt, denen die anderen 49 Elemente nicht ausgesetzt sind. Zum Beispiel ist das obere (oder erste) Element mehr dem Luftstrom und Licht ausgesetzt als der Rest der Elemente, wenn die Magazine während der Herstellung gehandhabt werden oder wenn die Magazine in den Elementzuführungen der klinischen Analysegeräte vorliegen.
  • Während der Lagerung, vor der Verwendung, werden die Magazine selber in versiegelten, Folien-umwickelten Beuteln gelagert. Jedoch ist das oberste Element immer noch mehr der restlichen Luft und Feuchtigkeit innerhalb des versiegelten Beutels ausgesetzt, als die anderen 49 Elemente.
  • Es wurde gefunden, daß, wenn eine gemeinsame Testflüssigkeit mit den Elementen in einer Kartusche reagiert wurde, die Rate der Farbbildung, die in dem oberen (oder ersten) Element beobachtet wurde, immer geringer war als die Rate der Farbbildung, die beobachtet wurde, wenn dieselbe Testflüssigkeit auf Elemente unter dem oberen Element in demselben Magazin aufgetragen wurde.
    • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die niedrigere Rate der Farbbildung des ersten Elements in dem oberen Element des Magazins im wesentlichen zu beseitigen. Diese Aufgabe wird im wesentlichen durch zur Verfügung stellen eines trockenen Immunassays analytischen Elements zum Testen eines Liganden gelöst, das einen Träger umfaßt, der trägt:
  • (a) eine Zone markierten Ligands;
  • (b) eine Verteilungszone; und
  • (c) eine Rezeptorzone, die eine fixierte Konzentration eines immobilisierten Rezeptors für den Liganden und den markierten Liganden enthält und wobei der Rezeptor kovalent an Polymerperlen gebunden ist, die einen Durchmesser im Bereich von 0,1 bis 5 um aufweisen;
  • dadurch gekennzeichnet, daß das Element ein wasserlösliches Polymer enthält, das Vanadium IV (V&spplus;&sup4;) Ionen enthält und die Zonen können in derselben oder getrennten Lagen vorliegen.
  • Sie wird weiterhin gelöst durch ein wasserlösliches Polymer, das a) Vanadium IV Ionen und b) sich wiederholende Polymereinheiten enthält, die die Struktur (I):
  • (A)x(B)y(C)z;
  • aufweisen, worin
  • A polymerisierte hydrophile Monomere, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Acrylamid, N-Isopropylacrylamid; N-t-Butylacrylamid, 1-Vinylimidazol, N- Vinylpyrrolidon, N-Methylolacrylamid, 2-Hydroxyethylacrylat und 2,3- Dihydroxypropylacrylat darstellt;
  • B polymerisierte Monomere ausgewählt aus den Monomeren enthaltend eine anionische oder mit Metall komplexierende oder Liganden bildende Gruppe, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Sulfonat; Sulfat; Carboxylat; Phosphonat; Phosphat; &beta;-Diketon
  • Gruppen; primären, sekundären oder tertiären Amingruppen; Carbonyl; Carboxy und Hydroxygruppen darstellt;
  • C sich wiederholende Einheiten abgeleitet von jeden anderen Monomeren, die mit dem Immunassay analytischen Element kompatibel sind
  • x 20 bis 98 Gewichtsprozent ist;
  • y 2 bis 80 Gewichtsprozent ist; und
  • z 0 bis 20 Gewichtsprozent ist.
  • Sie wird weiter durch ein Verfahren für den Test eines immunologisch reaktiven Liganden in einer wässrigen flüssigen Probe gelöst, umfassend die Schritte von:
  • A. zur Verfügung stellen eines trockenen Immunassay analytischen Elements gemäß der vorliegenden Erfindung;
  • B. in Kontakt bringen eines begrenzten Bereichs der oberen Zone oder Lage des Elements mit einer Probe der Flüssigkeit, wodurch (i) ein immobilisierter Liganden- Rezeptorkomplex und (ii) ein immobilisierter Enzym-markierter Liganden- Rezeptorkomplex gebildet wird;
  • C. in Kontakt bringen des begrenzten Bereichs der Lage, die den Enzym-markierten Liganden umfaßt, mit einer Substratlösung, wodurch die Entwicklung einer Farbe katalysiert wird; und
  • D. colorimetrische Bestimmung der Konzentration des Liganden.
    • Details der Erfindung
  • Die Elemente dieser Erfindung umfassen markierter Ligand-, Verteilungs- und Rezeptorzonen. Die verschiedenen Zonen können in einer beschichteten Lage oder in verschiedenen beschichteten Lagen vorliegen. Zum Beispiel können die Verteilungszone und die Rezeptorzone in einer einzigen Lage vorhanden sein oder sie können in getrennten Lagen vorhanden sein. Die getrennten Lagen können in jeder Reihenfolge auf dem Träger angeordnet sein. Oder die getrennten Lagen können so angeordnet sein, daß die Rezeptorlage direkt auf dem Träger vorliegt, die Verteilungslage direkt oberhalb der Rezeptorlage und die markierte Ligandenzone über der Verteilungslage vorliegt. Wenn die Rezeptorzone eine vollständig getrennte Lage bildet, wird die Lage ebenfalls ein Bindemittel des im folgenden beschriebenen Typs einschließen. Das Element kann zusätzliche Lagen einschließen, wie zum Beispiel die infra beschriebenen. Alle solche Lagen können unter der Verwendung von Beschichtungstechniken, die in diesem Stand der Technik bekannt sind, beschichtet werden und die infra kurz beschrieben werden.
  • Die markierte Ligandenzone oder Lage kann gravurbeschichtet werden, um 1) die Naßbedeckung der markierten Liganden-Beschichtungszusammensetzung zu minimieren, um Vorkontakt des markierten Liganden mit dem Rezeptor zu vermeiden, während zur selben Zeit genug Feuchtigkeit erhalten wird, um eine gleichmäßige Bedeckung des markierten Liganden zu erreichen und 2) ein schnelles Trocknen auf eine Weise zu erreichen, die a) im wesentlichen alles des Beschichtungslösemittels entfernt; b) ein nachteiliges Beeinflussen der Porosität der Verteilungslage und Verteilungszeit vermeidet und c) ausreichend Enzymaktivität beibehält.
  • Die relative Affinität von Antikörper und markiertem Ligand füreinander ist auch ein wichtiger Faktor bei der Minimierung der Vorbindung. Dieser Faktor wird kontrolliert, wie dem Durchschnittsfachmann gut bekannt ist, indem die Struktur des markierten Liganden manipuliert wird, zusammen mit einer sorgfältigen Auswahl an Antikörper.
  • Im allgemeinen wird die Menge von benötigter markiertem Liganden- Beschichtungsbedeckung empirisch für jeden spezifischen Immunassay gemäß dem folgenden Verfahren bestimmt:
  • 1. Bestimme die benötigte Konzentration an markiertem Liganden der benötigt wird, um eine akzeptable Immunassay-Umsetzung zu erreichen, wenn der Immunassay durch in Kontakt bringen des analytischen Elements mit dem markierten Liganden gemeinsam mit einer Probe durchgeführt wird. Eine akzeptable Testumsetzung wird erreicht, wenn (a) der Test in weniger als 20 Minuten durchgeführt werden kann; (b) der dynamische Bereich des Tests so ist, daß die nachweisbaren minimalen und maximalen Ligandenkonzentrationen einen klinisch brauchbaren Konzentrationsbereich abdecken; und (c) klinisch signifikante Ligandenkonzentrationen über den dynamischen Bereich hinweg nachgewiesen werden können.
  • 2. Bestimme empirisch den Level an Abdeckung mit Beschichtungsbedeckung markiertem Liganden, die für dasselbe analytische Element benötigt wird, um die oben etablierte akzeptable Testumsetzung zu erreichen, durch:
  • A. Beschichten, direkt über der Partikel-Rezeptorzone des Elements, die dazu verwendet wird, um ein Optimum an aufgetragenen markierten Ligandenleveln zu etablieren, den markierten Liganden bei einer Bedeckung in g/m², die ein Teil, vielfaches oder dasselbe wie die Konzentration an markiertem Liganden ist, der bei Auftragen des markierten Liganden in 1, supra verwendet wird.
  • B. Durchführen einer Serie von Assays mit Testproben, die eine bekannte Konzentration des Liganden enthalten.
  • C. Vergleiche die Ergebnisse der Tests mit den bekannten Konzentrationen des Liganden; und
  • D. Wiederhole Schritte B und C wie benötigt, wobei die markierte Ligandenbedeckung gemäß der gesehenen Ergebnisse in Schritt 2C variiert werden, um die benötigte markierte Ligandenbedeckung zu bestimmen.
  • In Abhängigkeit von dem markierten Liganden könnte die Bedeckung des markierten Liganden weniger als, dasselbe oder mehrere Vielfache größer (2X, 3X, 4X usw.) als die benötigte Konzentration an markiertem Liganden sein, wenn derselbe Test durchgeführt wird, in dem der markierte Ligand direkt auf das analytische Element aufgetragen wird.
