JP6026595B2 - ＨｂＡ１ｃの免疫学的測定方法 - Google Patents
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Description
本発明は、簡便かつ正確なＨｂＡ１ｃの免疫学的測定方法及び測定試薬に関する。
血中のヘモグロビンに糖が結合した糖化ヘモグロビン（グリコヘモグロビン）、特にヘモグロビンβ鎖のＮ末端バリン残基が糖化されたヘモグロビンＡ１ｃ（以下、「ＨｂＡ１ｃ」ということがある）は、その値が過去１〜２ヶ月の平均血糖値を反映することから、糖尿病の診断や糖尿病の経過観察に適した指標として広く使用されている。
ＨｂＡ１ｃの測定方法としては、ＨＰＬＣ法、キャピラリー電気泳動法、酵素法及び免疫学的測定法等が知られている。免疫学的測定法においては、ＨｂＡ１ｃの糖化されている部位（ヘモグロビンβ鎖Ｎ末端）に特異的な抗体を用いてＨｂＡ１ｃを測定するが、当該糖化部位はヘモグロビンタンパク質の表面に存在するのではなく、ヘモグロビンタンパク質の内部に埋もれており、生理的な条件下では抗体が結合し難い場所に存在することが判明している。このような性状より、当該糖化部位をエピトープとして認識する抗体を効率良く反応させて測定を行うために、当該エピトープをヘモグロビンタンパク質の表面に露出させる技術が以前より開発されている（特許文献１）。
当該エピトープをヘモグロビンタンパク質表面に露出させる手段としては、ヘモグロビンβ鎖Ｎ末端をタンパク質表面に露出させる成分（以下「Ｎ末端露出剤」ということがある）を使用してヘモグロビンを処理する方法やヘモグロビンをラテックス粒子に吸着させてヘモグロビンを処理する方法が報告されている。Ｎ末端露出剤を使用する露出方法としては、グアニジン、チオシアン酸、あるいはチオシアン酸リチウム塩をそれぞれ単独で糖化ヘモグロビン含有試料と混合して露出させる方法や、チオシアン酸とフェリシアニド等の酸化剤の組み合せ、グアニジンと非イオン性界面活性剤及び／又は亜硝酸塩との組み合せ、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤等を使用して露出させる方法（特許文献１〜７）が知られている。
しかしながら、これら従来のＮ末端露出剤を使用して糖化部位エピトープを露出させる処理方法に関しては、以下のような課題があった。例えば特許文献１に記載のグアニジンを使用してＮ末端を露出させる方法は加熱が必要で操作が煩雑であったり、特許文献２及び特許文献３に記載のチオシアン酸は環境上有害な物質であったり、フェリシアニド等の酸化剤は着色しやすく保存安定性に欠ける等の問題があった。また、本発明者らの検討により、先行技術文献に記載されたＮ末端露出剤（カオトロピック剤、還元剤、有機溶媒や界面活性剤）の中には、文献中に記載された条件で用いても十分なエピトープの露出効果が得られないものも存在することが明らかになった。このような場合に、十分なエピトープの露出効果を得ようとしてＮ末端露出剤を高濃度に使用すると免疫学的測定の前に希釈が必要となって操作が煩雑になる。また、エピトープの露出効果が十分であっても抗原抗体反応を阻害するため、免疫学的測定に使用できないＮ末端露出剤が含まれることも明らかになった。さらに本発明者らは、Ｎ末端露出剤として界面活性剤を用いてエピトープを露出させる処理をした後の測定試料（以下、「検体」あるいは「血液試料」ということがある）を、金コロイド粒子や着色ラテックス粒子を検出用の標識物質として使用するイムノクロマトグラフ法（以下、「粒子イムノクロマト法」ということがある）による測定系に適用した場合、使用するＮ末端露出剤の種類によっては粒子で標識された抗体（以下、「粒子標識抗体」ということがある）どうしが凝集してメンブレン上を展開せず、正確な測定ができないという新たな課題を見出した。この粒子標識抗体の凝集は、さまざまな界面活性剤で観察され、界面活性剤の性質や化学構造等の属性のみからは予測や回避することが困難なものであった。従って、本発明の課題は、新規なＨｂＡ１ｃの免疫学的測定方法、具体的には、簡便な測定系である粒子イムノクロマト法に適用可能な、ＨｂＡ１ｃの糖化部位（ヘモグロビンβ鎖Ｎ末端）の露出処理及び当該処理方法を使用するＨｂＡ１ｃの免疫学的測定方法を提供することにある。
本発明者らは、ＨｂＡ１ｃの糖化部位を効率的かつ簡便に露出させることができ、かつ、抗ＨｂＡ１ｃ抗体とＨｂＡ１ｃとの抗原抗体反応を阻害しないＮ末端露出剤を再検討し、両者を同時に達成することができるＮ末端露出剤を得ることができた。しかし、それらのＮ末端露出剤においても粒子標識抗体どうしが凝集して正確に測定できないという課題が残ったことから、さらに検討を重ねた。その結果、Ｎ末端露出剤で処理した血液試料を、水不溶性の状態にある環状多糖類と接触させた後に粒子標識抗体と反応させたところ、当該粒子標識抗体どうしが凝集することなく、メンブラン上を良好に展開し、前記課題を解決できることを見出した。すなわち本発明者らは、糖化部位が検出可能な程度に十分に露出され、抗原抗体反応も阻害せず、さらに粒子標識抗体どうしの凝集もなく、粒子イムノクロマト法によりＨｂＡ１ｃを簡便かつ正確に測定できる方法を見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、以下に関するものである。
［１］ 次の工程（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）を含むＨｂＡ１ｃのイムノクロマト測定方法。
（Ａ）赤血球を含有する測定試料を、ヘモグロビンβ鎖のＮ末端をタンパク質表面に露出させる性質を有する界面活性剤で処理する工程
（Ｂ）工程（Ａ）で得られた測定試料を、水不溶性の状態にある環状多糖類と接触させる工程
（Ｃ）工程（Ｂ）で得られた測定試料を、粒子で標識されたヘモグロビンのＮ末端を認識する抗体あるいは粒子で標識されたヘモグロビンのＮ末端以外を認識する抗体のいずれかと接触させる工程
（Ｄ）工程（Ｃ）において形成された、粒子で標識されたヘモグロビンのＮ末端を認識する抗体及び／又は粒子で標識されたヘモグロビンのＮ末端以外を認識する抗体と、ＨｂＡ１ｃとの免疫複合物を検出する工程
［２］ 環状多糖類が、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、ヒドロキシアルキル化（α，β又はγ）シクロデキストリン、スルホアルキル化（α，β又はγ）シクロデキストリン、モノクロロトリアジニル（α，β又はγ）シクロデキストリン、クラスターシクロデキストリン、修飾クラスターシクロデキストリン及びシクロアミロースからなる群より選択される、［１］のイムノクロマト測定方法。
［３］ ヘモグロビンβ鎖のＮ末端をタンパク質表面に露出させる性質を有する界面活性剤が、スクロースモノラウレート、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤及び両性界面活性剤からなる群より選択される、［１］のイムノクロマト測定方法。
［４］ 粒子が、金コロイド粒子又はラテックス粒子である、［１］のイムノクロマト測定方法。
［５］ 水不溶性の状態にある環状多糖類が、固相に化学結合されたものであるか、又は環状多糖類の水不溶性ポリマーである、［１］のイムノクロマト測定方法。
［６］ 固相が、イムノクロマト用テストストリップにおけるサンプルパッドである、［１］のイムノクロマト測定方法。
［７］ 環状多糖類を水不溶性の状態で含有しているサンプルパッド又は環状多糖類の水不溶性ポリマーを具備することを特徴とする、ＨｂＡ１ｃのイムノクロマト測定用のテストストリップ。
［１］ 次の工程（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）を含むＨｂＡ１ｃのイムノクロマト測定方法。
（Ａ）赤血球を含有する測定試料を、ヘモグロビンβ鎖のＮ末端をタンパク質表面に露出させる性質を有する界面活性剤で処理する工程
（Ｂ）工程（Ａ）で得られた測定試料を、水不溶性の状態にある環状多糖類と接触させる工程
（Ｃ）工程（Ｂ）で得られた測定試料を、粒子で標識されたヘモグロビンのＮ末端を認識する抗体あるいは粒子で標識されたヘモグロビンのＮ末端以外を認識する抗体のいずれかと接触させる工程
（Ｄ）工程（Ｃ）において形成された、粒子で標識されたヘモグロビンのＮ末端を認識する抗体及び／又は粒子で標識されたヘモグロビンのＮ末端以外を認識する抗体と、ＨｂＡ１ｃとの免疫複合物を検出する工程
［２］ 環状多糖類が、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、ヒドロキシアルキル化（α，β又はγ）シクロデキストリン、スルホアルキル化（α，β又はγ）シクロデキストリン、モノクロロトリアジニル（α，β又はγ）シクロデキストリン、クラスターシクロデキストリン、修飾クラスターシクロデキストリン及びシクロアミロースからなる群より選択される、［１］のイムノクロマト測定方法。
［３］ ヘモグロビンβ鎖のＮ末端をタンパク質表面に露出させる性質を有する界面活性剤が、スクロースモノラウレート、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤及び両性界面活性剤からなる群より選択される、［１］のイムノクロマト測定方法。
［４］ 粒子が、金コロイド粒子又はラテックス粒子である、［１］のイムノクロマト測定方法。
［５］ 水不溶性の状態にある環状多糖類が、固相に化学結合されたものであるか、又は環状多糖類の水不溶性ポリマーである、［１］のイムノクロマト測定方法。
［６］ 固相が、イムノクロマト用テストストリップにおけるサンプルパッドである、［１］のイムノクロマト測定方法。
［７］ 環状多糖類を水不溶性の状態で含有しているサンプルパッド又は環状多糖類の水不溶性ポリマーを具備することを特徴とする、ＨｂＡ１ｃのイムノクロマト測定用のテストストリップ。
本発明の免疫学的測定方法によれば、短時間の簡便な処理により血液試料中のＨｂＡ１ｃ中の糖化部分を効率的に露出させることができ、抗原抗体反応の阻害もなく、粒子標識抗体により検出する免疫学的測定法によってＨｂＡ１ｃを正確に測定することができる。すなわち本発明によれば、Ｎ末端露出剤でＨｂＡ１ｃの糖化部位を露出させた試料を測定前に希釈する操作が不要であり、界面活性剤の化学構造等の属性のみからは予測できない様々な要因によって起きる粒子標識抗体どうしの凝集を改善することが可能になる。
本発明に用いる試料は、ＨｂＡ１ｃ測定用の被検試料であり、血液試料、例えば血液、赤血球画分等が挙げられる。また、本発明の測定対象は、血中のＨｂＡ１ｃである。
本発明のＨｂＡ１ｃの免疫学的測定方法は、
（Ａ）赤血球を含有する測定試料を、ヘモグロビンβ鎖のＮ末端をタンパク質表面に露出させる性質を有する界面活性剤で処理する工程
（Ｂ）工程（Ａ）で得られた測定試料を、水不溶性の状態にある環状多糖類と接触させる工程
（Ｃ）工程（Ｂ）で得られた測定試料を、粒子で標識されたヘモグロビンのＮ末端を認識する抗体あるいは粒子で標識されたヘモグロビンのＮ末端以外を認識する抗体のいずれかと接触させる工程
（Ｄ）工程（Ｃ）において形成された、粒子で標識されたヘモグロビンのＮ末端を認識する抗体及び／又は粒子で標識されたヘモグロビンのＮ末端以外を認識する抗体と、ＨｂＡ１ｃとの免疫複合物を検出する工程
を含む。
（Ａ）赤血球を含有する測定試料を、ヘモグロビンβ鎖のＮ末端をタンパク質表面に露出させる性質を有する界面活性剤で処理する工程
（Ｂ）工程（Ａ）で得られた測定試料を、水不溶性の状態にある環状多糖類と接触させる工程
（Ｃ）工程（Ｂ）で得られた測定試料を、粒子で標識されたヘモグロビンのＮ末端を認識する抗体あるいは粒子で標識されたヘモグロビンのＮ末端以外を認識する抗体のいずれかと接触させる工程
（Ｄ）工程（Ｃ）において形成された、粒子で標識されたヘモグロビンのＮ末端を認識する抗体及び／又は粒子で標識されたヘモグロビンのＮ末端以外を認識する抗体と、ＨｂＡ１ｃとの免疫複合物を検出する工程
を含む。
工程（Ａ）は、Ｎ末端露出剤により、ＨｂＡ１ｃ中のエピトープを露出させる工程である。工程（Ａ）により露出されるエピトープは、例えばヘモグロビンβ鎖の糖化されたＮ末端領域であり、より好ましくはヘモグロビンβ鎖のＮ末端バリンが糖化されたペプチドを含む領域である。
工程（Ａ）に用いられるＮ末端露出剤としては、非イオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、両性界面活性剤から上述のヘモグロビンβ鎖の糖化されたＮ末端領域を検出可能な程度に十分に露出させることができ、かつヘモグロビンのＮ末端を認識する抗体あるいはヘモグロビンのＮ末端以外を認識する抗体とＨｂＡ１ｃとの抗原抗体反応を阻害しないことを限度として適宜選択可能である。これらのＮ末端露出剤は、単独で用いても良いし、２種類以上を組み合わせて用いても良い。
非イオン性界面活性剤としては、スクロースモノラウレートが挙げられる。
アニオン性界面活性剤としては、胆汁酸塩を除くアニオン性界面活性剤が使用可能であり、ラウリル硫酸ナトリウム等のアルキル硫酸塩、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム等のポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム等のアルキルベンゼンスルホン酸塩、ラウロイルメチルアラニン、Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム塩等のアシルアミノ酸塩、ジアルキルスルホコハク酸ナトリウム、βナフタレンスルホン酸ホルマリン縮合物ナトリウム塩、特殊ポリカルボン酸型高分子界面活性剤が挙げられる。ここで前記胆汁酸塩は、例えば、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム等をいう。
