JP3524401B2 - 酵素抗体複合体およびその製造方法 - Google Patents
酵素抗体複合体およびその製造方法Info
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- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
- G01N33/535—Production of labelled immunochemicals with enzyme label or co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or enzyme substrates
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は担体を介して共有結
合した酵素抗体複合体に関するもので、その複合体は免
疫組織化学、エンザイムイムノアッセイなどの免疫測定
に利用される。
合した酵素抗体複合体に関するもので、その複合体は免
疫組織化学、エンザイムイムノアッセイなどの免疫測定
に利用される。
【０００２】
【従来の技術】近年の免疫化学の進歩により、抗原抗体
反応を用いて微量の物質を感度良く検出する免疫測定が
広く用いられるようになった。例えば免疫組織化学の分
野においては、組織切片上の特定の物質をそれを認識す
る抗体を用いて検出することができる。その手法は、ま
ず組織切片上で検出すべき特定の物質を特異的に認識す
るする抗体（第一抗体）を反応させる。その際、第一抗
体に酵素を結合させておけば、その酵素活性により着色
性の基質を発色させることで特定の物質の検出が可能と
なる。しかしながら、実際にはこのシステムでは感度が
低いことと多種の第一抗体に酵素を標識することが現実
には多大な労力を要し困難なことから一般的ではない。
反応を用いて微量の物質を感度良く検出する免疫測定が
広く用いられるようになった。例えば免疫組織化学の分
野においては、組織切片上の特定の物質をそれを認識す
る抗体を用いて検出することができる。その手法は、ま
ず組織切片上で検出すべき特定の物質を特異的に認識す
るする抗体（第一抗体）を反応させる。その際、第一抗
体に酵素を結合させておけば、その酵素活性により着色
性の基質を発色させることで特定の物質の検出が可能と
なる。しかしながら、実際にはこのシステムでは感度が
低いことと多種の第一抗体に酵素を標識することが現実
には多大な労力を要し困難なことから一般的ではない。
【０００３】そのため通常は第一抗体との反応後、第一
抗体と特異的に結合する第二抗体と反応させる。このよ
うにすれば第一抗体の動物種に応じて数種の第二抗体を
用意すればよい。その際、第二抗体に直接酵素を結合さ
せた標品を用いれば、その酵素活性により基質を発色さ
せて検出することができる。しかしながら、このシステ
ムでもなお感度が低いために、工夫がなされている。
抗体と特異的に結合する第二抗体と反応させる。このよ
うにすれば第一抗体の動物種に応じて数種の第二抗体を
用意すればよい。その際、第二抗体に直接酵素を結合さ
せた標品を用いれば、その酵素活性により基質を発色さ
せて検出することができる。しかしながら、このシステ
ムでもなお感度が低いために、工夫がなされている。
【０００４】通常は複数のビオチンを結合させた第二抗
体を使用し、さらにビオチンと特異的に結合するストレ
プトアビジンに酵素を結合させたもの（酵素試薬）を反
応させることにより、第二抗体一分子当たりに結合する
酵素数を増幅させて特定の物質を良好な感度で検出す
る。また、予めストレプトアビジンと酵素が多数結合し
た複合体を形成させておき、ビオチンが結合した第二抗
体と反応させる増幅方法も使われている。このように組
織切片上の特定の物質を抗体を用いて検出することは可
能である。その操作には、１）第一抗体との反応、２）
第二抗体との反応、３）酵素試薬との反応、４）発色、
の過程が必要である。この場合、もし高品質な酵素標識
第二抗体が得られれば、１）第一抗体との反応、２）酵
素標識第二抗体との反応、３）発色、と従来より一段階
少ない操作で染色を実施できる。
体を使用し、さらにビオチンと特異的に結合するストレ
プトアビジンに酵素を結合させたもの（酵素試薬）を反
応させることにより、第二抗体一分子当たりに結合する
酵素数を増幅させて特定の物質を良好な感度で検出す
る。また、予めストレプトアビジンと酵素が多数結合し
た複合体を形成させておき、ビオチンが結合した第二抗
体と反応させる増幅方法も使われている。このように組
織切片上の特定の物質を抗体を用いて検出することは可
能である。その操作には、１）第一抗体との反応、２）
