JPH01276066A - 免疫検定法による低分子化合物の検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は低分子化合物の免疫測定法による低分子化合物
の検出および定量法に関する。

〔従来の技術〕

高感度、高精度に定量できる特徴を持つ免疫測定法は医
薬、臨床検査の分野では重要な技術である。ハプテンと
呼ばれる低分子化合物の従来からの検出および定量法と
しては、低分子化合物の支持体への定量的吸着が困難で
あったためにハプテンに対する抗体を支持体に吸着させ
た後、その低分子化合物に酵素でラベルした標識抗原と
、サンプル中の低分子化合物と競合させ、標識抗原を定
量することによって、間接的にサンプル中の低分子化合
物の検出および定量を行うＥＬＩＳＡ法と呼ばれる方法
が一般的に行われている。なお、上記した従来公知のＥ
ＬＩＳＡ法に関しては、例えば北用、市原、辻、石川編
集の「酵素免疫測定法」　（蛋白質核酸酵素別冊Ｎａ３
１，１９８７年、共立出版）に記載されている。

免疫分析（イムノアッセイ）において、本発明のように
、ハプテンを蛋白質を介して担体に吸着せしめること、
そしてその際に架橋剤を用いることについては、従来よ
りそのような技術についての知見はなく、新規である。

すなわち、ハプテンは、抗体との結合能は有するが、単
独では免疫応答を誘導する能力（免疫原性）は有しない
比較的低分子量の物質をいうものであり、イムノアッセ
イは、この抗体との結合能を専ら利用する技術であるか
ら、免疫原性をハプテンに付与するための蛋白質との結
合は全くその必要がなく、また、特に酵素免疫分析法（
ＥＩＡ）はデリケートな酵素を用いるものであるから、
ハプテンに免疫原性を付与するために行う蛋白質との結
合処理によってデリケートな酵素活性が影響を受けるこ
とが充分に予想されるため、イムノアッセイにおいて、
ハプテンと蛋白質との結合は全く予想されていない、と
いうよりむしろ排除されているのが技術の現状である。

〔発明が解決しようとする課題〕

ＥＬＩＳＡ法は抗体作製の他、低分子化合物を酵素でラ
ベルした標識抗原を作製し、さらに標識抗原の濃度設定
を検討せねばならず、煩雑な工程が各種必要であった。

〔課題を解決するための手段〕 本発明は、上記した欠点を解決するためになされたもの
であって、従来からのＥＬＩＳＡ法の改良では決定的な
解決策にはならないとの観点にたち、従来不可能とさえ
考えられていたところのハプテンを担体に直接吸着せし
めるという最も基本的な技術に着目し、その実現を目的
としてなされたものである。

そこで、標識抗原作製などの煩雑な行程を省略するため
に本発明者らは、支持体に測定する低分子化合物を定量
的に結合させた後、免疫測定を行う方法について研究し
た結果、蛋白質を介してハプテンを担体に結合させると
両者の結合がスムースに行われること、そして更に、そ
の際架橋剤を使用すれば更によい結果が得られることを
見出し、この新規な知見を基礎として更に研究をすすめ
、そして遂に本発明が完成されたのである。

すなわち、マイクロタイタープレート、ビーズ、膜など
の支持体に直接、低分子化合物を吸着させた後、イムノ
アッセイを行って該低分子化合物を検出、定量を行うこ
とは従来よりきわめて困難ないし不可能とさえいわれて
いたのであるが、発想を転換して鋭意検討の結果、前記
した技術の現状に敢えて抗して、蛋白質との結合に着目
した。そして更に研究を行った結果、上記支持体に蛋白
質を吸着させた後、低分子化合物と蛋白質を結合させる
架橋剤と共に該低分子化合物を含む試料を添加すること
によって支持体に吸着した蛋白質に該低分子化合物を結
合させた後、イムノアッセイを行うことによって該低分
子化合物の検出および定量が可能となることを見い出し
、この新知見を基礎として本発明を完成するに到った。

すなわち、本発明方法の重要なポイントは、支持体に蛋
白質を吸着させ検出しようとする低分子化合物を含む試
料を添加し、蛋白質と該低分子化合物を架橋する架橋剤
で処理することによって、支持体に該低分子化合物を間
接的に結合させ、その後、イムノアッセイを行い、該低
分子化合物の検出および定量を行う点にある。

本発明において、支持体としてはマイクロタイタープレ
ート、ビーズ、膜などが例示され、材質としては、ポリ
エステル、ポリスチレン、ポリエチレン、塩化ビニル、
ニトロセルロース、ナイロン、ガラス、紙などが例示さ
れる。また、更に、シリコンラバー、ポリスチレンボー
ル、赤血球、不活性化アルブミン粒子等も使用すること
ができるほか、イムノアッセイにおいて用いられる担体
であればすべてのものが自由に使用できる。

支持体の内、マイクロタイタープレートは、その上でハ
プテンの固定、サンプルの添加、抗原抗体反応、酵素反
応、分光分析、比色定量等がすべて実施できるので、イ
ムノアッセイの機械化ないし、自動化には特に適してい
る。