カチオン性界面活性剤としては、高級アルキルアミン類及び第４級アンモニウム塩が挙げられるが、エピトープ露出効果の点で第４級アンモニウム塩が好ましい。第４級アンモニウム塩としては、モノ長鎖アルキルトリメチルアンモニウム塩、ジ長鎖アルキルジメチルアンモニウム塩、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、塩化セチルピリジニウム、塩化デカリニウム等が挙げられる。このうち、モノ長鎖アルキルトリメチルアンモニウム塩としては、塩化Ｃ8−Ｃ22アルキルトリメチルアンモニウム、臭化Ｃ8−Ｃ22アルキルトリメチルアンモニウム等が挙げられる。ジ長鎖アルキルジメチルアンモニウム塩としては、塩化ジ（Ｃ8−Ｃ22アルキル）ジメチルアンモニウム、臭化ジ（Ｃ8−Ｃ22アルキル）ジメチルアンモニウム等が挙げられる。より好ましい第４級アンモニウム塩の具体例としては、塩化ドデシルトリメチルアンモニウム、塩化テトラデシルトリメチルアンモニウム、塩化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、塩化オクタデシルトリメチルアンモニウム、臭化ドデシルトリメチルアンモニウム、臭化テトラデシルトリメチルアンモニウム、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、臭化オクタデシルトリメチルアンモニウム、塩化ジ（ドデシル）ジメチルアンモニウム、塩化ジ（テトラデシル）ジメチルアンモニウム、塩化ジ（ヘキサデシル）ジメチルアンモニウム、塩化ジ（オクタデシル）ジメチルアンモニウム、臭化ジ（ドデシル）ジメチルアンモニウム、臭化ジ（テトラデシル）ジメチルアンモニウム、臭化ジ（ヘキサデシル）ジメチルアンモニウム、臭化ジ（オクタデシル）ジメチルアンモニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、塩化セチルピリジニウム、塩化デカリニウムが挙げられる。
両性界面活性剤としては、胆汁酸誘導体を除く両性界面活性剤が使用可能であるが、特にベタイン構造を持つものが好適に使用可能である。ベタイン構造を持つ両性界面活性剤としては、スルホベタイン１２〜１６、ラウリルベタイン、２−アルキル−２−カルボキシメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルイミダゾリウムベタイン、ラウリルジメチルアミンオキサイド、ラウリン酸アミドプロピルジメチルアミノ酢酸ベタインが挙げられる。ここで胆汁酸誘導体とは、例えば、３−［（３−コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ］プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシプロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳＯ）等、胆汁酸由来のアシル基が形成するアミド結合を介してスルホベタイン等の両性イオン基と結合している化合物をいう。
非イオン性界面活性剤としては、スクロースモノラウレートが挙げられる。
アニオン性界面活性剤としては、胆汁酸塩を除くアニオン性界面活性剤が使用可能であり、ラウリル硫酸ナトリウム等のアルキル硫酸塩、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム等のポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム等のアルキルベンゼンスルホン酸塩、ラウロイルメチルアラニン、Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム塩等のアシルアミノ酸塩、ジアルキルスルホコハク酸ナトリウム、βナフタレンスルホン酸ホルマリン縮合物ナトリウム塩、特殊ポリカルボン酸型高分子界面活性剤が挙げられる。ここで前記胆汁酸塩は、例えば、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム等をいう。
カチオン性界面活性剤としては、高級アルキルアミン類及び第４級アンモニウム塩が挙げられるが、エピトープ露出効果の点で第４級アンモニウム塩が好ましい。第４級アンモニウム塩としては、モノ長鎖アルキルトリメチルアンモニウム塩、ジ長鎖アルキルジメチルアンモニウム塩、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、塩化セチルピリジニウム、塩化デカリニウム等が挙げられる。このうち、モノ長鎖アルキルトリメチルアンモニウム塩としては、塩化Ｃ8−Ｃ22アルキルトリメチルアンモニウム、臭化Ｃ8−Ｃ22アルキルトリメチルアンモニウム等が挙げられる。ジ長鎖アルキルジメチルアンモニウム塩としては、塩化ジ（Ｃ8−Ｃ22アルキル）ジメチルアンモニウム、臭化ジ（Ｃ8−Ｃ22アルキル）ジメチルアンモニウム等が挙げられる。より好ましい第４級アンモニウム塩の具体例としては、塩化ドデシルトリメチルアンモニウム、塩化テトラデシルトリメチルアンモニウム、塩化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、塩化オクタデシルトリメチルアンモニウム、臭化ドデシルトリメチルアンモニウム、臭化テトラデシルトリメチルアンモニウム、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、臭化オクタデシルトリメチルアンモニウム、塩化ジ（ドデシル）ジメチルアンモニウム、塩化ジ（テトラデシル）ジメチルアンモニウム、塩化ジ（ヘキサデシル）ジメチルアンモニウム、塩化ジ（オクタデシル）ジメチルアンモニウム、臭化ジ（ドデシル）ジメチルアンモニウム、臭化ジ（テトラデシル）ジメチルアンモニウム、臭化ジ（ヘキサデシル）ジメチルアンモニウム、臭化ジ（オクタデシル）ジメチルアンモニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、塩化セチルピリジニウム、塩化デカリニウムが挙げられる。
両性界面活性剤としては、胆汁酸誘導体を除く両性界面活性剤が使用可能であるが、特にベタイン構造を持つものが好適に使用可能である。ベタイン構造を持つ両性界面活性剤としては、スルホベタイン１２〜１６、ラウリルベタイン、２−アルキル−２−カルボキシメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルイミダゾリウムベタイン、ラウリルジメチルアミンオキサイド、ラウリン酸アミドプロピルジメチルアミノ酢酸ベタインが挙げられる。ここで胆汁酸誘導体とは、例えば、３−［（３−コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ］プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシプロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳＯ）等、胆汁酸由来のアシル基が形成するアミド結合を介してスルホベタイン等の両性イオン基と結合している化合物をいう。
Ｎ末端露出剤は、これを含有する水溶液（以下、「検体前処理液」ということがある）として使用するのが好ましい。エピトープ露出効果の点及び抗体の抗原抗体反応性維持の点から、Ｎ末端露出剤含有検体前処理液中のＮ末端露出剤の濃度は、０．０１〜１０質量％（以下、単に％で示す）が好ましく、さらに０．０５〜５％がより好ましく、０．１〜３％が特に好ましい。検体前処理液は、チューブ等に分注して使用することはもちろん、別の態様として、メンブレン等に含浸・乾燥させて、イムノクロマトデバイスの一部にパッドとして組み込んで使用することも可能である。当該パッドは、後述するサンプルパッド、粒子標識抗体含有パッドよりも先に検体液と接触するよう配置される必要がある。
検体前処理液には溶血剤が添加されていてよいが、Ｎ末端露出剤が溶血剤の役割を兼ねていてもよい。検体前処理液は適宜、アジ化ナトリウムのような防腐剤、ＥＤＴＡのようなキレート剤、ＮａＣｌやＭｇＣｌ2のような金属イオンを含んでいてもよいし、引き続くイムノクロマト測定時の非特異反応抑制を目的としてＢＳＡやカゼイン等のタンパク質等を含んでいても良い。また、検体前処理液は、イムノクロマト測定時のメンブラン上での測定試料や粒子標識抗体の展開を良好にする目的で、界面活性剤を含んでいてもよく、当該界面活性剤のＮ末端露出能は問わない。当該界面活性剤は、非イオン性界面活性剤でも良い。
また当該検体前処理液のｐＨは、４．０〜９．０、さらに５．０〜９．０、さらに６．０〜８．０が好ましい。これらのｐＨに調整するには、適宜緩衝剤を添加してもよい。緩衝剤としては、クエン酸、フタル酸、酢酸、コハク酸、カコジル酸、マレイン酸、イミダゾール、コリジン、リン酸、Ｊｏｈｎｓｏｎ−Ｌｉｎｄｓａｙ等のユニバーサル緩衝剤、２−モルホリノエタンスルホン酸（以下、「ＭＥＳ」という）、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（以下、「Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ」という）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（以下、「ＰＩＰＥＳ」という）等のグッド緩衝剤が用いられる。
前記検体前処理液を用いて赤血球を含有する測定試料を処理するには、血液試料溶液に検体前処理液を添加し、攪拌すればよい。温度は、１℃〜５０℃、さらに１０℃〜４０℃、さらに１５℃〜２５℃が好ましい。処理時間は１０秒間〜３０分間、さらに３０秒間から５分間が好ましい。
血液試料中の糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）は、前記処理（工程（Ａ））により、糖化部位が効率良くヘモグロビンタンパク質表面に露出される。
次に、本発明においては、前記試料を水不溶性の状態にある環状多糖類と接触させる（工程（Ｂ））。工程（Ｂ）は、検体前処理液で処理された測定試料が検出用の粒子標識抗体と接触する前に行う必要がある。
工程（Ｂ）に用いられる環状多糖類には、環状オリゴ糖および環状多糖が含まれる。環状オリゴ糖としては、シクロデキストリン又は修飾シクロデキストリンが好ましい。より具体的にはα−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、ヒドロキシアルキル化（α，β又はγ）シクロデキストリン、スルホアルキル化（α，β又はγ）シクロデキストリン、モノクロロトリアジニル（α，β又はγ）シクロデキストリン（モノクロロトリアジニル基は、「ＭＣＴ」と略記されることがある）等が挙げられる。環状多糖としては、クラスターシクロデキストリン、修飾クラスターシクロデキストリン、シクロアミロース等が挙げられる。このうち、シクロデキストリン又は修飾シクロデキストリンが好ましい。
前記の環状多糖類は、水不溶性の状態で使用する。水不溶性の状態にあるとは、当該環状多糖類が水と接触した際に、環状多糖類を構成している環状オリゴ糖分子または環状多糖分子が水に溶解して拡散しない状態をいう。水不溶性の状態の具体例としては、例えば、通常イムノクロマト法において使用されるメンブレン等に環状多糖類が化学結合により固定化されている状態や、環状多糖類そのものがポリマーを形成している状態、多孔性の樹脂に練りこまれている状態等が挙げられる。当該メンブレンやポリマーは、例えば、イムノクロマト法においてデバイスの一部分を構成するパッド等として使用することが可能である。例えば、図１のサンプルパッド（ｂ）の繊維に化学結合させたり、サンプルパッド（ｂ）の上部または下部に接触するようシート状に加工した環状多糖類のポリマーを貼付したりすることができる。本発明においては、前記した環状多糖類を水不溶性の状態で含有しているサンプルパッド又は環状多糖類の水不溶性ポリマーを具備することを特徴とする、ＨｂＡ１ｃのイムノクロマト測定用のテストストリップも提供される。
環状多糖類を、化学的に固相に結合させる方法としては、例えば、綿布を、反応基を導入したシクロデキストリン（ＭＣＴ−β−ＣＤ）水溶液に浸漬し、風乾・熱処理する方法（松田ら、広島県立東部工業技術センター研究報告 Ｎｏ．１９ ｐ．１５−１９、図１（２００６））を応用することができるほか、架橋剤を介する方法、シクロデキストリンプレポリマーを紫外線で化学結合する方法、イソシアネートを用いて化学結合する方法等、定法によって作製することができる。また、環状オリゴ糖及び環状多糖のポリマーは、市販されているもの（例えば、α-シクロデキストリンポリマー（コードＮｏ．０３７−２１６１１）β-シクロデキストリンポリマー（コードＮｏ．０３４−２１６２１）、γ-シクロデキストリンポリマー（コードＮｏ．０３１−２１６３１）、いずれも和光純薬社）を使用することができる。