第二抗体との反応、３）酵素試薬との反応、４）発色、
の過程が必要である。この場合、もし高品質な酵素標識
第二抗体が得られれば、１）第一抗体との反応、２）酵
素標識第二抗体との反応、３）発色、と従来より一段階
少ない操作で染色を実施できる。
【０００５】また、２種の抗体を用いたエンザイムイム
ノアッセイは、特定の物質を感度良く検出することを可
能にした。エンザイムイムノアッセイにより特定の物質
を検出するには以下の作業を要する。即ち１）特定の物
質と結合する抗体（第一抗体）をマイクロタイタープレ
ートあるいはポリスチレンビーズなどに固相化する。
２）次にアルブミンなどの蛋白質でプレートあるいはビ
ーズをブロッキングする。３）特定の物質が含まれる溶
液を加え、一定時間反応させる。４）酵素標識した特定
の物質に結合する抗体（第二抗体）を加え、一定時間反
応させる。５）酵素の基質を加え、その発色の程度を分
光光度計にて測定する。なお、それぞれの段階の間には
洗浄操作が含まれる。
ノアッセイは、特定の物質を感度良く検出することを可
能にした。エンザイムイムノアッセイにより特定の物質
を検出するには以下の作業を要する。即ち１）特定の物
質と結合する抗体（第一抗体）をマイクロタイタープレ
ートあるいはポリスチレンビーズなどに固相化する。
２）次にアルブミンなどの蛋白質でプレートあるいはビ
ーズをブロッキングする。３）特定の物質が含まれる溶
液を加え、一定時間反応させる。４）酵素標識した特定
の物質に結合する抗体（第二抗体）を加え、一定時間反
応させる。５）酵素の基質を加え、その発色の程度を分
光光度計にて測定する。なお、それぞれの段階の間には
洗浄操作が含まれる。
【０００６】特定の物質の量は、この物質に結合した第
二抗体の標識酵素の酵素活性と相関することから、発色
の程度により特定の物質が定量できる。ここで使用され
る抗体はモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体のい
ずれでもよい。ただし、モノクローナル抗体の場合は固
相化に用いる抗体と標識する抗体が特定の物質の異なる
部位に結合する性質のものを使用する必要がある。エン
ザイムイムノアッセイの場合は免疫組織化学と異なり、
第二抗体に直接酵素を標識し増幅操作は行わないのが通
常である。従って、その測定系の感度は酵素標識した第
二抗体の品質に強く依存する。
二抗体の標識酵素の酵素活性と相関することから、発色
の程度により特定の物質が定量できる。ここで使用され
る抗体はモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体のい
ずれでもよい。ただし、モノクローナル抗体の場合は固
相化に用いる抗体と標識する抗体が特定の物質の異なる
部位に結合する性質のものを使用する必要がある。エン
ザイムイムノアッセイの場合は免疫組織化学と異なり、
第二抗体に直接酵素を標識し増幅操作は行わないのが通
常である。従って、その測定系の感度は酵素標識した第
二抗体の品質に強く依存する。
【０００７】以上のように高品質な酵素標識抗体を得る
ことにより、免疫組織化学の分野においてはより少ない
操作で染色を行うことが可能となり、またエンザイムイ
ムノアッセイにおいてはより高感度の測定を行うことが
可能となる。
ことにより、免疫組織化学の分野においてはより少ない
操作で染色を行うことが可能となり、またエンザイムイ
ムノアッセイにおいてはより高感度の測定を行うことが
可能となる。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明の
目的は、高品質な酵素標識抗体を新たに提供することで
ある。
目的は、高品質な酵素標識抗体を新たに提供することで
ある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、高品質な
酵素標識抗体を得るために酵素抗体複合体の製造方法に
ついて検討を行った結果、担体を介して酵素と抗体を結
合させることでその目的が達成されることを見出し、更
に研究を行い、遂に本発明の完成に至ったものである。
酵素標識抗体を得るために酵素抗体複合体の製造方法に
ついて検討を行った結果、担体を介して酵素と抗体を結
合させることでその目的が達成されることを見出し、更
に研究を行い、遂に本発明の完成に至ったものである。
【００１０】即ち、本発明は、マレイミド基あるいはチ
オール基を導入した１分子以上の酵素と、酵素にマレイ
ミド基を導入した場合にはチオール基を、また酵素にチ
オール基を導入した場合にはマレイミド基を導入した担
体がそれらを介して共有結合し、さらに前記複合体に残
