DE69620281T2

DE69620281T2 - Gerät und Verfahren für Bindungstests auf einem absorbierenden Trägermaterial

Info

Publication number: DE69620281T2
Application number: DE69620281T
Authority: DE
Inventors: Alexei D. Klimov; Shiow-Chuan J. Tsai
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1995-02-10
Filing date: 1996-01-31
Publication date: 2002-10-31
Anticipated expiration: 2016-02-01
Also published as: JPH08248030A; EP0726462B1; DE69620281D1; ES2173216T3; ATE215699T1; JP4007624B2; CA2167362A1; US5770458A; EP0726462A1

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Durchführung von Bindeassays.
Die Erfindung betrifft insbesondere Assays, wobei poröse Trägermaterialien zum Transport von Reagenzien verwendet werden.
Spezifische Bindeassays sind nützliche Werkzeuge bei vielfältigen Anwendungen. Solche Assays beinhalten zwei oder mehr Bindungskomponenten, von denen eine ein Analyt ist. Beispiele spezifischer Bindungskomponenten umfassen Antikörper und Antigen, DNA und/oder RNA Hybridisierung und Rezeptor-Liganden-Wechselwirkungen. Es sind zahlreiche Ausführungsformen spezifischer Bindeassays bekannt, einschließlich Verdrängungs-, "Sandwich"- und Agglutinations-Assays. Nachteilhafterweise läßt sich nicht immer eine spezifische Bindung beobachten. Demgemäß wurden Markierungstechniken entwickelt, um Bindungen entweder direkt oder indirekt sichtbar zu machen. Charakteristischerweise beinhaltet das Markieren das Ankoppeln eines erkennbaren Markers an eine oder beide Bindungskomponenten.
Radioisotopen, Fluoreszenzstoffe und Enzyme sind Beispiele "indirekten" Markierens, weil sie zur Detektion Geräte und/oder eine besondere Behandlung erfordern. Im Gegensatz dazu sind "direkte" Marker mit dem bloßen Auge sichtbar und benötigen keine besonderen Prozeduren oder Geräte zur Detektion. Metallische Kolloidlösungen, Farbkolloidlösungen und gefärbtes Latex sind Beispiele für "direkte" Marker.
Kürzlich wurde ein Verfahren entwickelt, das die Verwendung von Bindeassay- Verfahren mit porösen Trägermaterialien kombiniert. Eine Komponente des Bindungspaares (z. B. Antikörper oder Antigen) wird auf einem porösen Trägermaterial (z. B. eine fibröse oder poröse Membran) über ein im Stand der Technik bekanntes Verfahren immobilisiert, z. B. durch Absorption oder kovalente Bindung.
In einem Verdrängungsassay z. B. wird eine Probe, die ein Analyt enthält, typischerweise mit einem markierten Analyt oder einem markierten Analytanalogon (das Reagenz) gemischt, die mit der immobilisierten Komponente reagieren können. Diese Mischung wird dann auf das poröse Trägermaterial aufgebracht. Die Wanderung der Mischung wird durch die haarfeine Flechtrate bzw. Matrixdichte innerhalb des porösen Trägermaterials verursacht und bringt das Reagenz in eine Position, in der es um eine begrenzte Zahl an Bindungsstellen auf der immobilisierten spezifischen Bindungskomponente konkurriert. Ein Teil des markierten Reagenz bindet spezifisch an das immobilisierte Reagenz und wird so immobilisiert. Die Konzentration an gebundenem markierten Reagenz steht in inverser Proportion zu der Konzentration an Analyt in der Probe.
Überschüssiges ungebundenes Material wird durch Waschen entfernt, indem z. B. ein ausreichendes Volumen eines Eluats auf das poröse Trägermaterial aufgebracht wird. Nach dem Waschen kann der Marker entwickelt und/oder gemessen ("indirekter" Marker) oder visuell bestimmt ("direkter" Marker) werden. Das markierte Reagenz kann auch das poröse Trägermaterial imprägnieren bzw. tränken, so daß bei Anfeuchten der markierte Marker mobilisiert wird. In diesem Fall mag die Zugabe der Probe selbst ausreichend für die Initialisierung und den Lauf des Assays sein.
In den US-Patenten Nr. 4094647, 4235601 und 4361537 offenbaren Deutsch et al. eine Testvorrichtung zur Bestimmung eines Merkmals einer Probe (ein spezifischer Bindeassay), wobei Reagenzien in einer Ausführung eines transportiven Streifens gemischt und transportiert werden (vergleiche auch Baker et al., WO 87/02774, veröffentlicht am 07.05.1987). In einer Ausführungsform tränkt ein erstes spezifisches radioaktiv markiertes Reagenz den Streifen, und ein zweites Reagenz wird auf dem Streifen "downstream" bzw. stromabwärts von dem ersten Reagenz über Anbindung bzw. Ankopplung an Mikrokugeln immobilisiert. Eine Probe wird "upstream" bzw. stromaufwärts von dem ersten Reagenz aufgebracht, und das obere Ende des Streifens wird in ein Eluat getaucht. Während das Eluat durch den Streifen wandert, nimmt es die Probe auf. Das die Probe enthaltene Eluat rehydriert dann das erste Reagenz, mischt es mit der Probe und transportiert die Probe und das erste Reagenz zum zweiten Reagenz, wobei eine spezifische Bindungsreaktion eines Teil des radioaktiv markierten Reagenzes immobilisiert. Überschüssiges radioaktiv markiertes Reagenz wird am unteren Ende des Streifens ausgewaschen. Alternativ kann das markierte Reagenz direkt auf den Streifen aufgebracht werden.
US-Patent Nr. 4938927, erteilt für Kelton et al., offenbart einen rotierenden Bewegungsmanipulator, der eine runde chromatographische Membran enthält, die durch bewegliche Blockaden in viele bewegliche Passagen unterteilt ist. Jede bewegliche Passage enthält ein markiertes spezifisches Bindungsreagenz und ein immobilisiertes spezifisches Bindungsreagenz. Eine Testprobe wird auf oder in der Nähe des markierten Reagenzes aufgebracht. Dann wird ein Eluat an einer speziellen Stelle dicht am Zentrum der Membran aufgebracht. Das Eluat bewegt sich in besonderer Passage zur äußeren Seite des Kreises durch kapillare Sauggeschwindigkeit und zentrifugale Kräfte. Die Prinzipien der spezifischen Bindungsassays selbst sind identisch zu denen, die Deutsch et al. beschreiben.
US-Patent Nr. 5238652, Sun et al., bezieht sich auf eine analytische Testvorrichtung für einen Verdrängungsassay für besondere nicht-Protein-Antigene, solche Antigene wie z. B. Drogen.
Gefärbte Latexpartikel, die mit Detektionsantikörper für das nicht-Protein-Antigen sensibilisiert bzw. gekoppelt wurden, werden direkt auf die chromatographische Membran aufgebracht, daß die Latexkugeln unbeweglich sind, wenn trocken, und beweglich, wenn in Kontakt mit Flüssigkeit. "Downstream" bzw. stromabwärts von dem Latex wird die Membran mit einer Probe imprägniert, die eine permanent immobile Arzneimittelmischung enthält. Wenn eine Probe wie z. B. eine Körperflüssigkeit auf die Membran aufgebracht wird, werden die Latexpartikel durch die Probe resuspendiert und wandern zur Mischung. Wenn Arzneimittel oder ihre Metaboliten in der Probe enthalten sind, binden sie an den Antikörper auf dem Latex während dieser Wanderung. Wenn die Konzentration der Arzneimittel oder ihrer Metaboliten ausreicht, um alle Antikörperbindungsstellen zu besetzen, wird die Bindung der gefärbten Latexpartikel in der Probe der Arzneimittelmischung verhindert. Befinden sich keine Arzneimittel oder ihre Metaboliten in der Probe, binden die gefärbten Latexpartikel in der Arzneimittelmischung und ergeben eine distinkte gefärbte Bande.
