DE69217727T2

DE69217727T2 - Analytisches Element beschichtet durch ein Ätzverfahren

Info

Publication number: DE69217727T2
Application number: DE69217727T
Authority: DE
Inventors: Glen M Dappen; James W Hassett; James F Heinle
Original assignee: Johnson and Johnson Clinical Diagnostics Inc
Current assignee: Ortho Clinical Diagnostics Inc
Priority date: 1991-06-07
Filing date: 1992-06-04
Publication date: 1997-07-03
Anticipated expiration: 2012-06-05
Also published as: SG71663A1; JPH05172819A; EP0517338A2; DE69217727D1; CA2062176A1; EP0517338B1; EP0517338A3; ATE149688T1; HK121397A

Description

Die Erfindung betrifft die klinische Chemie, ein Element für Immunoassays und Verfahren zur Bestimmung eines immunologisch reaktiven Liganden.
Immunoassays, die sich natürlicher immunologischer Reaktionen bedienen, stellen weitverbreitete analytische Techniken in der klinischen Chemie dar. Aufgrund der Spezifität der Reaktionen erweisen sie sich als besonders vorteilhaft zur quantitativen Bestimmung von biologischen Analyten, die in sehr geringen Konzentrationen in biologischen Flüssigkeiten vorhanden sind. Zu derartigen Analyten gehören beispielsweise Antikorper, therapeutische Arzneistoffe, Narkotika, Enzyme, Hormone, Proteine und dergl.
Der Analyt, auf den der Assay abgestellt ist, wird hier als Ligand bezeichnet. Der markierte Analyt wird als markierter Ligand bezeichnet (unter Einschluß von immunokompetenten Derivaten und Analogen von derartigen Liganden). Verbindungen, die spezifisch den Liganden und den markierten Liganden erkennen und unter Bildung von Komplexen damit reagieren, werden hier als Rezeptoren bezeichnet. Der Rezeptor und der Ligand oder der markierte Ligand bilden ein Konjugatpaar. Beliebige Bestandteile des Paars können als Rezeptor oder als Ligand wirken.
Bei kompetitiv bindenden Immunoassays konkurriert ein markierter Ligand mit unmarkiertem Liganden um die Umsetzung mit einer feststehenden Menge des geeigneten Rezeptors. Unbekannte Konzentrationen des Liganden lassen sich aufgrund des gemessenen Signals entweder des gebundenen oder ungebundenen (d. h. freien) markierten Liganden bestimmen. Die Reaktion läuft folgendermaßen ab:
Ligand + markierter Ligand + Rezeptor < = >
Ligand-Rezeptor + markierter Ligand-Rezeptor.
Zu herkömmlichen Markierungen gehören radioaktive Markierungen, Enzyme, Chromophore, Fluorophore, stabile freie Radikale und Kofaktoren, Inhibitoren und allosterische Effektoren von Enzymen.
Analytische Immunoassay-Elemente sind aus den US-Patenten 4 517 288 und 4 258 001 bekannt. Im allgemeinen umfassen derartige Elemente Rezeptoren, wie Antikörper für einen Liganden, die in einer teilchenförmigen Schicht immobilisiert sind. Zusätzlich enthält das Element üblicherweise ein Reagenzsystem, das durch Wechselwirkung mit einer gebundenen oder ungebundenen Spezies zu einem Signal führt, das mit der Konzentration des Liganden in einer Probe korreliert werden kann. Bei der Anwendung wird die Probe manuell mit einem enzymmarkierten Liganden vereinigt und auf das Element aufgebracht. Nach einer bestimmten Zeitspanne wird eine ein Substrat für den markierten Liganden enthaltende Lösung auf die teilchenförmige Schicht aufgebracht. Das Substrat wird durch die Enzymmarkierung unter Bildung eines Reaktionsprodukts katalysiert, das schließlich die Entwicklung einer Signalfarbe verursacht. Die Reflexionsdichte der Farbe kann mit der Konzentration des Liganden in der Probe in Korrelation gebracht werden.
Häufig werden die vorstehenden analytischen Elemente in weitgehend automatisierten Immunoassays eingesetzt. Die Notwendigkeit der Zugabe von markiertem Liganden zu der Probe vor der Durchführung des Assays vermindert die potentielle Leistung von automatisierten Systemen.
Die beiden US-Patente 4 517 288 und 4 258 001 empfehlen jeweils die Verwendung eines markierten Liganden, der schichtförmig auf die teilchenförmige Schicht, in der der Rezeptor immobilisiert ist, aufgebracht ist. Das letztgenannte Patent lehrt die Verwendung einer Sperrschicht zwischen dem überzug mit dem markierten Liganden und der teilchenförmigen Schicht, um eine verfrühte Reaktion zwischen dem Rezeptor und dem markierten Liganden zu vermeiden. Die Schwierigkeit besteht darin, daß keines dieser Patente dem Fachmann eine Lehre vermittelt, wie ein Immunoassay-Element herzustellen ist, bei dem ein überzug mit einem markierten Liganden direkt über die den immobilisierten Rezeptor enthaltende Schicht ohne zwischenliegende Sperrschicht so aufzubringen ist, daß (a) eine Inaktivierung des Rezeptors, z. B. von Antikörpern, verhindert wird und (b) eine schädliche verfrühte Bindung zwischen dem markierten Liganden und dem Rezeptor verhindert wird. Eine derartige verfrühte Bindung würde die Beendigung eines Immunoassays innerhalb einer wirtschaftlich vernünftigen Zeit verhindern und mit Sicherheit mehr als 20 Minuten erfordern. Mit anderen Worten, der Stand der Technik vermittelt keine ausreichende Lehre zum technischen Handeln.
EP-A-0 277 723 beschreibt einen Assay, bei dem eine Ligandenprobe mit einem ersten Bindungsreagenz in fester Phase und einem zweiten markierten Bindungsreagenz in flüssiger Phase inkubiert wird, wobei vor der Inkubation das zweite Bindungsreagenz in einer Schicht enthalten ist, auf der das erste Bindungsreagenz immobilisiert ist.
US-A-4 461 829 beschreibt ein Assay-Element, das einen festen Träger umfaßt, der die zur Durchführung eines homogenen, spezifisch bindenden Assays erforderlichen Reagenzien enthält.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die Notwendigkeit zur Zugabe eines markierten Liganden zu der Probe oder dem Element während des tatsächlichen Assay-Verfahrens überflüssig zu machen. Diese Aufgabe wird durch Bereitstellung eines trockenen, analytischen Immunoassay-Elements gemäß der Definition in Anspruch 1 gelöst.