環状多糖類の使用濃度（使用量）は、正確なＨｂＡ１ｃ測定結果を得る点から、測定試料反応液中のＮ末端露出剤（界面活性剤）の物質量に対して１〜２０倍存在していることが好ましく、さらに１〜１０倍が好ましく、特に１〜５倍が好ましい。メンブレン等に環状多糖類を化学結合させた場合の環状多糖類のメンブレンへの結合量は、例えば、“Textile Finishing with MCT-β-Cyclodextrin (Acabado textil con MCT-β-ciclodextrina)” と題されたJ.P. Moldenhauer，H．Reuscherの文献(http://revistavirtualpro.com/files/TIE09_200704.pdf)を参照して算出することができる。また、環状多糖類のポリマー（シート状やビーズ状）を使用する際には、測定試料中のＮ末端露出剤の物質量を考慮し、シート状である環状多糖類のポリマーを使用する場合には、好適なシートの厚さや面積等を、ビーズ状である環状多糖類のポリマーを使用する場合には、好適な粒子数等を、計算あるいは実験的に求め使用する。
測定試料と環状多糖類とを接触させる際の温度は、特に制限されず、１℃〜５０℃、さらに１℃〜３０℃、さらに１５℃〜２５℃の温度が好ましい。試料と環状オリゴ糖又は環状多糖の接触時間は特に限定されず、３０分間以内、特に５分間以内が好ましい。環状多糖類が化学結合しているメンブレン等を試料が数秒程度の極めて短時間で通過する場合であっても、効果は十分に得られる。
本発明における工程（Ｃ）は、工程（Ｂ）で得られた測定試料を、粒子で標識されたヘモグロビンのＮ末端を認識する抗体あるいは粒子で標識されたヘモグロビンのＮ末端以外を認識する抗体のいずれかと接触させる工程であり、工程（Ｄ）は、工程（Ｃ）において形成された、粒子で標識されたヘモグロビンのＮ末端を認識する抗体及び／又は粒子で標識されたヘモグロビンのＮ末端以外を認識する抗体と、ＨｂＡ１ｃとの免疫複合物を検出工程である。これらの工程（Ｃ）及び工程（Ｄ）は、通常のイムノクロマト測定方法と同様にして行なわれる。
イムノクロマト法で測定する場合には、ＨｂＡ１ｃ濃度（％）が既知の血液成分を標準品として、次のような方法でＨｂＡ１ｃを定量できる。図１を用いて説明する。まず、本発明の工程（Ａ）で処理した測定試料液をサンプルパッド(ｂ）に滴下する。滴下された測定試料液は、毛細管現象により、検出用の粒子標識抗ヘモグロビン抗体を担持した粒子標識抗体含有パッド（ｃ）に引き込まれ、当該パッドを通過する間に、測定試料中のヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ、ＨｂＡ０、ＨｂＦ、ＨｂＳ等）が、粒子標識抗体と抗原抗体反応することで、複合体を形成する。当該複合体は、抗ＨｂＡ１ｃ抗体をライン状に塗布（固定化）した抗体固定化メンブレン (ｄ)上を展開し、抗ＨｂＡ１ｃ抗体塗布部（ｅ）に到達すると当該塗布部において測定試料中のＨｂＡ１ｃと抗原抗体反応してＨｂＡ１ｃを捕捉する。その他のヘモグロビンは捕捉されずに吸水パッド (ｆ)まで移動する。ＨｂＡ１ｃを捕捉したラインの標識粒子に由来する色の濃さ、反射強度、又は吸光度等をイムノクロマトリーダーで測定すれば、試料中のＨｂＡ１ｃが定量できる。
なお、抗ヘモグロビン抗体に対するＨｂＡ１ｃとその他のヘモグロビン（ＨｂＡ０、ＨｂＦ、ＨｂＳ等）の結合比率は、検体中の比率と同じであるので、抗体固定化メンブレンに抗ＨｂＡ１ｃ抗体が十分量固定化されている場合、抗ＨｂＡ１ｃ抗体に捕捉されているＨｂＡ１ｃに結合した検出用粒子量は、検体中のＨｂＡ１ｃ比率を反映するので、上述の定量結果から試料中のＨｂＡ１ｃ（％）を求めることができる。
なお、抗ヘモグロビン抗体に対するＨｂＡ１ｃとその他のヘモグロビン（ＨｂＡ０、ＨｂＦ、ＨｂＳ等）の結合比率は、検体中の比率と同じであるので、抗体固定化メンブレンに抗ＨｂＡ１ｃ抗体が十分量固定化されている場合、抗ＨｂＡ１ｃ抗体に捕捉されているＨｂＡ１ｃに結合した検出用粒子量は、検体中のＨｂＡ１ｃ比率を反映するので、上述の定量結果から試料中のＨｂＡ１ｃ（％）を求めることができる。
当該抗体固定化メンブレンに固定化されている抗体は、抗ＨｂＡ１ｃ抗体単独でも良いし、ＨｂＡ１ｃ測定に影響を与えない前記抗ＨｂＡ１ｃ抗体とは別の抗体がＨｂＡ１ｃラインと独立して固定化されていてもよい。例えば、ヒト生体中に存在しない物質を粒子で標識して粒子標識抗体含有パッド（ｃ）に添加し、当該物質を認識する抗体を抗ＨｂＡ１ｃ抗体と独立に塗布した場合、展開によって生じる当該物質のラインは、コントロールラインとして用いることができる。コントロールラインの強度は、個々の測定の妥当性を担保するものとして使用することができ、またＨｂＡ１ｃライン強度を必要に応じて補正するために使用することもできる。
さらに、イムノクロマト法で測定する場合には、ヘモグロビンのβ鎖Ｎ末端が修飾されていないＨｂＡ１ｃとヘモグロビンＡ０（以下、「ＨｂＡ０」という）とを同時に測定することができる。このとき、ともに濃度（μＭ）が既知のＨｂＡ１ｃとＨｂＡ０を含む血液成分を標準品として用いる。以下、図３を用いて説明する。まず、抗ＨｂＡ１ｃ抗体及び抗ＨｂＡ０抗体とをそれぞれ別の部位（抗ＨｂＡ１ｃ抗体塗布部（ｅ）及び抗ＨｂＡ０抗体塗布部(ｆ））に固定化した抗体固定化メンブレン（ｄ）を用いる。本発明の工程（Ａ）で処理した検体液をサンプルパッド（ａ）に滴下する。滴下された検体液は、毛細管現象により抗体固定化メンブレン（ｄ）を展開され、抗ＨｂＡ１ｃ抗体塗布部（ｅ）に到達すると試料中のＨｂＡ１ｃのみが反応し、抗ＨｂＡ０抗体塗布部(ｆ）に到達すると試料中のＨｂＡ０のみが反応する。その他のヘモグロビンは反応せずに吸水パッド（ｈ）まで移動する。両抗体塗布部の色の濃さ、反射強度、又は吸光度等をイムノクロマトリーダーで測定すれば、試料中のＨｂＡ０及びＨｂＡ１ｃがそれぞれ定量できる。ここで、ＨｂＡ０の定量値をＡ、ＨｂＡ１ｃの定量値をＢとすると、ＨｂＡ１ｃ（％）＝（Ｂ／（Ａ＋Ｂ））×１００として、ＨｂＡ１ｃ（％）を求めることも出来る。
ここで抗ＨｂＡ１ｃ抗体としては、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよく、例えば特許文献（特許文献１、特開平６−６６７９６号公報）記載のもの等が使用可能である。
本発明のイムノクロマト法に使用される検出標識は、免疫学的測定試薬として使用され得る微小粒子であり、金属コロイド粒子又はラテックス粒子が好ましい。金属コロイド粒子としては、例えば、金コロイド粒子、銀コロイド粒子、白金コロイド粒子、酸化鉄コロイド粒子、水酸化アルミニウムコロイド粒子等が挙げられ、特に、金コロイド粒子を好適に使用することができる。これらの金属コロイド粒子の平均粒径は１〜５００ｎｍ、特に強い色調が得られる１０ｎｍ〜１５０ｎｍ、より好ましくは２０〜１００ｎｍの範囲内であることがさらに好ましい。金属コロイド粒子として、例えば金コロイド粒子を用いる場合には、常法、例えば塩化金酸をクエン酸ナトリウムで還元する方法により金コロイド粒子を調製することができるし、市販のものを用いてもよい。
ラテックス粒子としては、免疫学的測定試薬として一般的に用いられているラテックス粒子であれば特に制限されず、適宜色素で着色されていてよい。ラテックス粒子は、種々のモノマーを重合又は共重合させることによって得ることができる。ここにモノマーとしては、例えばスチレン、クロルスチレン、α−メチルスチレン、ジビニルベンゼン、ビニルトルエン等の重合性不飽和芳香族類、例えば（メタ）アクリル酸、イタコン酸、マレイン酸、フマール酸等の重合性不飽和カルボン酸類、例えば（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸−ｎ−ブチル、（メタ）アクリル酸−２−ヒドロキシエチル、（メタ）アクリル酸グリシジル、エチレングリコール−ジ−（メタ）アクリル酸エステル、（メタ）アクリル酸トリブロモフェニル等の重合性不飽和カルボン酸エステル類、（メタ）アクリロニトリル、（メタ）アクロレイン、（メタ）アクリルアミド、Ｎ−メチロール−（メタ）アクリルアミド、メチレンビス（メタ）アクリルアミド、ブタジエン、イソプレン、酢酸ビニル、ビニルピリジン、Ｎ −ビニルピロリドン、塩化ビニル、塩化ビニリデン、臭化ビニル等の不飽和カルボン酸アミド類、重合性不飽和ニトリル類、ハロゲン化ビニル類、共役ジエン類等を挙げることができる。これらのモノマーは、標識物質として要求される表面特性、比重等によって適宜選択され、１種を単独で又は２種以上を混合して使用することができる。
ラテックス粒子の形状は特に制限されないが、その平均粒子径は、ラテックス粒子表面のタンパク質と測定対象物質との凝集反応の結果生じる凝集体が肉眼又は光学的に検出できるに充分な大きさが望ましい。好ましい平均粒子径としては０．０２〜１．６μｍであり、特に０．０３〜０．５μｍが好ましい。
ラテックス粒子に抗ＨｂＡ１ｃ抗体を感作する方法は、特に制限されず、公知の方法が使用できる。例えば、ラテックス粒子表面に物理的に吸着させる方法、官能基を有するラテックス粒子表面に共有結合させる方法、及び免疫学的結合によって感作する方法等が挙げられる。
イムノクロマト法において、工程（Ｂ）は、サンプルパッド上で行うのが好ましい。すなわち、サンプルパッドに環状オリゴ糖又は環状多糖を固定化して、工程（Ａ）を行った測定試料液を当該サンプルパッド上に滴下すれば、当該サンプルパッド上で工程（Ｂ）が行われる。工程（Ｂ）が行われた測定試料液は毛細管現象により、次の免疫反応の場に移動することになる。粒子標識抗体を含む「粒子標識抗体含有パッド」は、当該サンプルパッドよりも後に検体液と接触するよう配置して使用する。
次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。
参考例１：抗ヘモグロビン抗体及び抗ＨｂＡ１ｃ抗体の調製
（Ｉ）材料と方法
（１）精製ＨｂＡ０及び精製ＨｂＡ１ｃの調製
ＨｂＡ０及びＨｂＡ１ｃは、非特許文献（Ｍｅｌｉｓｅｎｄａ Ｊ．ＭｃＤｏｎａｌｄ ｅｔ ａｌ、ＪＢＣ、２５３（７）、２３２７−２３３２、１９７８）記載のＢｉｏ−Ｒｅｘ７０（バイオラッド社）を用いるイオン交換クロマトグラフィーにより、ヒト赤血球溶血液から精製し、以降の実験に用いた。
（Ｉ）材料と方法
（１）精製ＨｂＡ０及び精製ＨｂＡ１ｃの調製
ＨｂＡ０及びＨｂＡ１ｃは、非特許文献（Ｍｅｌｉｓｅｎｄａ Ｊ．ＭｃＤｏｎａｌｄ ｅｔ ａｌ、ＪＢＣ、２５３（７）、２３２７−２３３２、１９７８）記載のＢｉｏ−Ｒｅｘ７０（バイオラッド社）を用いるイオン交換クロマトグラフィーにより、ヒト赤血球溶血液から精製し、以降の実験に用いた。
（２）各種ペプチド、及び糖化ペプチドの調製
２種類のアミノ配列のペプチド（ＶＨＬＴＣ（配列番号１）及びＶＨＬＴＰＥＥＫＹＹＣ（配列番号２）：アルファベットはアミノ酸の一文字表記を示す）は、ペプチド自動合成装置を用いＦｍｏｃ法により合成、及び精製した。各ペプチドの純度は、ＨＰＬＣにより９５％以上であることを確認した。また、各ペプチドの分子量は、質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ法）により理論値と同じであることを確認した。
前記２種類のペプチドを特許文献１記載の方法にて糖化し、糖化ペプチド（ｆ−ＶＨＬＴＣ及びｆ−ＶＨＬＴＰＥＥＫＹＹＣ：ｆは、フルクトシル化を意味する）を精製した。すなわち、各配列のペプチドそれぞれとグルコースを無水ピリジン中で反応させて糖化ペプチドを合成し、ＨＰＬＣで精製した。各糖化ペプチドの分子量は、質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ法）により理論値、すなわち各ペプチドの分子量に１６２を加算した分子量と同じであることを確認した。
２種類のアミノ配列のペプチド（ＶＨＬＴＣ（配列番号１）及びＶＨＬＴＰＥＥＫＹＹＣ（配列番号２）：アルファベットはアミノ酸の一文字表記を示す）は、ペプチド自動合成装置を用いＦｍｏｃ法により合成、及び精製した。各ペプチドの純度は、ＨＰＬＣにより９５％以上であることを確認した。また、各ペプチドの分子量は、質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ法）により理論値と同じであることを確認した。
前記２種類のペプチドを特許文献１記載の方法にて糖化し、糖化ペプチド（ｆ−ＶＨＬＴＣ及びｆ−ＶＨＬＴＰＥＥＫＹＹＣ：ｆは、フルクトシル化を意味する）を精製した。すなわち、各配列のペプチドそれぞれとグルコースを無水ピリジン中で反応させて糖化ペプチドを合成し、ＨＰＬＣで精製した。各糖化ペプチドの分子量は、質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ法）により理論値、すなわち各ペプチドの分子量に１６２を加算した分子量と同じであることを確認した。
（３）ペプチド結合タンパク、及び糖化ペプチド結合タンパクの調製
ペプチド結合タンパク、及び糖化ペプチド結合タンパクは、前記（２）で調製したペプチド又は糖化ペプチドを、次のようにしてキャリアタンパクであるオブアルブミン（ＯＶＡ）に結合させて調製した。すなわち、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ含有２０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）（以下、総称的に「ＰＢＳ」ということがある）に５ｍｇ／ｍＬの濃度に溶解したペプチド（ＶＨＬＴＣ）、又は糖化ペプチド（ｆ−ＶＨＬＴＣ）を、５ｍｇ／ｍＬの濃度で精製水に溶解したマレイミド活性型オブアルブミン（ＰＩＥＲＣＥ社製）と１対１の容量比で混和後、室温で緩やかに反応容器を回転させながら２時間インキュベートして調製し、ＰＢＳで透析した後、使用した（ＶＨＬＴＣ−ＯＶＡ、ｆ−ＶＨＬＴＣ−ＯＶＡ）。