存する少なくとも１個のアミノ基にマレイミド基を導入
し、抗体あるいは抗体断片上の還元して得たチオール基
を介して前記複合体のマレイミド基と共有結合した酵素
抗体複合体に関するものである。さらには、マレイミド
基あるいはチオール基を導入した酵素と、酵素にマレイ
ミド基を導入した場合にはチオール基を、また酵素にチ
オール基を導入した場合にはマレイミド基を導入した担
体を共有結合させる工程およびその複合体に残存する少
なくとも１個のアミノ基にマレイミド基を導入し、還元
した抗体をそのチオール基を介して共有結合させる工程
を含む酵素抗体複合体の製造方法に関するものである。
以下に本発明を詳細に説明する。
オール基を導入した１分子以上の酵素と、酵素にマレイ
ミド基を導入した場合にはチオール基を、また酵素にチ
オール基を導入した場合にはマレイミド基を導入した担
体がそれらを介して共有結合し、さらに前記複合体に残
存する少なくとも１個のアミノ基にマレイミド基を導入
し、抗体あるいは抗体断片上の還元して得たチオール基
を介して前記複合体のマレイミド基と共有結合した酵素
抗体複合体に関するものである。さらには、マレイミド
基あるいはチオール基を導入した酵素と、酵素にマレイ
ミド基を導入した場合にはチオール基を、また酵素にチ
オール基を導入した場合にはマレイミド基を導入した担
体を共有結合させる工程およびその複合体に残存する少
なくとも１個のアミノ基にマレイミド基を導入し、還元
した抗体をそのチオール基を介して共有結合させる工程
を含む酵素抗体複合体の製造方法に関するものである。
以下に本発明を詳細に説明する。
【００１１】本発明は当初免疫組織化学、エンザイムイ
ムノアッセイの分野において使用できる酵素抗体複合体
について検討する過程でなされたものであるが、他の分
野に適用することに何ら制限はない。
ムノアッセイの分野において使用できる酵素抗体複合体
について検討する過程でなされたものであるが、他の分
野に適用することに何ら制限はない。
【００１２】本発明でいう担体とは少なくとも２以上の
アミノ基を有する物質であれば特別な制限はない。しか
し、免疫測定の感度を上げるには多数の酵素、抗体を担
体に結合させることが望ましい。従って、ある程度の大
きさの分子量でしかも多数のアミノ基を有することが必
要である。そのような目的を達成する担体の例として
は、多数のアミノ基を有するペプチドポリマー及び／又
は多糖類が挙げられ、更にはそれらの分子量が５，００
０〜５００，０００、さらに好ましくは１０，０００〜
３００，０００の分子量のものが適している。ただし、
上記の分子量の範囲は一応の目安を示したものであっ
て、液中で沈澱や沈降を生じないものであれば上記範囲
よりも大きな分子量のものでも使用可能であり、また、
本発明の目的が達成されるのであれば上記範囲よりも小
さい分子量のものでも使用可能である。
アミノ基を有する物質であれば特別な制限はない。しか
し、免疫測定の感度を上げるには多数の酵素、抗体を担
体に結合させることが望ましい。従って、ある程度の大
きさの分子量でしかも多数のアミノ基を有することが必
要である。そのような目的を達成する担体の例として
は、多数のアミノ基を有するペプチドポリマー及び／又
は多糖類が挙げられ、更にはそれらの分子量が５，００
０〜５００，０００、さらに好ましくは１０，０００〜
３００，０００の分子量のものが適している。ただし、
上記の分子量の範囲は一応の目安を示したものであっ
て、液中で沈澱や沈降を生じないものであれば上記範囲
よりも大きな分子量のものでも使用可能であり、また、
本発明の目的が達成されるのであれば上記範囲よりも小
さい分子量のものでも使用可能である。
【００１３】本発明においては、結合性を有する多数の
アミノ基を含有するペプチドが担体として適宜使用され
る。その１例としては、リジン、アルギニン、オルニチ
ン、グルタミン、各種塩基性アミノ酸等α−アミノ基、
ε−アミノ基その他を有するアミノ基を有するペプチド
が例示される。更にその具体例としては、ε−アミノ基
を有するリジンのポリマーであるポリリジンのほか、リ
ジンを多数有するとともに他のアミノ酸も有する各種ペ
プチドが挙げられる。そして後者のペプチドポリマーの
例として、リジンとグリシンのランダムコポリマー、リ
ジンとセリンのランダムコポリマー、リジンとグルタミ
ン酸のランダムコポリマーなどが挙げられ、各種分子量
のものが市販されている。
アミノ基を含有するペプチドが担体として適宜使用され
る。その１例としては、リジン、アルギニン、オルニチ
ン、グルタミン、各種塩基性アミノ酸等α−アミノ基、
ε−アミノ基その他を有するアミノ基を有するペプチド
が例示される。更にその具体例としては、ε−アミノ基