Das erfindungsgemäße Immunoassay-Element ist insofern im wesentlichen frei von einer vorzeitigen Bindung, als die Dosis-Wirkungs-Kurve eines mit einem derartigen Element durchgeführten Immunoassays im wesentlichen die gleiche ist, wie die Dosis-Wirkungs-Kurve, die mit dem gleichen Element, wobei aber der markierte Ligand nicht schichtförmig im Element enthalten ist, erhalten wird. Statt dessen wird dabei der markierte Ligand gleichzeitig mit der zu testenden Probe auf das Element aufgebracht.
Außerdem enthält das Element keine Sperrschicht zwischen der teilchenförmigen, den Rezeptor enthaltenden Schicht und der den markierten Liganden enthaltenden Schicht, wodurch die Notwendigkeit für eine zusätzliche Beschichtungsstufe und zusätzliche Sperrschichtmaterialien entfällt. Dies wird ohne jeden signifikanten nachteiligen Einfluß auf die Rezeptoren erreicht.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Testen eines immunologischen reaktiven Liganden in einer Flüssigkeit unter Verwendung des vorstehenden Elements gemäß der Definition in Anspruch 12 bereit.
Figg. 1-4 sind Kurven, die die vorzeitige Bindung erläutern, die zwischen einem Antikörper und einem markierten Liganden erfolgt, wenn der markierte Ligand mit den in den Vergleichsbeispielen 1-4 eingesetzten Beschichtungsverfahren schicht förmig aufgebracht wird.
Figg. 5-6 sind Kurven, die zeigen, daß bei Anwendung der Beschichtungsverfahren der Beispiele 5-6 eine vorzeitige Bindung im wesentlichen ausbleibt.
Die erfindungsgemäßen Elemente umfassen (a) einen Überzug aus einem markierten Liganden über (b) einer teilchenförmigen Schicht, die immobilisierte Rezeptoren für den Liganden enthält. Das Element kann zusätzliche Schichten umfassen, wie sie beispielsweise nachstehend beschrieben sind. Alle diese Schichten, mit Ausnahme des den markierten Liganden enthaltenden Überzugs, können unter Anwendung von aus dem Stand der Technik bekannten Beschichtungstechniken, die nachstehend kurz erörtert werden, aufgebracht werden. Jedoch werden die den markierten Liganden enthaltenden überzüge durch Tiefdruckbeschichtung gemäß den nachstehend beschriebenen Verfahren aufgebracht.
Wie bereits erläutert, ist der überzogene markierte Ligand im wesentlichen frei von jeglichen Bindungsreaktionen mit dem Rezeptor. Die vorherige Bindung wird im wesentlichen vermieden, indem man in sorgfältiger Weise eine gleichzeitige Optimierung von 1) einer auf ein Minimum zurückgeführten Naßbeschichtungsmenge der den markierten Liganden enthaltenden Überzugszusammensetzung, wobei gleichzeitig eine zur Erzielung einer gleichmäßigen Bedeckung des markierten Liganden ausreichend nasse Beschaffenheit aufrechterhalten wird, und 2) einer raschen Trocknung in der Weise, daß a) im wesentlichen das gesamte Beschichtungslösungsmittel entfernt wird und b) eine ausreichende Enzymaktivität aufrechterhalten wird, vornimmt.
Die relative Affinität des Antikörpers und des markierten Liganden füreinander stellt ebenfalls einen wichtigen Faktor bei der Minimierung der vorherigen Bindung dar. Dieser Faktor wird entsprechend dem Wissen des Fachmanns gesteuert, indem man die Struktur des markierten Liganden bei gleichzeitiger sorgfältiger Wahl des Antikörpers manipuliert.
Im allgemeinen wird die Beschichtungsmenge an markiertem Liganden, die in einem erfindungsgemäßen Element erforderlich ist, empirisch für jeden spezifischen Immunoassay gemäß dem Verfahren von Anspruch 9 festgelegt. Dieses Verfahren umfaßt im allgemeinen die folgende Vorgehensweise:
1. Es wird die Konzentration an markiertem Liganden bestimmt, die zur Erzielung eines annehmbaren Immunoassay-Verhaltens erforderlich ist, wenn der Immunoassay durchgeführt wird, indem man auf das analytische Element den markierten Liganden gleichzeitig mit einer Probe aufsetzt. Ein annehmbares Testverhalten wird erreicht, wenn (a) der Test in weniger als 20 Minuten durchgeführt werden kann; (b) der dynamische Bereich des Tests so beschaffen ist, daß die nachweisbaren minimalen und maximalen Ligandenkonzentrationen einen klinisch geeigneten Konzentrationsbereich abdecken; und (c) klinisch signifikante Ligandenkonzentrationen für den dynamischen Bereich hinweg nachgewiesen werden können.
2. Der Grad der Beschichtungsmenge des markierten Liganden, die zusammen mit dem gleichen analytischen Element erforderlich ist, um ein annehmbares Testverfahren zu erreichen, wird empirisch bestimmt, indem man:
A. Direkt über die teilchenförmige Rezeptorschicht des Elements, das zur Festlegung der optimalen Aufsetzkonzentrationen des markierten Liganden verwendet wird, den markierten Liganden in einer Beschichtungsmenge in g/m² aufbringt, bei der es sich um einen Bruchteil, ein Vielfaches oder um die gleiche Konzentration des markierten Liganden, wie er beim Aufsetzen des markierten Liganden im vorstehenden Abschnitt 1. verwendet wird, handelt.
B. Eine Reihe von Tests mit Testproben, die eine bekannte Konzentration des Liganden enthalten, wird durchgeführt.
C. Die Ergebnisse der Tests mit der bekannten Ligandenkonzentration werden verglichen und
D. die Stufen B und C werden je nach Bedarf wiederholt, wobei man die markierte Liganden-Beschichtungsmenge je nach den in Stufe 2C erzielten Ergebnissen variiert, um die erforderliche Beschichtungsmenge für den markierten Liganden zu bestimmen.
Je nach dem markierten Liganden soll die Beschichtungsmenge des markierten Liganden im Vergleich zu der Konzentration des markierten Liganden, die erforderlich ist, wenn der gleiche Test durch direktes Aufsetzen des markierten Liganden auf das analytische Element durchgeführt wird, geringer sein, gleich groß sein oder ein Vielfaches davon (2X, 3X, 4X und dergl.) betragen.