EP-Patent Nr. 0291194, May, offenbart eine analytische Testvorrichtung, die einen hohlen Behälter umfaßt, der eine chromatographische poröse Membran enthält. Die Vorrichtung umfaßt weiterhin ein markiertes spezifisches Bindungsreagenz (z. B. gefärbtes Latex) für ein Analyt und ein unmarkiertes spezifisches Reagenz für dasselbe Analyt, das permanent auf der Membran immobilisiert ist. Die Flüssigprobe permeiert die Membran über Kapillarkräfte, nimmt das markierte Reagenz auf und wandert zu dem Bereich mit dem unmarkierten Reagenz. Die Gegenwart eines Analyts in der Probe wird durch den Gehalt an gebundenem markierten Reagenz bestimmt unter Verwendung der Ausführungsform eines entweder "Sandwich"- oder Verdrängungsassays.
EP-A-0525829 offenbart einen chromatographischen Teststreifen. Eine inerte Trägerfolie trägt einige blattähnliche Stücke, bzw. Lagen von saugfähigem Material. Diese Lagen sind linear angeordnet und berühren einander paarweise, so daß sie einen kontinuierlichen Transportweg für Flüssigkeiten darstellen. Eine Flüssigprobe wird auf die Lage an einem Ende des Teststreifens aufgebracht und wandert durch die aufeinander folgenden Lagen bis die letzte Lage auf der gegenüberliegenden Seite des Teststreifens erreicht ist. Dadurch wechselwirken die Reagenzien, die in einer oder mehrerer Lagen enthalten sind, mit dem Analyt, das in der Flüssigprobe enthalten ist, und ermöglichen seine Detektion.
Um unerwünschte Wechselwirkungen zwischen dem markierten Reagenz und der Membran zu minimieren, die möglicherweise ein irreversibles Kleben des markierten Reagenzes an der Membran verursachen, wurde vorgeschlagen, das markierte Reagenz als Oberflächenschicht aufzubringen. Um dies zu erreichen, wird vor dem Aufbringen des markierten Reagenzes ein glasiertes Material, wie z. B. wäßrige Fruchtzucker oder Cellulose, aufgebracht, um eine glasierte Schicht zu bilden. Das markierte Reagenz wird dann auf die glasierte Schicht aufgebracht. In der Praxis penetriert allerdings das glasierte Material zu einem gewissen Grad in die Membranenschicht, wie auch das markierte Reagenz.
US-Patent Nr. 5275785, May et al., ("May 785") offenbart eine chromatographische Testvorrichtung, die eine Anzahl Flüssigkeit leitender Membranen unterschiedlicher Sauggeschwindigkeiten (wicking ability) und ein Material, das in Kontakt mit Flüssigkeit veränderlich stark schwillt, verbindet, um einen Flüssigkeitsfluß zu regulieren. Unterschiedliche Wandergeschwindigkeiten der Flüssigkeiten in den einzelnen Membranen erlauben in Verbindung mit dem veränderlich schwellbaren Material (das den Kontakt zwischen den Membranen herstellt oder unterbricht) die Bereitstellung der Reagenzien in der Detektionszone in einer bestimmten Reihenfolge und/oder Proportion.
Allerdings haben die oben erwähnten Verfahren zahlreiche Nachteile. Zwei besonders erwähnenswerte Probleme betreffen das Mobilisieren trockener Bindungsreagenzien: Das erste Problem betrifft die Quantität der mobilisierten Reagenzien und das zweite die Art der Mobilisierung. Obwohl es ein Ziel ist, Reagenzien quantitativ zu mobilisieren, ist es in der Praxis oft nicht möglich, weil die Reagenzien dazu tendieren, irreversibel an der porösen Membran zu kleben.
Bevorzugt werden die Reagenzien gleichmäßig mobilisiert, um ein Kontinuum zu bilden mit keinem oder minimalen Konzentrationsgradienten. So ein Kontinuum bevorzugt einen einheitlichen Bindungsgrad (insbesondere kritisch für den Verdrängungsassay) und ergibt eine reproduzierbare einheitliche Ergebnisbande. Ein bekannter Weg, Mobilisierung und eine einheitliche Konzentration innerhalb einer Lösung von Reagenzien zu erreichen, ist, die Probe mit einem flüssigen Bindungsreagenz vorzumischen, z. B. einem markierte Bindungsreagenz, und dann die Mischung entweder direkt oder über einen Probenpad auf eine Testvorrichtung aufzubringen. Allerdings unterliegt diese Mehrschrittprozedur experimentellen Fehlern und erhöht die Handhabung mit gesundheitsgefährdenden Proben.
Einschrittvorrichtungen benötigen nur einen Schritt der Probenzugabe zur Durchführung eines Tests. Das Bindungsreagenz ist im allgemeinen eingebettet in ein absorbierendes Material, das in Folgekontakt mit dem porösen Trägermaterial steht, oder wird direkt auf das poröse Trägermaterial aufgebracht. Allerdings mobilisiert in einem solchen Fall die Flüssigfront einer Probe nicht einheitlich das trockene imprägnierte Bindungsreagenz, so daß die Reagenzkonzentration an der Front am höchsten ist. Das hat ein uneinheitliches Konzentrationsmuster zur Folge, das sehr anfällig für Variationen im porösen Trägermaterial ist. Sogar geringe Lotdifferenzen können einen gegenteiligen Effekt verursachen, und präzise Titration des markierten Reagenzes ist notwendig. Da der Titer im Hinblick auf die Leistung im Abschaltlevel eines Analyts gewählt wird, ist es oft schwierig, eine substanzielle Differenzierung zwischen den Signalen zu erhalten, die durch kein Analyt und durch Abschalten verursacht werden.
Andere Nachteile bekannter Einschritt-Systeme sind die uneinheitliche Wanderung des markierten Bindungsreagenz und die geringe Rehydrierung des Latex. Der Stand der Technik versuchte das Problem der geringen Rehydrierung und dem irreversiblen Kleben des Latex zu lösen, indem ein Bindungsreagenz auf eine Oberflächenschicht auf einem glasierten Material aufgebracht wurde (siehe Beispiel May et al., wie oben erwähnt). Allerdings beeinträchtigen die viskosen Bestandteile des glasierten Materials die Wanderung und verursachen Wirbel. Das führt zu einer geringen Reproduzierbarkeit und einer nicht-durchgängigen Ergebnisbande. In einer Ausführungsform des Verdrängungsassays sind diese Nachteile akuter als in der eines "Sandwichs".
Gegenstand der Erfindung ist daher eine Assay-Vorrichtung, die die oben erwähnten Probleme löst.
Eine erfindungsgemäße Assay-Vorrichtung ist gekennzeichnet dadurch, daß sie umfaßt,
(a) ein erstes absorbierendes Material, auf das ein erstes Reagenz an eine erste vorbestimmte Position immobilisiert wurde; und
(b) ein zweites absorbierendes Material, das mit dem ersten absorbierenden Material in Kontakt steht und auf dem ersten absorbierenden Material angeordnet ist, und auf das ein zweites lösbares Reagenz an eine zweite vorbestimmte Position immobilisiert wurde, wobei das erste absorbierende Material (101) und das zweite absorbierende Material zueinander benachbart liegen, so daß eine Flüssigkeit durch das erste absorbierende Material fließt, das zweite Reagenz vom zweiten absorbierenden Material löst und durch das erste absorbierende Material durch fließt.
Die wichtigsten Vorteile der erfindungsgemäßen Offenbarung sind folgende:
Die Erfindung löst die oben erwähnten Probleme und stellt einen verbesserten spezifischen Bindeassay bereit durch die Verwendung einer zusätzlichen oberen Membran (ein poröses Trägermaterial), die ein spezifisches Bindungsreagenz enthält. Durch eine weitere unabhängige Membran, die mit einem spezifischen Bindungsreagenz getränkt ist, wird die Rehydrierung des spezifischen Reagenzes und der Grad seiner Verdünnung durch die Probe kontrolliert und daher die Leistungsfähigkeit des Assays optimiert. Dieser einzigartige Aufbau ermöglicht ein einheitlicheres Wanderungsmuster des markierten Reagenzes und eliminiert unerwünschtes Fluten der Membran, wenn sehr hohe Probenvolumina aufgebracht werden.
Die Erfindung kann - ist jedoch nicht darauf beschränkt - mit einer Assay- Vorrichtung zur Durchführung von spezifischen Bindeassays verwendet werden, insbesondere mit Vorrichtungen zum Nachweis von Drogen. Eine derartige Assay- Vorrichtung ist konfiguriert und bemessen für die Verwendung von Teststreifen aus porösem Trägermaterial. Eine Vorrichtung dieses Typs wurde in der EP-Anmeldung Nr. EP-A-0668745 offenbart.
In einer erfindungsgemäßen Assay-Vorrichtung bestehen bevorzugt das erste absorbierende Material und das zweite absorbierende Material aus dem gleichen Material.
In einer erfindungsgemäßen Assay-Vorrichtung wurde das erste absorbierende Material bevorzugt aus der Gruppe saugfähiger und poröser Membranen ausgewählt. Das erste absorbierende Material ist bevorzugt Nitrocellulose.
In einer erfindungsgemäßen Assay-Vorrichtung wurde das zweite absorbierende Material bevorzugt aus der Gruppe saugfähiger und poröser Membranen ausgewählt. Das zweite absorbierende Material ist bevorzugt Nitrocellulose.
In einer bevorzugten Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Assay-Vorrichtung werden das erste absorbierende Material und das zweite absorbierende Material über eine Halterung zueinander in Kontakt gehalten, wobei die Halterung bevorzugt ein Materialband und das Materialband bevorzugt ein Polyesterfilm ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Assay-Vorrichtung ist das zweite Reagenz markiert, wobei die Markierung bevorzugt gefärbtes Latex ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Assay-Vorrichtung weist das erste absorbierende Material eine Mehrzahl auf ihm immobilisierter Reagenzien auf.
In einer bevorzugten Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Assay-Vorrichtung weist das zweite absorbierende Material eine Mehrzahl auf ihm immobilisierter Reagenzien auf.
In einer bevorzugten Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Assay-Vorrichtung weisen das erste Reagenz und das zweite Reagenz eine Bindungsaffinität zueinander auf.
In einer bevorzugten Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Assay-Vorrichtung weisen jeweils das erste Reagenz und das zweite Reagenz eine Bindungsaffinität zu derselben Substanz auf.
In einer bevorzugten Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Assay-Vorrichtung ist die Sauggeschwindigkeit des ersten absorbierenden Materials die gleiche oder höher ist als die Sauggeschwindigkeit des zweiten absorbierenden Materials.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Assay- Vorrichtung ist die Sauggeschwindigkeit des ersten absorbierenden Materials niedriger ist als die Sauggeschwindigkeit des zweiten absorbierenden Materials.
In einer bevorzugten Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Assay-Vorrichtung ist das erste Reagenz irreversibel an das erste absorbierende Material immobilisiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Assay-Vorrichtung weisen jeweils das erste absorbierende Material und das zweite absorbierende Material ebene Oberflächen auf. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die ebene Oberfläche des ersten absorbierenden Materials benachbart zur ebenen Oberfläche des zweiten absorbierenden Materials.
Verfahren zur Durchführung eines erfindungsgemäßen Bindeassays, dadurch gekennzeichnet, daß es die Schritte aufweist:
Einbringen einer Flüssigprobe in das erste absorbierende Material einer erfindungsgemäßen Assay-Vorrichtung, um einen ersten Flüssigkeitsstrom innerhalb des ersten absorbierenden Materials zu generieren, wobei sich der erste Flüssigkeitsstrom in zwei Ströme aufteilt, sobald er das zweite absorbierende Material erreicht, wobei die Flüssigkeit von dem ersten absorbierenden Material in das zweite absorbierende Material eingebracht wird, um einen zweiten Flüssigkeitsstrom innerhalb des zweiten absorbierenden Materials zu generieren, wobei der erste Flüssigkeitsstrom innerhalb des ersten absorbierenden Materials verbleibt, und wobei das zweite Reagenz in den zweiten Flüssigkeitsstrom innerhalb des zweiten absorbierenden Materials mobilisiert wird, wobei der zweite Flüssigkeitsstrom, der nach Mobilisierung des zweiten Reagenz im wesentlichen generell parallel zum ersten Flüssigkeitsstrom innerhalb des ersten absorbierenden Materials verläuft, und
Einbringen des zweiten Flüssigkeitsstroms und des zweiten Reagenzes von dem zweiten absorbierenden Material in das erste absorbierende Material, um sie mit dem ersten Flüssigkeitsstrom innerhalb des ersten absorbierenden Materials zu vereinigen.
In einer bevorzugten Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Verfahrens fließt der erste Flüssigkeitsstrom innerhalb des ersten absorbierenden Materials mit gleicher oder höherer Geschwindigkeit als der zweite Flüssigkeitsstrom innerhalb des zweiten absorbierenden Materials.
In einer bevorzugten Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Verfahrens fließt der erste Flüssigkeitsstrom innerhalb des ersten absorbierenden Materials mit geringerer Geschwindigkeit als der zweite Flüssigkeitsstrom innerhalb des zweiten absorbierenden Materials.
Eine Ausführungsform der Erfindung wird im folgenden unter Bezug auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben, die umfassen:
Fig. 1A stellt eine Vorderansicht eines Streifenkompartiments von einer Assay- Vorrichtung ohne Abdeckplatte dar.
Fig. 1B stellt eine geschnittene Seitenansicht von Fig. 1A dar.
Fig. 1C stellt die Abdeckplatte der Assay-Vorrichtung dar.
Fig. 1D stellt eine perspektivische Ansicht des erfindungsgemäßen Teststreifens dar.
Fig. 2 stellt ein Diagramm von kolorimetrischer Dichte vs. Morphinkonzentration eines durchgeführten Assays unter Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung dar.
Fig. 3 stellt ein Diagramm von kolorimetrischer Dichte vs. Morphinkonzentration eines durchgeführten Assays unter Verwendung von Nitrocellulose dar, auf der Reagenzien unter Verwendung eines IVEK Digispense 2000TM dispensiert wurden.
Fig. 4 stellt ein Diagramm von kolorimetrischer Dichte vs. Tetrahydrocannabinoidkonzentration (THC) eines durchgeführten Assays unter Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung dar.