ペプチド結合タンパク、及び糖化ペプチド結合タンパクは、前記（２）で調製したペプチド又は糖化ペプチドを、次のようにしてキャリアタンパクであるオブアルブミン（ＯＶＡ）に結合させて調製した。すなわち、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ含有２０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）（以下、総称的に「ＰＢＳ」ということがある）に５ｍｇ／ｍＬの濃度に溶解したペプチド（ＶＨＬＴＣ）、又は糖化ペプチド（ｆ−ＶＨＬＴＣ）を、５ｍｇ／ｍＬの濃度で精製水に溶解したマレイミド活性型オブアルブミン（ＰＩＥＲＣＥ社製）と１対１の容量比で混和後、室温で緩やかに反応容器を回転させながら２時間インキュベートして調製し、ＰＢＳで透析した後、使用した（ＶＨＬＴＣ−ＯＶＡ、ｆ−ＶＨＬＴＣ−ＯＶＡ）。
（４）抗ヘモグロビン抗体及び抗ＨｂＡ１ｃ抗体の調製
抗ヘモグロビン抗体は、前記（１）の精製ＨｂＡ０を免疫原として常法にて作製したマウスモノクローナル抗体を使用した。当該モノクローナル抗体は、抗原固相化ＥＬＩＳＡで精製ＨｂＡ１ｃ及び精製ＨｂＡ０のいずれとも反応する性質を有している。
抗ＨｂＡ１ｃ抗体は、特許文献１記載の方法にて作製したマウスモノクローナル抗体を使用した。すなわち、前記（２）で合成した糖化ペプチド（ｆ−ＶＨＬＴＰＥＥＫＹＹＣ）をスカシ貝ヘモシアニンに結合させ、これを免疫原とした。ハイブリドーマのスクリーニングでは、抗原固相化ＥＬＩＳＡで精製ＨｂＡ１ｃと反応し、かつ精製ＨｂＡ０と反応しない株を選択した。クローニングを経て、最終的に抗原固相化ＥＬＩＳＡで精製ＨｂＡ１ｃと反応し、かつ精製ＨｂＡ０と反応しないモノクローナル抗体を得た。
抗ヘモグロビン抗体は、前記（１）の精製ＨｂＡ０を免疫原として常法にて作製したマウスモノクローナル抗体を使用した。当該モノクローナル抗体は、抗原固相化ＥＬＩＳＡで精製ＨｂＡ１ｃ及び精製ＨｂＡ０のいずれとも反応する性質を有している。
抗ＨｂＡ１ｃ抗体は、特許文献１記載の方法にて作製したマウスモノクローナル抗体を使用した。すなわち、前記（２）で合成した糖化ペプチド（ｆ−ＶＨＬＴＰＥＥＫＹＹＣ）をスカシ貝ヘモシアニンに結合させ、これを免疫原とした。ハイブリドーマのスクリーニングでは、抗原固相化ＥＬＩＳＡで精製ＨｂＡ１ｃと反応し、かつ精製ＨｂＡ０と反応しない株を選択した。クローニングを経て、最終的に抗原固相化ＥＬＩＳＡで精製ＨｂＡ１ｃと反応し、かつ精製ＨｂＡ０と反応しないモノクローナル抗体を得た。
実施例１：Ｎ末端露出剤候補によるヘモグロビンのＮ末端露出と抗原抗体反応阻害の確認
（Ｉ）材料と方法
（１）競合ＥＬＩＳＡ法による、Ｎ末端露出剤候補のＮ末端露出率確認試験
（ａ）糖化ペプチド結合タンパク（ｆ−ＶＨＬＴＣ−ＯＶＡ）をＰＢＳで１μｇ／ｍＬの濃度に希釈後、５０μＬ／ｗｅｌｌずつ９６穴マイクロプレートに分注し、４℃で一晩静置した。
（ｂ）前記（ａ）のマイクロプレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）含有ＰＢＳ（以下、「ＰＢＳＴ」という）４００μＬ／ｗｅｌｌで３回洗浄後、ブロッキング液（１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有ＰＢＳＴ、以下、「ＢＳＡ−ＰＢＳＴ」という）を１００μＬ／ｗｅｌｌずつマイクロプレートに分注し、室温で１時間静置し、ｆ−ＶＨＬＴＣ−ＯＶＡ固定化プレートを作製した。
（ｃ）ＥＤＴＡ採血管で採取した血液を、１０℃、３０００ｒｐｍで５分間遠心して血球を分離し、当該血球を−７０℃以下で凍結・融解することで赤血球を溶血させて、溶血赤血球とした（以降の各試験において溶血赤血球を検体とする場合、同様に調製した）。表１及び表２に記載のＮ末端露出剤候補を、表１及び表２記載の濃度含有する５ｍｍｏｌ／Ｌ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）を検体前処理液とし、前記溶血赤血球と前記検体前処理液を１対５０の容量比でよく混合し、２５℃で静置した。５分後、当該混合液を５ｍｍｏｌ／Ｌ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）で３２倍に希釈し、検体液とした。なお、ネガティブコントロールは、表１及び表２に記載のＮ末端露出剤候補を含まない５ｍｍｏｌ／Ｌ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）を検体前処理液として使用し、前記と同様の操作で溶血赤血球を処理し、ネガティブコントロール用検体液を調製した。
（ｄ）前記（ｂ）のマイクロプレートをＰＢＳＴで３回洗浄後、前記（ｃ）の各検体液を２５μＬ／ｗｅｌｌずつマイクロプレートに分注した。続いて、ＢＳＡ−ＰＢＳＴで１．０μｇ／ｍＬに希釈した抗ＨｂＡ１ｃ抗体を２５μＬ／ｗｅｌｌずつマイクロプレートに分注し、室温で１時間振とうした。
（ｅ）前記（ｄ）のマイクロプレートをＰＢＳＴで３回洗浄後、Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｌｉｎｓ／ＨＲＰ（Ｄａｋｏ Ｄｅｎｍａｒｋ Ａ／Ｓ社製）をＢＳＡ−ＰＢＳＴで５０００倍に希釈した溶液を５０μＬ／ｗｅｌｌずつマイクロプレートに分注し、室温で１時間振とうした。
（ｆ）前記（ｅ）のマイクロプレートをＰＢＳＴで３回洗浄後、オルトフェニレンジアミン塩酸塩（東京化成社）を２ｍｇ／ｍＬ、過酸化水素を０．０２％の濃度で含むクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）を５０μＬ／ｗｅｌｌずつマイクロプレートに分注し、室温で１０分間静置した。
（ｇ）前記（ｆ）のマイクロプレートに、１．５Ｎ硫酸を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ分注して反応を停止させた後、プレートリーダーで４９２ｎｍの吸光度を測定した。
（Ｉ）材料と方法
（１）競合ＥＬＩＳＡ法による、Ｎ末端露出剤候補のＮ末端露出率確認試験
（ａ）糖化ペプチド結合タンパク（ｆ−ＶＨＬＴＣ−ＯＶＡ）をＰＢＳで１μｇ／ｍＬの濃度に希釈後、５０μＬ／ｗｅｌｌずつ９６穴マイクロプレートに分注し、４℃で一晩静置した。
（ｂ）前記（ａ）のマイクロプレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）含有ＰＢＳ（以下、「ＰＢＳＴ」という）４００μＬ／ｗｅｌｌで３回洗浄後、ブロッキング液（１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有ＰＢＳＴ、以下、「ＢＳＡ−ＰＢＳＴ」という）を１００μＬ／ｗｅｌｌずつマイクロプレートに分注し、室温で１時間静置し、ｆ−ＶＨＬＴＣ−ＯＶＡ固定化プレートを作製した。
（ｃ）ＥＤＴＡ採血管で採取した血液を、１０℃、３０００ｒｐｍで５分間遠心して血球を分離し、当該血球を−７０℃以下で凍結・融解することで赤血球を溶血させて、溶血赤血球とした（以降の各試験において溶血赤血球を検体とする場合、同様に調製した）。表１及び表２に記載のＮ末端露出剤候補を、表１及び表２記載の濃度含有する５ｍｍｏｌ／Ｌ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）を検体前処理液とし、前記溶血赤血球と前記検体前処理液を１対５０の容量比でよく混合し、２５℃で静置した。５分後、当該混合液を５ｍｍｏｌ／Ｌ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）で３２倍に希釈し、検体液とした。なお、ネガティブコントロールは、表１及び表２に記載のＮ末端露出剤候補を含まない５ｍｍｏｌ／Ｌ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）を検体前処理液として使用し、前記と同様の操作で溶血赤血球を処理し、ネガティブコントロール用検体液を調製した。
（ｄ）前記（ｂ）のマイクロプレートをＰＢＳＴで３回洗浄後、前記（ｃ）の各検体液を２５μＬ／ｗｅｌｌずつマイクロプレートに分注した。続いて、ＢＳＡ−ＰＢＳＴで１．０μｇ／ｍＬに希釈した抗ＨｂＡ１ｃ抗体を２５μＬ／ｗｅｌｌずつマイクロプレートに分注し、室温で１時間振とうした。
（ｅ）前記（ｄ）のマイクロプレートをＰＢＳＴで３回洗浄後、Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｌｉｎｓ／ＨＲＰ（Ｄａｋｏ Ｄｅｎｍａｒｋ Ａ／Ｓ社製）をＢＳＡ−ＰＢＳＴで５０００倍に希釈した溶液を５０μＬ／ｗｅｌｌずつマイクロプレートに分注し、室温で１時間振とうした。
（ｆ）前記（ｅ）のマイクロプレートをＰＢＳＴで３回洗浄後、オルトフェニレンジアミン塩酸塩（東京化成社）を２ｍｇ／ｍＬ、過酸化水素を０．０２％の濃度で含むクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）を５０μＬ／ｗｅｌｌずつマイクロプレートに分注し、室温で１０分間静置した。
（ｇ）前記（ｆ）のマイクロプレートに、１．５Ｎ硫酸を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ分注して反応を停止させた後、プレートリーダーで４９２ｎｍの吸光度を測定した。
（２)Ｎ末端露出率の算出
前記（１）の競合ＥＬＩＳＡ法は、プレートに固定化された糖化ペプチドと検体液中のＨｂＡ１ｃによる競合阻害法である。検体前処理液中にＮ末端露出剤が存在しないためヘモグロビンのＮ末端が露出されないネガティブコントロールの場合には、測定系中で糖化ペプチドとＨｂＡ１ｃの競合が起こらないため、測定される吸光度が最大となる。一方、Ｎ末端露出剤によるＮ末端露出度合いの増加に伴い競合も増加し、測定される吸光度は減少する。前記（１)（ｇ）にて測定された吸光度から、下記の式を用いて各Ｎ末端露出剤候補の露出率（競合の度合）を算出し、各Ｎ末端露出剤候補のＮ末端露出効果の指標とした。本露出率が大きいほどＮ末端露出効果が高いといえる。本実施例では、露出率が１０％以上の場合を、「Ｎ末端露出効果あり」と判定する基準とした。
露出率（％）＝[（Ａ−Ｂ）／Ａ]×１００
Ａ：ネガティブコントロールの吸光度
Ｂ：各検体液の吸光度
前記（１）の競合ＥＬＩＳＡ法は、プレートに固定化された糖化ペプチドと検体液中のＨｂＡ１ｃによる競合阻害法である。検体前処理液中にＮ末端露出剤が存在しないためヘモグロビンのＮ末端が露出されないネガティブコントロールの場合には、測定系中で糖化ペプチドとＨｂＡ１ｃの競合が起こらないため、測定される吸光度が最大となる。一方、Ｎ末端露出剤によるＮ末端露出度合いの増加に伴い競合も増加し、測定される吸光度は減少する。前記（１)（ｇ）にて測定された吸光度から、下記の式を用いて各Ｎ末端露出剤候補の露出率（競合の度合）を算出し、各Ｎ末端露出剤候補のＮ末端露出効果の指標とした。本露出率が大きいほどＮ末端露出効果が高いといえる。本実施例では、露出率が１０％以上の場合を、「Ｎ末端露出効果あり」と判定する基準とした。
露出率（％）＝[（Ａ−Ｂ）／Ａ]×１００
Ａ：ネガティブコントロールの吸光度
Ｂ：各検体液の吸光度
（３）ＥＬＩＳＡ法による、Ｎ末端露出剤候補の抗原抗体反応阻害率確認試験
前記（１）競合ＥＬＩＳＡ法の手順（ｃ）において、表１及び表２に記載の濃度でＮ末端露出剤候補を含む５ｍｍｏｌ／Ｌ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）を溶血赤血球と混合することなく、そのまま検体液として使用した以外は、前記（１）と同様の手順で行った。
前記（１）競合ＥＬＩＳＡ法の手順（ｃ）において、表１及び表２に記載の濃度でＮ末端露出剤候補を含む５ｍｍｏｌ／Ｌ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）を溶血赤血球と混合することなく、そのまま検体液として使用した以外は、前記（１）と同様の手順で行った。
（４）抗ＨｂＡ１ｃ抗体に対する抗原抗体反応阻害率の算出
Ｎ末端露出剤候補が、抗ＨｂＡ１ｃ抗体とプレートに固定化された糖化ペプチドとの抗原抗体反応を阻害する場合、阻害度合いの増加に伴い測定される吸光度が減少する。測定された吸光度から、下記の式を用いて、各Ｎ末端露出剤候補の抗原抗体反応阻害率を算出し、各Ｎ末端露出剤候補の抗原抗体反応阻害効果の指標とした。本阻害率が大きいほど、抗原抗体反応阻害効果が高いといえる。本実施例では、Ｎ末端露出剤候補が高濃度であることを考慮し、実用的な観点から抗原抗体反応が成立していると考えられる阻害率が７０％未満の場合を、「抗原抗体反応を阻害しない」と判定する基準とした。
阻害率（％）＝[（Ｃ−Ｄ）／Ｃ]×１００
Ｃ：ネガティブコントロールの吸光度
Ｄ：各検体液の吸光度
Ｎ末端露出剤候補が、抗ＨｂＡ１ｃ抗体とプレートに固定化された糖化ペプチドとの抗原抗体反応を阻害する場合、阻害度合いの増加に伴い測定される吸光度が減少する。測定された吸光度から、下記の式を用いて、各Ｎ末端露出剤候補の抗原抗体反応阻害率を算出し、各Ｎ末端露出剤候補の抗原抗体反応阻害効果の指標とした。本阻害率が大きいほど、抗原抗体反応阻害効果が高いといえる。本実施例では、Ｎ末端露出剤候補が高濃度であることを考慮し、実用的な観点から抗原抗体反応が成立していると考えられる阻害率が７０％未満の場合を、「抗原抗体反応を阻害しない」と判定する基準とした。