  • Unter der Anwendung der oberen Richtlinien wurden sorgsam kontrollierte Gravurbeschichtungsverfahren erfolgreich durchgeführt, wobei die folgenden Bedeckungen und Trocknungsprotokolle verwendet wurden. Die markierte Ligand-Beschichtungen in den Elementen der Erfindung wurden mit einer Gravurmaschine (hergestellt durch Yasui in Japan) hergestellt. Für alle Beispiele verwendete Trocknungsbedingungen waren 120ºF (49ºC) nur im ersten Trocknungsabschnitt. Der zweite Abschnitt wurde nicht verwendet. Der verwendete Gravurzylinder enthielt 295 Zellen/Inch (1,344 · 10&sup8; Zellen/m²). Die Zellen wiesen eine Tiefe von 19 Mikron, eine Weite von 72 Mikron und eine Abstandsweite zwischen den Zellen von 12 Mikron auf. Dieser Zylinder wird ungefähr 4,3 g/m² Beschichtungszusammensetzung enthaltend den markierten Liganden, zu der Perlenteilungszone zuführen, wobei der direkte Gravurprozeß bei einer Beschichtungsmaschinen-Geschwindigkeit von 50 ft/min (15,24 m/Minute) verwendet wurde. Der Durchschnittsfachmann in der Gravurbeschichtungstechnik wird leicht in der Lage sein, das vorher beschriebene Verfahren an jede Gravurbeschichtungsmaschine anzupassen.
  • Die Beschichtungszusammensetzung für den markierten Liganden war wie folgt:
    • Beschichtete markierter Ligand-Beschichtungszusammensetzung, basierend auf 4,3 g/m² Naßbedeckung Komponente g/m² Trockenbedeckung
  • MOPS-Puffer 0,0045
  • BSA (Rinderserumalbumin) 0,000215
  • Poly(acrylamid) 0,00108
  • 4'-Hydroxyacetanilid 0,000325
  • *markierter Ligand 0,000016
  • *markierter Ligand wurde überall zwischen 4 und 64 ug/m² beschichtet
  • Die übrigen Lagen des Elements können unter der Verwendung von gut bekannten Beschichtungstechniken in diesem Bereich beschichtet werden. Um ein Vor-Binden zu minimieren, ist es empfohlen, daß jede getrennte Lage oder Zone getrennt beschichtet wird und es ihr erlaubt, wird zu trocknen, bevor nachfolgende Lagen oder Zonen aufgebracht werden.
  • Die Verteilungszone, wenn als eine getrennte Lage aufbeschichtet, ist porös und über die Rezeptorlage beschichtet. Sie enthält als einen essentiellen Inhaltsstoff ein wasserlösliches Polymer, das sich wiederholende Einheiten an polymerisierten Monomeren enthält, die Vanadium IV-Ionen aufweisen, um ein Salz oder einen mit Ligand versehenen Metallkomplex zu bilden. Die Ionen können als Vanadyl (VO&spplus;²) Ionen vorhanden sein. Das Polymer ist im allgemeinen ausgewählt aus a) Polymersalzen, die sich wiederholende anionische Monomere, die Vanadyl (VO&spplus;²) enthalten, aufweisen und b) Polymeren, die Heteroatome aufweisen, die Liganden mit Vanadyl (VO&spplus;²) Ionen gebildet haben.
  • Monomere, die anionische Gruppen enthalten, wie zum Beispiel Sulfonat, Sulfat, Carboxylat, Phosphat und Phosphonat werden verwendet, um die in der Erfindung verwendeten Polymersalze zu bilden. Monomere, die Heteroatomliganden komplexierende Gruppen enthalten, wie zum Beispiel &beta;-Diketon, Amin, Sulfhydryl, Carbonyl, Carboxy und Hydroxy werden verwendet, um die Polymerligandenkomplexe zu bilden.
  • Brauchbare wasserlösliche Polymersalze und Polymerligandenkomplexe werden mit Polymeren gebildet, die die Struktur (I) aufweisen:
  • (A)x(B)y(C)z;
  • worin
  • A polymerisierte hydrophile Monomere, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Acrylamid, N-Isopropylacrylamid; N-t-Butylacrylamid, 1-Vinylimidazol, N- Vinylpyrrolidon, N-Methylolacrylamid, 2-Hydroxyethylacrylat und 2,3- Dihydroxypropylacrylat darstellt;
  • B polymerisierte Monomere, ausgewählt aus Monomeren, die eine anionische oder mit Metall komplexierende oder Liganden bildende Gruppe, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Sulfonat; Sulfat; Carboxylat; Phosphonat; Phosphat; &beta;-Diketon
  • Gruppen; primären, sekundären oder tertiären Amingruppen; Carboxyl, Carbonyl; und Hydroxygruppen, darstellt;
  • C sich wiederholende Einheiten, abgeleitet von jeden anderen Monomeren, die kompatibel mit dem Immunassay analytischen Element sind, darstellt
  • x 20 bis 98 Gewichtsprozent ist;
  • y 2 bis 80 Gewichtsprozent ist; und
  • z 0 bis 20 Gewichtsprozent ist.
  • Monomere innerhalb der oben genannten Definition von B schließen N-(3- Acetoacetamidopropyl)methacrylamid, 2-Acetoacetoxyethylmethacrylat, N-(2- Acetoacetoxyethyl)acrylamid, N-2-Acetoacetamidoethyl)methacrylamid, Natrium-2- acrylamido-2-methylpropansulfonat, Natrium-3-acryloyloxypropan-1-sulfonat, 2- Aminoethylmethacrylathydrochlorid, N-(3-Aminopropyl)methacrylamidhydrochlorid, Acrylsäure, Methacrylsäure, 3-(p-Vinylbenzylthio)propionsäure, 2-Phosphatoethylacrylat, 2- Phosphatoethylmethacrylt, 3-Phosphatopropylacrylat, 3-Phosphatopropylmethacrylat, 2- Sulfatoethylmethacrylat und N-(m-&p-Vinylbenzyl)nitrilo-diessigsäure ein.
  • Die Amingruppe enhaltenden Monomere sind typischerweise als die Aminsäure- Additionssalze (-NH&sub2;·HX und X ist ein Säureanion) inkorporiert. Die Copolymere können ein Gemisch von verschiedenen anionischen und heteroionischen Gruppen-enthaltenden Monomeren innerhalb der oben genannten Definitionen enthalten. Jedoch muß das Polymer wasserlöslich sein.
  • Die &beta;-Diketon. Monomere und Polymere, die sie enthalten, sind in Eastman Kodak Company US-Patenten Nrn. 3,459,790 3,488,708, 2,865,893, 2,860,986, 2,904,539, 3,554,987, 3,658,878, 3,929,482, 3,939,130, 4,346,231, 4,438,278, 4,421,915 und 3,904,418 beschrieben. Bevorzugte Monomere sind diejenigen aus US Nr. 4,438,278.
  • Die in der vorliegenden Erfindungen verwendeten Polymere werden durch einfaches Mischen einer wässrigen Lösung des Polymers (typischerweise das Polymerreaktionsgemisch bei ungefähr 5 bis 25% Feststoffen) bei Raumtemperatur mit einem Salz oder einer Lösung eines Salz des Metallions (ungefähr 20-100% Lösung), bevorzugterweise einem Vanadylsulfatsalz oder Salzlösung hergestellt, in einem Verhältnis von Metallsalz zu komplexierenden Gruppen (d. h. Monomer B, wenn B eine komplexierende Gruppe, wie zum Beispiel eine anionische, Amin- oder &beta;-Diketon-Gruppe aufweist) von ungefähr 0,1/1 bis zu ungefähr 1/1, bevorzugt ungefähr 1/1.
  • Andere Materialien zur Verwendung in Verteilungslagen sind im Stand der Technik der Herstellung von trockenen analytischen Elementen gut bekannt, wie zum Beispiel in US-Patent Nr. 4,258,001 beschrieben. Solche Lagen schließen makroporöse Lagen, hergestellt aus Stoff, Papier, usw. ein. Eine bevorzugte partikuläre Lage ist eine Perlenverteilungslage (PVL). Diese Lage kann leicht konstruiert werden, um eine geeignete Porosität zur Verwendung in den Elementen der vorliegenden Erfindung aufzuweisen, um eine Testprobe (z. B. 1 bis 100 ml), verdünnt oder unverdünnt, aufzunehmen. Bevorzugterweise ist die Verteilungslage isotropisch porös, wobei diese Eigenschaft durch miteinander verbundene Zwischenräume zwischen den Partikeln, die die Zone umfassen, erzeugt wird. Mit isotropisch porös ist gemeint, daß die Verteilungslage die aufgetragene Flüssigkeit gleichmäßig in alle Richtungen durch die Lage hindurch verteilt.
  • Brauchbare Verteilungslagen, einschließlich Perlen-Verteilungslagen sind in den US-Patenten Nrn. 4,670,381, 4,258,001 und 4,430,436 beschrieben. Besonders brauchbare Verteilungslagen sind diejenigen, die eine partikuläre Struktur aufweisen, die durch organo-polymere Partikel und ein Polymeradhäsionsmittel für diese Partikel gebildet wird, beschrieben in US- Patent Nr. 4,258,001. Die in der Verteilungslage brachbaren organo-polymeren Partikel sind allgemein hitzestabile, sphärische Perlen, die eine Partikelgröße im Bereich von ungefähr 10 bis 40 um im Durchmesser oder sogar kleiner aufweisen.