Unter Berücksichtigung der vorstehenden Richtlinien wurden sorgfältig kontrollierte Tiefdruckbeschichtungsverfahren mit Erfolg durchgeführt, wobei man sich an die folgenden Beschichtungsmengen und Trocknungsabläufe hielt. Die Überzüge mit dem beschichteten Liganden in den Beispielen wurden mit einer Tiefdruckmaschine (hergestellt von der Fa. IMD Corporation, Birmingham, Alabama) mit zwei bogenförmigen Flotationstrocknungsabschnitten von 15 ft hergestellt. Die Trocknungsbedingungen für sämtliche Beispiele waren 180ºF (82ºC) nur im ersten Trocknungsabschnitt. Der zweite Abschnitt wurde nicht eingesetzt. Der Luftstrom im Trockner wurde so eingestellt, daß eine angemessene Flotation über die gesamte Länge des Trockners aufrechterhalten wurde, so daß die Überzüge beim Transport durch den Trockner weder von der Trägerseite noch von der beschichteten Seite gekratzt wurden. Der verwendete Tiefdruckzylinder enthielt 295 Zellen/Zoll² (4.57 × 10&sup5; Zellen/m²). Die Zellen wiesen eine Tiefe von 19 µm, eine Breite von 72 µm und eine Stegbreite zwischen den Zellen von 12 µm auf. Dieser Zylinder gibt 4,3 g/m² Beschichtungszusammensetzung mit einem Gehalt an dem markierten Liganden auf die Perl- Verteilungsschicht unter Anwendung des direkten Tiefdruckverfahrens mit einer Geschwindigkeit der Beschichtungsmaschine von 50 ft/min (15,24 m/min) ab. Der Fachmann auf dem Gebiet der Tiefdruckbeschichtung ist leicht in der Lage, die vorstehend beschriebene Vorgehensweise auf beliebige Tiefdruckbeschichtungsmaschinen anzuwenden. Folgende Beschichtungszusammensetzung für den markierten Liganden wurde verwendet: Zusammensetzung der Überzugsbeschichtung mit einem Gehalt an markiertem Liganden Bezogen auf eine Naßbeschichtungsmenge von 4,3 g/m²
* der markierte Ligand war überall in einer Beschichtungsmenge von 4 bis 64 µg/m² aufgetragen.
Wie bereits erwähnt, können die übrigen Schichten des Elements nach aus dem Stand der Technik bekannten Beschichtungstechniken aufgebracht werden. Beispielsweise können Gleitextrusionstrichter der im US-Patent 2 761 417 beschriebenen Art häufig in vorteilhafter Weise zum gleichzeitigen schichtförmigen Aufbringen einer Mehrzahl von Schichten, von denen mindestens eine aus polymeren Teilchen mit immobilisierten Perlen (Kügelchen) besteht, verwendet werden. Insbesondere kann ein mehrschichtiges Element gebildet werden, indem man eine die Perlen enthaltende Beschichtungszusammensetzung durch einen Extrusionsschlitz eines Gleitextrusionstrichters führt und gleichzeitig eine Schicht einer zweiten Beschichtungszusammensetzung, die gegebenenfalls ebenfalls Perlen enthält, auf einer Gleitfläche des Gleitextrusionstrichters nach unten fließen läßt. Vorzugsweise wird die durch den Extrusionsschlitz fließende Beschichtungszusammensetzung mit einer volumetrischen Strömungsgeschwindigkeit zugeführt, die erheblich über der volumetrischen Strcmungsgeschwindigkeit der auf der Gleitfläche nach unten fließenden Beschichtungszusammensetzung liegt. Ferner ist es erwünscht, daß die durch den Extrusionsschlitz geleitete Beschichtungszusamrnensetzung eine Viskosität aufweist, die erheblich größer als die Viskosität der Beschichtungszusammensetzung, die an der Gleitfläche nach unten fließt, ist. Sie soll ferner eine Oberflächenspannung aufweisen, die mindestens ebenso hoch und vorzugsweise etwas höher als die Oberflächenspannung der an der Gleitfläche nach unten fließenden Beschichtungszusammensetzung ist. Eine derartige Steuerung der Beschichtungsparameter in bezug auf Fließgeschwindigkeit, Viskosität und Oberflächenspannung unterstützt die Bildung von diskreten Schichten, die frei von einer Vermischung unter den Schichten ist und vermeidet die Bildung von Abstoßungsdefekten.
Die teilchenförmige Schicht, in der die Rezeptoren immobilisiert sind, ist porös. Materialien zur Verwendung in derartigen Schichten sind auf dem Gebiet der Herstellung von trockenen analytischen Elementen bekannt und beispielsweise im US-Patent 4 258 001 beschrieben. Zu derartigen Schichten gehören makroporöse Schichten aus Stoff, Papier und dergl. Eine bevorzugte teilchenförmige Schicht ist eine Perlverteilungsschicht (BSL). Diese Schicht läßt sich leicht so bereitstellen, daß sie eine geeignete Porosität zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Elementen aufweist und zur Aufnahme einer verdünnten oder unverdünnten Testprobe (beispielsweise 1 bis 100 µl) geeignet ist. Vorzugsweise ist die Verteilungsschicht isotrop porös, eine Eigenschaft, die durch miteinander verbundene Hohlräume zwischen den die Zone bildenden Teilchen erzeugt wird. Unter "isotrop porös" ist zu verstehen, daß die Verteilungsschicht die aufgebrachte Flüssigkeit gleichmäßig radial über die gesamte Schicht verteilt.
Geeignete teilchenförmige Verteilungsschichten, einschließlich Perlverteilungsschichten, sind in den US-Patenten 4 670 381, 4 258 001 und 4 430 436 beschrieben. Besonders geeignete Verteilungsschichten sind solche mit einer teilchenförmigen Struktur, die durch Organopolymerteilchen und einen polymeren Klebstoff für derartige Teilchen gebildet sind (vergl. US-Patent 4 258 001). Die für die Verteilungsschicht geeigneten Organopolymerteilchen sind im allgemeinen wärmestabile, kugelförmige Perlen mit einer Teilchengröße entsprechend einem Durchmesser von 20 bis 40 µm oder sogar darunter.
Die Teilchen können aus einer Vielzahl von organischen Polymeren unter Einschluß von natürlichen und synthetischen Polymeren, die die erforderlichen Eigenschaften aufweisen, zusammengesetzt sein. Vorzugsweise sind sie jedoch aus einem oder mehreren Additionspolymeren, die in den vorerwähnten Patenten beschrieben sind, zusammengesetzt.
Die teilchenförmige Schicht des Elements wird von einem geeigneten Träger gehalten. Bei einem derartigen Träger kann es sich um ein beliebiges geeignetes, dimensionsstabiles und vorzugsweise nicht-poröses und durchsichtiges (d. h. strahlungsdurchlässiges) Material handeln, das elektromagnetische Strahlung mit einer Wellenlänge von 200 bis 900 nm durchläßt. Ein Träger der Wahl für ein spezielles Element soll mit dem vorgesehenen Nachweismodus (Reflexions-, Transmissions- oder Fluoreszenzspektroskopie) verträglich sein. Zu geeigneten Trägermaterialien gehören Polystyrol, Polyester (z. B. Poly-(ethylenterephthalat)), Polycarbonate, Celluloseester (z. B. Celluloseacetat) und dergl.