阻害率（％）＝[（Ｃ−Ｄ）／Ｃ]×１００
Ｃ：ネガティブコントロールの吸光度
Ｄ：各検体液の吸光度
（ＩＩ）結果
（１）各Ｎ末端露出剤候補のＮ末端露出率及び抗原抗体反応阻害率の比較
前記（Ｉ）（２）及び同（４）により算出された各Ｎ末端露出剤候補のＮ末端露出率、及び抗原抗体反応阻害率を表１及び表２の各欄に示す。
（１）各Ｎ末端露出剤候補のＮ末端露出率及び抗原抗体反応阻害率の比較
前記（Ｉ）（２）及び同（４）により算出された各Ｎ末端露出剤候補のＮ末端露出率、及び抗原抗体反応阻害率を表１及び表２の各欄に示す。
Ｎ末端露出剤候補として試験した界面活性剤の中で、前記露出率基準より「Ｎ末端露出効果あり」と判定されたものは、非イオン性界面活性剤では、ショ糖脂肪酸エステル型のうちスクロースモノラウレート、アニオン性界面活性剤では、サルフェート型、スルホネート型、カルボン酸型、ポリカルボン酸高分子型、芳香族スルホン酸ホルマリン縮合物、カチオン性界面活性剤では、アンモニウム型、ベンザルコニウム型、両性界面活性剤では、胆汁酸誘導体を除くベタイン（スルホベタイン型、アルキルベタイン型、アミドベタイン型等）のカテゴリに属する界面活性剤であった（ここで、胆汁酸誘導体とは、胆汁酸由来のアシル基が形成するアミド結合を介してスルホベタイン等の両性イオン基と結合している化合物をいう）。この結果は、本実施例で使用した以外の抗ＨｂＡ１ｃ抗体を用いて試験した場合でも同様であった。なお、表１及び表２における界面活性剤のカテゴリは、通常使用される分類、例えば、界面活性剤分析研究会編（１９８７）、「新版界面活性剤分析法」、幸書房、吉田時行ら編（２０００）、「新版界面活性剤ハンドブック」、工学図書株式会社、日本国特許庁ホームページ、「標準技術集（農薬製剤技術）データベース：界面活性剤、http://www.jpo.go.jp/shiryou/s_sonota/hyoujun_gijutsu/nouyaku/0005.html」等に記載された分類を基礎に、市販品のカタログ等の製品情報を考慮して分類したものである。
Ｎ末端露出剤候補として試験した界面活性剤の中で、前記阻害率基準より「抗原抗体反応を阻害しない」と判定されたものは、いずれも前記「Ｎ末端露出効果あり」と判定された界面活性剤（スクロースモノラウレート、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、両性界面活性剤）であった。
以上より、本実施例で「Ｎ末端露出効果あり」と判定され、かつ「抗原抗体反応を阻害しない」と判定された前記界面活性剤群を「本発明のＮ末端露出剤」として選択した。
以上より、本実施例で「Ｎ末端露出効果あり」と判定され、かつ「抗原抗体反応を阻害しない」と判定された前記界面活性剤群を「本発明のＮ末端露出剤」として選択した。
Ｎ末端露出剤候補として試験した界面活性剤以外の成分のうち、本実施例の露出率及び阻害率の判定基準を同時に満たしたのは、カオトロピック剤（塩酸グアニジン、及び塩酸グアニジン・亜硝酸ナトリウム・ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標））混合物）であった。タンパク変性剤として広く用いられる尿素の場合は、抗原抗体反応を阻害しない一方で、Ｎ末端露出効果を全く認めなかった。還元剤であるＬ-システイン、及びジチオスレイトールを用いた場合、Ｎ末端露出効果が認められたが、同時に抗原抗体反応も大きく阻害された。有機溶媒であるジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、及び２−ブタノールを用いた場合は、抗原抗体反応を阻害しない一方で、Ｎ末端露出効果はごく僅かであった。
以上より、カオトロピック剤を「本発明のＮ末端露出剤」として選択した。
以上より、カオトロピック剤を「本発明のＮ末端露出剤」として選択した。
本実施例の競合ＥＬＩＳＡ法によるＮ末端露出率確認試験において、吸光度の減少がＮ末端露出剤による抗原抗体反応阻害のためではないことを以下により確認した。選択された本発明の各Ｎ末端露出剤を含む検体前処理液を、溶血赤血球を添加せずに、直接、５ｍｍｏｌ／Ｌ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）で３２倍に希釈して検体液（Ｎ末端露出剤を含むが溶血赤血球を含まない）とし、ネガティブコントロール（Ｎ末端露出剤を含まないが溶血赤血球を含む）と比較した。選択された本発明のＮ末端露出剤のいずれを用いた場合においてもＮ末端露出効果に対して十分に小さいものであり、抗原抗体反応の阻害はなかった。この試験は、選択された本発明のＮ末端露出剤濃度を前記（Ｉ）（３）の３２倍稀薄濃度に変更して、本実施例のＥＬＩＳＡ法による抗原抗体反応阻害率確認試験を実施したものに相当する。
また、ｆ−ＶＨＬＴＣ−ＯＶＡに代えてヘモグロビンを固定化したプレートと後記する抗ヘモグロビン抗体を用い、本実施例（Ｉ）１（３）、及び同（４）と同様の方法にて、選択された本発明の各Ｎ末端露出剤による抗原抗体反応阻害の有無を確認したところ、いずれのＮ末端露出剤も「抗原抗体反応を阻害しない」と判定された。以上より、選択された本発明のＮ末端露出剤によって抗ヘモグロビン抗体の認識部位が損なわれる、もしくは抗ヘモグロビン抗体との抗原抗体反応が阻害されることなく、抗ＨｂＡ１ｃ抗体等とのサンドイッチ法により検体中のヘモグロビンを検出可能であることを確認した。
比較例１：粒子イムノクロマト法によるＨｂＡ１ｃ測定（１）
（Ｉ）材料と方法
（１）未処理サンプルパッド
未処理サンプルパッドとして、セルロースメンブレン（ミリポア社、シュアウィック（登録商標） Ｃ０８３）を用いた。
（Ｉ）材料と方法
（１）未処理サンプルパッド
未処理サンプルパッドとして、セルロースメンブレン（ミリポア社、シュアウィック（登録商標） Ｃ０８３）を用いた。
（２）金コロイド粒子標識抗体含有パッドの作製
５２７ｎｍにおける吸光度が１．０Ｏ．Ｄ．／ｍＬである金コロイド粒子水溶液（粒径５０ｎｍ、ｐＨ９．０）に対して、抗ヘモグロビン抗体を終濃度１．５μｇ／ｍＬとなるよう添加し、室温で１０分間攪拌した。さらに、当該金コロイド−抗ヘモグロビン抗体混合液に、ＢＳＡを終濃度０．３％となるよう添加し、室温で５分間攪拌してブロッキング処理を行った。続いて、当該混合液を１０℃にて１００００ｒｐｍで４５分間遠心し、沈渣（金コロイド粒子標識抗ヘモグロビン抗体）を得た。得られた金コロイド粒子標識ヘモグロビン抗体を、５３１ｎｍにおける吸光度が４．０Ｏ．Ｄ．／ｍＬとなるよう１．３％（ｗ／ｖ）カゼインを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＰＢＳ(ｐＨ７．０)を用いて懸濁し、金コロイド粒子標識抗体液とした。ガラス繊維シート（日本ポール社、Ｎｏ．８９６４）を前記金コロイド粒子標識抗体液に浸漬し、液が垂れない程度に液切りした後、乾燥機で乾燥させて金コロイド粒子標識抗体含有パッドとした。
５２７ｎｍにおける吸光度が１．０Ｏ．Ｄ．／ｍＬである金コロイド粒子水溶液（粒径５０ｎｍ、ｐＨ９．０）に対して、抗ヘモグロビン抗体を終濃度１．５μｇ／ｍＬとなるよう添加し、室温で１０分間攪拌した。さらに、当該金コロイド−抗ヘモグロビン抗体混合液に、ＢＳＡを終濃度０．３％となるよう添加し、室温で５分間攪拌してブロッキング処理を行った。続いて、当該混合液を１０℃にて１００００ｒｐｍで４５分間遠心し、沈渣（金コロイド粒子標識抗ヘモグロビン抗体）を得た。得られた金コロイド粒子標識ヘモグロビン抗体を、５３１ｎｍにおける吸光度が４．０Ｏ．Ｄ．／ｍＬとなるよう１．３％（ｗ／ｖ）カゼインを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＰＢＳ(ｐＨ７．０)を用いて懸濁し、金コロイド粒子標識抗体液とした。ガラス繊維シート（日本ポール社、Ｎｏ．８９６４）を前記金コロイド粒子標識抗体液に浸漬し、液が垂れない程度に液切りした後、乾燥機で乾燥させて金コロイド粒子標識抗体含有パッドとした。
（３）ラテックス粒子標識抗体含有パッドの作製
１％（ｗ／ｖ）の赤色ラテックス懸濁液（ポリスチレンラテックス粒子、粒径１５０ｎｍ、２０ｍｍｏｌ／Ｌ トリス緩衝液（ｐＨ８．５））に対して、抗ヘモグロビン抗体を終濃度０．２５ｍｇ／ｍＬとなるよう添加し、４℃で２時間攪拌した。さらに当該ラテックス−抗ヘモグロビン抗体混合液に、ＢＳＡを終濃度１％となるよう添加し、４℃で１時間攪拌してブロッキング処理を行ないラテックス粒子標識抗ヘモグロビン抗体を得た。得られたラテックス粒子標識抗ヘモグロビン抗体を、１００倍量（ｖ／ｖ）の２０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液(ｐＨ７．０)を用いて３回透析した後、ラテックス粒子に対してカゼインを終濃度１．３％（ｗ／ｗ）となるよう添加し、ラテックス粒子標識抗体液とした。ガラス繊維シート（日本ポール社、Ｎｏ．８９６４）を前記金コロイド粒子標識抗体液に浸漬し、液が垂れない程度に液切りした後、乾燥機で乾燥させて金コロイド粒子標識抗体含有パッドとした。
１％（ｗ／ｖ）の赤色ラテックス懸濁液（ポリスチレンラテックス粒子、粒径１５０ｎｍ、２０ｍｍｏｌ／Ｌ トリス緩衝液（ｐＨ８．５））に対して、抗ヘモグロビン抗体を終濃度０．２５ｍｇ／ｍＬとなるよう添加し、４℃で２時間攪拌した。さらに当該ラテックス−抗ヘモグロビン抗体混合液に、ＢＳＡを終濃度１％となるよう添加し、４℃で１時間攪拌してブロッキング処理を行ないラテックス粒子標識抗ヘモグロビン抗体を得た。得られたラテックス粒子標識抗ヘモグロビン抗体を、１００倍量（ｖ／ｖ）の２０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液(ｐＨ７．０)を用いて３回透析した後、ラテックス粒子に対してカゼインを終濃度１．３％（ｗ／ｗ）となるよう添加し、ラテックス粒子標識抗体液とした。ガラス繊維シート（日本ポール社、Ｎｏ．８９６４）を前記金コロイド粒子標識抗体液に浸漬し、液が垂れない程度に液切りした後、乾燥機で乾燥させて金コロイド粒子標識抗体含有パッドとした。
（４）抗体固定化メンブレンの作製
１０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液(ｐＨ７．０)に対し、抗ＨｂＡ１ｃ抗体を１．０ｍｇ／ｍＬ、スクロースを２．５％（ｗ／ｖ）となるように添加し、抗ＨｂＡ１ｃ抗体固定化試薬（以下、「Ａ１ｃ用抗体」ということがある）とした。ニトロセルロースメンブレン（ミリポア社、ＨＦ１８０）上に、当該抗Ａ１ｃ用抗体をライン状に塗布（図１（ｅ））し、乾燥機で乾燥させたものを抗体固定化メンブレンとした（図１（ｄ））。以下、Ａ１ｃ用抗体が塗布されたライン（図１（ｅ））を「Ａ１ｃライン」ということがある。
１０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液(ｐＨ７．０)に対し、抗ＨｂＡ１ｃ抗体を１．０ｍｇ／ｍＬ、スクロースを２．５％（ｗ／ｖ）となるように添加し、抗ＨｂＡ１ｃ抗体固定化試薬（以下、「Ａ１ｃ用抗体」ということがある）とした。ニトロセルロースメンブレン（ミリポア社、ＨＦ１８０）上に、当該抗Ａ１ｃ用抗体をライン状に塗布（図１（ｅ））し、乾燥機で乾燥させたものを抗体固定化メンブレンとした（図１（ｄ））。以下、Ａ１ｃ用抗体が塗布されたライン（図１（ｅ））を「Ａ１ｃライン」ということがある。
（５）イムノクロマトデバイスの作製
プラスチック製粘着シート（ａ）に、前記（４)で作製した抗体固定化メンブレン（ｄ）を貼り、未処理サンプルパッド（ｂ）、前記（２）又は（３)で作製した２種類の粒子標識抗体含有パッド（ｃ）、及び吸水パッド（ワットマン社、ＢＴＳ−ＳＰ３００）（ｆ）を図１のように配置した。すなわち、前記（４）で作製した抗体固定化メンブレン（ｄ）において、測定試料の展開方向における上流側の末端近傍に、前記（２）又は（３）で作製した粒子標識抗体含有パッド（ｃ）のいずれか一つを配置し、この粒子標識抗体含有パッド（ｃ）に一部重なるように、未処理サンプルパッド（ｂ）を配置した。また前記（４）で作製した抗体固定化メンブレン（ｄ）の測定試料の展開方向における下流側の末端に、当該メンブレンと一部重なるように吸水パッド（ｆ）を配置した。各部材の配置後、さらにその上から、透明プラスチックシール（ｇ）で覆った。貼り合わせたシートは６ｍｍ幅で裁断し、テストストリップとした。当該テストストリップの外寸は、６ｍｍ×７０ｍｍ（幅×長さ）であった。測定の際は、プラスチック製の専用のハウジング（サンプル添加窓部及び検出窓部を有する、当該ハウジングは図１中には図示せず）に格納・搭載し、イムノクロマトデバイスの形態とした。