  • Die Partikel können aus einer großen Vielzahl von organischen Polymeren zusammengesetzt sein, einschließlich sowohl natürlichen und synthetischen Polymeren, die die erforderlichen Eigenschaften aufweisen. Bevorzugterweise sind sie jedoch aus einem oder mehreren Additionspolymeren zusammengesetzt, die in den vorgenannten Patenten beschrieben sind.
  • Wenn die Rezeptorzone als eine getrennte Lage beschichtet ist, ist sie über einen Träger hergestellt und beschichtet. Die Rezeptoren sind kovalent an Polymerpartikel durch oberflächenreaktive Gruppen auf dem Rezeptor (nukleophile freie Aminogruppen und Sulfhydrylgruppen) gebunden.
  • Ein allgemeines Verfahren zur Anbringung von Rezeptoren an die kleinen Polymerperlen schließt ein kovalentes Anbringen des ausgewählten Rezeptors an die Perlen unter der Verwendung von allgemein bekannten Reaktionen ein. Im Fall von vielen abhängenden Gruppen, zum Beispiel den Haloalkyl, 2-substituierten aktivierten Ethylsulfonyl und Vinylsulfonyl, kann der Rezeptor direkt an die Perlen angebracht werden. Im allgemeinen werden die Perlen mit dem Rezeptor in einer wässrigen gepufferten Lösung gemischt (pH im allgemeinen von ungefähr 5 bis ungefähr 10) und einer Konzentration von ungefähr 0,1 bis ungefähr 40 Gewichtsprozent Polymerpartikel (bevorzugterweise von ungefähr 0,1 bis ungefähr 10 Gewichtsprozent). Die Menge von Rezeptor ist bei einem Verhältnis zum Polymer von ungefähr 0,1 : 1000 bis ungefähr 1 : 10 und bevorzugterweise von ungefähr 1 : 100 bis ungefähr 1 : 10. Ein Mischen wird bei einer Temperatur im Bereich von ungefähr 5 bis ungefähr 50ºC und bevorzugterweise bei ungefähr 5 bis ungefähr 40ºC durchgeführt, für ungefähr 0,5 bis ungefähr 48 Stunden. Jeder geeignete Puffer kann verwendet werden.
  • In einigen Fällen müssen die abhängenden reaktiven Gruppen an der äußeren Oberfläche modifiziert oder aktiviert werden, um ein kovalentes Anbringen des Liganden zu verursachen. Zum Beispiel müssen Carboxylgruppen unter der Verwendung bekannter Carbodiimid- oder Carbamoylonium-Chemie, beschrieben in EP 308235, offengelegt am 22. Juli 1992 und US- Patent Nr. 5,155,166, aktiviert werden.
  • Das Anbringen des Rezeptors an Carboxylgruppen-enthaltende monodispergierte Polymerperlen wird jedoch in zwei Schritten durchgeführt, wobei der erste ein in Kontakt bringen einer wässrigen Suspension der Partikel mit Carbodiimid- oder einer Carbamoylonium- Verbindung einschließt, um reaktive Intermediat-Polymerpartikel herzustellen, die Intermediat reaktive Gruppen anstelle den Carboxylgruppen aufweisen. Dieser Schritt wird bei einem geeigneten pH unter der Verwendung geeigneter Säuren oder Puffer durchgeführt, um den gewünschten pH zur Verfügung zu stellen. Im allgemeinen ist der pH niedriger als 6, jedoch ist dies nicht kritisch, solange die Reaktion fortschreiten kann. Wahrscheinlicher ist der pH zwischen ungefähr 3,5 und ungefähr 7. Das molare Verhältnis von Carbodiimid- oder Carbamoylonium-Verbindung zu den Carboxylgruppen auf der Oberfläche der Partikel ist von ungefähr 10 : 1 bis 500 : 1.
  • Im zweiten Schritt des Verfahrens wird das im ersten Schritt gebildete reaktive Intermediat mit einem reaktiven Amin- oder Sulfhydryl-Gruppe enthaltenden Rezeptor in Kontakt gebracht. Eine kovalente Bindung wird dadurch zwischen den Partikeln und dem Rezeptor gebildet. Das Gewichtsverhältnis des Rezeptors zu den Polymerpartikeln ist im allgemeinen von ungefähr 1 : 1000 bis ungefähr 1 : 1 und bevorzugterweise von ungefähr 1 : 100 bis ungefähr 1 : 10.
  • In anderen Fällen kann eine Epoxy-Gruppe auf der äußeren Oberfläche hydrolysiert werden, um eine Diolverbindung zu binden, die in der Lage ist, mit Cyanogenbromid zu reagieren, das als ein Kupplungsmittel für Amingruppen in der immunologischen Spezies funktionieren kann. Aldehyde können direkt mit Aminen reagieren, um eine Schiffs-Base zu bilden, die dann nachfolgend reduziert werden kann, um eine kovalente Bindung zu bilden. Alternativ kann das Aldehyd zu einer Säure oxidiert werden und die oben angegebene Chemie für Carboxylgruppen kann verwendet werden, um eine Amidbrücke zu bilden.
  • Jeder reaktive Amin- oder Sulthydryl-enthaltende Rezeptor kann an die monodispergierten Polymerperlen angebracht werden, solange wie dieser Rezeptor jeweils eine reaktive Amin- oder Sulfhydrylgruppe enthält, die mit den reaktiven Gruppen auf dem Polymer reagieren wird oder mit dem Intermediat, das durch die Reaktion einer Carbodümid- oder Carbamoylonium-Verbindung mit Carboxylgruppen auf den Partikeln gebildet wurde, für den Fall in dem das Polymer reaktive Carboxylgruppen aufweist.
  • Die kleinen Polymerperlen, die reaktive Gruppen aufweisen, die leicht direkt mit den Amin- oder Sulfhydrylgruppen auf den Rezeptoren reagieren, werden einfach, wenn nötig, in einem geeigneten Puffer mit den Rezeptoren gemischt und es ihnen erlaubt, zu reagieren.
  • Polymere, aus denen Perlen für den Rezeptor ausgewählt werden können, schließen die folgenden ein: Poly(m & p-chlormethylstyrol), Poly(styrol-co-m & p-chlormethylstyrol-co-2- hydroxyethylacrylat) (67 : 30 : 3 molares Verhältnis), Poly(styrol-co-m & p- chlorethylsulfonylmethylstyrol) (95,5 : 4, 5 molares Verhältnis), Poly[styrol-co-N-[p-(2- chlorethylsulfonylmethyl)phenyl]acrylamid] (99,3 : 0,7 molares Verhältnis), Poly (m & p- chlormethylstyrol-co-methacrylsäure) (95 : 5, 98 : 2 und 99,8 : 0,2 molares Verhältnis), Poly(styrol-co-m & pchlorethylsulfonylmethylstyrol-co-methacrylsäure) (93,5; 4, 5 : 2 molares Verhältnis), Poly[styrol-co-N-[p-(2-chlorethylsulfonylmethyl)phenyl]acrylamid-comethacrylsäuer] (97,3 : 0,7 : 2 molares Verhältnis), Poly(styrol-co-m & p-chlormethylstyrol) (70 : 30 molares Verhältnis), Poly[styrol-co-3-(p-vinylbenzylthio)propionsäure] (97,6/2,4 molares Verhältnis), Poly(styrol-co-vinylbenzylchlorid-co-acrylsäure) (85 : 10 : 5 molares Verhältnis), Poly(styrol-co-acrylsäure) (99 : 1 molares Verhältnis), Poly(styrol-co-methacrylsäure) (90 : 10 molares Verhältnis), Poly(styrol-co-acrylsäure-co-m & p-divinylbenzen) (89 : 10 : 1 molares Verhältnis), Poly(styrol-co-2-carboxyethylacrylat) (90 : 10 molares Verhältnis), Poly(methylmethacrylat-co-acrylsäure) (70 : 30 molares Verhältnis), Poly(styrol-co-m & pvinylbenzaldehyd) (95 : 5 molares Verhältnis) und Poly(styrol-co-m & p-vinylbenzaldehyd-co- methacrylsäure) (93 : 5 : 2 molares Verhältnis).
  • Das Element wird auf einem geeigneten Träger getragen. Die Rezeptorlage wird über den Träger geschichtet, obwohl dazwischen liegende Lagen zwischen dem Träger und der Rezeptorlage vorhanden sein können, wie zum Beispiel eine Gelatine/Pufferlage. Der Träger kann jedes geeignete dimensional stabile und bevorzugterweise nicht poröse und durchlässige (d. h. strahlungsdurchlässige) Material sein, das elektromagnetische Strahlung einer Wellenlänge zwischen ungefähr 200 und ungefähr 900 nm überträgt. Ein Träger der Wahl für ein bestimmtes Element sollte mit der beabsichtigten Weise des Nachweises (Reflektion, Transmission oder Fluoreszenz-Spektroskopie) kompatibel sein. Brauchbare Trägermaterialien schließen Polystyrol, Polyester [z. B. Poly(ethylenterephthalat)], Polycarbonate, Zelluloseester (z. B. Zelluloseacetat), usw. ein.
  • Polymere Bindemittel für die Rezeptorlage sind allgemein im kanadischen Patent 1,240,445 beschrieben. Brauchbare Polymere sind kühl-gellierbare Polymere, die von ungefähr 30 bis 97 Gewichtsprozent an polymerisiertem N-Alkyl-substiuierten Acrylamid, wie zum Beispiel N-Isopropylacrylamid umfassen. Andere N-Alkyl-substituierte Acrylamide schließen N-n- Butylacrylamid, N,N-Diethylacrylamid und N-n-Propylacrylamid ein. Poly(Nisopropylacrylamid-co-methacrylsäure-co-N,N'-methylenbisacrylamid) wird in den Beispielen verwendet, um die Brauchbarkeit dieser Bindemittel zu verdeutlichen.