Fig. 5 stellt ein Diagramm von kolorimetrischer Dichte vs. Tetrahydrocannabinoidkonzentration (THC) eines durchgeführten Assays unter Verwendung von Nitrocellulose dar, auf der Reagenzien unter Verwendung eines IVEK Digispense 2000TM dispensiert wurden.
Fig. 6 stellt ein Diagramm von kolorimetrischer Dichte vs. Tetrahydrocannabinoidkonzentration (THC) eines durchgeführten Assays unter Verwendung von Nitrocellulose dar, auf der Reagenzien unter Verwendung eines Paasche-Airbrush gesprayt wurden.
Fig. 7 stellt ein Diagramm von kolorimetrischer Dichte vs. Tetrahydrocannabinoidkonzentration (THC) eines durchgeführten Assays auf Nitrocellulose dar, auf der Fruchtzucker glasiert wurde.
Fig. 8 stellt ein Diagramm von kolorimetrischer Dichte vs. Tetrahydrocannabinoidkonzentration (THC) eines durchgeführten Assays auf glasierter Nitrocellulose dar, auf der Latex in Methyl-Cellulose-Lösung über die Fruchtzuckerschicht aufgebracht wurde.
Die Erfindung ist im folgenden in ihrer bevorzugten Ausführungsform beschrieben. Diese Ausführungsformen sind offenbart, um die Erfindung besser verständlich zu machen, limitieren sie jedoch nicht.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung und das erfindungsgemäße Verfahren sind besonders geeignet für die Verwendung in Testverfahren von Drogen, wie z. B. Kokain, Amphetaminen, Kannabinoiden, Barbituraten, Benzodiazepinen, Opiaten, Phenylcyclidinen, Propoxyphin, Methaqualon, trizyklische Antidepressiva und Methadon, sowohl in Testverfahren der klinischen Chemie, Schwangerschaftstests und ähnlichen Testanwendungen.
In der Beschreibung wurden die Begriffe "Membran", "poröses Trägermaterial" und "absorbierendes Material" untereinander austauschbar verwendet, wobei sie das gleiche Material beschreiben, das für den hier beschriebenen erfindungsgemäßen Assay geeignet ist.
Um die Erfindung besser verständlich zu machen, wurden einige Positionsbeschreibungen verwendet. Die "obere" und "Haupt"-Membranen wurden mit den Begriffen "vornliegend" und "rückwärtig" beschrieben. "Vornliegend" ist die Position einer Membran, die sich über den Längsmittelpunkt erstreckt (lokalisiert in Fließrichtung innerhalb der Membran). Die am weitesten vorn liegende Position einer Membran wurde als "terminales Ende" bezeichnet. "Rückwärtig" ist das Gegenteil von vornliegend und bezieht sich auf den Teil der Membran, der sich vom Längsmittelpunkt an bis in Richtung Ende erstreckt, das zuerst Kontakt mit der Probenflüssigkeit erhält. Die am weitesten rückwärtig liegende Position einer Membran wurde als "beginnendes Ende" bezeichnet. "Downstream" bzw. stromabwärts beschreibt die Richtung, in der die Flüssigkeit innerhalb der Membranen fließt. Im Gegensatz dazu beschreibt "upstream", bzw. stromaufwärts die entgegengesetzte Richtung des Flüssigkeitsfluß innerhalb der Membran.
Eine Probe wird am beginnenden Ende der Hauptmembran absorbiert und längs der Hauptmembran durch kapillare Kräfte transportiert. Eine Membran ist im allgemeinen im Bereich von 1 bis 10 cm lang, 0,4 bis 2 cm breit und 0,1 bis 1 mm dick. Die Membran ist typischerweise wie ein verlängertes, rechtwinkliges dünnes Prisma geformt.
Sobald der Probenfluß die mit dem Reagenz versehende obere Membran erreicht hat (die im allgemeinen das markierte Reagenz enthält), teilt er sich in zwei Flüssigkeitsströme auf: der eine fließt in die Hauptmembran und der zweite permeiert, typischerweise in rückwärtiger Position in die obere Membran und mobilisiert das Reagenz, das in der oberen Membran lokalisiert ist. Das in der oberen Membran lokalisierte Reagenz ist beweglich, wenn es in einem feuchten Zustand vorliegt. Obwohl zur Eindeutigkeit ein einzelnes Reagenz als der oberen Membran lokalisiert beschrieben wurde, können auch mehrere Reagenzien verwendet werden. Genauso kann auch eine Mehrzahl von oberen Membranen, in der jeder ein oder mehrere Reagenzien lokalisiert sind, verwendet werden.
Bevorzugte Marker sind gefärbte Kolloidpartikel, wobei gefärbtes Latex bevorzugt wird. Gefärbtes Latex ist sofort mit dem bloßen Auge sichtbar, wenn es in der Detektionszone gebunden wird. Daher werden keine zusätzlichen Entwicklungsverfahren benötigt. Prozeduren zur Sensibilisierung bzw. Kopplung von Latex mittels spezifischer Bindungsreagenzien sind bekannt (z. B. siehe Illum, L. and P. D. E. Jones, Attachment of Monoclonal Antibodies to Mikrospheres, Methods in Enzymology, Vol. 112, S. 67-84 (1985) and Galloway, R. J., Development of Microparticle Tests and Immunoassays, Seradyn. Inc., S. 6-31, (1988)). Wie weiter oben bereits hingewiesen können mehrere Reagenzien in einer oder mehreren oberen Membranen verwendet werden. Genauso können mehrere mit Latex versehende Membranen oder eine mit Latex versehende Membran, die mit einer Mehrzahl von Bindungsreagenzien sensibilisiert bzw. gekoppelt wurde, z. B. Antigenen und/oder Antikörpern, verwendet werden.
Die zwei parallel verlaufenden Flüssigkeitsströme vereinigen und mischen sich in der Hauptmembran nahe bei oder an der vorn liegenden Kante der oberen Membran. Während die Wanderung zur Detektionszone innerhalb der Hauptmembran verläuft, findet eine Bindungsreaktion zwischem dem Reagenz und dem Analyt statt. Dieser Bindungsgehalt oder nur die Gegenwart des Analyt, abhängig davon, ob es sich bei dem Assay um einen Verdrängungs- oder "Sandwich"-Assay handelt, werden an der Detektionszone gemessen, an der spezifische Bindung mit dem markierten Reagenz stattfindet. Ungebundenes Material wandert weiter nach unten zum terminalen Ende der Hauptmembran und wird teilweise an der Kontrollseite festgehalten. Kein ungebundenes markiertes Reagenz verbleibt in der Detektions- oder Kontrollzone.
Auf der Hauptmembran befindet sich eine Detektionszone, an der spezifisches Bindungsreagenz (im allgemeinen unmarkiert) immobilisiert ist, weil dann das immobilisierte spezifische Bindungsreagenz nicht von der Entwicklungsflüssigkeit fortgewaschen werden kann. Weiter unten an der Detektionsstelle befindet sich eine Kontrollzone, an der ein anderes Bindungsreagenz immobilisiert wurde. Beim Zusammenfügen steht die obere Membran in Kontakt mit der Oberfläche der Hauptmembran weiter oben an der Kontrollzone (siehe Fig. 1D).
Es kann optional ein Probenpad zur Absorption der Flüssigprobe und zum Aufbringen der Flüssigkeit in das vordere Ende der Hauptmembran verwendet werden. Das Probenpad ist im allgemeinen aus Blottmaterial hergestellt und steht in Kontakt mit der Hauptmembran und kann optional zusätzliche Reagenzien enthalten.
Ein Pad, das wie eine Senke geformt und aus Blottmaterial hergestellt wurde, kann optional am unteren Ende der Hauptmembran verwendet werden, um überschüssige Reagenzlösung zu absorbieren und den Kapillarfluß in der Hauptmembran über einen längeren Zeitraum zu begünstigen.