プラスチック製粘着シート（ａ）に、前記（４)で作製した抗体固定化メンブレン（ｄ）を貼り、未処理サンプルパッド（ｂ）、前記（２）又は（３)で作製した２種類の粒子標識抗体含有パッド（ｃ）、及び吸水パッド（ワットマン社、ＢＴＳ−ＳＰ３００）（ｆ）を図１のように配置した。すなわち、前記（４）で作製した抗体固定化メンブレン（ｄ）において、測定試料の展開方向における上流側の末端近傍に、前記（２）又は（３）で作製した粒子標識抗体含有パッド（ｃ）のいずれか一つを配置し、この粒子標識抗体含有パッド（ｃ）に一部重なるように、未処理サンプルパッド（ｂ）を配置した。また前記（４）で作製した抗体固定化メンブレン（ｄ）の測定試料の展開方向における下流側の末端に、当該メンブレンと一部重なるように吸水パッド（ｆ）を配置した。各部材の配置後、さらにその上から、透明プラスチックシール（ｇ）で覆った。貼り合わせたシートは６ｍｍ幅で裁断し、テストストリップとした。当該テストストリップの外寸は、６ｍｍ×７０ｍｍ（幅×長さ）であった。測定の際は、プラスチック製の専用のハウジング（サンプル添加窓部及び検出窓部を有する、当該ハウジングは図１中には図示せず）に格納・搭載し、イムノクロマトデバイスの形態とした。
（６）検体液の調製
実施例１で選択したＮ末端露出剤を、表３に記載の濃度になるように、０．３％ＢＳＡ、０．０５％プロクリン（登録商標）３００を含む１０ｍｍｏｌ／Ｌ トリス緩衝液（ｐＨ７．２）（以下、「ＢＳＡ−Ｔｒｉｓ」ということがある）に溶解し、検体前処理液とした。続いて、各検体前処理液５００μＬに溶血赤血球１μＬを添加してよく混合し、検体液とした。
実施例１で選択したＮ末端露出剤を、表３に記載の濃度になるように、０．３％ＢＳＡ、０．０５％プロクリン（登録商標）３００を含む１０ｍｍｏｌ／Ｌ トリス緩衝液（ｐＨ７．２）（以下、「ＢＳＡ−Ｔｒｉｓ」ということがある）に溶解し、検体前処理液とした。続いて、各検体前処理液５００μＬに溶血赤血球１μＬを添加してよく混合し、検体液とした。
（７）測定
前記混合から３０秒後、当該検体液１５０μＬを前記（５）で作製したイムノクロマトデバイスのサンプルパッドに滴下し、Ａ１ｃラインへの各粒子標識抗体の集積（以下、「Ａ１ｃ検出ラインの形成」等ということがある）を確認した。さらに、滴下から１５分後に、ハウジングよりテストストリップを取り出して、図１上段に記載の側面図における粒子標識抗体含有パッド（ｃ）の終端と抗体固定化メンブレン（ｄ）の接触部位の近傍（以下「標識パッド接点」という）における金コロイド粒子標識抗体又はラテックス粒子標識抗体の凝集を目視観察した。
前記混合から３０秒後、当該検体液１５０μＬを前記（５）で作製したイムノクロマトデバイスのサンプルパッドに滴下し、Ａ１ｃラインへの各粒子標識抗体の集積（以下、「Ａ１ｃ検出ラインの形成」等ということがある）を確認した。さらに、滴下から１５分後に、ハウジングよりテストストリップを取り出して、図１上段に記載の側面図における粒子標識抗体含有パッド（ｃ）の終端と抗体固定化メンブレン（ｄ）の接触部位の近傍（以下「標識パッド接点」という）における金コロイド粒子標識抗体又はラテックス粒子標識抗体の凝集を目視観察した。
（II）結果
結果を表３に示す。実施例１で選択したＮ末端露出剤として、スクロースモノラウレート（非イオン性界面活性剤）、ラウリル硫酸ナトリウム（アニオン性界面活性剤）、臭化ラウリルトリメチルアンモニウム（カチオン性界面活性剤）、ラウリルベタイン（両性界面活性剤）、塩酸グアニジン（カオトロピック剤）をそれぞれ含む検体前処理液を用いて溶血赤血球を処理した検体液を、未処理サンプルパッドに滴下し測定したところ、以下の結果であった。
結果を表３に示す。実施例１で選択したＮ末端露出剤として、スクロースモノラウレート（非イオン性界面活性剤）、ラウリル硫酸ナトリウム（アニオン性界面活性剤）、臭化ラウリルトリメチルアンモニウム（カチオン性界面活性剤）、ラウリルベタイン（両性界面活性剤）、塩酸グアニジン（カオトロピック剤）をそれぞれ含む検体前処理液を用いて溶血赤血球を処理した検体液を、未処理サンプルパッドに滴下し測定したところ、以下の結果であった。
（１）金コロイド粒子標識抗体で検出した場合
ラウリル硫酸ナトリウムを含む検体液の場合を除き、Ａ１ｃ検出ラインの形成は再現性が不良であり、塩酸グアニジンを含む検体液の場合にはＡ１ｃ検出ラインが形成されなかった。また、ラウリル硫酸ナトリウムを含む検体液の場合を除き、標識パッド接点における金コロイド粒子標識抗体の凝集が確認された。金コロイド粒子標識抗体の凝集の程度は、Ｎ末端露出剤として、塩酸グアニジン又は臭化ラウリルトリメチルアンモニウムを用いた場合が最も大きかったが、スクロースモノラウレート又はラウリルベタインを用いた場合にも明瞭に確認できた。
ラウリル硫酸ナトリウムを含む検体液の場合を除き、Ａ１ｃ検出ラインの形成は再現性が不良であり、塩酸グアニジンを含む検体液の場合にはＡ１ｃ検出ラインが形成されなかった。また、ラウリル硫酸ナトリウムを含む検体液の場合を除き、標識パッド接点における金コロイド粒子標識抗体の凝集が確認された。金コロイド粒子標識抗体の凝集の程度は、Ｎ末端露出剤として、塩酸グアニジン又は臭化ラウリルトリメチルアンモニウムを用いた場合が最も大きかったが、スクロースモノラウレート又はラウリルベタインを用いた場合にも明瞭に確認できた。
（２）ラテックス粒子標識抗体で検出した場合
塩酸グアニジンを含む検体液の場合にはＡ１ｃ検出ラインが形成されず、その他のＮ末端露出剤でもＡ１ｃ検出ラインの形成は再現性が不良であった。また、いずれのＮ末端露出剤を含む検体液の場合でも、標識パッド接点におけるラテックス粒子標識抗体の凝集が確認された。ラテックス粒子標識抗体の凝集の程度は、Ｎ末端露出剤として、塩酸グアニジン、又は臭化ラウリルトリメチルアンモニウムを用いた場合が最も大きく、次いでラウリルベタイン又はラウリル硫酸ナトリウム、さらにスクロースモノラウレートを用いた場合の順であった。
塩酸グアニジンを含む検体液の場合にはＡ１ｃ検出ラインが形成されず、その他のＮ末端露出剤でもＡ１ｃ検出ラインの形成は再現性が不良であった。また、いずれのＮ末端露出剤を含む検体液の場合でも、標識パッド接点におけるラテックス粒子標識抗体の凝集が確認された。ラテックス粒子標識抗体の凝集の程度は、Ｎ末端露出剤として、塩酸グアニジン、又は臭化ラウリルトリメチルアンモニウムを用いた場合が最も大きく、次いでラウリルベタイン又はラウリル硫酸ナトリウム、さらにスクロースモノラウレートを用いた場合の順であった。
以上のように、Ｎ末端露出剤として、金コロイド粒子標識抗体の凝集を認めなかったラウリル硫酸ナトリウムを用いた場合でも、ラテックス粒子標識抗体の凝集が確認されたことより、実施例１で選択したＮ末端露出剤を含む検体液を粒子イムノクロマト法に広く適用しようとした場合、Ｎ末端露出剤のカテゴリに拘わらず粒子標識抗体を凝集させ、粒子イムノクロマト法による測定系が成立しない場合があることが確認された。
表３において、「−」は粒子標識抗体の凝集あるいはＡ１ｃ検出ラインの形成を認めず、「＋」、「＋＋」、「＋＋＋」は＋の数に応じて粒子標識抗体の凝集の程度が大きいか、又はＡ１ｃ検出ラインの形成が明瞭であったことを示す。なお「±」は、Ａ１ｃ検出ライン形成の再現性が不良であったことを示す。
比較例２：環状多糖類による粒子標識抗体凝集の改善効果の確認（１）
（Ｉ）材料と方法
（１）環状多糖類水溶液の作製
表４に示す環状多糖類のいずれかを、表４に記載の濃度含有する５ｍｍｏｌ／Ｌ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）を調整し、環状多糖類水溶液を作製した。また、糖が環状に結合してなる環状多糖類と類似した構造を有するカリックスアレーン類（フェノールが環状に結合してなる）も、前記と同様にその水溶液を調製し、参考条件として試験した。
（Ｉ）材料と方法
（１）環状多糖類水溶液の作製
表４に示す環状多糖類のいずれかを、表４に記載の濃度含有する５ｍｍｏｌ／Ｌ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）を調整し、環状多糖類水溶液を作製した。また、糖が環状に結合してなる環状多糖類と類似した構造を有するカリックスアレーン類（フェノールが環状に結合してなる）も、前記と同様にその水溶液を調製し、参考条件として試験した。
（２）イムノクロマトデバイスの作製
比較例１（Ｉ）（１）に記載の未処理サンプルパッドと、同（２）に記載の金コロイド粒子標識結合抗体含有パッドと、同（４）に記載の抗体固定化メンブレンを用い、同（５）に記載の方法と同様にしてイムノクロマトデバイスを作製した。
比較例１（Ｉ）（１）に記載の未処理サンプルパッドと、同（２）に記載の金コロイド粒子標識結合抗体含有パッドと、同（４）に記載の抗体固定化メンブレンを用い、同（５）に記載の方法と同様にしてイムノクロマトデバイスを作製した。
（３）検体液の調製
臭化ラウリルトリメチルアンモニウム（実施例１で選択されたＮ末端露出剤：カチオン性界面活性剤）を、０．７５％（ｗ／ｖ）となるよう、ＢＳＡ−Ｔｒｉｓに溶解し、検体前処理液とした。続いて、当該検体前処理液５００μＬに溶血赤血球１μＬを添加してよく混合し、検体液とした。前記混合から３０秒後、当該検体液８０μＬに、前記（１)で調製した環状多糖類水溶液５０μＬを混合し、環状多糖類含有検体液とし、直ちに測定に使用した。
別途、α−シクロデキストリンを５０ｍｍｏｌ／Ｌとなるよう、ＢＳＡ−Ｔｒｉｓに溶解し、Ｎ末端露出剤、及び溶血赤血球の添加は行わず、そのままコントロール用検体液として使用した。
臭化ラウリルトリメチルアンモニウム（実施例１で選択されたＮ末端露出剤：カチオン性界面活性剤）を、０．７５％（ｗ／ｖ）となるよう、ＢＳＡ−Ｔｒｉｓに溶解し、検体前処理液とした。続いて、当該検体前処理液５００μＬに溶血赤血球１μＬを添加してよく混合し、検体液とした。前記混合から３０秒後、当該検体液８０μＬに、前記（１)で調製した環状多糖類水溶液５０μＬを混合し、環状多糖類含有検体液とし、直ちに測定に使用した。
別途、α−シクロデキストリンを５０ｍｍｏｌ／Ｌとなるよう、ＢＳＡ−Ｔｒｉｓに溶解し、Ｎ末端露出剤、及び溶血赤血球の添加は行わず、そのままコントロール用検体液として使用した。
（４）測定
当該各環状多糖類含有検体液１５０μＬを、前記（２)で作製したイムノクロマトデバイスのサンプルパッドに滴下し、Ａ１ｃ検出ラインの形成を確認した。さらに、滴下から１５分後に、ハウジングよりテストストリップを取り出して、標識パッド接点における金コロイド粒子標識抗体の凝集を目視確認した。なお、参考条件として試験したカリックスアレーン類は、臭化ラウリルトリメチルアンモニウムを含む検体液と混合すると検体液が白濁したことから、サンプルパッドへ滴下以降の操作を行わなかった。
当該各環状多糖類含有検体液１５０μＬを、前記（２)で作製したイムノクロマトデバイスのサンプルパッドに滴下し、Ａ１ｃ検出ラインの形成を確認した。さらに、滴下から１５分後に、ハウジングよりテストストリップを取り出して、標識パッド接点における金コロイド粒子標識抗体の凝集を目視確認した。なお、参考条件として試験したカリックスアレーン類は、臭化ラウリルトリメチルアンモニウムを含む検体液と混合すると検体液が白濁したことから、サンプルパッドへ滴下以降の操作を行わなかった。
（II）結果
結果を表４に示す。いずれの環状多糖類含有検体液を測定した場合でも、環状多糖類非添加の検体液を測定した場合と比較して、Ａ１ｃ検出ラインの形成が確認されるものの形成された検出ラインは明瞭ではなく、再現性もいまだ不良であった。また、標識パッド接点における金コロイド粒子標識抗体の凝集はいずれの環状多糖類を使用した場合でも、環状多糖類非添加の検体液を測定した場合と比較して改善されてはいたが、Ａ１ｃ検出ラインの形成が不良であることより、その効果は実用上十分なものとはいえなかった。
また、Ｎ末端露出剤、及び溶血赤血球を含んでいないコントロール用検体液を測定した場合には、環状多糖類非添加の検体液を測定した場合と比較して程度は小さいものの標識パッド接点に凝集が確認された。従来、シクロデキストリンは、微粒子の分散安定化効果が知られているため、シクロデキストリンと金コロイド粒子標識抗体の混合液であるコントロール用検体液の測定おいて、金コロイド粒子標識抗体の凝集が生じることはないものと考えられたが、意外にも金コロイド粒子標識抗体を凝集させる場合があることがわかった。以上より、単に環状多糖類をＮ末端露出剤と共存させて測定を行っただけでは粒子イムノクロマト法には適用できないことが確認された。
なお、環状多糖類に代えて、シクロデキストリンの構成糖であるグルコースを用いて非環状糖水溶液を調製し、本比較例と同様に操作したが、粒子標識抗体凝集及びＡ１ｃ検出ラインの形成は、環状多糖類非添加の場合と同様であった。以上より、環状多糖であることが、粒子標識抗体凝集及びＡ１ｃ検出ライン形成の改善に有効であることが確認された。
結果を表４に示す。いずれの環状多糖類含有検体液を測定した場合でも、環状多糖類非添加の検体液を測定した場合と比較して、Ａ１ｃ検出ラインの形成が確認されるものの形成された検出ラインは明瞭ではなく、再現性もいまだ不良であった。また、標識パッド接点における金コロイド粒子標識抗体の凝集はいずれの環状多糖類を使用した場合でも、環状多糖類非添加の検体液を測定した場合と比較して改善されてはいたが、Ａ１ｃ検出ラインの形成が不良であることより、その効果は実用上十分なものとはいえなかった。
また、Ｎ末端露出剤、及び溶血赤血球を含んでいないコントロール用検体液を測定した場合には、環状多糖類非添加の検体液を測定した場合と比較して程度は小さいものの標識パッド接点に凝集が確認された。従来、シクロデキストリンは、微粒子の分散安定化効果が知られているため、シクロデキストリンと金コロイド粒子標識抗体の混合液であるコントロール用検体液の測定おいて、金コロイド粒子標識抗体の凝集が生じることはないものと考えられたが、意外にも金コロイド粒子標識抗体を凝集させる場合があることがわかった。以上より、単に環状多糖類をＮ末端露出剤と共存させて測定を行っただけでは粒子イムノクロマト法には適用できないことが確認された。