  • Das polymere Bindemittel umfaßt ebenfalls von ungefähr 3 bis 25 Gewichtsprozent an einem oder mehreren polymerisierten kreuzvernetzenden Monomeren, die mindestens zwei Additions-polymerisierbare Gruppen pro Molekül aufweisen. Diese kreuzvernetzenden Monomere sind allgemein im Stand der Technik gut bekannt. Die bevorzugten kreuzvernetzenden Monomere enthalten Acrylamido- oder Methacrylamidogruppen, um die Polymerisation mit den N-Alkyl-substituierten Acrylamiden zu erleichtern.
  • Beispiele von brauchbaren kreuzvernetzenden Monomeren schließen ein:
  • N,N'-Methylenbisacrylamid;
  • N,N'-Methylenbismethacrylamid;
  • Ethylendimethacrylat;
  • 2,2-Dimethyl-1,3-propylendiacrylat;
  • Divinylbenzen;
  • Mono[2,3-bis(methacryloyloxy)propyl]phosphat;
  • N,N'-bis(Methacryloyl)harnstoff;
  • Triallylcyanurat;
  • Allylacrylat;
  • Allylmethacrylat;
  • N-Allylmethacrylamid;
  • 4,4'-Isopropylidendiphenylendiacrylat;
  • 1,3-Butylendiacrylat;
  • 1,4-Cyclohexylendimethylendimethacrylat;
  • 2,2'-Oxydiethylendiemethacrylat;
  • Divinyloxymethan;
  • Ethylendiacrylat;
  • Ethylidendiacrylat;
  • Propylidendimethacrylat;
  • 1,6-Diacrylamidohexan;
  • 1,6-Hexamethylendiacrylat;
  • 1,6-Hexamethylendimethacrylat;
  • Phenylethylendimethacrylat;
  • Tetramethylendimethacrylat;
  • 2,2,2-Trichlorethylidendimethacrylat;
  • Ethylen(oxyethylen)diacrylat;
  • Ethylenbis(oxyethylen)dimethacrylat;
  • Ethylidintrimethacrylat;
  • Propylidintriacrylat;
  • Vinylallyloxyacetat;
  • 1-Vinyloxy-2-allyloxyethan;
  • 2-Crotonoyloxyethylmethacrylat;
  • Diallylphthalat; und
  • 2-(5-Phenyl-2,4-pentadienoyloxy)ethylmethacrylat.
  • Diese kühl gellierbaren Polymerbindemittel können ebenfalls 0 bis 60 Gewichtsprozent an polymerisierten hydrophilen Monomeren einschließen. Mengen von 5 bis 35 Gewichtsprozent sind ebenfalls brauchbar. Hydrophile Monomere sind beschrieben im Kanadischen Patent Nr. 1,240,445. Insbesondere weisen solche Monomere eine oder mehrere Gruppen, ausgewählt aus Hydroxy, Pyrrolidon, Amin, Amid, Carboxy, Sulfo, Carboxylatsalz, Sulonatsalz und Sulfatsalz-Gruppen auf. Im allgemeinen sind die Gegenionen der Salzgruppen Alkalimetalle oder Ammonium. Brauchbare hydrophile Monomere sind Acrylsäure und Methacrylsäure und ihre Salze, 2-Acrylamido-2-methylpropansulfonat, 2-Hydroxyethylacrylat, 2- Hydroxyethylmethacrylat, 2-Hydroxypropylacrylat, 2-Hydroxypropylmethacrylat und Glycerylmethacrylat.
  • Weiter erlauben es die aufgeführten Bindemittel aufgrund der sehr geringen Bindemittelviskositäten, die durch Scherverdünnung während Extrusions-Trichterbeschichtung erreicht wird gleichmäßige Beschichtungen von Rezeptorlagen zu bilden. Ein weiterer Vorteil wird mit dem angegebenen Bindemitteln dadurch erreicht, daß unmittelbar nach der Bildung von gleichmäßigen Beschichtungen die Viskosität der Bindemittel zunimmt, was im wesentlichen zu einer "abgesetzten Lage" führt, die während nassem Transport und Trocknen der Bindemittel stabil und gleichmäßig bleibt.
  • Die Rezeptoren können ebenfalls in einem Polymerbindemittel dispergiert werden, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:
  • - Poly(vinylalkohol);
  • - Rinderserumalbumin;
  • - Akaziengummi;
  • - Homopolymere von Poly-N-vinylpyrrolidon, die ein Molekulargewicht im Bereich von 8.000 bis 400.000 aufweisen; und
  • wasserlöslichen Vinyladdtionspolymeren, die zwei oder mehr Monomere, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Acrylamid, Methacrylamid, N-Alkyl-substituierten Acrylamiden, N- Alkyl-substituierten Methacrylamiden, 1-Vinylimidazol, 2-Alkyl-substituierten-1- vinylimidazolen, 2-Hydroxyalkyl-substituierten-1-vinylimidazolen, N-Vinylpyrrolidon, Hydroxyalkylacrylaten, Hydroxyethylmethacrylate, Acrylsäure und Methacrylsäure; wobei das Alkyl und Hydroxyalkyl in den Copolymeren 1 bis 6 Kohlenstoffatome aufweist, wie zum Beispiel Methyl, Ethyl, Propyl und Hexyl aufweisen.
  • Das Element kann eine oder mehrere zusätzliche Lagen, z. B. getrennte oder kombinierte Reagenz/Verteilungslage und eine Gelatine/Pufferlage umfassen, die andere nötige Zusatzstoffe, wie zum Beispiel Elektronentransfermittel enthalten.
  • Die Gelatine/Pufferlage oder die Reagenzlage oder die Verteilungslage des Elements kann die Indikatorzusammensetzung enthalten, die eine oder mehrere Reagenzien, dispergiert in einem oder mehreren synthetischen oder natürlichen Bindematerialien, wie zum Beispiel Gelatine oder andere natürlich-auftretende Kolloide, Homopolymere und Copolymere, wie zum Beispiel Poly(acrylamid), Poly(vinylpyrrolidon), Poly(N-isopropylacrylamid), Poly(acrylamidco-N-vinyl-2-pyrrolidon) und ähnliche Copolymere umfaßt. Die Indikatorzusammensetzung kann ebenfalls in der Rezeptorlage dispergiert vorliegen.
  • Andere optionale Lagen, z. B. unterstützende Lagen, radioaktive Strahlung-blockierende Lagen, usw. können, wenn gewünscht, eingeschlossen werden. Alle Lagen des Elements sind in flüssigem Kontakt miteinander, das bedeutet, daß Flüssigkeiten und Reagenzien und nicht komplexierte Reaktionsprodukte in den Flüssigkeiten zwischen sich überlagernden Regionen von angrenzenden Lagen passieren könnten.
  • Die Lagen des Elements können eine Vielzahl von anderen wünschenswerten jedoch optionalen Verbindungen, einschließlich oberflächenaktiven Stoffen, Verdickungsmitteln, Puffern, Härtemitteln, Antioxidantien, Kupplungslösemittel und andere Materialien, die im Stand der Technik bekannt sind, enthalten. Die Mengen dieser Komponenten liegen ebenfalls innerhalb des Könnens des Durchschnittsfachmanns.
  • Die Elemente können dazu verwendet werden, um niedrige Konzentrationen von immunologisch reaktiven Liganden in einer Flüssigkeit, wie zum Beispiel einer biologischen Flüssigkeit (z. B. Gesamtblut, Serum, Plasma, Urin, Spinalflüssigkeit, Suspensionen von menschlichen oder tierischen Geweben, Fäkalien, Speichel, lymphatischen Flüssigkeiten und ähnliches) zu bestimmen. Die Liganden können in Konzentrationen so gering wie ungefähr 10&supmin;¹&sup5; molar nachgewiesen werden und gewöhnlicherweise bei einer Konzentration von ungefähr 10&supmin;¹¹ bis ungefähr 104 molar.
  • Liganden, die entweder quantitativ oder qualitativ nachgewiesen werden können,, schließen therapeutische Wirkstoffe (z. B. Phenobarbital, Digoxin, Digitoxin, Theophyllin, Gentamicin, Quinidin, Phenytoin, Propanolol, Carbamazepin, Tobramycin, Lidocain, Procainamid und ähnliche), natürliche oder synthetische Steroide (z. B. Kortison, Aldosteron, Testosteron, Progesteron, Östriol, usw.), Hormone (Thyroidhormone, Peptidhormone, Insulin, usw.), Proteine (z. B. Albumin, IgG, IgM, Ferritin, Blutgerinnungsfaktoren, C-reaktives Protein, Isoenzyme, Apolipoproteine, usw.), Antigene, Antikörper einschließlich monoklonaler Antikörper, und andere Spezies ein, die natürlicherweise mit einem Rezeptor reagieren werden. Diese Erfindung ist besonders brauchbar für den Nachweis von therapeutischen Wirkstoffen, wie zum Beispiel Digoxin, Phenytoin, Theophyllin, Carbamazepin oder Phenobarbital und Hormonen, wie zum Beispiel Thyroxin oder Trijodothyronin.