Das Element kann eine oder mehrere zusätzliche Schichten enthalten, beispielsweise getrennte oder kombinierte Reagenz/Verteilungsschichten und Gelatine/Puffer-Schichten mit einem Gehalt an weiteren erforderlichen Additiven, Kupplungsenzymen und dergl.
Die Gelatine/Puffer-Schicht, die Reagenzschicht oder die Verteilungsschicht des Elements können die Indikatorzusammensetzung enthalten, die ein oder mehr Reagenzien in dispergiertem Zustand in einem oder mehreren synthetischen oder natürlichen Bindemittelmaterialien, wie Gelatine oder andere natürlich vorkommende Kolbide, Homopolymere und Copolymere, wie Poly-(acrylamid), Poly-(vinylpyrrolidon), Poly-(N-isopropylacrylamid), Poly-(acrylamid-co-N-vinyl-2-pyrrolidon) und ähnliche Copolymere, umfassen.
Weitere fakultative Schichten, beispielsweise Unterschichten, strahlungsblockierende Schichten und dergl., können gegebenenfalls vorgesehen sein. Sämtliche Schichten des Elements sind miteinander in Fluidkontakt, was bedeutet, daß Fluide und Reagenzien sowie unkomplexierte Reaktionsprodukte in den Fluiden zwischen übereinanderliegenden Regionen von benachbarten Schichten passieren können.
Die Schichten des Elements können eine Vielzahl von weiteren erwünschten, jedoch fakultativen Komponenten enthalten, wozu oberflächenaktive Mittel, Verdickungsmittel, Puffer, Härtungsmittel, Antioxidantien, Kupplungsmittel, Lösungsmittel und andere aus dem Stand der Technik bekannte Materialien gehören. Die Mengen dieser Komponenten liegen innerhalb des Wissens des Fachmanns.
Die Elemente können zur Bestimmung von niedrigen Konzentrationen von immunologisch reaktiven Liganden in einer Flüssigkeit, beispielsweise einer biologischen Flüssigkeit (wie Vollblut, Serum, Plasma, Urin, Rückenmarkflüssigkeit, Suspensionen von menschlichem oder tierischem Gewebe, Faeces, Speichel, Lymphflüssigkeit und dergl.) verwendet werden. Die Liganden können in Konzentrationen von nur 10-15 m und im allgemeinen in einer Konzentration von 10&supmin;¹&sup0; bis 10&supmin;&sup4; m bestimmt werden.
Zu Liganden, die auf diese Weise quantitativ oder qualitativ bestimmt werden können, gehören therapeutische Arzneistoffe (z. B. Phenobarbital, Theophyllin, Gentamicin, Chinidin, Phenytom, Propranolol, Carbamazepin, Tobramycin, Lidocain, Procainamid und dergl.), natürliche oder synthetische Steroide (z. B. Cortisol, Aldosteron, Testosteron, Progesteron, Östriol und dergl.), Hormone (z. B. Thyroidhormone, Peptidhormone, Insulin und dergl.), Proteine (z. B. Albumin, IgG, IgM, Ferritin, C-reaktives Protein, Isoenzyme, Apolipoproteine und dergl.), Antigene, Antikörper, einschließlich monoklonale Antikörper, und andere Spezies, die natürlicherweise mit einem Rezeptor reagieren. Die Erfindung eignet sich insbesondere zur Bestimmung von therapeutischen Arzneistoffen, wie Digoxin, Phenytom, Theophyllin oder Phenobarbital, sowie von Hormonen, wie Thyroxin oder Triiodthyronin.
Der Test kann unter Verwendung einer beliebigen Enzymmarkierung, die am Liganden unter Bildung eines markierten Liganden angebracht werden kann, durchgeführt werden. Enzyme, wie Glucose-oxidase, Peroxidasen, wie Meerrettich-peroxidase (HRP), alkalische Phosphatase und Galactosidase stellen bevorzugte Markierungen dar.
Das Substrat für das Enzym ist im Element vorhanden oder wird in Form einer Substratlösung zugesetzt. Das Substrat kann dem Element vor Zugabe der flüssigen Probe oder gleichzeitig damit oder nach Beendigung der Bindungsreaktion zugesetzt werden. Es liegt im Wissen des Durchschnittsfachrnanns auf dem Gebiet der klinischen Chemie für eine gegebene Markierung ein geeignetes Substrat zu ermitteln. Beim Substrat kann es sich um ein Material handeln, auf das die Enzymmarkierung direkt einwirkt, oder es kann sich um ein Material handeln, das an einer Reihe von Reaktionen beteiligt ist, zu denen die enzymatische Reaktion der Markierung gehört. Wenn es sich beispielsweise bei der Enzymmarkierung um eine Peroxidase handelt, kann als Substrat Wasserstoffperoxid vorliegen. Bei Verwendung von Glucose-oxidase als Beispiel liegt das Substrat Glucose allgemein in der Reagenzschicht vor oder wird als Substratlösung zugesetzt, wobei die Menge 0,01 mol/m² und vorzugsweise 0,001 bis 0,1 mol/m² beträgt. Der Fachmann weiß, wie er die Menge eines speziellen Substrats auf die Menge der im Test verwendeten Enzymmarkierung einstellen kann.
Die Reagenzschicht kann eine Indikatorzusamrnensetzung enthalten, die ein oder mehr Reagenzien umfaßt, die als Folge der durch die Markierung katalysierten Reaktion eine nachweisbare Spezies ergeben. Vorzugsweise handelt es sich bei der Indikatorzusarnmensetzung um eine kolorimetrische Indikatorzusammensetzung, die als Ergebnis einer enzymatischen Reaktion eines enzymmarkierten Ligandenanalogen mit einem Substrat eine kolorimetrisch nachweisbare Spezies ergibt.
Bei der Indikatorzusammensetzung kann es sich um eine einzelne Verbindung handeln, die bei der enzymatischen Reaktion einen nachweisbaren Farbstoff liefert, oder es kann sich um eine Kombination von Reagenzien handeln, die den Farbstoff bilden. Wird beispielsweise Glucose als Substrat und Glucose-oxidase als Enzymmarkierung verwendet, so kann die kolorimetrische Indikatorzusammensetzung ein Kupplungsmittel und eine oxidierbare Verbindung, die unter Bildung eines Farbstoffs reagieren, enthalten. Alternativ kann die Zusammensetzung einen Leukofarbstoff und eine Peroxidase oder eine eine andere geeignete peroxidierbare Verbindung enthalten, die als Folge der Bildung von Wasserstoffperoxid, wenn Glucoseoxidase Glucose in Gluconsäure umwandelt, einen nachweisbaren Farbstoff erzeugt. Geeignete Leukofarbstoffe sind aus dem Stand der Technik bekannt. Hierzu gehören beispielsweise die im US-Patent 4 089 747 (Ausgabetag 16.5.1978, Bruschi) und in der US-Anmeldung 612 509 (Anmeldetag 21.5.1984, Babb et al.) beschriebenen Farbstoffe. Die speziellen Mengen der kolorimetrischen Indikatorzusammensetzung und seine verschiedenen Komponenten liegen im Wissen des Fachmanns.