を有するリジンのポリマーであるポリリジンのほか、リ
ジンを多数有するとともに他のアミノ酸も有する各種ペ
プチドが挙げられる。そして後者のペプチドポリマーの
例として、リジンとグリシンのランダムコポリマー、リ
ジンとセリンのランダムコポリマー、リジンとグルタミ
ン酸のランダムコポリマーなどが挙げられ、各種分子量
のものが市販されている。
【００１４】一方、アミノ基を導入した多糖類も、本発
明における担体として使用することができる。多糖類と
しては、デキストラン、アガロース、デキストリン、Ｄ
ＥＡＥ（又はＤＥＡＡ、ＴＥＡＥ、ＣＭ）−セルロー
ス、可溶性澱粉等が例示される。アミノ基の導入は、公
知の方法にしたがって、多糖類の骨格にアミノ基を導入
することによって行われる。例えば、アミノデキストラ
ンは、デキストランを原料として公知の方法によって調
製することができる。その例として、例えば、アミノデ
キストランを過ヨウ素酸ナトリウムで酸化してアルデヒ
ド基を生成させた後、ジアミンと反応させ水素化ホウ素
ナトリウムにて還元することにより、調製できる。その
分子量は原料のデキストランの分子量を選択することに
より所望する分子量のアミノデキストランが得られる。
明における担体として使用することができる。多糖類と
しては、デキストラン、アガロース、デキストリン、Ｄ
ＥＡＥ（又はＤＥＡＡ、ＴＥＡＥ、ＣＭ）−セルロー
ス、可溶性澱粉等が例示される。アミノ基の導入は、公
知の方法にしたがって、多糖類の骨格にアミノ基を導入
することによって行われる。例えば、アミノデキストラ
ンは、デキストランを原料として公知の方法によって調
製することができる。その例として、例えば、アミノデ
キストランを過ヨウ素酸ナトリウムで酸化してアルデヒ
ド基を生成させた後、ジアミンと反応させ水素化ホウ素
ナトリウムにて還元することにより、調製できる。その
分子量は原料のデキストランの分子量を選択することに
より所望する分子量のアミノデキストランが得られる。
【００１５】本発明において使用する酵素としては、１
以上のアミノ基を有するものであればすべての酵素が使
用可能であって、免疫測定法において一般的に使用され
る酵素が適宜使用される。その非限定例としては次のも
のが挙げられる：西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカ
リフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコー
スオキシダーゼ等。
以上のアミノ基を有するものであればすべての酵素が使
用可能であって、免疫測定法において一般的に使用され
る酵素が適宜使用される。その非限定例としては次のも
のが挙げられる：西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカ
リフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコー
スオキシダーゼ等。
【００１６】更に本発明においては、これらの酵素にマ
レイミド基を導入するが、そのためには１分子中にマレ
イミド基とスクシンイミドエステル基を有する化合物を
使用する。例えば、一端にマレイミド基を、他端にＮ−
ハイドロキシスクシンイミド基を有する二価の架橋剤を
用いればよい。例えば、N-(6-Maleimidocaproyloxy)suc
cinimide（ＥＭＣＳ）、N-(4-Maleimidobutyryloxy)suc
cinimide（ＧＭＢＳ）などである。これらの物質は酵素
のアミノ基と結合して酸アミド結合（−ＮＨ−ＣＯ−）
を形成して酵素と結合する一方、マレイミド基が導入さ
れる（このマレイミド基は、後述するように、担体に導
入されたチオール基と反応してチオエーテル結合（−Ｓ
−）を形成して担体に結合する）。
レイミド基を導入するが、そのためには１分子中にマレ
イミド基とスクシンイミドエステル基を有する化合物を
使用する。例えば、一端にマレイミド基を、他端にＮ−
ハイドロキシスクシンイミド基を有する二価の架橋剤を
用いればよい。例えば、N-(6-Maleimidocaproyloxy)suc
cinimide（ＥＭＣＳ）、N-(4-Maleimidobutyryloxy)suc
cinimide（ＧＭＢＳ）などである。これらの物質は酵素
のアミノ基と結合して酸アミド結合（−ＮＨ−ＣＯ−）
を形成して酵素と結合する一方、マレイミド基が導入さ
れる（このマレイミド基は、後述するように、担体に導
入されたチオール基と反応してチオエーテル結合（−Ｓ
−）を形成して担体に結合する）。
【００１７】１分子中にマレイミド基とスクシンイミド