このような支持体に吸着する蛋白質としては、ＢＳＡＣ
牛血清アルブミン）、サイログロブリン、合成ポリリジ
ン、アルブミン、赤血球等が広く例示される。さらに支
持体に固定化させる低分子化合物とは、ハプテンとして
抗体を作製することのできるすべての化合物を指すもの
である。

蛍白質を介して低分子化合物を支持体に結合するには、
低分子化合物と蛍白質を架橋剤で結合せしめた後に支持
体に吸着させる方法、又は、支持体に蛋白質を吸着せし
めた後に架橋剤を用いて低分子化合物を結合させる方法
のいずれの方法も採用しうるちのであり、使用する支持
体、蛋白質、架橋剤、低分子化合物の種類に応じて、蛋
白変性や標識として用いる酵素の変性等のない最適な方
法を選択使用すればよい。

低分子化合物と蛋白質を架橋剤で結合させた後。

支持体に吸着させてもよいが、通常の場合、架橋剤によ
っては、蛋白質が凝集してしまうことがあるので、架橋
剤で処理する前に蛋白質を支持体に吸着させたほうが望
ましい。また、本発明では支持体に吸着した蛋白質と低
分子化合物を結合させる架橋剤としては、ハプテン抗原
作製法で用いられている架橋剤を用いることができる。

架橋剤に関して、例えば、北用、市原、辻、石川編集の
「酵素免疫測定法」　（蛋白質核酸酵素別冊Ｎｏ、３１
　＋１９８７年、井守出版）のＰ２８〜Ｐ３３に記載さ
れている方法がすべて使用することができる。

本発明によれば、各種の低分子化合物を広く測定するこ
とができる。低分子化合物としては、薬剤、抗生物質、
各種低分子化合物が広く包含され、次のものが例示され
る二カテコールアミン（ノルアドレナリン、アドレナリ
ン、ドーパミン）；ステロイド（コルチゾール、プロゲ
ステロン、テストステロン、エストリオール、エストロ
ゲン等）：抗生物質（バイオマイシン、アンピシリン、
ゲンタマイシン等）；抗てんかん剤（フェニトイン、フ
ェノバルビタール、プリミドン、カルバマゼピン、エト
サクシイミド、パルプロ酸）；核酸類（アデノシン等）
；薬剤類（モルフイン、メサトン、バルビッール酸、ア
ンフェタミン、オキサゼパム、プロポキシフェン等）；
その他（サイロキシン、同エステル、トリヨードサイロ
ニン等）。

本発明を実施するには、前記した方法にしたがって、架
橋剤を用いて、被検試料中の低分子化合物を蛋白質を介
して支持体に結合せしめた後、該低分子化合物に対する
抗体を作成し、これを利用してイムノアッセイの常法に
したがって処理操作を行えばよい。

標識抗体に用いる標識としては、一般に用いられている
、酵素、螢光物質、フェリチン、ラジオアイソトープ等
が用いられ、上記低分子化合物との免疫反応の後に、ラ
ベルの特性を利用して測定を行えばよいものである（酵
素の場合には、基質から生成物への変化；螢光物質やフ
ェリチンにあっては、螢光やフェリチンの存在；放射性
同位元素にあっては、放射能；等の測定）。

本発明において、酵素標識抗体法を利用する場合、酵素
としては、例えばβ−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダ
ーゼ、グルコースオシキダーゼ、アルカリホスファター
ゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素等が用いられ、
これらの酵素を用いて、グルタルアルデヒド法、過ヨウ
素酸法、マレイミド法、ピリジル・ジスルフィド法等公
知の方法によって、酵素ラベルした抗体を作成しておく
。次いで、低分子化合物と抗原抗体反応を行わしめ、酵
素の基質を加えて生成物を生成せしめ、例えば発色性（
ないしは退色性、変色性）生成物にあっては、吸光光度
法、螢光光度法、化学発色法等によって測定を行うので
ある。

次に本発明の実施例及び比較例について述べる。

〔実施例〕

以下、本発明の方法を更に具体的に説明する。

実施例１ カテコールアミンの一種であるドーパミンの検出および
定量を行った。以下順を追って説明する。

（１）抗体の作製 Ａｖｒａｎ＋ｅａｓ、Ｓ、らの方法（Ｉｍｍｕｎｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ、　６　＋４３（１９６９）　）に従っ
て、Ｄｏｐａｍｉｎｅのアミノ基とＢＳＡＩＪ、ジンの
ε−アミノ基をゲルタールアルデヒドによって架橋し、
Ｄｏｐａｍｉｎｅ−ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ−Ｂ
Ｓ八をハブテン抗原として、「細胞免疫実験操作法」（
今井勝行／用口進／原田孝之共訳、理工学社）のＰ２３
９〜Ｐ２４０の方法に従って、Ｄｏｐａｍｉｎｅに対す
る抗体を作製した。