Die markierten Liganden können unter Heranziehung bekannter Ausgangsmaterialien und Verfahrensweisen hergestellt werden oder im Handel bezogen werden. Im allgemeinen wird der Ligand über eine kovalente Bindung an der Markierung (beispielsweise an einem Enzymrest) angebracht.
Der Immunoassay kann manuell oder automatisiert durchgeführt werden. Im allgemeinen wird die Menge eines Liganden in einer Flüssigkeit bestimmt, indem man das Element von einer Zufuhrrolle, einem Streifenpaket oder einer anderen Quelle entnimmt und physikalisch eine begrenzte Fläche der Verteilungsschicht mit einer Probe der Flüssigkeit, beispielsweise 1 bis 100 µl, in Kontakt bringt. Die begrenzte Fläche, die kontaktiert wird, beträgt im allgemeinen nicht mehr als 100 mm².
Die Ligandenmenge wird bestimmt, indem man direkt das Element durch eine geeignete Vorrichtung führt, um das komplexierte Ligandenanaloge direkt oder die als Folge der enzymatischen Reaktion einer Enzymmarkierung und eines Substrats gebildete nachweisbare Spezies nachzuweisen. Beispielsweise kann die Spezies mit einer geeigneten spektrophotornetrischen Vorrichtung unter Anwendung allgemein bekannter Verfahrensweisen nachgewiesen werden. In einer enzymatischen Reaktion wird das erhaltene Produkt bestimmt, indem man beispielsweise die Geschwindigkeit der Veränderung der Reflexions- oder Transmissionsdichte in der begrenzten Fläche, die mit der Testprobe kontaktiert worden ist, bestimmt. Die Meßfläche beträgt im allgemeinen 3 bis 5 mm². Die Ligandenmenge in der flüssigen Probe ist umgekehrt proportional zur Menge der in der begrenzten Fläche gemessenen Markierung. Im allgemeinen wird die Messung der Markierung 5 bis 180 Sekunden nach Probenkontakt und Verteilung oder nach Aufbringen einer Substratlösung durchgeführt.
Nachstehend wird ein typisches erfindungsgemäßes Element vorgestellt. Es ist darauf hinzuweisen, daß der Fachmann das erfindungsgemäße Prinzip in erfolgreicher Weise in einem beliebigen Immunoassay-Element verwirklichen kann. Erfindungsgemäßes Immunoassay-Element
Das vorstehende Element kann zur quantitativen Bestimmung von Liganden, die vom vorerwähnten Phenytom abweichen, verwendet werden. Der gewählte markierte Ligand hängt vom speziellen Test ab. Nur ein einziger derartiger markierter Ligand wird in einem einzelnen Test mit einem gepaarten Antikörper in der Perlverteilungsschicht eingesetzt, so daß für jeden Test ein spezifisches Antikörper-Liganden-Paar existiert.
Die Bezeichnungen und Symbole im vorerwähnten Element haben die nachstehend aufgeführten Bedeutungen:
MOPS: 3-Morpholinopropansulfonsäure-Puffer
Dimedon: 5,5-Dimethyl-1,3-cyclohexandion
Triarylimidazol-Leukofarbstoff: 4,5-Bis- (4-dimethylaminophenyl)- 2-(4-hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl)-imidazolblau bildender Leukofarbstoff
MaWnaMt: Pol-(methylacrylat-co-natrium-2-acrylamido-2-methylpropansulfonat-co-2-acetoacetoxyethyl-methacrylat)
VtE: Poly-(m-&p-vinyltoluol-co-methacrylsäure)
Zonyl-FSN: nichtionogenes, fluoriertes oberflächenaktives Mittel der Fa. E. I. du Pont de Nemours
SUb: Poly-[styrol-co-m-&p-(2-chlorethylsulfonylmethyl)-styrol]
Antiphenytoin-SUb-Perlen: Teilchen eines SUB-Polymeren, an die der entsprechende immunoreaktive Antikörper kovalent gebunden ist
TX-100: Triton X-100, Octylphenoxypolyethoxyethanol, nicht-ionogenes oberflächenaktives Mittel der Fa. Rohm and Haas
HRP: Meerrettich-peroxidase
BVSME: Bis-(vinylsulfonylmethyl)-ether-Gelatinehärter
Rousselau-Typ IV-Gel: Knochengelatine
Die Gelatineschicht wurde schichtförmig auf einen mit einer Unterschicht versehenen, mit Gelatine gewaschenen Poly-(ethylenterephthalat)- Träger aufgebracht. Die übrigen Schichten wurden darauf aufgebracht. Die Perlverteilungsschicht wurde auf die Gelatineschicht aufgebracht. Alle vorerwähnten Schichten wurden unter Anwendung der herkömmlichen, vorerwähnten Beschichtungstechniken, die auf dem Gebiet der Herstellung von trockenen Immunoassay-Elementen bekannt sind, aufgebracht. Der markierte Ligand wurde gemäß der vorstehend beschriebenen Verfahrensweise durch Tiefdruckbeschichtung aufgebracht.
Die folgenden Vergleichsbeispiele und die erfindungsgemäßen Beispiele belegen die Ausführbarkeit der vorliegenden Erfindung. Beim verwendeten Immunoassay-Element handelte es sich in sämtlichen Beispielen um das gleiche Element, mit der Ausnahme in bezug auf den Unterschied auf die Beschichtungsverfahren und den Antikörper in Beispiel 6.
In den Beispielen wurde der Test stufenweise gemäß folgender Vorgehensweise durchgeführt. 10 µl Probe wurden auf die Oberseite eines erfindungsgemäßen trockenen Immunoassay-Elements aufgesetzt. Das Element mit der nunmehr aufgesetzten Probe wurde 5 Minuten bei 37ºC inkubiert. Es ist zu erwarten, daß bei den erfindungsgemäßen Elementen ein Gleichgewicht in bezug auf die Konkurrenz zwischen markiertem und unmarkiertem Liganden um die Rezeptorbindungsstellen in der Perlverteilungsschicht innerhalb von 20 und vorzugsweise innerhalb von 5 Minuten vollständig erreicht ist. Nach dieser Inkubationsperiode wurde das Element aus dem Inkubator entnommen und mit 10 µl einer Enzym-Substratlösung in Kontakt gebracht. Für die in den Beispielen herangezogenen Assays handelte es sich bei der Markierung um Meerrettich-peroxidase (HRP) und bei der Substratlösung um 0,3 gew.-%-iges H&sub2;O&sub2;. Die Substratlösung enthielt ferner Natriumphosphatpuffer (pH-Wert 6,8) 0,01 M, 4'-Hydroxyacetanilid 0,005 M, Diethylentriaminpentaessigsäure 10 µm und ein oberflächenaktives Mittel. Der gebundene, HRP-markierte Ligand katalysiert die Oxidation eines farblosen Leukofarbstoffs unter Bildung der gefärbten Form. Derartige Farbstoffe sind auf dem Gebiet der trockenen analytischen Elemente bekannt und werden hier nicht ausführlich beschrieben. In den hier vorgelegten Beispielen handelte es sich beim Farbstoff um einen Triarylimidazol-Leukofarbstoff. Die Geschwindigkeit der katalysierten Reaktion wurde aufgrund der Veränderung der Reflexionsdichte bei 37ºC im Laufe der Zeit gemessen. Verfahren und Mittel zur Messung der Reflexionsdichte sind auf dem Gebiet der analytischen Technik bekannt. Die Reflexionsdichte wird unter Verwendung der Clapper-Williams-Transformation in die Transmissionsdichte übergeführt.