基を併有する化合物としては、上記したＥＭＣＳ、ＧＭ
ＢＳのほか、次のものが非限定的に例示される：Ｎ−ス
クシンイミジル−Ｎ−マレイミドアセテート（N-Succin
imidyl-N-maleimidoacetate）、Ｎ−スクシンイミジル
−４−（Ｎ−マレイミド）ブチレート（N-Succinimidyl
-4-(N-maleimido) butyrate)、Ｎ−スクシミジル−６−
（マレイミド）ヘキサノエート（N-Succimidyl-6-(N-ma
leimido) hexanoate、Ｎ−スクシンイミジル−４−（Ｎ
−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシ
レート（N-Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl) cyclo
hexane-1-carboxylate)、Ｎ−スクシンイミジル−ｍ−
（Ｎ−マレイミド）ベンゾエート（N-succinimidyl-m-
(N-maleimido) benzoate)、Ｎ−スクシミジル−ｐ−
（Ｎ−マレイミドフェニル）−４−ブチレート（N-Succ
inimidyl-p-(N-maleimidophenyl)-4-butyrate)、Ｎ−ス
ルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）
シクロヘキサン−１−カルボキシレート（N-Sulfosucci
nimidyl-4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carbox
ylate)、Ｎ−スクシンイミジル−ｍ−（Ｎ−マレイミ
ド）ベンゾエート（N-Succinimidyl-m-(N-maleimido) b
enzoate)、Ｎ−スルホスクシンイミジル−ｐ−（Ｎ−マ
レイミドフェニル）−４−ブチレート（N-Sulfosuccini
midyl-p-(N-maleimidophenyl)-4-butyrate) など。
基を併有する化合物としては、上記したＥＭＣＳ、ＧＭ
ＢＳのほか、次のものが非限定的に例示される：Ｎ−ス
クシンイミジル−Ｎ−マレイミドアセテート（N-Succin
imidyl-N-maleimidoacetate）、Ｎ−スクシンイミジル
−４−（Ｎ−マレイミド）ブチレート（N-Succinimidyl
-4-(N-maleimido) butyrate)、Ｎ−スクシミジル−６−
（マレイミド）ヘキサノエート（N-Succimidyl-6-(N-ma
leimido) hexanoate、Ｎ−スクシンイミジル−４−（Ｎ
−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシ
レート（N-Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl) cyclo
hexane-1-carboxylate)、Ｎ−スクシンイミジル−ｍ−
（Ｎ−マレイミド）ベンゾエート（N-succinimidyl-m-
(N-maleimido) benzoate)、Ｎ−スクシミジル−ｐ−
（Ｎ−マレイミドフェニル）−４−ブチレート（N-Succ
inimidyl-p-(N-maleimidophenyl)-4-butyrate)、Ｎ−ス
ルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）
シクロヘキサン−１−カルボキシレート（N-Sulfosucci
nimidyl-4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carbox
ylate)、Ｎ−スクシンイミジル−ｍ−（Ｎ−マレイミ
ド）ベンゾエート（N-Succinimidyl-m-(N-maleimido) b
enzoate)、Ｎ−スルホスクシンイミジル−ｐ−（Ｎ−マ
レイミドフェニル）−４−ブチレート（N-Sulfosuccini
midyl-p-(N-maleimidophenyl)-4-butyrate) など。
【００１８】また本発明においては、上記と異なり、酵
素にチオール基を導入する場合も包含されるが、その場
合、酵素にチオール基を導入するには、S-acetylmercap
tosuccinic anhydride、N-Succinimidyl 3-(2-pyridyld
ithio)propionate（ＳＰＤＰ）などを用いる方法が知ら
れている。これらの試薬は酵素のアミノ基と反応しブロ
ックされたチオール基が酵素に導入される。その後、S-
acetylmercaptosuccinic anhydrideを用いた場合にはHy