Die Membranen und Pads sind bevorzugt in einer Halterung angeordnet. Die Verwendung eines Probenpads und eines Pads, das wie eine Senke geformt ist, wurde in den US-Patenten Nr. 4956302 und 5238652 beschrieben. Ein Fachmann würde mit Kenntnis der vorliegenden Erfindung in der Lage sein, solche Pads in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung verwenden zu können.
Beispiele geeigneter oberer und Hauptmembranen schließen saugfähiges fibröses Material, in dem Kapillarkräfte wirken können, ein wie z. B. dünne Lagen von Chromatographie-Materialien, Papier- oder Cellulose-Chromatographie-Materialien, poröse synthetische Plastikmaterialien, usw.. Bevorzugte Absorbiermaterialien besitzen gute Matrixdichten, eine weiche Oberfläche, die guten Kontakt zwischen den "oberen" und "Haupt"membranen sicher stellt, die Fähigkeit zur reversible Bindung der markierten Komponente an die Membran, um quantitative Mobilisierung zu unterstützen, die Fähigkeit zum Transport eines markierten Reagenzes über Kapillarkräfte, besitzen geeignete Sauggeschwindigkeiten und ermöglichen ein reproduzierbares und bequemes Aufbringen des Reagenz.
Bevorzugte Membranen schließen Nitrocellulose und Nylon ein. Besonders bevorzugt wegen der bequemen Handhabung sind auf Plastik fixierte Membranen. Nitrocellulose ist bevorzugt, da es
1. fähig ist, Proteine über Adsorption ohne komplizierte kovalente Bindung zu binden,
2. exzellente Saugfähigkeiten besitzt und
3. in einem geeigneten Bereich von Porengrößen erhältlich ist.
Gebackene Nitrocellulose (beispielsweise auf Plastikmaterial fixiert) ist am meisten bevorzugt. Prozeduren zur Adsorption spezifischer Proteine auf Nitrocellulose, um Detektions- und Kontrollzonen zu bilden, und das Blockieren unbesetzter Bindungsstellen auf der Nitrocellulose mit neutralem Blockingreagenz sind bekannt (siehe z. B. Harvey, M. A., Optimization of Nitrocellulose Membrane-Based Immunoassays, Schleicher & Schuell, Nr. 557, S. 18-23, 1991).
Wanderraten variieren mit Membraneigenschaften, z. B. mit der Porengröße. Ein Fachmann besitzt die Kenntnis, die Flußrate, den geeigneten Membrantyp und die Porengröße zu wählen, und sie können mit minimalem experimentellen Aufwand bestimmt werden.
Wegen der Flußdynamiken innerhalb der oberen Membran ist das (typischerweise markierte) Reagenz an der vorderen Kante der oberen Membran konzentrierter und sickert langsam in die Hauptmembran, wobei es sich mit dem ersten Flüssigkeitsstrom mischt. Man postuliert, daß in der vorliegenden Erfindung der Verdünnungsgrad durch die Flußdynamiken eher kontrolliert wird als durch den Grad an Mobilisierung des Reagenzes, wie von anderen Ausführungsformen bekannt. Auf diese Weise bietet die Erfindung den Vorteil einer relativ konstanten Konzentration des Reagenzes auf der oberen Membran innerhalb des vereinigten Flusses, der weiter unten der Hauptmembran erscheint. Diese relativ konstante Konzentration des Reagenzes bleibt so lange erhalten wie das Aufbringen von Reagenz auf der oberen Membran anhält.
Der Verdünnungsgrad an Reagenz von der oberen Membran kann über die Auswahl eines geeigneten Unterschiedes in den Matrices der Haupt- und oberen Membran kontrolliert werden. Die "Matrixdichte" bezieht sich auf die Geschwindigkeit von Flüssigkeitsbewegung innerhalb der Membran (Distanz/Zeit). Die obere Membran kann aus dem gleichen Material oder einem anderen geeigneten porösen Trägermaterial bestehen. Allerdings ist es angenehmer, wenn die oberen und die Hauptmembranen im allgemeinen aus dem gleichen Material bestehen. Die Wahl einer geeigneten Membran wird vom Fachmann unmittelbar mit Kenntnis dieser Beschreibung getroffen. Wird z. B. eine höhere Verdünnungsrate benötigt, kann Reagenz über eine Membran aufgebracht werden, die eine langsamere Saugfähigkeit besitzt, beispielsweise unter Verwendung einer Membran mit einer kleineren Porengröße.
Die Matrixdichte der Hauptmembran ist bevorzugt höher oder gleich zur Matrixdichte der oberen Membran. Daher permeiert Reagenz von der oberen Membran in die Hauptmembran hinter der Flüssigkeitsfront in die Hauptmembran und ermöglicht so, daß der erste Flüssigkeitsstrom die Hauptmembran vor-befeuchtet. Das Vorbefeuchten hat den Vorteil, daß es
1. die einheitliche Wanderung des Reagenzes von der oberen Membran begünstigt,
2. den negativen Effekt der Hydrophobizität, der durch unmarkiertes Bindungsreagenz an der Detektionszone verursacht wird, eliminiert oder wenigstens signifikant reduziert, und
3. Bindung an der Detektionszone begünstigt.
Ein markiertes Bindungsreagenz wird normalerweise auf eine Membran aufgebracht, die zuvor mit einer Blockingsubstanz blockiert wurde, um unspezifisches Binden eines markierten Reagenzes an der Membranoberfläche zu verhindern.
Die Membran kann zerschnitten werden, und die Teststreifen können in geeigneter Weise angeordnet werden. Alternativ kann die Membran in bestimmte Dimensionen vorgeformt werden. Z. B. kann es brauchbar sein, große Segmente anzuordnen, indem zunächst die obere Membran auf der Oberfläche der Hauptmembran befestigt wird, welche dann in Streifen geschnitten wird. Die obere Membran weist bevorzugt die gleiche Breite wie die Hauptmembran auf oder ist schmaler. Die Länge jeder Membran wird empirisch ermittelt, jedoch werden Membranen bevorzugt, die relativ kurz sind und Dimensionen aufweisen, die gerade ausreichen, um die benötigte Menge an Bindungsreagenz aufzunehmen. Der exakte Abstand zwischen der Membran und der Detektionszone wird ermittelt durch Abwägen der Zeit, die für die ordentliche Mischung der Reagenzien nötig ist, und der Komplettierung einer Bindungsreaktion mit der Verschlechterung einer einheitlichen Wanderung, wenn der Abstand zu lang ist. Diese speziellen Parameter können experimentell mit minimalem Aufwand ermittelt werden. Ein Abstand in dem Bereich von 0,5 bis 5 cm wird derzeit bevorzugt. Die Position der oberen Membran auf der Hauptmembran befindet sich weiter oben der Detektionszone und weiter unten der Auftragsstelle für die Probe.
Laminierung der Haupt- und oberen Membranen verhindert gelegentliches Fluten der Membran, das durch Austritt überschüssiger Probe aus den Membranen verursacht wird. Erreicht eine Flutwelle der Probe die Stelle, an der das Reagenz eingebettet ist, kann das Testergebnis völlig verzerrt werden. Das Problem ist besonders in solchen Ausführungsformen akut, in denen die Probe nach unten wandert.
Der Kontakt zwischen der oberen und der Hauptmembran kann auf vielfältige Weise erreicht werden. Z. B. können die Haupt- und oberen Membranen über Gehäuseelemente gegeneinander gepreßt oder gegeneinander geschichtet werden oder beides. Laminierung wird bevorzugt, weil damit ein verläßlicher "enger" Kontakt erreicht wird. Zudem fungiert die Schichtung als ein Damm zur Verhinderung des Flutens. Eine bevorzugte Ausführungsform zur Maximierung des Kontaktes zwischen den Membranen ist, wenn die obere Membran auf die Hauptmembran in benachbarter Position unter Verwendung eines Polyesterfilms, z. B. eines Mylartapes, geschichtet wird, wie es im folgenden Beispiel beschrieben ist.