In den einzelnen nachstehenden Beispielen wurde ein Vergleich zwischen den Dosis-Reaktions-Kurven der mit den erfindungsgemäßen Elementen durchgeführten Tests und der mit den gleichen Elementen, bei denen ein Überzug mit markiertem Liganden nicht vorhanden war, durchgeführt, um das Ausmaß der vorherigen Bindung zu bestimmen. Mit den letztgenannten Elementen wurde der markierte Ligand zu der 10 µl-Probe gegeben und gleichzeitig mit der Probe auf das Element aufgesetzt.
Nachstehend werden die Vergleichsbeispiele 1-4 vorgelegt, um die hochgradige vorherige Bindung von Rezeptor/markiertem Liganden, die bei einer Anzahl von erfolglosen Beschichtungsverfahren auftrat, zu belegen. Mehrere (erfolglose) Möglichkeiten zum schichtförmigen Aufbringen des markierten Liganden in einem trockenen analytischen Element wurden erwogen und durchgeführt, um eine vorherige Bindung sowie nachteilige Einflüsse auf Rezeptoren, wie Antikörper, zu vermeiden. Die erfolglosen Versuche, die mit dem Ziel zur Lösung der erfindungsgemäßen Aufgabe untersucht wurden, beinhalteten folgendes: Direkte Zugabe (Vergleichsbeispiel 1) von Phenytoin-HRP zur Beschichtungszusammensetzung, die zur Bildung der teilchenförmigen Schicht mit den Polymerperlen (nachstehend als Perlverteilungsschicht oder BSL bezeichnet) und immobilisierten Antikörpern verwendet wurden; Einverleibung von Phenytoin-HRP in die Beschichtungszusammensetzung für die Perlverteilungsschicht durch ein Mischschmelzverfahren (Vergleichsbeispiel 2); Verwendung eines Dual X-Trichters zum schichtförmigen Aufbringen einer wäßrigen Phenytoin-HRP-Lösung aus dem oberen X-Schlitz und der Perlverteilungsschicht mit einem Gehalt an Antikörper-Perlen für Phenytom aus dem Boden-X-Schlitz; und schichtförmiges Aufbringen des Phenytoin-HRP in einer ungehärteten Gelatineschicht unter der Perlverteilungsschicht, die immobilisierte Antikörper für Phenytoin enthielt. Die nachstehenden Vergleichsbeispiele 1-4 erläutern das Ausmaß der vorherigen Bindung, die mit diesen Beschichtungstechniken erfolgt, was zeigt, daß ein Verfahren zum erfolgreichen schichtförmigen Auftrag eines markierten Liganden in einem Element direkt über eine Perlverteilungsschicht, die Rezeptoren für den Liganden enthält, wobei im wesentlichen keine vorherige Bindung auftritt, nicht naheliegend ist.
Vergleichsbeispiel 1: Direkte Zugabe von Phenytoin-HRP zur Perlverteilungsschicht-Beschichtungszusammensetzung, die Antikörper-Perlen für Phenytom enthält
Antikörper gegen Phenytom, die kovalent an Perlen von etwa 1 µm gebunden waren, und eine Lösung von Phenytoin-HRP wurden zu einer standardmäßigen Perlverteilungsschicht-Beschichtungszusammensetzung gegeben. Die Beschichtungszusammensetzung wurde etwa 30 Minuten stehengelassen und sodann schichtförmig auf eine gehärtete Gelatineschicht eines aus dem vorerwähnten US-Patent 4 258 001 bekannten Typs mit einem Gehalt an 0,5 M Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 aufgebracht. Ein Kontrollelement wurde genau auf die vorstehend beschriebene Weise hergestellt, mit der Ausnahme, daß Phenytoin-HRP aus der vorstehenden Perlverteilungsschicht weggelassen wurde. Das Vergleichstestelement dieses Beispiels wurde durch Auftragen der Probe auf die Perlverteilungsschicht getestet. Das Kontrollelement wurde durch Zugabe von Phenytoin-HRP zu der Probe mit einem Gehalt an Phenytoin vor dem Auftragen der Probe auf die Kontroll-Perlverteilungsschicht getestet. Beide Elemente wurden gemäß dem vorstehend beschriebenen Testverfahren unter Verwendung einer Reihe von wäßrigen Phenytoinlösungen im Bereich von 10&supmin;&sup9; bis 10&supmin;&sup4; M, die Phenytoin-HRP entweder nicht oder in einer Konzentration von 1 rim enthielten, getestet. Die Geschwindigkeitsergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengestellt. Ein aus diesen Daten erstelltes Diagramm ist in Fig. 1 gezeigt. Tabelle I
Bei gleichmäßiger Beschichtung mit Phenytoin-HRP ergeben selbst sehr hohe Phenytoin-Konzentrationen (10&supmin;&sup4; M) nur eine geringfügige Veränderung der beobachteten Geschwindigkeit im Vergleich zu den Ergebnissen der Kontrolle, bei der die Markierung im überzug nicht enthalten war, sondern der Probe zugesetzt wurde. Die Ergebnisse zeigen, daß eine erhebliche vorherige Bindung erfolgte, wenn die Markierung in der Perlverteilungsschicht schichtförmig aufgebracht wurde.
Vergleichsbeispiel 2: Einverleibung von Phenytoin-HRP durch ein Mischschmelzverfahren in die Perlverteilungsschicht-Beschichtungsmasse mit einem Gehalt an Antikörper-Perlen für Phenytoin
Eine standardmäßige wäßrige Perlverteilungsschicht-Beschichtungszusammensetzung wurde einem 3-fachen Mischschmelzvorgang in einem Abstand von einigen Fuß vom Beschichtungstrichter mit den Antikörper-Perlen und einer getrennten Phenytoin-HRP-Lösung unterzogen. Die Überzüge wurden in einem Verhältnis von 25 Teilen Perlen zu 1 Teil Antikörper-Perlen zu 1 Teil Phenytoin-HRP vermischt. Die letztgenannte Zusammensetzung wurde auf eine gehärtete Gelschicht wie in Vergleichsbeispiel 1 zur Bildung des Elements dieses Beispiels schichtförmig aufgebracht. Das Kontrollelement von Beispiel 1 wurde auch als Kontrolle für dieses Beispiel herangezogen. Beide Elemente wurden gemäß den Angaben in Vergleichsbeispiel 1 getestet. Die Geschwindigkeitsergebnisse sind in Tabelle II zusammengestellt. Diese Daten sind in Fig. 2 in Form eines Diagramms aufgetragen. Tabelle II
Die Ergebnisse zeigen, daß es zu einer erheblichen vorherigen Bindung kam, wenn das markierte Phenytom aus einer gemäß Beispiel 2 hergestellten Beschichtungszusamrnensetzung aufgebracht wurde.