dorxylamine、ＳＰＤＰを用いた場合にはＤＴＴで処理
することによりチオール基をブロックしている保護基を
除去し、チオール基を生成する。
素にチオール基を導入する場合も包含されるが、その場
合、酵素にチオール基を導入するには、S-acetylmercap
tosuccinic anhydride、N-Succinimidyl 3-(2-pyridyld
ithio)propionate（ＳＰＤＰ）などを用いる方法が知ら
れている。これらの試薬は酵素のアミノ基と反応しブロ
ックされたチオール基が酵素に導入される。その後、S-
acetylmercaptosuccinic anhydrideを用いた場合にはHy
dorxylamine、ＳＰＤＰを用いた場合にはＤＴＴで処理
することによりチオール基をブロックしている保護基を
除去し、チオール基を生成する。
【００１９】担体にマレイミド基、チオール基を導入す
る方法は、酵素にそれらを導入する方法と何ら変わりは
ない。マレイミド基とチオール基は速やかに反応して共
有結合する。従って、マレイミド基を導入した酵素とチ
オール基を導入した担体を混合することにより、両者は
共有結合する。チオール基を導入した酵素とマレイミド
基を導入した担体も全く同様である。担体を酵素と結合
させる際、後に抗体とも結合させるため担体に少なくと
も１以上のアミノ基を残存させるようにマレイミド基、
チオール基を導入する必要がある。この条件の設定には
特別な困難は伴わず、例えばマレイミド基、チオール基
を導入する際に用いる試薬のモル数を担体のアミノ基の
モル数より少なくすればよい。
る方法は、酵素にそれらを導入する方法と何ら変わりは
ない。マレイミド基とチオール基は速やかに反応して共
有結合する。従って、マレイミド基を導入した酵素とチ
オール基を導入した担体を混合することにより、両者は
共有結合する。チオール基を導入した酵素とマレイミド
基を導入した担体も全く同様である。担体を酵素と結合
させる際、後に抗体とも結合させるため担体に少なくと
も１以上のアミノ基を残存させるようにマレイミド基、
チオール基を導入する必要がある。この条件の設定には
特別な困難は伴わず、例えばマレイミド基、チオール基
を導入する際に用いる試薬のモル数を担体のアミノ基の
モル数より少なくすればよい。
【００２０】本発明でいう抗体はポリクロナール抗体、
モノクロナール抗体のいずれでもよい。抗体の重鎖はＳ
−Ｓ結合により重鎖同士が結合しており、その結合は還
元剤にて切断されチオール基を生じる。還元剤としては
メルカプトエタノール、メルカプトエチルアミンなどが
あげられる。また、抗体はペプシンによる消化でF(ab')
2断片を生じる。F(ab')2も上記還元剤によりＳ−Ｓ結合
が切断されFab'となりチオール基が新たに生じる。これ
らのチオール基は抗体の抗原結合には関与せず、しかも
抗原結合部位の近傍には存在しないためこのチオール基
を介して他の物質と結合しても抗原への結合性が失われ
ることはない。抗体断片としては、F(ab')2のほか、Fa
b'、F(abc')2、Fabc'等も使用することができる。
モノクロナール抗体のいずれでもよい。抗体の重鎖はＳ
−Ｓ結合により重鎖同士が結合しており、その結合は還
元剤にて切断されチオール基を生じる。還元剤としては
メルカプトエタノール、メルカプトエチルアミンなどが
あげられる。また、抗体はペプシンによる消化でF(ab')
2断片を生じる。F(ab')2も上記還元剤によりＳ−Ｓ結合
が切断されFab'となりチオール基が新たに生じる。これ
らのチオール基は抗体の抗原結合には関与せず、しかも
抗原結合部位の近傍には存在しないためこのチオール基
を介して他の物質と結合しても抗原への結合性が失われ
ることはない。抗体断片としては、F(ab')2のほか、Fa
b'、F(abc')2、Fabc'等も使用することができる。
【００２１】酵素が結合した担体にマレイミド基を導入
する方法は、上述したとおりである。マレイミド基を導
入した酵素結合担体と、還元することによりチオール基
を生成した抗体あるいは抗体断片は両者を混合すること
により容易に共有結合させることができ、それにより抗
体を介した酵素抗体複合体が完成する。
する方法は、上述したとおりである。マレイミド基を導
入した酵素結合担体と、還元することによりチオール基
を生成した抗体あるいは抗体断片は両者を混合すること
により容易に共有結合させることができ、それにより抗
体を介した酵素抗体複合体が完成する。
【００２２】本発明の実施態様のひとつとして、ポリ−
Ｌ−リジンを担体として用い、マレイミド基を導入した