Für das Reagenz der oberen Membran ist derzeit bevorzugt, daß es möglichst nicht die Schnittstelle zwischen den Membranen zu überschreitet, sondern eher vollständig innerhalb der oberen Membran zur vorderen Kante transportiert wird.
Fig. 1A bis 1D stellen eine spezifische Ausführungsform unter Verwendung von chromatographischen Prinzipien zur Durchführung eines spezifischen Bindeassays dar. Drei poröse Trägermembranen zum Test von drei unterschiedlichen Analyten werden in einer Plastikhalterung (102) gezeigt. Diese Halterung kann die Form einer Assay- Ausführungsform aufweisen, wie sie in der Anmeldung EP-A-0668745 offenbart wurde.
Typischerweise beinhaltet die Plastikhalterung (102) drei bis fünf poröse Trägermembranen. Fig. 1A zeigt drei poröse Trägermembranen, und Fig. 1 C zeigt Fenster für fünf poröse Trägermembranen.
Die Hauptmembran (101) enthält eine Detektionszone (103) und eine Kontrollzone (104). Markiertes spezifisches Bindungsreagenz (105) wird in die obere Membran (106) eingebettet, die mit der oberen Oberfläche der Hauptmembran (101) in Kontakt steht. Die obere Membran (106) ist eng an die Hauptmembran (101) angebracht mittels eines Polyesterfilms mit adhäsivem Belag, z. B. mit adhäsivem Mylartape (107). Das beginnende Ende (108) einer jeden Hauptmembran (101), das in Kontakt steht und bevorzugt ein wenig überlappt, ist ein Probenpad (109). Die Probe steht mit dem Probenpad (109) über einige kleine Löcher in der Rückseite des Pads (nicht gezeigt) in Kontakt. Jedes obere Ende des Probenpads (109) trägt eine weiche Gummiabdichtung (110). Der benötigte Weichheitsgrad wird vom Fachmann unmittelbar bestimmt. Die Gummiabdichtung (110) ist ein wenig größer als das Probenpad (109), so daß es das Probenpad (109) abdeckt und entlang seiner Seiten abdichtet, wenn dies zusammengedrückt wird.
Das Abdichten ist nötig, um das Auslaufen der Probe zu verhindern, wenn die chromatoghraphischen Membranen vertikal angeordnet werden (die Probe wandert nach unten). Natürlich kann auch eine Abdichtung (110) verwendet werden, wenn die Vorrichtung in einer anderen als der vertikalen Orientierung verwendet wird. Das absorbierende Pad (111) am terminalen Ende (112) der chromatoghraphischen Membranen ist bei allen dreien Membranen gleich. Jede Detektionszone kann durch ein kreuzförmiges Ergebnisfenster (113) und die jeweilige korrespondierende Kontrollseite durch ein rundes Kontrollfenster (114) der Abdeckplatte (115) eingesehen werden. Das Plastik der Abdeckplatte ist typischerweise nicht transparent. Das kreuzförmige Ergebnisfenster wird für einen Detektionsassay von Benzoylecgonin im Urin mit COC markiert. Das kreuzförmige Ergebnisfenster wird für einen Detektionsassay von Kannabinoiden im Urin mit THC, das Tetrahydrocannabinoide abkürzt, markiert. Das kreuzförmige Ergebnisfenster wird für einen Detektionsassay von Opiaten im Urin mit MOR markiert. Das Erscheinen eines blauen Streifens in jedem der runden Fenster (114), markiert mit "Test beendet", zeigt an, daß der korespondierende Test bis zum Ende durchgeführt wurde und das Ergebnis ausgewertet werden kann. Diese Fenster (114) zeigen einen Ausschnitt des Membranstreifens, der mit BSA-(Anti-Rinder- Serum-Albumin-) Antikörpern beschichtet war. Latexmikropartikel sind mit BSA- Antikörpern beschichtet, so daß, wenn sie hinter diesen Bereich der Membran wandern, der Antikörper an das Rinder-Serum-Albumin bindet und die Mikropartikel festhält.
Die vorliegende Erfindung ist insbesondere nutzbar in einer Ausführungsform des Verdrängungsassays. In einer dieser Ausführungsformen ist das markierte Reagenz in der oberen Membran das Analyt selbst oder ein Analogon mit denselben spezifischen Bindungseigenschaften. Das markierte Reagenz wird durch eine Probe mobilisiert und verdünnt und wandert mit der Probe in Richtung Detektionszone, wo unmarkiertes Reagenz in der Lage ist, das Analyt oder sein Strukturanalogon zu binden und so immobilisiert. Ist ein Analyt in der Probe zugegen, wird es mit dem markierten Reagenz um eine limierte Anzahl an Bindungsstellen in dem Detektionsbereich konkurrieren, und es kann die relative Konzentration des Analyts von dem Grad der Reduktion von Bindungen des markierten Reagenz ermittelt werden.
In einer anderen Ausführungsform ist die Verdrängung zeitaufgelöst. In diesem Fall ist das markierte Reagenz ein Bindungspartner des Analyts oder seines Strukturanalogons. Das markierte Reagenz wird durch eine Probe mobilisiert und verdünnt und wandert dann mit der Probe in Richtung Detektionszone, wo unmarkiertes Analyt oder sein Strukturanalogon immobilisiert wird. Ist ein Analyt in der Probe zugegen, wird es während seiner Wanderung an das markierte Reagenz binden. Verbleibende nicht gesättigte Bindungsstellen des markierten Reagenz können das immobilisierte Reagenz in der Detektionszone binden. Auch hier kann die Konzentration des Analyts von dem Grad der Reduktion von Bindungen des markierten Reagenz ermittelt werden.
Bei beiden Ausführungsformen des Verdrängungsassays sollte das Verhältnis von Konzentrationen der Bindungskomponenten in der wandernden Flüssigkeit nicht signifikant über den Dimensionen des Bereichs liegen, in dem markiertes Reagenz wandert. Auch sollte Einheitlichkeit nicht über dem Wanderungszeitraum in der Detektionszone abfallen. Eine Abweichung in der Einheitlichkeit des Flusses führt zu Schwankungen in der Verdrängung und damit zu schwer reproduzierbaren Ergebnissen. Die vorliegende Erfindung minimiert (das Problem der) Uneinheitlichkeit und verbessert die Sensitivität durch erhöhtes Verdünnen des markierten Reagenz (wie weiter unten beschrieben).
Eine Unterscheidung zwischen dem Nulllevel und dem Abschaltlevel des Analyts kann verbessert werden durch eine Erhöhung der Gesamtmenge an markiertem Reagenz und des Volumens, in dem es vorliegt. Als Folge daraus wird das Analytsignal am Nulllevel stärker, während das Signal am Abschaltlevel unverändert bleibt und ermöglicht durch eine steilere Kalibrierungskurve eine verbesserte Unterscheidung.
Die vorliegende Erfindung ist ebenso in einer Ausführungsform eines "Sandwichs"- Assays nutzbar. In dieser Ausführungsform sind sowohl das markierte Reagenz als auch das unmarkierte immobilisierte Reagenz Bindungspartner des Analyts (obwohl sie typischerweise an unterschiedliche Epitope des Analyts binden sollten). Bevorzugt wird, daß sowohl markiertes Reagenz als auch immobilisiertes unmarkiertes Reagenz im Überschuß zum Analyt vorhanden sind. Ist ein Analyt in der Probe zugegen, wird es während seiner Wanderung vollständig an das markierte Reagenz binden. In der Detektionszone wird das Analyt, das schon an das markierte Reagenz gebunden ist, an das immobilisierte Reagenz binden unter Ausbindung des "Sandwichs". Die Konzentration an Analyt ist direkt proportional zum Bindungsvorgang an der Detektionszone.