vergleichsbeispiel 3: Verwendung eines Dual X-Trichters zum schichtförmigen Aufbringen einer wäßrigen Phenytoin-HRP-Beschichtungszusammensetzung aus dem oberen X-Schlitz und des Perlverteilungsschicht-Überzugs mit einem Gehalt an Antikörper-Perlen für Phenytom aus dem Boden-X- Schlitz
Eine Perlverteilungsschicht -Beschichtungszusammensetzung mit einem Gehalt an Phenytoin-Antikörper-Perlen wurde gemäß Vergleichsbeispiel 1 hergestellt und aus dem Boden-X-Schlitz eines doppelten X-Trichters aufgebracht. Eine wäßrige Phenytoin-HRP-Beschichtungszusarnmensetzung wurde aus dem oberen X-Schlitz aufgebracht. Das Beschichtungsverhältnis betrug 12,5 Teile Perlverteilungsschicht-Beschichtungszusarnrnensetzung auf 1 Teil Phenytoin-HRP-Beschichtungszusammensetzung. Die Perlverteilungsschicht- Beschichtungszusammensetzung wurde gemäß den vorstehenden Angaben auf eine gehärtete Gelatineschicht aufgetragen. Zwei Kontrollelemente wurden hergestellt, indem man die Perlverteilungsschicht-Beschichtungszusammensetzung aus dem Boden-X-Schlitz aufbrachte und aus dem oberen X-Schlitz entweder (1) nichts aufbrachte oder (2) die Phenytoin-HRP-Beschichtungszusammensetzung (ohne markiertes Phenytom) aufbrachte. Die Kontrollelemente und das Element mit der Phenytoin-HRP-Beschichtung wurden gemäß Vergleichsbeispiel 1 getestet. Die Geschwindigkeitsergebnisse sind in Tabelle III zusammengestellt. Die Geschwindigkeitsergebnisse sind in Fig. 3 in Form eines Diagramms aufgetragen. Tabelle III
Die Ergebnisse zeigen, daß es zu einer erheblichen vorherigen Bindung kam.
vergleichsbeispiel 4: Beschichtung mit Phenytoin-HRP in einer ungehärteten Gelatineschicht unter der Perlverteilungsschicht, die Antikörper-Perlen für Phenytom enthält.
Dieses Element wurde auf die nachstehend beschriebene Weise hergestellt. Ungehärtete Gelatine wurde mit Phenytoin-HRP auf eine gehärtete Gelatineschicht gemäß den Angaben in Vergleichsbeispiel 1 aufgebracht, mit der Ausnahme, daß 0,05 M TES-Puffer mit einem pH-Wert von 7,0 verwendet wurde. Eine Perlverteilungsschicht-Beschichtungszusamrnensetzung mit einem Gehalt an Antikörper-Perlen gemäß den Angaben in Vergleichsbeispiel 1 wurde auf die ungehärtete Gelatineschicht mit einem Gehalt an Phenytoin-HRP aufgebracht. Zwei Kontrollelemente wurden hergestellt, indem man (1) die Perlverteilungsschicht-Beschichtungszusarnrnensetzung mit den Antikörper-Perlen über der gehärteten Gelatineschicht direkt ohne eine zwischenliegende ungehärtete Gelatineschicht aufbrachte und (2) indem man die Perlverteilungsschicht-Beschichtungszusarnmensetzung mit Antikörper- Perlen über die ungehärtete Gelatineschicht (ohne Phenytoin-HRP) aufbrachte. Sämtliche drei Elemente wurden gemäß den Angaben in Vergleichsbeispiel 1 getestet. Die Geschwindigkeitsergebnisse sind in Tabelle IV zusammengestellt. Diese Daten sind in Fig. 4 in Form eines Diagramms dargestellt. Tabelle IV
Die Ergebnisse zeigen, daß es zu einer erheblichen vorherigen Bindung kam, wenn Phenytoin-HRP auf diese Weise schichtförrnig aufgebracht wurde.
Die folgenden Beispiele belegen das Beschichtungsverfahren, das zur Herstellung der erfindungsgemäßen Elemente mit einem Überzug eines markierten Liganden angewandt wird. Obgleich diese Beispiele die Verwendung von Phenytoin-HRP beinhalten, ist es für den Fachmann ersichtlich, daß Elemente mit anderen markierten Liganden gemäß der nachstehenden Lehre ebenfalls hergestellt werden können.
Beispiel 5: Tiefdruckbeschichtung einer vorher gebildeten Perlverteilungsschicht mit einem Gehalt an Antikörper-Perlen für Phenytoin mit einer wäßrigen Phenytoin-HRP-Lösung
Ein erfindungsgemäßes Element wurde unter Anwendung des vorstehend beschriebenen Tiefdruckverfahrens hergestellt. Eine Phenytoin-HRP-Beschichtungszusarnrnensetzung wurde schichtförmig auf eine vorher gebildete Perlverteilungsschicht mit einem Gehalt an Phenytoin-Antikörper-Perlen aufgebracht. Die Perlschicht wurde gemäß den vorstehenden Angaben auf eine gehärtete Gelatineschicht aufgebracht. Ein Kontrollelement wurde auf ähnliche Weise hergestellt, mit der Ausnahme, daß der Phenytoin-HRP-überzug weggelassen wurde. Sowohl das Elernent dieses Beispiels als auch das Kontrollelement wurden gemäß Vergleichsbeispiel 1 getestet, mit der Ausnahme, daß die Testprobe, die auf das Kontrollelernent aufgebracht wurde, das Phenytoin-HRP enthielt. Die Geschwindigkeitsergebnisse sind in Tabelle V zusammengestellt. Die Daten sind in Fig. 5 in Form eines Diagramms dargestellt. Tabelle V
Die Ergebnisse zeigen, daß es zu einer sehr geringen vorherigen Bindung kam, wenn das Phenytoin-HRP unter Anwendung des beschriebenen Tiefdruckbeschichtungsverfahrens aufgebracht wurde. Der Geschwindigkeitsbereich beträgt etwa 80% des Werts, der bei aufgesetztem Phenytoin-HRP erzielt wurde, wenn diese Kombination aus Antikörper und markiertem Ligand für den Phenytom-Test eingesetzt wurde.
Beispiel 6: Es wurde ein erfindungsgemäßes Element gemäß Beispiel 5 hergestellt und gegen eine Kontrolle getestet, mit der Ausnahme, daß ein anderer Antikörper für Phenytom verwendet wurde. Ferner wurde die Perlverteilungsschicht-Beschichtungsmasse auf gehärtete Gelatine mit einem Gehalt an 0,2 M TES-Puffer vom pH-Wert 7,0 aufgebracht. Ein Kontrollüberzug wurde zum Test von aufgetragenem Phenytoin-HRP, das kein Tiefdruckverfahren durchlief, verwendet. Die Elemente wurden wie in Vergleichsbeispiel 1 unter Verwendung von Kalibratoren auf Serumbasis ohne Phenytoin- HRP oder mit einem Gehalt an 1 mM Phenytoin-HRP getestet. Die Geschwindigkeitsergebnisse sind in Tabelle VI zusammengestellt. Diese Daten sind in Fig. 6 in Form eines Diagramms dargestellt. Tabelle VI
Die Ergebnisse zeigen, daß es zu einer sehr geringen vorherigen Bindung kam, wenn Phenytoin-HRP auf die vorstehend beschriebene Weise schichtförmig aufgebracht wurde. Die Geschwindigkeitsveränderung beträgt etwa 84% des Werts, der bei Auftragen von Phenytoin-HRP erzielt wurde, wenn diese Kombination von Antikörper und markiertem Liganden für den Phenytom-Test herangezogen wurde.