なお、環状多糖類に代えて、シクロデキストリンの構成糖であるグルコースを用いて非環状糖水溶液を調製し、本比較例と同様に操作したが、粒子標識抗体凝集及びＡ１ｃ検出ラインの形成は、環状多糖類非添加の場合と同様であった。以上より、環状多糖であることが、粒子標識抗体凝集及びＡ１ｃ検出ライン形成の改善に有効であることが確認された。
表４において、「＋」、「＋＋」は＋の数に応じて粒子標識抗体凝集の程度が大きいか、又はＡ１ｃ検出ラインの形成が明瞭であったことを示す。なお「±」は、ライン形成の再現性が不良であったことを示す。
比較例３：環状多糖類による粒子標識抗体凝集の改善効果の確認（２）
（Ｉ）材料と方法
（１）シクロデキストリン浸漬サンプルパッドの作製
精製水に、α−シクロデキストリン（ナカライテスク、１０００５−８２）又はモノクロロトリアジノ化βシクロデキストリン（株式会社シクロケム、ＣＡＶＡＳＯＬ（登録商標）Ｗ７ ＭＣＴ）を、１０％（ｗ／ｖ）となるよう溶解し、環状多糖類水溶液を作製した。比較例１（Ｉ）（１）の未処理サンプルパッドを当該環状多糖類水溶液に１０分間浸漬した後、液が垂れない程度に液切りした後、室温で減圧乾燥し、２種類のシクロデキストリン浸漬サンプルパッドとした。
（Ｉ）材料と方法
（１）シクロデキストリン浸漬サンプルパッドの作製
精製水に、α−シクロデキストリン（ナカライテスク、１０００５−８２）又はモノクロロトリアジノ化βシクロデキストリン（株式会社シクロケム、ＣＡＶＡＳＯＬ（登録商標）Ｗ７ ＭＣＴ）を、１０％（ｗ／ｖ）となるよう溶解し、環状多糖類水溶液を作製した。比較例１（Ｉ）（１）の未処理サンプルパッドを当該環状多糖類水溶液に１０分間浸漬した後、液が垂れない程度に液切りした後、室温で減圧乾燥し、２種類のシクロデキストリン浸漬サンプルパッドとした。
（２）イムノクロマトデバイスの作製
比較例１（Ｉ）（１）に記載の未処理サンプルパッド又は前記（１）で作製した２種類のシクロデキストリン浸漬サンプルパッドと、比較例１（Ｉ）（２）に記載の金コロイド粒子標識結合抗体含有パッドと、比較例１（Ｉ）（４）に記載の抗体固定化メンブレンを用い、比較例１（Ｉ）（５）に記載の方法と同様にしてイムノクロマトデバイスを作製した。各デバイスに組み込んだサンプルパッドの種類により、デバイスＡ（未処理サンプルパッド）、デバイスＢ（α−シクロデキストリン浸漬サンプルパッド）、デバイスＣ（モノクロロトリアジノ化βシクロデキストリン浸漬サンプルパッド）とした（表５）
比較例１（Ｉ）（１）に記載の未処理サンプルパッド又は前記（１）で作製した２種類のシクロデキストリン浸漬サンプルパッドと、比較例１（Ｉ）（２）に記載の金コロイド粒子標識結合抗体含有パッドと、比較例１（Ｉ）（４）に記載の抗体固定化メンブレンを用い、比較例１（Ｉ）（５）に記載の方法と同様にしてイムノクロマトデバイスを作製した。各デバイスに組み込んだサンプルパッドの種類により、デバイスＡ（未処理サンプルパッド）、デバイスＢ（α−シクロデキストリン浸漬サンプルパッド）、デバイスＣ（モノクロロトリアジノ化βシクロデキストリン浸漬サンプルパッド）とした（表５）
（３）検体液の調製と測定
臭化ラウリルトリメチルアンモニウム（実施例１で選択されたＮ末端露出剤：カチオン性界面活性剤）を、０．７５％（ｗ／ｖ）となるよう、ＢＳＡ−Ｔｒｉｓに溶解し、検体前処理液とした。続いて、当該検体前処理液５００μＬに溶血赤血球１μＬを添加してよく混合し、検体液とした。当該検体液を比較例１（Ｉ）（７）と同様に測定した。
臭化ラウリルトリメチルアンモニウム（実施例１で選択されたＮ末端露出剤：カチオン性界面活性剤）を、０．７５％（ｗ／ｖ）となるよう、ＢＳＡ−Ｔｒｉｓに溶解し、検体前処理液とした。続いて、当該検体前処理液５００μＬに溶血赤血球１μＬを添加してよく混合し、検体液とした。当該検体液を比較例１（Ｉ）（７）と同様に測定した。
（II）結果
結果を表５に示す。デバイスＡ（未処理サンプルパッド）では、Ａ１ｃ検出ラインの形成を全く認めず、また標識パッド接点において金コロイド粒子標識抗体の凝集塊が密集した状態で確認され、比較例１及び２の結果を再現した。このように、Ｎ末端露出剤を含む検体液を、そのまま粒子イムノクロマト法に適用した場合、粒子標識抗体の凝集が生じ、測定系が成立しない。これに対しデバイスＢ（α−シクロデキストリン浸漬サンプルパッド）、デバイスＣ（モノクロロトリアジノ化βシクロデキストリン浸漬サンプルパッド）では、Ａ１ｃ検出ライン形成の再現性は不良であったものの、標識パッド接点における金コロイド粒子標識抗体の凝集は、デバイスＢ、ＣともデバイスＡに対して明らかに改善されていた。金コロイド粒子標識抗体の凝集が改善されながら、Ａ１ｃ検出ライン形成の改善が見られない理由の一つとして、シクロデキストリン溶液の粘性の影響が考えられる。すなわち、乾燥状態でサンプルパッドに含まれていたシクロデキストリンが、検体液の添加により再溶解し、サンプルパッドより漏出して抗体固定化メンブレンに到達し、当該メンブレン上を検体液と一緒に展開しようとするため、検体液の当該メンブレン上での展開が不均一になるか妨害され、検体液（特にＨｂＡ１ｃと粒子標識抗体の免疫複合体）がＡ１ｃラインまで均一かつ十分に到達することができなかったことが考えられる。
このように、環状多糖類は、Ｎ末端露出剤による金コロイド粒子標識抗体の凝集を抑制・改善する効果を有することが確認される一方で、その粘性の高さ等が原因となって粒子イムノクロマト法への適用の障害となることがわかった。
結果を表５に示す。デバイスＡ（未処理サンプルパッド）では、Ａ１ｃ検出ラインの形成を全く認めず、また標識パッド接点において金コロイド粒子標識抗体の凝集塊が密集した状態で確認され、比較例１及び２の結果を再現した。このように、Ｎ末端露出剤を含む検体液を、そのまま粒子イムノクロマト法に適用した場合、粒子標識抗体の凝集が生じ、測定系が成立しない。これに対しデバイスＢ（α−シクロデキストリン浸漬サンプルパッド）、デバイスＣ（モノクロロトリアジノ化βシクロデキストリン浸漬サンプルパッド）では、Ａ１ｃ検出ライン形成の再現性は不良であったものの、標識パッド接点における金コロイド粒子標識抗体の凝集は、デバイスＢ、ＣともデバイスＡに対して明らかに改善されていた。金コロイド粒子標識抗体の凝集が改善されながら、Ａ１ｃ検出ライン形成の改善が見られない理由の一つとして、シクロデキストリン溶液の粘性の影響が考えられる。すなわち、乾燥状態でサンプルパッドに含まれていたシクロデキストリンが、検体液の添加により再溶解し、サンプルパッドより漏出して抗体固定化メンブレンに到達し、当該メンブレン上を検体液と一緒に展開しようとするため、検体液の当該メンブレン上での展開が不均一になるか妨害され、検体液（特にＨｂＡ１ｃと粒子標識抗体の免疫複合体）がＡ１ｃラインまで均一かつ十分に到達することができなかったことが考えられる。
このように、環状多糖類は、Ｎ末端露出剤による金コロイド粒子標識抗体の凝集を抑制・改善する効果を有することが確認される一方で、その粘性の高さ等が原因となって粒子イムノクロマト法への適用の障害となることがわかった。
表５において、「−」は粒子標識抗体の凝集あるいはＡ１ｃ検出ラインの形成を認めず、「＋」、「＋＋」、「＋＋＋」は＋の数に応じて粒子標識抗体の凝集の程度が大きいか、又はＡ１ｃ検出ラインの形成が明瞭であったことを示す。なお、「±」は、ライン形成の再現性が不良であったことを示す。
実施例２：本発明の方法を用いた環状多糖類による粒子標識抗体凝集の改善効果の確認
（Ｉ）材料と方法
（１）シクロデキストリン化学結合サンプルパッドの作製
精製水に、炭酸ナトリウムを４％（ｗ／ｖ）、モノクロロトリアジノ化βシクロデキストリン（株式会社シクロケム、ＣＡＶＡＳＯＬ（登録商標）Ｗ７ ＭＣＴ）を１０％（ｗ／ｖ）となるよう溶解した。比較例１（Ｉ）（１）の未処理サンプルパッドを当該液に１０分間浸漬した後、液が垂れない程度に液切りした後、室温で減圧乾燥させた。続いて１５０℃にて１０分間加熱した後、精製水に浸漬して未反応原料を洗浄・除去し、さらに７０℃で３０分乾燥させて、シクロデキストリン化学結合サンプルパッドとした。
（Ｉ）材料と方法
（１）シクロデキストリン化学結合サンプルパッドの作製
精製水に、炭酸ナトリウムを４％（ｗ／ｖ）、モノクロロトリアジノ化βシクロデキストリン（株式会社シクロケム、ＣＡＶＡＳＯＬ（登録商標）Ｗ７ ＭＣＴ）を１０％（ｗ／ｖ）となるよう溶解した。比較例１（Ｉ）（１）の未処理サンプルパッドを当該液に１０分間浸漬した後、液が垂れない程度に液切りした後、室温で減圧乾燥させた。続いて１５０℃にて１０分間加熱した後、精製水に浸漬して未反応原料を洗浄・除去し、さらに７０℃で３０分乾燥させて、シクロデキストリン化学結合サンプルパッドとした。
（２）イムノクロマトデバイスの作製
比較例１（Ｉ）（１）に記載の未処理サンプルパッド又は前記（１）で作製したシクロデキストリン化学結合サンプルパッドと、比較例１（Ｉ）（２）又は比較例１（Ｉ）（３）に記載の２種類の粒子標識結合抗体含有パッドと、比較例１（Ｉ）（４）に記載の抗体固定化メンブレンを用い、比較例１（Ｉ）（５）に記載の方法と同様にしてイムノクロマトデバイスを作製した。
比較例１（Ｉ）（１）に記載の未処理サンプルパッド又は前記（１）で作製したシクロデキストリン化学結合サンプルパッドと、比較例１（Ｉ）（２）又は比較例１（Ｉ）（３）に記載の２種類の粒子標識結合抗体含有パッドと、比較例１（Ｉ）（４）に記載の抗体固定化メンブレンを用い、比較例１（Ｉ）（５）に記載の方法と同様にしてイムノクロマトデバイスを作製した。
（３）検体液の調製と測定
実施例１で選択したＮ末端露出剤として、スクロースモノラウレート、ラウリル硫酸ナトリウム、臭化ラウリルトリメチルアンモニウム、ラウリルベタイン、塩酸グアニジンを使用し、比較例１（Ｉ）（６）と同様の方法で検体液を調製した。測定は、比較例１（Ｉ）（７）と同様の方法で行った。
実施例１で選択したＮ末端露出剤として、スクロースモノラウレート、ラウリル硫酸ナトリウム、臭化ラウリルトリメチルアンモニウム、ラウリルベタイン、塩酸グアニジンを使用し、比較例１（Ｉ）（６）と同様の方法で検体液を調製した。測定は、比較例１（Ｉ）（７）と同様の方法で行った。
（II）結果
結果を表６に示す。
（１）金コロイド粒子標識抗体で検出した場合
Ｎ末端露出剤として塩酸グアニジンを使用した場合を除き、Ａ１ｃ検出ラインの形成は明瞭に、かつ再現性よく確認された。また、標識パッド接点における金コロイド粒子標識抗体の凝集も、Ｎ末端露出剤として塩酸グアニジンを使用した場合を除き、顕著に改善され、目視で確認されることはなかった。
結果を表６に示す。
（１）金コロイド粒子標識抗体で検出した場合
Ｎ末端露出剤として塩酸グアニジンを使用した場合を除き、Ａ１ｃ検出ラインの形成は明瞭に、かつ再現性よく確認された。また、標識パッド接点における金コロイド粒子標識抗体の凝集も、Ｎ末端露出剤として塩酸グアニジンを使用した場合を除き、顕著に改善され、目視で確認されることはなかった。
（２）ラテックス粒子標識抗体で検出した場合
Ｎ末端露出剤として塩酸グアニジンを使用した場合を除き、Ａ１ｃ検出ラインの形成は明瞭に、かつ再現性よく確認された。また、標識パッド接点におけるラテックス粒子標識抗体の凝集は、ラウリル硫酸ナトリウム、臭化ラウリルトリメチルアンモニウム、ラウリルベタインで顕著に改善され、目視で確認されることはなかった。スクロースモノラウレートでは、未処理サンプルパッドを使用した場合と比較して凝集は減少していたが、わずかに観察される場合があった。塩酸グアニジンの場合には、ラテックス粒子標識抗体の凝集がなお確認された。
Ｎ末端露出剤として塩酸グアニジンを使用した場合を除き、Ａ１ｃ検出ラインの形成は明瞭に、かつ再現性よく確認された。また、標識パッド接点におけるラテックス粒子標識抗体の凝集は、ラウリル硫酸ナトリウム、臭化ラウリルトリメチルアンモニウム、ラウリルベタインで顕著に改善され、目視で確認されることはなかった。スクロースモノラウレートでは、未処理サンプルパッドを使用した場合と比較して凝集は減少していたが、わずかに観察される場合があった。塩酸グアニジンの場合には、ラテックス粒子標識抗体の凝集がなお確認された。
以上より、サンプルパッドとしてシクロデキストリン化学結合パッドを組み込んだテストストリップを格納・搭載したイムノクロマトデバイスは、Ｎ末端露出剤として非イオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、両性界面活性剤のいずれを検体前処理に用いた場合にも使用することができ、検出用の標識粒子として金コロイド粒子、ラテックス粒子のいずれを用いた場合にも凝集の改善に有効であった。
なお、塩酸グアニジンをＮ末端露出剤として使用した場合に、粒子凝集、及びＡ１ｃラインエ形成の改善効果が界面活性剤をＮ末端露出剤とした場合と比較して低かった理由の一つとして、Ｎ末端露出に必要な塩酸グアニジンの量（濃度）が界面活性剤群の量（濃度）よりも高いことが考えられる。これより、検体液中の塩酸グアニジンに対する環状多糖類の量比を適切な範囲に調整することで本発明の効果を得ることができると推測される。
なお、塩酸グアニジンをＮ末端露出剤として使用した場合に、粒子凝集、及びＡ１ｃラインエ形成の改善効果が界面活性剤をＮ末端露出剤とした場合と比較して低かった理由の一つとして、Ｎ末端露出に必要な塩酸グアニジンの量（濃度）が界面活性剤群の量（濃度）よりも高いことが考えられる。これより、検体液中の塩酸グアニジンに対する環状多糖類の量比を適切な範囲に調整することで本発明の効果を得ることができると推測される。