Beispiel 1

Das folgende Beispiel eines Morphin-Assays erläutert die Erfindung. Es wird jedoch daraufhin gewiesen, daß die vorliegende Erfindung nicht auf eine bestimmte Substanz beschränkt ist.
Ein Morphinderivat - N-[3-[(7,8-Didehydro-4,5-epoxy-6-hydro-17-methyl-morphinan-3- yl)oxyl]propoxy]-4-isothiocyanatobenzamid - wurde gemäß Beschreibung aus der Anmeldung EP-A-0386644 hergestellt.
Die Konjugation dieses Morphinderivats an Rinder-Serum-Albumin (BSA) wurde wie folgt durchgeführt:
Zu einer BSA-Lösung (ca. 57 mg/ml) in 50 mM Kaliumphosphat, pH 8, (438 ml) (im Eisbad gekühlt) wurde Dimethylsulfoxid (DMS) (188 ml) zugetropft. Nach Erwärmung auf 25ºC wurde eine 5 mg/ml konzentrierte Lösung des oben erwähnten Derivates in DMSO (190 ml) zugetropft. Die Reaktionsmischung wurde 16 h bei Raumtemperatur (RT) gerührt, in ein Dialysetube transferiert und zuerst gegen 15 Volumen 20% DMSO-Kaliumphosphatpuffer (50 mM, pH 8), dann gegen 10% DMSO- Kaliumphosphatpuffer und dann vier weitere Male gegen Kaliumphosphatpuffer dialysiert.
Styren-Mikropartikel, die einheitlich gefärbt und carboxyliert-modifiziert wurden, z. B. blaues Latex von Seradyn (0,3 Mikronpartikel), werden zunächst dreimal auf 1% Feststoffanteil in 20 mM MES (2-[N-morpholino]ethansulfonsäure, pH 6,1) durch Zentrifugieren gewaschen. Das gewaschene Latex wird auf 5% Feststoffanteil in MES eingestellt und
1. mit 2 mg/ml konzentrierten Anti-Morphin monoklonalen Antikörpern für 16 h bei RT gekoppelt,
2. mit einer BSA-Lösung in MES für 1 h bei RT blockiert,
3. dreimal auf 1% Feststoffanteil in MES durch Zentrifugieren gewaschen, und
4. erneut auf 5% Feststoffanteil eingestellt.
Vor Gebrauch werden gleiche Volumina des Latex und 35% (w/v) Fruchtzucker in MES gemischt.
Großporige Nitrocellulose, die direkt auf einen Polyesterfilm fixiert ist, z. B. Mylar gebackene großporige Nitrocellulose (10-20 Mikron) von Millipore, wird in Stücke von 10 cm Länge und 5 cm Breite gaschnitten. Die Lösung des Morphin-BSA-Gemisches (ca. 5 mg/ml) und die Anti-BSA monoklonale Antikörper (ca. 2 mg/ml), die beide in 50 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7,5, vorliegen, werden unter Verwendung eines Verdrängungsflüssigkeitsdispensiersystems, z. B. IVEK Corp. Digispense 2000TM System, mit einer Rate von 1 ul/cm auf Nitrocellulose mit einem Abstand von 2 cm bzw. 1 cm von der 10 cm-Seite entfernt dispensiert. Die Nitrocellulosesegmente trocknen für ca. 30 Min. bei 37ºC und werden dann mit einer 1% (w/v) Polyvinylalkohollösung (PVA, MG 13.000-23.000) in 20 mM Tris, pH 8, für 30 Min. bei RT blockiert. Die Segmente werden dann mit Wasser abgespült und trocknen gelassen.
Probenpads wurden hergestellt, indem ein Cellulosefilterpapier, z. B. BioRad Gel Blotter, in 0,5 cm² große Stücke zerschnitten wurde. Das gleiche Cellulosepapier wurde für die Herstellung der Pads, die wie eine Senke geformt sind, verwendet.
Die gleiche Nitrocellulose wie oben in diesem Beispiel beschrieben wurde als Trennmembran für den Latex verwendet (obere Membran). Zu diesem Zweck wurde die Nitrocellulose, die zuvor in der gleichen Weise wie die Hauptmembran blockiert worden war, in 5 cm breite Streifen geschnitten. Latex wurde unter Verwendung des IVEK Dispensiersystems aufgebracht. Nach dem Trocknen bei 37ºC für 30 Min. wurde diese Membran mit der Nitrocelluloseoberfläche nach unten auf die Hauptmembran gelegt und mit der Hauptmembran unter Verwendung eines Polyesterfilms mit adhäsivem Belag, z. B. mit Adhesive Research Inc. Adhäsivmylar, fest verbunden. Danach wurde das Segment in 5 cm breite Streifen geschnitten, und das Probenpad und das wie eine Senke geformte Pad an das beginnende bzw. terminale Ende des Streifens angeordnet. Nach Verwendung der (Vorschlag: Standard)lösungen mit bekannter Konzentration der verwendeten Droge (Morphinsulfat) konnte die Kalibrierungskurve ermittelt werden.
Eine optimale Kalibrierungskurve (1,1 ul/cm Latex) ist in Fig. 2 abgebildet. Diese Kurve und die in Fig. 3 bis 8 folgenden Kurven wurden mittels Bestimmung der kolorimetrischen Dichte der Ergebnisbanden unter Verwendung eines farbreflektierenden Dreibereichsanalysators, z. B. Minolta CR-241 Chroma Meter, erhalten.
In den Diagrammen, die in den Fig. 2 bis 8 gezeigt werden, zeigen die Vertikalachsen Werte, die mit dem Minolta CR-241 Chroma Meter gemessen wurden multipliziert mit dem Faktor 1000. Dies wird durch die Achsenbezeichnung "Minolta Messung · 1000" bezeichnet. Diese Minolta Messungen wurden von der kolorimetrischen Dichte Dx abgeleitet, die ihrerseits aus den Farbwerten X, Y, Z, bestimmt wurde, wie von der CIE festgelegt (Commission Internationale de L'Eclairage). Die Farbwerte sind von dem Yxy-Farbsystem abgeleitet worden, das die CIE 1931 begründet hatte, wobei Y den Helligkeitsfaktor und die Faktoren x und y die Koordinaten des Farbwerts darstellen. Der Farbwert X ist durch den Farbwert Y durch die Gleichung X = Y(x/y) darstellbar. Dx, die kolorimetrische Dichte von X wird abgeleitet von der Gleichung Dx = -log&sub1;&sub0; (XmIXo), wobei Xm den gemessenen Farbwert X der Ergebnisbande und Xo den gemessenen Farbwert X der Lichtquelle darstellt.
Für jeden Streifen wurde die kolorimetrische Dichte (Dx) im roten Spektralbereich an fünf Punkten der Misch- oder Ergebnisbande gemessen, wobei jeder Meßpunkt sich 1 mm entfernt vom benachbarten Meßpunkt befand. Der Hintergrundslevel der kolorimetrischen Dichte des Ergebnisbandes wurde gemessen. Die Durchschnittsmessung, die Standardabweichung und der Variationskoeffizient (% CV) wurden bestimmt.
Zum Vergleich wurde Latex direkt auf die Hauptmembran aufgebracht. Eine optimale Kalibrierungskurve (0,5 ul/cm Latex) ist in Fig. 3 abgebildet. Wurde ein Latex- Volumen, das größer als 0,5 ul/cm war, auf die Membran aufgebracht, war die Inhibierung bei der Unterbrechungskonzentration gering.
Die Einheitlichkeit der Ergebnisbande und der Kontrollbande kann ermittelt werden mittels Variation der Farbintensität der fünf Meßpunkte. Die Tabelle 1 zeigt Variationskoeffizienten (% CV) in den Intensitäten der Kontroll- und Ergebnisbanden. Tabelle 1 Variationen (% CV) in den Intensitäten der Kontroll- und Ergebnisbande