Claims

1. Trockenes, analytisches Immunoassay-Element zum Testen eines Liganden&sub1; umfassend (a) eine teilchenförmige Schicht, die eine feststehende Konzentration eines immobilisierten Rezeptors für den Liganden enthält, und (b) einen überzug, der einen enzymmarkierten Liganden in einer Beschichtungsrnenge innerhalb eines vorbestimmten Bereichs enthält und durch Tiefdruck direkt auf die teilchenförmige Schicht (a) ohne eine zwischenliegende Sperrschicht aufgebracht ist, wobei das Element im wesentlichen frei von Bindungsreaktionen zwischen dem Rezeptor und dem markierten Liganden ist.

2. Element nach Anspruch 1, wobei der markierte Ligand in einer Beschichtungsmenge von 4 bis 64 µg/m² vorhanden ist.

3. Element nach Anspruch 1 oder 2, wobei es sich bei der teilchenförmigen Schicht um eine perlstreichschicht handelt, bei der die Rezeptoren an Perlen immobilisiert sind.

4. Element nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Ligand ein Hapten umfaßt, das unter Digoxin, Phenytom, Carbamazepin, Phenobarbital, C-reaktivem Protein, Thyroxin und Theophyllin ausgewählt ist.

5. Element nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei es sich beim Rezeptor um einen Antikörper für den Liganden handelt.

6. Element nach einem der Ansprüche 1 bis 51 ferner umfassend mindestens eine zusätzliche Schicht, die mindestens einen Teil einer Indikatorzusammensetzung enthält, die eine nachweisbare Veränderung im Element ergibt, die eine quantitative Messung des Liganden ermöglicht.

7. Element nach Anspruch 6, wobei die zusätzliche Schicht einen Puffer und ein Elektronenübertragungsmittel umfaßt.

8. Element nach Anspruch 6 oder 7, wobei die zusätzliche Schicht einen Farbstoffvorläufer umfaßt, der durch andere Teile der Indikatorzusammensetzung in einen Farbstoff übergeführt wird.

9. Verfahren zur Herstellung eines trockenen analytischen Immunoassay-Elements, umfassend folgende Stufen:

A. Bereitstellen eines trockenen analytischen Immunoassay-Elements mit einer teilchenförmigen Schicht, die eine feststehende Konzentration eines immobilisierten Rezeptors für den Liganden enthält;

B. Bestimmen der Konzentration an markiertem Liganden, die zur Erzielung eines annehmbaren Immunoassay-Verhaltens erforderlich ist, wenn der Immunoassay durchgeführt wird, indem man auf das analytische Element den markierten Liganden gleichzeitig mit einer Probe aufsetzt;

C. empirische Bestimmung der Konzentration der Beschichtungsmenge des markierten Liganden&sub1; die zusammen mit dem gleichen analytischen Element erforderlich ist, um ein annehmbares Testverfahren zu erreichen, indem man:

(i) direkt über die teilchenförmige Rezeptorschicht des Elements, das zur Festlegung der optimalen Aufsetzkonzentrationen des markierten Liganden verwendet wird, durch Tiefdruck einen überzug aufbringt, der einen enzymmarkierten Liganden in einer vorbestimmten Beschichtungsmenge enthält;

(ii) Durchführen einer Reihe von Tests mit Testproben, die eine bekannte Konzentration des Liganden enthalten;

(iii) Vergleichen der Ergebnisse der Tests mit der bekannten Ligandenkonzentration;

(iv) Wiederholung der Stufen (i) und (ii) je nach Bedarf, wobei man die markierte Liganden-Beschichtungsmenge je nach den in Stufe (ii) erzielten Ergebnissen variiert, um die erforderliche Beschichtungsmenge für den markierten Liganden zu bestimmen; und

D. Aufbringen der in Stufe C empirisch bestimmten Beschichtungsmenge des markierten Liganden durch Tiefdruck.

10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei der markierte Ligand in (i) in einer Beschichtungsmenge von 4 bis 64 µg/m² vorhanden ist.

11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, wobei die Beschichtungsmenge des markierten Liganden im Vergleich zu der Konzentration des markierten Liganden, die bei Durchführung des Tests gemäß Stufe B erforderlich ist, geringer oder gleich groß ist oder ein Mehrfaches davon beträgt.

12. Verfahren zur Bestimmung eines immunologisch reaktiven Liganden in einer Flüssigkeit unter Verwendung des Elements nach einem der Ansprüche 1 bis 8, umfassend folgende Stufen:

A. Kontaktieren einer begrenzten Fläche der teilchenförmigen Schicht mit einer Probe der Flüssigkeit unter Bildung (i) eines immobilisierten Liganden-Rezeptor-Kornplexes und (ii) eines immobilisierten, markierten Liganden-Rezeptor-Komplexes innerhalb des begrenzten Bereichs;

B. Kontaktieren des begrenzten Bereichs der teilchenförmigen Schicht mit einer Substratlösung; und

C. Bestimmung der Konzentration des Liganden.