  • Der Test kann unter der Verwendung jedes Enzymmarkers durchgeführt werden, der an dem Liganden angebracht werden kann, um einen markierten Liganden zu bilden. Enzyme, wie zum Beispiel Glukoseoxidase, Peroxidasen, wie zum Beispiel Rettichperoxidase (HRP), Amin angereicherte-Rettichperoxidase (HRP), alkalische Phosphatase und Galaktosidase sind bevorzugte Marker.
  • Es liegt innerhalb des Könnens des Durchschnittsfachmanns in klinischer Chemie, ein geeignetes Substrat für einen bestimmten Marker zu bestimmen. Das Substrat kann ein Material sein, das direkt durch den Enzymmarker behandelt wird oder ein Material das bei einer Reihe von Reaktionen beteiligt ist, die enzymatische Reaktion des Markers einschließen. Zum Beispiel, wenn der Enzymmarker eine Peroxidase ist, ist das Substrat Wasserstoffperoxid plus einem geeigneten reduzierenden Mittel. Unter der Verwendung von Glukoseoxidase auf einem Beispiel liegt das Substrat Glukose im allgemeinen in der Reagenzlage vor oder ist als eine Substratlösung hinzugefügt, um ungefähr 0,01 Mol/m² zu ergeben und bevorzugterweise von ungefähr 0,001 bis ungefähr 0,1 Mol/m². Ein Durchschnittsfachmann wird wissen, wie die Menge eines bestimmten Substrats für die Menge von in diesem Test verwendeten Enzymmarker einzustellen ist.
  • Die Reagenzlage kann eine Indikatorzusammensetzung enthalten, die eines oder mehrere Reagenzien umfaßt, die eine nachweisbare Spezies als ein Ergebnis der durch den Marker katalysierten Reaktion zur Verfügung stellt. Die nachweisbare Spezies könnte eine Farbe entwickeln, radioaktiv sein, fluoreszieren oder chemilumineszent sein. Für die vorliegenden Zwecke wird die Erfindung unter der Verwendung einer colorimetrischen Indikatorzusammensetzung verdeutlicht, die eine colorimetrisch nachweisbare Spezies als ein Ergebnis einer enzymatischen Reaktion eines Enzym-markierten Ligandenanalogons mit einem Substrat zur Verfügung stellt.
  • Die Indikatorzusammensetzung kann eine einzelne Verbindung sein, die eine nachweisbare Farbe nach enzymatischer Reaktion produziert oder eine Kombination von Reagenzien, die die Farbe produzieren. Zum Beispiel kann die colorimetrische Indikatorzusammensetzung, wenn Glukose als das Substrat verwendet wird und Glukoseoxidase als der Enzymmarker, ein Kupplungsmittel und eine oxidierbare Verbindung einschließen, die reagieren, um eine Farbe zur Verfügung zu stellen. Alternativ kann die Zusammensetzung einen Leuco-Farbstoff und eine Peroxidase oder eine andere Peroxidaseverbindung einschließen, die einen nachweisbaren Farbstoff als ein Ergebnis der Bildung von Wasserstoffperoxid erzeugt, das produziert wird, wenn Glukoseoxidase Glukose zu Glukonsäure überführt. Brauchbare Leuco-Farbstoffe sind im Stand der Technik bekannt und schließen diejenigen, zum Beispiel beschrieben in US-Patent Nr. 4,089,747 (erteilt am 16. Mai 1978 an Bruschi) und U.S. 4,670,747, angemeldet am 21. Mai 1984 durch Babb et al., ein. Die bestimmten Mengen der colorimetrischen Indikatorzusammensetzung und ihren verschiedenen Verbindungen liegen innerhalb des Könnens des Durchschnittsfachmanns.
  • Die markierten Liganden können unter der Verwendung bekannter Ausgangsmaterialien und -verfahren hergestellt werden oder käuflich erhalten werden. Im allgemeinen wird der Ligand durch eine kovalente Bindung an den Marker (z. B. eine Enzymgruppe) angebracht.
  • Der Immunassay kann manuell oder automatisiert sein. Im allgemeinen wird die Menge eines Liganden in einer Flüssigkeit bestimmt indem das Element von einer Zuführrolle, einem Chippaket oder anderer Quelle entnommen wird und physikalisch ein begrenzter Bereich der Verteilungslage mit einer Probe der Flüssigkeit, z. B. 1 bis 100 ul, in Kontakt gebracht wird. Der bestimmte Bereich, der in Kontakt gebracht wird, ist im allgemeinen nicht mehr als ungefähr 150 mm².
  • Die Menge von Liganden wird durch Passieren des Elements durch einen geeigneten Apparat zum Nachweis des komplexierten Ligandenanalogons direkt oder aber der nachweisbaren Spezies, die als ein Ergebnis einer enzymatischen Reaktion eines Enzymmarkers und eines Substrats gebildet wurde, bestimmt. Zum Beispiel kann die Spezies mit einem geeignetem spektrophotometrischen Apparat unter der Verwendung von allgemein bekannten Verfahren nachgewiesen werden. In einer enzymatischen Reaktion wird das sich ergebende Produkt durch zum Beispiel Messen der Veränderungsrate der Reflektions- oder Transmissionsdichte in dem begrenzten Bereich, der mit der Testprobe in Kontakt gebracht wurde, bestimmt. Der Bereich, der gemessen wird, weist einen Durchmesser von im allgemeinen von ungefähr 3 bis ungefähr 5 mm auf. Die Menge von Ligand in der flüssigen Proben ist invers proportional zu der Menge an in den begrenzten Bereich gemessenen Marker. Im allgemeinen wird die Markierungsmessung nach der Aufbringung einer Substratlösung durchgeführt.
  • Die folgenden Beispiele verdeutlichen die Praxis dieser Erfindung.
    • Herstellung von Vanadium IV enthaltenden Polymeren Präparatives Beispiel I
  • Komplex von Vanadylsulfat und Poly[acrylamid-co-N-(3- acetoacetamidopropyl)methacrylamid](Gewichtsverhältnis 70/30)(1/1 Polymer/Metallsalz).
  • Eine 12,5% wässrige Lösung von Poly[acrylamid-co-N-(3- acetoacetamidopropyl)methacrylamid)(Gewichtsverhältnis 70/30) (100 g, 0,017 Mol an &beta;- Diketongruppen) wurde bei Raumtemperatur mit 3,3 g, 0,017 Mol von VOSO&sub4;·H&sub2;O behandelt und leicht gerührt, um eine blaue gebrauchsfertige Lösung zu ergeben.
    • Präparatives Beispiel 2
  • Komplex von Vanadylsulfat und Poly(acrylamid-co-acrylsäure) (Gewichtsverhältnis 90/10) (1/1 Polymer/Metallkomplex).
  • Eine Lösung von 2,7 g Vanadylsulfat in 20 ml Wasser wurde zu einer Lösung von 10 g (Trocken) Poly(acrylamid-co-acrylsäure) (Gewichtsverhältnis 90/10) in 200 ml Wasser hinzugefügt und bei Raumtemperatur sanft gerührt, um eine gebrauchsfertige blaue Lösung des Polymer/Metallkomplexes zu ergeben.
  • Komplexe von Vanadylsulfat wurden mit den folgenden Polymeren ähnlich hergestellt:
    • Vergleichsbeispiele Vergleichsbeispiel 1
  • Ein Element, frei von Vanadium IV (V&spplus;&sup4;) enthaltenden Polymeren, zur Durchführung eines Immunassays auf Phenobarbital in Serumproben, wurde auf einem Poly(ethylenterephthalat)- Träger hergestellt. Das Element wies die folgende Konfiguration und Inhaltsstoffe auf.
  • Die in den oben angegebenen Element aufgelisteten Verbindungen, die in den nachfolgenden Verfahren verwendet werden, sind wie folgt:
  • Marker: Der Marker war ein Phenobarbital/Amin-angereichertes Rettichperoxidasekonjugat, beschrieben in Beispiel 6 (Marker F), hergestellt wie beschrieben in US-Patent 5,284,948 und US-Patent 5,601,994. Der Marker ist ein Konjugat einer Amin-angereicherten Amin- Rettichperoxidase und eines Phenobarbitalhaptens, das eine verlängerte Verbindungskette aufweist.
  • Magenta-Farbstoff: 4,5-Dihydroxy-3-(6,8-disulfo-2-naphtylazo)-2,7-naphtalindisulfonsäure, Natriumsalz (KANN 905783).
  • MOPS: 3-(N-Morpholino)propansulfonsäurepuffer.
  • BSA: Rinderserumalbumin.
  • TX-100: Triton X-100 oberflächenaktives Mittel - ein Octylphenoxypolyethoxyethanol oberflächenaktives Mittel, verkauft durch Union Carbide.
  • TES: N-[tris(Hydroxymethyl)methyl]-2-aminoethansulfonsäurepuffer.
  • Adhäsives Polymer: Poly(methylacrylat-co-natrium-2-acrylamid-2-methylpropansulfonat-co- 2-acetoacetoxyethylmethacrylat).
  • Polymerperlen: Poly(vinyltoluol-co-methacrylsäure)-Partikel, die einen durchschnittlichen Durchmesser im Bereich von 20-40 uM aufweisen.
  • Polymerbindemittel: Poly(N-isopropylacrylamid-co-2-hydroxyethylmethacrylat-co-N,N'- methylenbisacrylamid).