Beispiel 2

Das folgende Beispiel eines Tetrahydrokannabinoid-Assays erläutert weiterhin die Erfindung.
Nitrocellulose-Membranen wie in Beispiel 1 für die vorliegende Erfindung beschrieben wurden wie folgt hergestellt:
Es wurde ein Tetrahydrokannabinoid-BSA-Gemisch ähnlich dem Morphin-BSA-Gemisch hergestellt, allerdings in einem Verhältnis von 20 : 1 Drogenderivat zu BSA. Es wurden β-Cyclodextrin in das Probenpad eingebettet und blauer Latex mit Anti- Tetrahydrokannabinoid monoklonalen Antikörpern gekoppelt. Die Analyse der Ergebnisfarbbanden wurde wie in dem Beispiel 1 durchgeführt. Eine optimale Kalibrierungskurve von 3,0 ul/cm Latex ist in Fig. 4 abgebildet.
Die Fig. 5 und 6 zeigen optimale THC-Kurven, wenn Latex direkt auf die Hauptmembran (1 ul/cm) über ein IVEK System und ein Kompressionsflüssigkeitsdispensier- System oder -Airbrush bzw. ein Paasche Company Airbrush aufgebracht wurde.
Die Leistungsfähigkeit der Ausführungsform, bei der Latex über eine Schicht von glasiertem Fruchtzucker (35% bis 66% (w/v) Fruchtzucker in Wasser) aufgebracht wurde, wurde ebenso ermittelt. Eine optimale Kurve bei einer 60%-igen Schicht Fruchtzucker und bei 2,0 ul/cm Latex ist in Fig. 7 abgebildet. Eine andere Latexformulierung, bei der die Latex-Lösung in 1% Methylcellulose, z. B. Methocel K4MTM Methylcellulose (Dow Chemical Company), und 0,6% (w/v) PVA hergestellt wurde, wurde direkt oben auf die Fruchtzuckerschicht aufgebracht, wie in der Anmeldung EP-A-0291194 beschrieben, und gemessen (Fig. 8). Mehr als die Hälfte des Latex begann in diesem Fall nicht einmal zu wandern. Die Fruchtzuckerschicht verlangsamt die Wanderung des Latex stark, und die Wanderung ist nicht einheitlich.
Die Einheitlichkeit der Ergebnisbande und der Kontrollbande kann ermittelt werden mittels Variation der Farbintensität der fünf Meßpunkte. Die Tabelle 2 zeigt Variationskoeffizenten (% CV) in den Intensitäten der Kontroll- und Ergebnisbanden. Tabelle 2 Variationen (% CV) in den Intensitäten der Kontroll- und Ergebnisbande
Wie den Ergebnissen der zwei oben beschriebenen Beispiele zu entnehmen ist, ermöglicht die vorliegende Vorrichtung verbesserte Ergebnisse, wenn sie mit Systemen des Stands der Technik verglichen wird.

Claims

1. Vorrichtung zur Durchführung eines Bindeassays, aufweisend:

(c) ein erstes absorbierendes Material (101), auf das ein erstes Reagenz an eine erste vorbestimmte Position immobilisiert wurde; und

(d) ein zweites absorbierendes Material (106), das mit dem ersten absorbierenden Material (101) in Kontakt steht und auf dem ersten absorbierenden Material (101) angeordnet ist, und auf das ein zweites lösbares Reagenz an eine zweite vorbestimmte Position immobilisiert wurde, wobei das erste absorbierende Material (101) und das zweite absorbierende Material (106) zueinander benachbart liegen, so daß das Fließen einer Flüssigkeit durch das erste absorbierende Material (101) bewirkt, daß das zweite Reagenz vom zweiten absorbierenden Material (106) gelöst wird und durch das erste absorbierende Material (101) fließt.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei das erste absorbierende Material (101) und das zweite absorbierende Material (106) aus dem gleichen Material bestehen.

3. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei das erste absorbierende Material (101) ausgewählt wurde aus der Gruppe saugfähiger und poröser Membranen.

4. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei das zweite absorbierende Material (106) ausgewählt wurde aus der Gruppe saugfähiger und poröser Membranen.

5. Vorrichtung nach Anspruch 3, wobei das absorbierende Material (101) Nitrocellulose ist.

6. Vorrichtung nach Anspruch 4, wobei das absorbierende Material (106) Nitrocellulose ist.

7. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei das erste absorbierende Material (101) und das zweite absorbierende Material (106) über eine Halterung zueinander in Kontakt gehalten werden.

8. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei das erste absorbierende Material (101) und das zweite absorbierende Material (106) über ein Materialband (107) zueinander in Kontakt gehalten werden.

9. Vorrichtung nach Anspruch 8, wobei das Materialband (107) ein Polyesterfilm ist.

10. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei das zweite Reagenz markiert ist.

11. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei das erste absorbierende Material (101) eine Mehrzahl auf ihm immobilisierter Reagenzien aufweist.

12. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei das zweite absorbierende Material (106) eine Mehrzahl auf ihm immobilisierter Reagenzien aufweist.

13. Vorrichtung nach Anspruch 10, wobei die Markierung gefärbtes Latex ist.

14. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei das erste Reagenz und das zweite Reagenz eine Bindungsaffinität zueinander aufweisen.

15. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Sauggeschwindigkeit des ersten absorbierenden Materials (101) die gleiche oder höher ist als die Sauggeschwindigkeit des zweiten absorbierenden Materials (106).

16. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei das erste Reagenz irreversibel an das erste absorbierende Material (101) immobilisiert ist.

17. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei jeweils das erste absorbierende Material (101) und das zweite absorbierende Material (106) ebene Oberflächen aufweisen.

18. Vorrichtung nach Anspruch 17, wobei die ebene Oberfläche des ersten absorbierenden Materials (101) benachbart zur ebenen Oberfläche des zweiten absorbierenden Materials (106) ist.

19. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei jeweils das erste Reagenz und das zweite Reagenz eine Bindungsaffinität zu derselben Substanz aufweisen.

20. Verfahren zur Durchführung eines Bindeassays, umfassend:

Einbringen einer Flüssigprobe in das erste absorbierende Material (101) einer Vorrichtung nach Anspruch 1 bis 19, um einen ersten Flüssigkeitsstrom innerhalb des ersten absorbierenden Materials (101) zu generieren,

wobei sich der erste Flüssigkeitsstrom in zwei Ströme aufteilt, sobald er das zweite absorbierende Material (106) erreicht,

wobei die Flüssigkeit von dem ersten absorbierenden Material (101) in das zweite absorbierende Material (106) eingebracht wird, um einen zweiten Flüssigkeitsstrom innerhalb des zweiten absorbierenden Materials (106) zu generieren, wobei der erste Flüssigkeitsstrom innerhalb des ersten absorbierenden Materials (101) verbleibt, und

wobei das zweite Reagenz in den zweiten Flüssigkeitsstrom innerhalb des zweiten absorbierenden Materials (106) mobilisiert wird,

wobei der zweite Flüssigkeitsstrom nach Mobilisierung des zweiten Reagenz im wesentlichen generell parallel zum ersten Flüssigkeitsstrom innerhalb des ersten absorbierenden Materials (101) verläuft, und

Einbringen des zweiten Flüssigkeitsstroms und des zweiten Reagenzes von dem zweiten absorbierenden Material (106) in das erste absorbierende Material (101), um sie mit dem ersten Flüssigkeitsstrom innerhalb des ersten absorbierenden Materials (101) zu vereinigen.

21. Verfahren nach Anspruch 20, wobei der erste Flüssigkeitsstrom innerhalb des ersten absorbierenden Materials (101) mit gleicher oder höherer Geschwindigkeit fließt als der zweite Flüssigkeitsstrom innerhalb des zweiten absorbierenden Materials (106).