イムノアッセイには１％ＢＳＡを含む生理食塩水で１０
００倍に希釈して使用した。

（２）　　Ｄｏｐａｍｉｎｅの検出および定量操作■　
マイクロタイタープレート　（９６穴）に蛋白質液（１
％ＢＳＡ）を２００μｆ加え１夜４°Ｃで放置する。

■　マイクロタイタープレートの蛋白質液を捨て、Ｄｏ
ｐａｍｉｎｅを含む試料を５０ｕｌ添加し、さらに４％
グルタルアルデヒドを５０μｌ加え１時間室温で放置す
る。

■　生理食塩水で十分に洗浄する。

■　再び蛋白質液（１％ＢＳ＾）を２００μ！加え１時
間室温で放置する。

■　蛋白質液を捨てた後、（１）の抗体を１００μｌ加
え室温で２時間放置する。

■　生理食塩水で十分に洗浄する。

■　パーオキシダーゼを標識した２次抗体（３００倍希
釈）を１００μｌ加え室温で２時間放置する。

■　生理食塩水で十分に洗浄する。

■　０−フェニレンジアミンと過酸化水素水を含む発色
剤（ｐＨ５，０）を１００μ！加え室温で２０分間発色
させる。

（！ｉ）　　６Ｎの硫酸を５０μ！加えて発色を停止さ
せる。

■　イムノリーダーで測定する。　（λ＋＝４９０゜λ
、＝６２０の２波長、イムノリーダー）（３）上記操作
によって得たＤｏｐａｍｉｎｅ濃度と吸光度の関係の結
果を第１図に示した。

第１図の結果からも明らかなように、Ｄｏｐａｎ＋ｉｎ
ｅ濃度に応じて吸光度も増大し、両者間にリニアー関係
が存在することが判る。

比較例１ 実施例１において蛋白質を支持体に吸着させずに試料を
添加した以外は、該実施例と同様に行った結果を第２図
に示した。

しかしながら、第２図から明らかなように、Ｄｏｐａ＋
＊ｉｎｅ濃度が低い領域では、濃度が増加しても吸光度
に変化が認められず、また、Ｄｏｐａｍｉｎｅ濃度が高
い領域では、濃度が増加すると吸光度が逆に低下してし
まい、結局、吸光度からＤｏｐａｍｉｎｅ１度を知るこ
とができず、定量不可能であることが判る。

比較例２ 実施例１において架橋剤であるグルタルアルデヒドを添
加しない以外は該実施例と同様に行った結果を第３図に
示した。

しかしながら、第３図から明らかなように、Ｄｏｐａｓ
ｉｎｅ１度全域に亘ってその濃度が高くなっても吸光度
はほとんど変化することなく一定であって、結局、吸光
度からＤｏｐａｍｉｎｅｆｉ度を知ることができず、定
量が全く不可能であることが判る。

〔発明の効果〕

本発明のイムノアッセイに従えば、ハプテンとなる低分
子化合物の検出定量が標識抗原を使用せずともはじめて
可能となった。また末法は免疫平衡状態の一部を測定す
るＥＬＩＳＡ法の競合型の測定法とは異なり、免疫反応
した対象物の全量を測定するので、検出しようとする低
分子化合物の検出限界濃度が向上するという著効も得ら
れる。

また、支持体としてマイクロタイタープレートを用いる
と、吸着から測定に到るすべての操作をこの上で実施で
きるので、機械化ないし自動化も可能となり、本発明は
きわめてすぐれている。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例１の結果を図示したものであり、そし
て、第２図及び第３図は、それぞれ比較例１及び比較例
２の結果を図示したものである。 出願人　三井石油化学工業株式会社 代理人　弁理士　平　木　祐　輔 代理人　弁理士　石　井　貞　次 手続補正書（方式） 昭和６３年　８月　４日 特許庁長官　　吉　１）文　毅　殿 １、事件の表示 特願昭６３−１０４２８３号 ２、発明の名称 免疫検定法による低分子化合物の検出方法３、補正をす
る者 事件との関係　　　　特許出願人 住　所　東京都千代田区霞が関三丁目２番５号名　称　
（５８８）三井石油化学工業株式会社代表者竹林省吾 ４、代　理　人 住　所　東京都港区虎ノ門１丁目１５番７号５、補正命
令の日付 昭和６３年７月２６日（発送臼） ６、補正の対象 図面の第１図、第２図及び第３図 ７、補正の内容 別紙の通り

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）支持体に蛋白質を吸着させ、検出しようとする低
   分子化合物を含有するサンプルを添加し、架橋剤で処理
   することを特徴とする免疫検定法によって低分子化合物
   を検出する方法。
2. （２）該低分子化合物がアミノ基を有する化合物である
   ことを特徴とする請求項１記載の方法。
3. （３）該低分子化合物がカテコールアミンであることを
   特徴とする請求項１記載の方法。（４）該低分子化合物
   がドーパミンであることを特徴とする請求項１記載の方
   法。