  • Leuco-Farbstoff: 4,5-Bis(4-dimethylaminophenyl)-2-(3,5-dimethoxy-4- hydroxyphenyl)imidazol.
  • Tetronic T908: Ein nichtionisches oberflächenaktives Mittel, das ein Block-Copolymer aus Ethylenoxid und Propylenoxid ist, verkauft durch BASF Corp.
  • Olin 10G: Ein Isononylphenoxypolyglycidol oberflächenaktives Mittel, das im Durchschnitt ungefähr 10 Glycidol-Einheiten pro Molekül enthält, verkauft durch Olin Chem. Co.
  • Antikörperperlen: Polymerpartikel aus Poly[styrol-co-3-(p-vinylbenzylthio)propionsäure], die einen kovalent daran gebunden Antikörper gegen Carbamazepin aufweisen.
  • BVSME: Bis(Vinylsulfonylmethyl)ether.
  • DTPA: Diethylentriaminpentaessigsäure.
  • Magazine, die diese Elemente enthalten, wurden hergestellt und auf eine Laborbank über Nacht plaziert. Das Licht in dem Labor wurde über Nacht angelassen. Am nächsten Tag wurden die Elemente in einem Prototyp-automatisierten Dünnfilm-Immunassay-Analyzer getestet. Zehn ul einer Testlösung, die 10 ug/ml Phenobarbital enthielt, wurden auf das Element aufgetragen. Das Element wurde dann für 5 Minuten bei 37ºC inkubiert, wonach 10 ul einer Waschflüssigkeit, enthaltend Na&sub2;HPO&sub4; (10 mM, pH 6,8), 4'-Hydroxyacetanilid (5 mM), 4'- Hexadecylpyridiniumchlorid (0,1%), H&sub2;O&sub2; (8,8 mM) und DTPA (10 uM), auf die Scheibe aufgetragen wurde. Diese Flüssigkeit wäscht sowohl nicht gebundenen Marker aus dem Nachweisbereich weg und initiiert die HRP-katalysierte Farbbildungsreaktion. Das Element wurde dann in einem 37ºC Inkubator plaziert und Reflektionsdichteablesungen wurden alle 3 Sekunden bei 670 nM genommen. Die Rate der Farbbildung wurde von diesen Ablesungen berechnet. Die Ergebnisse waren:
  • Die oberste Scheibe wies eine signifikant geringere Rate auf, als die anderen Scheiben in dem Magazin.
  • *n = Die Zahl der getesteten Scheiben. Der Dt/Min-Wert ist ein Durchschnitt für die Zahl von getesteten Scheiben.
    • Vergleichsbeispiel 2
  • Die in den oberen Elementen beobachteten geringeren Raten könnten ebenfalls in den Elementen induziert sein, indem sie von dem Magazin entnommen werden und sie auf den Labortisch plaziert werden, wodurch ihr Aussetzen gegenüber Umweltfaktoren (z. B. Licht, Luft), zu denen die obersten Elemente in den Magazinen ausgesetzt waren, erhöht wird. Dies führte zu einem noch größerem Verlust der Raten als in dem obersten Element eines Magazins beobachtet.
  • Phenobabitalelemente der im Vergleichsbeispiel 1 beschriebenen Formulierungen wurden auf eine Laborbank über Nacht plaziert. Magazine, die ähnliche Elemente enthielten, wurden ebenfalls hergestellt und ebenfalls auf dieselbe Laborbank über Nacht plaziert. Das Licht in dem Labor wurde während des Experiments angelassen. Am nächsten Tag wurden die Elemente in einem Prototyp-automatisierten Dünnfilm-Immunassay-Analyzer, wie beschrieben in Vergleichsbeispiel 1, getestet. Die Ergebnisse waren (die Raten von den oberen Elementen in den Magazinen wurden nicht in die Datenanalyse einbezogen):
  • Obwohl dieser Typ an Aussetzen bei weitem schwerer war, als derjenige, dem die oberen Elemente in einem Magazin ausgesetzt sind, stellte es ein bequemes experimentelles System zur Verfügung, um den Effekt von Umweltfaktoren auf die Rate der Farbentwicklung zu untersuchen.
    • Vergleichsbeispiel 3
  • Die Verbesserung in der Enzymstabilität, die durch die Polymere der vorliegenden Erfindung hervorgerufen wird, wurde in einem anderen Test unter der Verwendung einer Dünnfilmbeschichtung offensichtlich. In diesem Beispiel wurde ein Dünnfilm der folgenden Formulierung auf einem Poly(ethylenterephthalat)-Träger hergestellt:
  • Dieses Element wurde verwendet, um die HRP Stabilität mit dem folgenden Protokoll zu messen. Zehn Mikroliter einer Lösung von 10 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, der ungefähr 3 · 10&supmin;&sup8; M HRP enthielt, wurden auf jedes der drei Elemente aufgetropft, die aus dem oben beschriebenen Dünnfilm hergestellt waren. Diese Elemente wurden in eine dunkle Schublade über Nacht plaziert. Am nächsten Tag wurden die Elemente aus der Schublade entfernt und die HRP wurde durch Einweichen jedes Elements in 1 ml einer Lösung von 10 mM Natriumphosphat, 0,15 M Natriumchlorid, 0,1% Rinderserumalbumin, pH 7,0 in ein Testgefäß extrahiert, um die HRP zu extrahieren. Nach Vortexen des Testgefäßes (was die Dünnlilmkomponenten von dem Poly(ethylenterephthalat)-Träger entfernte), wurde die so erhaltene Suspension zentrifugiert und die Lösung entfernt. Die Menge von aktiver HRP in dieser Lösung wurde bestimmt, indem ein 100 ul Aliquot abgenommen wurde und dieser Aliquot zu einer Spektrophotometer-Küvette hinzugefügt wurde, die bereits 800 ul einer Lösung von 10 mM Natriumphosphat, pH 6,8, 10 mM Diethylentriaminpentaessigsäure, 5 mM 4'- Hydroxyacetanilid, 1,25% Polyvinylpyrrolidon, 0,01% 4,5-bis(4-Dimethylaminophenyl)-2- (4-hydroxy-3-methoxyphenyl)imidazol Leuco-Farbstoff und 8,8 mM Wasserstoffperoxid und 100 ul einer Lösung von 5 mM 4'-Hydroxyacetanilid enthielt. Eine blaue Farbe wurde gebildet, dessen Rate spektrophotometrisch bei 670 nM gemessen wurde. Die Rate der Farbbildung war direkt proportional zu der Menge von aktivem Enzym in dem Extrakt.
  • In dem oben beschriebenen Fall (wobei die HRP zu dem Element in einer Lösung von 10 mM Phosphatpuffer, pH 7,0 hinzugefügt wurde), wurde die Menge von aktivem Enzym, das von dem Element nach Befolgen des oben angegebenen Protokolls extrahiert wurde (Fraktion aktiver extrahierter HRP) mit der Menge von auf dem Element aufgetragenem aktivem Enzym verglichen. Das Ergebnis war:
    • Beispiele der Erfindung Beispiele 1 und 2
  • Die niedrige Rate der Farbbildung des oberen Elements würde eine falsche Voraussage der auf diesem Element getesteten Analytenprobe verursachen. Um diese Situation zu beseitigen, wurde die Formulierung der Elemente verbessert, um zu vermeiden, daß Umweltfaktoren diesen negativen Effekt auf das obere Element aufweisen. Es wurde gefunden, daß die Inkorporation von Polymeren, die Vanadium IV enthalten, in Beschichtungen in Elementen, die über Nacht auf der Laborbank plaziert waren, zu einer viel größeren Resistenz der Rate der Farbentwicklung gegenüber dem Aussetzen der Umwelt führte.
  • Phenobarbital-Elemente wurden unter der Verwendung der Formulierung des Vergleichsbeispiels 1 hergestellt, mit der Ausnahme, daß der Komplex von Vanadylsulfat und Poly[acrylamid-co-N-(3-acetoacetamidopropyl)methylacrylamid] (Gewichtsverhältnis 95/5) des präparativen Beispiels 5 bei einer Trockenbedeckung von 0,45 g/m² in die Perlenverteilungslage inkorporiert wurde. In einem Experiment, ähnlich zu dem in Vergleichsbeispielen 1 und 2 beschriebenen, wurden Elemente dieser neuen Formulierung direkt auf die Laborbank über Nacht plaziert, und Magazine, die diese neuen Elemente enthielten, wurden hergestellt und die Magazine wurden ebenfalls auf der Laborbank über Nacht plaziert. Das Licht im Labor wurde über Nacht angelassen. Am nächsten Tag wurden die Elemente in einem Prototypautomatisierten Dünnfilm-Immunassay-Analyzer, wie beschrieben im Vergleichsbeispiel 1, getestet. Die Ergebnisse waren (die Raten der obersten Elemente in den Magazinen wurden nicht in die Datenanalyse einbezogen):
    • Beispiel 1
  • Obere Elemente in Magazinen waren gegenüber einem Verlust der Rate weniger empfänglich, wenn sie unter der Verwendung dieser neuen Formulierung hergestellt wurden. In einem Experiment, ähnlich zu dem in Vergleichsbeispiel 1 beschriebenen (oberes Element in einem Magazin verglichen zu nicht-oberen Elementen in demselben Magazin), waren die Ergebnisse:
  • In diesem Experiment war die Prozentrate des oberen Elements verglichen zu den nichtoberen Elementen (-7%) im Vergleich zu der Originalformulierung (Vergleichsbeispiel 1, -49%) verbessert.