酵素を用いた場合の酵素抗体複合体の製造について、以
下に概説する。
Ｌ−リジンを担体として用い、マレイミド基を導入した
酵素を用いた場合の酵素抗体複合体の製造について、以
下に概説する。
【００２３】 チオール基結合担体の作成
ポリ−Ｌ−リジン含有液にＳ−アセチルメルカプトエチ
ルコハク酸無水物を加えて反応させた後、ヒドロキシル
アミンを反応させ、担体にチオール基を導入する（担体
−ＳＨの作成）。但し、担体はすべてチオール化するの
ではなく、いくつかのアミノ基は遊離のまま残してお
く。
ルコハク酸無水物を加えて反応させた後、ヒドロキシル
アミンを反応させ、担体にチオール基を導入する（担体
−ＳＨの作成）。但し、担体はすべてチオール化するの
ではなく、いくつかのアミノ基は遊離のまま残してお
く。
【００２４】 マレイミド基結合ペルオキシダーゼの
作成 西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）にＥＭＣＳを反
応させ、マレイミド基結合ペルオキシダーゼ（Ｍ−ＰＯ
Ｄ）を作成する。
作成 西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）にＥＭＣＳを反
応させ、マレイミド基結合ペルオキシダーゼ（Ｍ−ＰＯ
Ｄ）を作成する。
【００２５】 ＰＯＤ−ポリＬリジン複合体の作成
チオール基結合担体とＭ−ＰＯＤとを混合して４℃、１
８時間反応させることにより、複合体（担体−ＳＨ−Ｍ
−ＰＯＤ）を作成する。この反応により、上記したＳＨ
−Ｍ−ＰＯＤのグループ、ＳＨのみのグループが導入さ
れるほか、何も導入されないフリーのアミノ基を有する
担体（複合体）が得られる。
８時間反応させることにより、複合体（担体−ＳＨ−Ｍ
−ＰＯＤ）を作成する。この反応により、上記したＳＨ
−Ｍ−ＰＯＤのグループ、ＳＨのみのグループが導入さ
れるほか、何も導入されないフリーのアミノ基を有する
担体（複合体）が得られる。
【００２６】 マレイミド基結合前記複合体の作成
前記複合体にＥＭＣＳ溶液を加えて両者を反応させ、前
記複合体の遊離のアミノ基の一部にマレイミド基を導入
する。この反応により、ＳＨ−Ｍ−ＰＯＤグループ、更
にＭのみのグループが導入されるほか、何も導入されな
いフリーのアミノ基を残存せしめたままの担体（複合
体）が得られる。
記複合体の遊離のアミノ基の一部にマレイミド基を導入
する。この反応により、ＳＨ−Ｍ−ＰＯＤグループ、更
にＭのみのグループが導入されるほか、何も導入されな
いフリーのアミノ基を残存せしめたままの担体（複合
体）が得られる。
【００２７】 還元した抗体断片の作成
ヤギ抗ウサギＩｇＧをペプシン処理してそのF(ab')2断
片を得、これにシステアミンを反応させて還元した抗体
断片（ＳＨ−Ｆａｂ'）を得る。
片を得、これにシステアミンを反応させて還元した抗体
断片（ＳＨ−Ｆａｂ'）を得る。
【００２８】 酵素抗体複合体の作成
還元した抗体断片とで得た複合体とを混合して反応さ
せることにより、担体に結合したマレイミド基の多数に
断片（ＳＨ−Ｆａｂ'）を導入し、酵素抗体複合体を得
る。この反応により、ＳＨ−Ｍ−ＰＯＤ、Ｍの各グルー
プが導入され更にＭの一部にはＳ−Ｆａｂ'が導入され
るほか、何も導入されないフリーのアミノ基を残存せし
めたままの担体（酵素抗体複合体）が得られる。
せることにより、担体に結合したマレイミド基の多数に
断片（ＳＨ−Ｆａｂ'）を導入し、酵素抗体複合体を得
る。この反応により、ＳＨ−Ｍ−ＰＯＤ、Ｍの各グルー
プが導入され更にＭの一部にはＳ−Ｆａｂ'が導入され
るほか、何も導入されないフリーのアミノ基を残存せし
めたままの担体（酵素抗体複合体）が得られる。
【００２９】本発明に係る酵素抗体複合体は、上記した
構造を採ることにはじめて成功したものであり、そのた
め、先ず、抗体（Ｍ−Ｓ−Ｆａｂ'）の数が多くて抗原
と結合する確率がきわめて高くなり、その結果、感度が
きわめて高くなり、また、標識酵素（ＳＨ−Ｍ−ＰＯ
Ｄ）の数が多いため、たとえごく一部の抗体しか抗原に
結合しなくとも、多数の標識酵素がそれには結合してい
るために（換言すれば、シグナルが多いために）これを
発色せしめた場合、きわめて強い発色が得られ、この点
でも感度がきわめて高くなる。したがって、本発明によ
れば、ごく微量の試料、非常に希釈された試料であって
も、正確にその分析をすることができるという著効が奏
される。
構造を採ることにはじめて成功したものであり、そのた
め、先ず、抗体（Ｍ−Ｓ−Ｆａｂ'）の数が多くて抗原
と結合する確率がきわめて高くなり、その結果、感度が
きわめて高くなり、また、標識酵素（ＳＨ−Ｍ−ＰＯ
Ｄ）の数が多いため、たとえごく一部の抗体しか抗原に