表６において、「−」は粒子標識抗体の凝集あるいはＡ１ｃ検出ライン形成を認めず、「＋」、「＋＋」は＋の数に応じて粒子標識抗体の凝集の程度が大きいか、又はＡ１ｃ検出ラインの形成が明瞭であったことを示す。
実施例３：本発明の方法を用いたＨｂＡ１ｃの定量的測定
（Ｉ）材料と方法
（１）イムノクロマトデバイスの作製
実施例２（Ｉ）（１）に記載のシクロデキストリン化学結合サンプルパッド、比較例１（Ｉ）（２）に記載の金コロイド粒子標識結合抗体含有パッド、比較例１（Ｉ）（４）に記載の抗体固定化メンブレンを用い、比較例１（Ｉ）（５）に記載の方法と同様にしてイムノクロマトデバイスを作製した。
（Ｉ）材料と方法
（１）イムノクロマトデバイスの作製
実施例２（Ｉ）（１）に記載のシクロデキストリン化学結合サンプルパッド、比較例１（Ｉ）（２）に記載の金コロイド粒子標識結合抗体含有パッド、比較例１（Ｉ）（４）に記載の抗体固定化メンブレンを用い、比較例１（Ｉ）（５）に記載の方法と同様にしてイムノクロマトデバイスを作製した。
（２）比較測定
ＥＤＴＡ採血管で採取した血液を、１０℃、３０００ｒｐｍで５分間遠心して赤血球を分離した。酵素法によるＨｂＡ１ｃ測定試薬「ノルディア（登録商標）Ｎ ＨｂＡ１ｃ」（積水メディカル株式会社）、「ノルディア（登録商標）Ｎ ＨｂＡ１ｃ用ＨｂＡ１ｃ前処理液」（積水メディカル株式会社）、及び汎用自動分析装置「ＢＭ９１３０」（日本電子株式会社）を用い、添付文書に従ってＨｂＡ１ｃ（％）（検体中の総ヘモグロビン濃度に対するＨｂＡ１ｃ濃度）を測定した。
ＥＤＴＡ採血管で採取した血液を、１０℃、３０００ｒｐｍで５分間遠心して赤血球を分離した。酵素法によるＨｂＡ１ｃ測定試薬「ノルディア（登録商標）Ｎ ＨｂＡ１ｃ」（積水メディカル株式会社）、「ノルディア（登録商標）Ｎ ＨｂＡ１ｃ用ＨｂＡ１ｃ前処理液」（積水メディカル株式会社）、及び汎用自動分析装置「ＢＭ９１３０」（日本電子株式会社）を用い、添付文書に従ってＨｂＡ１ｃ（％）（検体中の総ヘモグロビン濃度に対するＨｂＡ１ｃ濃度）を測定した。
（３）検体液の調製
臭化ラウリルトリメチルアンモニウム（実施例１で選択されたＮ末端露出剤：カチオン性界面活性剤）を、０．７５％（ｗ／ｖ）となるよう、ＢＳＡ−Ｔｒｉｓに溶解し、検体前処理液とした。前記（２）で得られた赤血球１μＬを、５００μＬの当該検体前処理液に添加し、よく混合して検体液とした。
臭化ラウリルトリメチルアンモニウム（実施例１で選択されたＮ末端露出剤：カチオン性界面活性剤）を、０．７５％（ｗ／ｖ）となるよう、ＢＳＡ−Ｔｒｉｓに溶解し、検体前処理液とした。前記（２）で得られた赤血球１μＬを、５００μＬの当該検体前処理液に添加し、よく混合して検体液とした。
（４）測定
前記混合から３０秒後、当該検体液１５０μＬを前記（１）で作製したイムノクロマトデバイスのサンプルパッドに滴下し、１０分後のＡ１ｃライン吸光度（反射光）を、ラピッドピア（浜松ホトニクス）で測定した。
前記混合から３０秒後、当該検体液１５０μＬを前記（１）で作製したイムノクロマトデバイスのサンプルパッドに滴下し、１０分後のＡ１ｃライン吸光度（反射光）を、ラピッドピア（浜松ホトニクス）で測定した。
（II）結果
１０人分の赤血球について、本発明のイムノクロマトデバイス及びノルディア（登録商標）Ｎ ＨｂＡ１ｃで測定した結果を、表７、図２に示す。本発明のシクロデキストリン化学結合パッドを組み込んだイムノクロマトデバイスを用いた測定では、ノルディアＮ ＨｂＡ１ｃを用いて測定したＨｂＡ１ｃ（％）の濃度に依存した吸光度が測定された（相関係数ｒ＝０．９６４）。以上より、本発明の方法によれば検体中の総ヘモグロビン濃度に対するＨｂＡ１ｃ濃度を測定できることが確認された。
１０人分の赤血球について、本発明のイムノクロマトデバイス及びノルディア（登録商標）Ｎ ＨｂＡ１ｃで測定した結果を、表７、図２に示す。本発明のシクロデキストリン化学結合パッドを組み込んだイムノクロマトデバイスを用いた測定では、ノルディアＮ ＨｂＡ１ｃを用いて測定したＨｂＡ１ｃ（％）の濃度に依存した吸光度が測定された（相関係数ｒ＝０．９６４）。以上より、本発明の方法によれば検体中の総ヘモグロビン濃度に対するＨｂＡ１ｃ濃度を測定できることが確認された。
参考例２：抗ＨｂＡ０特異抗体の調製
（Ｉ）材料と方法
（１)材料
抗ＨｂＡ０抗体は、前記参考例１（Ｉ）（３）で調製したペプチド結合タンパク（ＶＨＬＴＣ−ＯＶＡ）を免疫原として、常法にて作製したマウスモノクローナル抗体を使用した。ハイブリドーマのスクリーニングでは、抗原固相化ＥＬＩＳＡで精製ＨｂＡ０と反応し、かつ精製ＨｂＡ１ｃと反応しない株を選択した。前記スクリーニングで選択された株についてクローニングを実施し、抗ＨｂＡ０モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを独立行政法人産業技術総合研究所（２００８年１１月２８日付け、日本国茨城県つくば市東一丁目１番地１中央第６）に寄託した。寄託番号は以下のとおりである。
抗体番号：８５２０１
受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１８７
（Ｉ）材料と方法
（１)材料
抗ＨｂＡ０抗体は、前記参考例１（Ｉ）（３）で調製したペプチド結合タンパク（ＶＨＬＴＣ−ＯＶＡ）を免疫原として、常法にて作製したマウスモノクローナル抗体を使用した。ハイブリドーマのスクリーニングでは、抗原固相化ＥＬＩＳＡで精製ＨｂＡ０と反応し、かつ精製ＨｂＡ１ｃと反応しない株を選択した。前記スクリーニングで選択された株についてクローニングを実施し、抗ＨｂＡ０モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを独立行政法人産業技術総合研究所（２００８年１１月２８日付け、日本国茨城県つくば市東一丁目１番地１中央第６）に寄託した。寄託番号は以下のとおりである。
抗体番号：８５２０１
受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１８７
なお、精製ＨｂＡ０固定化プレートと前記抗ＨｂＡ０抗体を用い、実施例１（Ｉ）１（３）、及び同（４）と同様の方法にて、表１及び表２記載の各Ｎ末端露出剤による抗原抗体反応阻害の有無を確認したところ、いずれのＮ末端露出剤も「抗原抗体反応を阻害しない」と判定された。以上より、選択された本発明のＮ末端露出剤によって抗ＨｂＡ０抗体の認識部位が損なわれる、もしくは抗ＨｂＡ０抗体との抗原抗体反応が阻害されることなく、抗ヘモグロビン抗体とのサンドイッチ法により検体中のＨｂＡ０を検出可能であることを確認した。
実施例４：本発明の方法を用いたＨｂＡ１ｃとＨｂＡ０の同時検出
（１）抗体固定化メンブレンの作製
１０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液(ｐＨ７．０)に対し、参考例２で作製した抗ＨｂＡ０抗体を１．０ｍｇ／ｍＬ、スクロースを２．５％（ｗ／ｖ）となるように添加し、抗ＨｂＡ０抗体固定化試薬（以下、Ａ０用抗体という）とした。Ａ1ｃ用抗体は、参考例１（Ｉ）（４）に記載のＡ１ｃ用抗体を使用した。前記２種の抗体固定化試薬を、ニトロセルロースメンブレン（ミリポア社、ＨＦ１８０）に、展開の開始方向からＡ１ｃ用抗体（図３（ｅ））、Ａ０用抗体（図３（ｆ））の順序で、ライン状に、相互に間隔をあけて塗布し、乾燥機で乾燥させたものを抗体固定化メンブレンとした（図３（ｄ））。以下、Ａ１ｃ用抗体が塗布されたライン（図３（ｆ））を「Ａ０ライン」ということがある。
（１）抗体固定化メンブレンの作製
１０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液(ｐＨ７．０)に対し、参考例２で作製した抗ＨｂＡ０抗体を１．０ｍｇ／ｍＬ、スクロースを２．５％（ｗ／ｖ）となるように添加し、抗ＨｂＡ０抗体固定化試薬（以下、Ａ０用抗体という）とした。Ａ1ｃ用抗体は、参考例１（Ｉ）（４）に記載のＡ１ｃ用抗体を使用した。前記２種の抗体固定化試薬を、ニトロセルロースメンブレン（ミリポア社、ＨＦ１８０）に、展開の開始方向からＡ１ｃ用抗体（図３（ｅ））、Ａ０用抗体（図３（ｆ））の順序で、ライン状に、相互に間隔をあけて塗布し、乾燥機で乾燥させたものを抗体固定化メンブレンとした（図３（ｄ））。以下、Ａ１ｃ用抗体が塗布されたライン（図３（ｆ））を「Ａ０ライン」ということがある。
（２）イムノクロマトデバイスの作製
抗体固定化メンブレンとして前記（１）で作製した抗体固定化メンブレンを使用した以外は、実施例３と同様の方法でイムノクロマトデバイスを作製した。
抗体固定化メンブレンとして前記（１）で作製した抗体固定化メンブレンを使用した以外は、実施例３と同様の方法でイムノクロマトデバイスを作製した。
（３）検体液の調製
臭化ラウリルトリメチルアンモニウムを、０．７５％（ｗ／ｖ）となるよう、ＢＳＡ−Ｔｒｉｓに溶解し、検体前処理液とした。続いて、当該検体前処理液５００μＬに溶血赤血球１μＬを添加してよく混合し、検体液とした。
臭化ラウリルトリメチルアンモニウムを、０．７５％（ｗ／ｖ）となるよう、ＢＳＡ−Ｔｒｉｓに溶解し、検体前処理液とした。続いて、当該検体前処理液５００μＬに溶血赤血球１μＬを添加してよく混合し、検体液とした。
（４）測定
前記混合から３０秒後、当該検体液１５０μＬを前記（２）で作製したイムノクロマトデバイスのサンプルパッドに滴下し、Ａ１ｃラインまたはＡ０ラインへの粒子標識抗体の集積（以下、「Ａ１ｃ又はＡ０検出ラインの形成」等ということがある）を確認した。さらに、滴下から１５分後に、ハウジングよりテストストリップを取り出して、図３上段に記載の側面図における粒子標識抗体含有パッド（ｃ）の終端と抗体固定化メンブレン（ｄ）の接触部位の近傍（以下「標識パッド接点」という）における金コロイド粒子標識抗体又はラテックス粒子標識抗体の凝集を目視観察した。
前記混合から３０秒後、当該検体液１５０μＬを前記（２）で作製したイムノクロマトデバイスのサンプルパッドに滴下し、Ａ１ｃラインまたはＡ０ラインへの粒子標識抗体の集積（以下、「Ａ１ｃ又はＡ０検出ラインの形成」等ということがある）を確認した。さらに、滴下から１５分後に、ハウジングよりテストストリップを取り出して、図３上段に記載の側面図における粒子標識抗体含有パッド（ｃ）の終端と抗体固定化メンブレン（ｄ）の接触部位の近傍（以下「標識パッド接点」という）における金コロイド粒子標識抗体又はラテックス粒子標識抗体の凝集を目視観察した。
（II）結果
本発明のシクロデキストリン化学結合パッドを組み込んだイムノクロマトデバイスを用いた測定では、Ａ１ｃ検出ライン、ＨｂＡ０検出ラインとも良好に形成が確認できた。また、標識パッド接点における金コロイド粒子の凝集も認めなかった。以上より、本発明の方法では粒子イムノクロマト法によるＨｂＡ１ｃとＨｂＡ０の同時検出が可能であり、従来達成されていなかった、ＨｂＡ０を直接測定してＨｂＡ１ｃ（％）を算出する方法を簡便に実施することが可能になった。
本発明のシクロデキストリン化学結合パッドを組み込んだイムノクロマトデバイスを用いた測定では、Ａ１ｃ検出ライン、ＨｂＡ０検出ラインとも良好に形成が確認できた。また、標識パッド接点における金コロイド粒子の凝集も認めなかった。以上より、本発明の方法では粒子イムノクロマト法によるＨｂＡ１ｃとＨｂＡ０の同時検出が可能であり、従来達成されていなかった、ＨｂＡ０を直接測定してＨｂＡ１ｃ（％）を算出する方法を簡便に実施することが可能になった。
Claims (7)
- 水と接触した際に水に溶解して拡散しない状態にある環状多糖類を含有している固相又は環状多糖類の水不溶性ポリマーを具備することを特徴とする、ＨｂＡ１ｃのイムノクロマト測定用のテストストリップ。
- 前記環状多糖類が、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、ヒドロキシアルキル化（α，β又はγ）シクロデキストリン、スルホアルキル化（α，β又はγ）シクロデキストリン、モノクロロトリアジニル（α，β又はγ）シクロデキストリン、クラスターシクロデキストリン、修飾クラスターシクロデキストリン及びシクロアミロースからなる群より選択される、請求項１に記載のテストストリップ。
- 水と接触した際に水に溶解して拡散しない状態にある環状多糖類が、固相に化学結合されたものである、請求項１又は２に記載のテストストリップ。
- 前記固相が、イムノクロマト用テストストリップにおけるサンプルパッドである、請求項１から３のいずれか１項に記載のテストストリップ。
- 前記環状多糖類の水不溶性ポリマーが、シート状に加工された環状多糖類の水不溶性ポリマーである、請求項１又は２に記載のテストストリップ。
- 測定対象試料が、ヘモグロビンβ鎖のＮ末端をタンパク質表面に露出させる性質を有する界面活性剤で処理された赤血球含有試料である、請求項１から５のいずれか１項に記載のテストストリップ。
- 前記ヘモグロビンβ鎖のＮ末端をタンパク表面に露出させる性質を有する界面活性剤が、スクロースモノラウレート、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤及び両性界面活性剤からなる群より選択される、請求項６に記載のテストストリップ。
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