    • Beispiel 2
  • Die neue Formulierung war erheblich besser geschützt, sogar wenn die Elemente offen auf der Laborbank belassen wurden.
  • Die 42% Verlustrate unter der Verwendung der neuen Formulierung war im Vergleich zu der 84% Verlustrate (Vergleichsbeispiel 2) unter der Verwendung der Ausgangsformulierung erheblich verbessert.
    • Beispiel 3
  • Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung wurden zu der Lösung von HRP und Phosphatpuffer aus Vergleichsbeispiel 3 hinzugefügt, so daß die Konzentration von Vanadyl (VO&spplus;²) 1 mM betrug, und das Protokoll des Vergleichsbeispiel 3 wurde befolgt. Die folgenden Ergebnisse wurden erhalten:
  • Die Prozent von HRP Restaktivität (55-61%) waren erheblich verbessert, wenn diese Verbindungen vorhanden waren, verglichen zu einer Lösung, die nur Phosphatpuffer enthielt (27%).
    • Beispiel 4
  • Ein Element für den Test auf Thyroxin in Serumproben wurde auf einem Poly(ethylenterephthalat)-Träger hergestellt. Das Element wurde genau wie in den vorherigen Beispielen verwendet, mit der Ausnahme, daß Thyroxin-Antikörperperlen verwendet wurden, anstelle eines Antikörpers gegen Phenobarbital. Die Gravurlage enthielt keine Trehalose. Die Perlenverteilungslage enthielt a) 0,22 g/m² von 3'5'-Dichlor-4'-hydroxyacetanilid); 0,9 g/m² Rindergammaglobulin (BGG) anstelle des 1,0 g/m² BSA; und 0,1 g/m² Tetronic T908 oberflächenaktives Mittel. Die Rezeptorlage wies 0,80 g/m² polymeres Bindemittel auf und die Gellage wies 0,44 g/m² an 3,5'-Dichlor-4'-hydroxyacetanilid und 0,165 g/m² Furosemid auf.
  • Der Marker in dem Element war Thyroxin-Rettichoxidase. Dies ist ein Konjugat von Rettichperoxidase und N-[4-(-(Succinimid- oxycarbonylpropionyl)piperazinocarbonylmethoxyacetyl]thyroxinmethylester, hergestellt gemäß der Intermediatherstellung 1 und dem präparativen Beispiel 1 der Erfindung aus US- Patent 5,527,709.
  • Beschichtete Elemente, die Polymere der Erfindung enthielten, die in den präparativen Beispielen 1, 2 und 3 hergestellt wurden, wurden in die Perlenverteilungslagen von getrennten Elementen bei einer Wiederbenässungskonzentration von 2 mM inkorporiert.
    • Beschichtungsnummer Präparatives Polymer
  • 1 1
  • 2 2
  • 3 3
  • Die Beschichtungen wurden geschnitten und als Elemente montiert. Magazine die diese Elemente enthielten, wurden hergestellt und wie in Vergleichsbeispiel 1 beschrieben, getestet, mit der Ausnahme, daß 10 ml einer Testlösung, die 9,2 ug/dl Thyroxin enthielt, auf jedes Element aufgetragen wurde.
  • Die Ergebnisse waren:
  • Es wurde sehr wenig Verlustrate in den oberen Elementen jeder dieser Beschichtungen beobachtet.
  • Die Erfindung wurde genau mit besonderem Bezug auf bevorzugte Ausführungsformen davon beschrieben, es wird jedoch verstanden werden, daß Variationen und Modifikationen innerhalb des Bereichs der Erfindung bewirkt werden können, wie in den Ansprüchen definiert.

Claims (20)

1. Trockenes Immunoassay-Analyseelement zur Untersuchung eines Liganden, umfassend einen Träger, tragend
(a) einer markierter Ligand-Zone,
(b) eine Verteilungsorte; und
(c) eine Aufnahmezone, die eine feste Konzentration eines immobilisierten Rezeptors für den Liganden und den markierten Liganden enthält und wobei der Rezeptor kovalent an Polymerbeads gebunden ist, die einen Durchmesser im Bereich von 0,1 bis 5 um aufweisen;
dadurch gekennzeichnet, daß das Element ein wasserlösliches Polymer enthält, das Vanadium IV (V&spplus;&sup4;) Ionen enthält und die Zonen in derselben oder getrennten Lagen vorhanden sein können.
2. Element nach Anspruch 1, wobei das Vanadium IV (V&spplus;&sup4;) Ion im Polymer als Vanadyl (VO&spplus;²) Ionen vorhanden ist.
3. Element nach Anspruch 2, wobei das Polymer ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus a) Polymersalzen, die Vanadyl (VO&spplus;²) Ionen enthalten und b) Polymere, die Heteroatome aufweisen, die in der Lage sind, Liganden mit Vanadyl (VO&spplus;²) Ionen zu bilden.
4. Element nach Anspruch 3, wobei das Polymer von 2 bis 80 Gewichtsprozent von sich wiederholenden Einheiten, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) polymerisierten Monomeren, die Seitenketten aufweisen, die anionische Gruppen enthalten und b) polymerisierte Monomere, die Seitenketten auf weisen, die Heteroatome enthalten, die in der Lage sind, Liganden mit Metallen zu bilden, umfaßt.
5. Element nach Anspruch 4, wobei a) die anionischen Gruppen bestehend aus Sulfonat Sulfat, Carboxylat, Phosphat und Phosphonat und b) die Heteroatom Ionen Liganden-bildende Gruppe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus &beta;-Diketon, Amin, Sulfhydryl Carbonyl, Carboxy und Hydroxy.
6. Element nach Anspruch 5, wobei die Polymersalze und die Polymerliganden mit Polymeren gebildet werden, die die Struktur (I):
(A)x(B)y(C)z
aufweisen, worin
A polymerisierte hydrophile Monomere ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Acrylamid, N-Isopropylacrylamid, N-t-Butylacrylamid, 1-Vinylimidazol, N-Vinylpyrrolidon, N- Methylolcacrylamid, 2-Hydroxyethylacrylat und 2-Diydroxypropylacrylat darstellt; B polymerisierte Monomere ausgewählt aus Monomeren, die eine anionische oder Metallkomplexierende oder Liganden-bildende Gruppe, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Sulfonat; Carboxylat; Phosphonat; &beta;-Diketon
Gruppen; primäre, sekundäre oder tertiäre Amingruppen; Carboxyl; Carbonyl und Hydroxygruppen enthalten, darstellt;
C sich wiederholende Einheiten, abgeleitet von jeden anderen Monomeren, die mit dem Immunoassay-Analyseelement kompatibel sind, darstellt
x 20 bis 98 Gewichtsprozent ist;
y 2 bis 80 Gewichtsprozent ist; und
z 0 bis 20 Gewichtsprozent ist
7. Element nach Anspruch 6, worin B ein polymerisiertes Monomer ist, das Komponenten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Sulfonat, &beta;-Diketon oder einem primären Amin aufweist und C Acrylnitril, Maleimid, Methacrylamid und N-t-Butylacrylamid darstellt.
8. Element nach Anspruch 7, worin B polymerisiertes N-(3- Acetoacetamidopropyl)methacrylamid, 2-Acetoacetoxyethylmethacrylat, N-(2- Acetoxyethyl)acrylamid, N-(2-Acetoacetamidoethyl)methacrylamid, Natrium 2-Acrylamid-2- methylpropansulfonat, Natrium 3-Acryloyloxypropan-1-sulfonat, 2- Aminoethylmethacrylathydrochlorid N-(3-Aminopropyl)methacrylamidhydrochlorid, Acrylsäure, Methacrylsäure, 3-(p-Vinylbenzylthio)propionsäure, 2-Phosphatethylacrylat, 2- Phosphatethylmethacrylat, 3-Phosphatpropylacrylat, 3-Phoshatpropylmethacrylat, 2- Sulfatethylmethacrylat und N-(m-& p-Vinylbenzyl)nitrilodiessigsäure darstellt
9. Element nach Anspruch 8, wobei das Polymer, das Vanadyl (VO&spplus;²) oder Vanadium IV Ionen enthält, ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Poly[acrylamid-co-N-(3- acetoacetamidopropyl)metracrylamid]; Poly(acrylamid-co-acrylsäure); Poly(acrylamid-co-natrium-2- acrylamid-2-methyl-propansulfonat); Poly[acrylamid-co-N-t-butylacrylamid-co-N-(3- aminopropyl)methacrylamidhydrochlorid]; und Poly[acrylamid-co-natrium-2-acrylamid-2- methylpropansulfonat-co-N-(3-acetoacetamidopropyl)methacrylamid].
10. Element nach Ansprach 9, wobei das Polymer aus der folgenden Tabelle ausgewählt ist:
11. Element nach einem der Ansprüche 1-10, wobei die trockenen Bedeckungen von Vanadyl in dem Polymer zwischen 13 und 53 mg/m² sind.
12. Element nach einem der Ansprüche 1-10, wobei Meerrettichperoxidase der Marker in dem markierten Liganden ist.
13. t Element nach Anspruch 10, wobei das Element ebenfalls in einer seiner Lagen das Elektronentransfermittel (ETM) 3'5'-Dichlor-4'-hydroxyacetanilid umfaßt.
14. Wasserlösliches Polymer, enthaltend a) Vanadium IV Ionen und b) sich wiederholende polymerisierte Einheiten die die Struktur (T):
(A)x(B)y(C)z;
aufweisen, worin
A polymerisierte hydrophile Monomere, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Acrylamid, N- Isopropylacrylamid, N-t-Butylacrylamid, 1-Vinylimidazol, N-Vinylpyrrolidon, N-Methyloacrylamid, 2- Hydroxyethylacrylat und 2,3-Dihydroxypropylacrylat darstellt;
B polymerisierte Monomere ausgewählt aus Monomeren, die eine anionische oder Metallkomplexierende oder Liganden-bildende Gruppe, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Sulfonat; Sulfat; Carboxylat; Phosphat; &beta;-Diketon
Gruppen; primäre, sekundäre oder tertiäre Amingruppen; Carbonyl und Carboxyl und Hydroxygruppen enthalten, darstellt;
C sich wiederholende Einheiten, abgeleitet von allen anderen Monomeren, die mit dem Immunoassay- Analyseelement kompatibel sind, darstellt;
x 20 bis 98 Gewichtsprozent ist;
y 2 bis 80 Gewichtsprozent ist; und
z 0 bis 20 Gewichtsprozent ist
15. Polymer nach Anspruch 14, worin B ein polymerisiertes Monomer ist, das Komponenten abgewählt aus der Gruppe bestehend aus Sulfonat, &beta;-Diketon oder einem primären Amin aufweist und C Acrylnitril, Maleimid, Methacrylamid und N-t-Butylacrylamid darstellt.
16. Polymer nach Anspruch 14, worin B polymerisiertes N-(3- Acetoacetamidopropyl)methacrylamid, 2-Acetoacetoxymethylmethacrylat, N-(2- Acetoacetoxyethyl)acrylamid, N-t-Acetcocetamidcethyl)methacrylamid, Natrium-2-Acrylamid-2- methylpropansulfonat, Natrium-3-Acetyloyloxypropan-1-sulfonat, 2- Aminoethylmethacrylathydrochlorid, N-3-Aminopropyl)methacrylamidhydrochlorid, Acrylsäure, Methacrylsäure, 3-(p-Vinylbenylthio)propionsäure, 2-Phosphatethylacrylat, 2- Phosphatethylmethacrylat, 3-Phosphatpropylacrylat, 3-Phosphatpropylmethacrylat, 2- Sutatethylmethacrylat und N-(m-& p-vinylbenzyl)nitridodiessigsäure darstellt
17. Polymer nach Anspruch 15, wobei das Polymer Vanadium IV Ionen und ein zweites Polymer, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Poly[acrylamid-co-N-(3- acetoacetamidopropyl)methacrylamid]; Poly[acrylamid-co-acrylsäure); Poly(acrylamid-co-natrium-2- acrylamid-2-methyl-propansulfonat); Poly[acrylamid-co-N-t-butylacrylamid-cc-N-(3- aminopropyl)methacrylamidhydrochlorid und Poly[acrylamid-co-natrium-2-acrylamid-2- methylpropansulfonat-co-N-(3-acetoacetamidopropyl)methacrylamid] enthält.
18. Polymer nach Anspruch 17, wobei das Polymer ausgewählt ist aus der folgenden Tabelle:
19. Zusammensetzung, umfassend das Polymer nach Anspruch 15 und Meerrettichperoxidase oder ein Konjugat daraus.
20. Verfehlen zur Bestimmung eines immunologisch reaktiven Liganden in einer wässrigen Flüssigkeitsprobe, umfassend die Schritte von:
A. Zur Verfügung stellen eines trocknen Immunoassay-Analyseelements nach Anspruch 1;
B. In Kontakt bringen eines begrenzten Bereichs der oberen Zone oder Lage des Elements mit einer Probe der Flüssigkeit, wodurch (i) ein immobilisierter Liganden-Rezeptor- Komplex und (n) ein immobilisierter Enzym-markierter Liganden-Rezeptor-Komplex gebildet werden;
C. In Kontakt bringen des begrenzten Bereichs des Elements mit einer Substratlösung, wodurch die Entwicklung einer Farbe katalysiert wird; und
D. Colorimetrische Bestimmung der Konzentration des Liganden.
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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5883644A (en) 1993-10-29 1999-03-16 Hewlett-Packard Company Resolution-dependent and color-dependent print masking
US5686254A (en) * 1995-06-07 1997-11-11 Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. Reduction in first slide bias and improved enzyme stability by the incorporation of diaryl tellurides in thin-film immunoassay elements
US5928886A (en) * 1995-06-07 1999-07-27 Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. Reduction in first slide bias and improved enzyme stability by incorporation of diaryl tellurides in the gravure layer of dry-film, immunoassay elements
DE19732902A1 (de) * 1997-07-30 1999-02-04 Sun Chemical Corp Deckschicht für lichtempfindliche Materialien umfassend ein (1-Vinylimidazol)-Polymer oder -Copolymer
WO1999060385A1 (en) * 1998-05-20 1999-11-25 University Of Maryland, Baltimore Analyte quantitation using a metal-ligand complex probe
JP4634868B2 (ja) 2005-06-03 2011-02-16 株式会社ミツトヨ 画像測定方法及びシステム
JP5150508B2 (ja) * 2005-12-07 2013-02-20 ロチャル インダストリーズ エルエルピー 液状のポリマー含有被覆材料
JP5393757B2 (ja) * 2010-12-22 2014-01-22 富士フイルム株式会社 新規化合物及びその製造方法

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2865893A (en) 1954-07-27 1958-12-23 Eastman Kodak Co Hydrolysis copolymers of vinyl acetate and unsaturated carbamates
US2860986A (en) 1956-08-31 1958-11-18 Eastman Kodak Co Partially acetalized polyvinyl alcohol containing active halogen
US2904539A (en) 1956-12-17 1959-09-15 Eastman Kodak Co Cyanoacetamidophthalic acid esters of polymers
US3554987A (en) 1965-12-20 1971-01-12 Eastman Kodak Co Novel compounds and photographic materials containing said compounds
US3488708A (en) 1965-12-20 1970-01-06 Eastman Kodak Co Photographic materials containing novel polymers
US3459790A (en) 1965-12-20 1969-08-05 Eastman Kodak Co Polymerizable acrylic acid esters containing active methylene groups
US3658878A (en) 1965-12-20 1972-04-25 Eastman Kodak Co Ethylenically unsaturated cyano group containing compounds
BE790993A (fr) * 1971-11-09 1973-05-07 Monsanto Chemicals Matieres polymeres a liaisons de reticulation thermiquement reversible
US3939130A (en) 1974-08-15 1976-02-17 Indicon Inc. Polymers of monomers containing active methylene groups and other ethylenically unsaturated monomers
US3904418A (en) 1974-08-15 1975-09-09 Eastman Kodak Co Hardenable vehicles for silver halide emulsions
US3929482A (en) 1973-09-04 1975-12-30 Eastman Kodak Co Hardenable vehicles for silver halide emulsions
US4089747A (en) 1976-08-09 1978-05-16 Eastman Kodak Company Compositions for the detection of hydrogen peroxide
NL7610608A (nl) * 1976-09-24 1978-03-29 Akzo Nv Werkwijze voor het stabiliseren van peroxidase- -bevattende composities.
US4346231A (en) * 1978-12-20 1982-08-24 Ponticello Ignazio S Polymerizable ethylenically unsaturated amide compounds
US4258001A (en) 1978-12-27 1981-03-24 Eastman Kodak Company Element, structure and method for the analysis or transport of liquids
US4421915A (en) 1980-06-09 1983-12-20 Eastman Kodak Company Polymerizable ethylenically unsaturated amide compounds
US4438278A (en) 1980-06-09 1984-03-20 Eastman Kodak Company Polymerizable ethylenically unsaturated amide compounds
JPS57101761A (en) * 1980-12-17 1982-06-24 Konishiroku Photo Ind Co Ltd Analyzing element
CA1240445A (en) 1982-03-09 1988-08-09 Wayne A. Bowman Chill-gelable polymers
US4670381A (en) 1985-07-19 1987-06-02 Eastman Kodak Company Heterogeneous immunoassay utilizing horizontal separation in an analytical element
EP0308235B1 (de) * 1987-09-18 1992-07-22 EASTMAN KODAK COMPANY (a New Jersey corporation) Verknüpfung von Verbindungen mit polymeren Teilchen unter Verwendung von Carbamoyloniumvebindungen
DE3940010A1 (de) * 1989-12-02 1991-06-06 Boehringer Mannheim Gmbh Verwendung eines schwer loeslichen salzes einer heteropolysaeure zur bestimmung eines analyts, entsprechendes bestimmungsverfahren sowie hierfuer geeignetes mittel
US5155166A (en) 1990-06-18 1992-10-13 Eastman Kodak Company Use of 1-(1-pyrrolidinylcarbonyl)pyridinium salts to attach compounds to carboxylated particles and a kit containing same
US5516645A (en) * 1994-04-25 1996-05-14 Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. Immunoassay analytical elements containing vanadium IV(V+4)ions

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Publication number Publication date
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US5696193A (en) 1997-12-09
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JP3696874B2 (ja) 2005-09-21
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