結合しなくとも、多数の標識酵素がそれには結合してい
るために（換言すれば、シグナルが多いために）これを
発色せしめた場合、きわめて強い発色が得られ、この点
でも感度がきわめて高くなる。したがって、本発明によ
れば、ごく微量の試料、非常に希釈された試料であって
も、正確にその分析をすることができるという著効が奏
される。
【００３０】
【実施例】以下に本発明を更に詳細に説明するために実
施例を記載するが、本発明はこれら実施例に限定される
ものではない。
施例を記載するが、本発明はこれら実施例に限定される
ものではない。
【００３１】
【実施例１】（酵素担体複合体の製造）マレイミド基結
合ペルオキシダーゼを次のように調製した。１．２ｍｌ
の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に溶
解した１６ｍｇの西洋ワサビペルオキシダーゼに３００
μｌのＤＭＦに溶解した５ｍｇのＥＭＣＳを加え、室温
で３０分反応させた。その後、セファデックスＧ２５
（ファルマシア製）にてゲルろ過を行い４０３ｎｍの吸
光度を測定し、そのピークを集め限外濾過にて濃縮し
た。
合ペルオキシダーゼを次のように調製した。１．２ｍｌ
の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に溶
解した１６ｍｇの西洋ワサビペルオキシダーゼに３００
μｌのＤＭＦに溶解した５ｍｇのＥＭＣＳを加え、室温
で３０分反応させた。その後、セファデックスＧ２５
（ファルマシア製）にてゲルろ過を行い４０３ｎｍの吸
光度を測定し、そのピークを集め限外濾過にて濃縮し
た。
【００３２】次に、チオール基結合ポリリジンを以下の
通り調製した。８８０μｌの０．１Ｍりん酸緩衝液に溶
解した４．４ｍｇのポリＬリジンハイドロブロマイド
（シグマ社製、分子量１２００００）に２０μｌのＤＭ
Ｆに溶解した３．２ｍｇのS-acetylmercaptosuccinic a
nhydrideを加え、３０℃、２０分間反応させた。その
後、２００μｌの０．１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７）及び
１Ｍ hydoxylamine（ｐＨ７）、２０μｌのＥＤＴＡナ
トリウム溶液（ｐＨ７）を加え、３０℃、５分間反応さ
せた。次に反応液をセファデックスＧ２５にてゲルろ過
し、２３０ｎｍの吸光度のピークを集め、限外ろ過にて
濃縮した。
通り調製した。８８０μｌの０．１Ｍりん酸緩衝液に溶
解した４．４ｍｇのポリＬリジンハイドロブロマイド
（シグマ社製、分子量１２００００）に２０μｌのＤＭ
Ｆに溶解した３．２ｍｇのS-acetylmercaptosuccinic a
nhydrideを加え、３０℃、２０分間反応させた。その
後、２００μｌの０．１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７）及び
１Ｍ hydoxylamine（ｐＨ７）、２０μｌのＥＤＴＡナ
トリウム溶液（ｐＨ７）を加え、３０℃、５分間反応さ
せた。次に反応液をセファデックスＧ２５にてゲルろ過
し、２３０ｎｍの吸光度のピークを集め、限外ろ過にて
濃縮した。
【００３３】マレイミド基結合ペルオキシダーゼとチオ
ール基結合ポリＬリジンを混合し４℃、１８時間反応さ
せた。反応物をウルトロゲルＡｃＡ４４（ＢＩＯＳＥＰ
ＲＡ社製）にてゲルろ過し、各分画の４０３ｎｍの吸光
度を測定した。西洋ワサビペルオキシダーゼとポリＬリ
ジンの複合体は高分子画分に存在した。
ール基結合ポリＬリジンを混合し４℃、１８時間反応さ
せた。反応物をウルトロゲルＡｃＡ４４（ＢＩＯＳＥＰ
ＲＡ社製）にてゲルろ過し、各分画の４０３ｎｍの吸光
度を測定した。西洋ワサビペルオキシダーゼとポリＬリ
ジンの複合体は高分子画分に存在した。
【００３４】
【実施例２】（酵素抗体複合体の製造１）１．５ｍｌの
０．１Ｍりん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解
した５ｍｇの西洋ワサビペルオキシダーゼとポリＬリジ
ンの複合体に３７５μｌのＤＭＦに溶解した１５ｍｇの
ＥＭＣＳを加え室温で３０分間反応させた。反応物をセ
ファデックスＧ２５を用いたゲルろ過にて分離し、４０
３ｎｍのピークを分取、限外ろ過にて濃縮した。
０．１Ｍりん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解
した５ｍｇの西洋ワサビペルオキシダーゼとポリＬリジ
ンの複合体に３７５μｌのＤＭＦに溶解した１５ｍｇの
ＥＭＣＳを加え室温で３０分間反応させた。反応物をセ
ファデックスＧ２５を用いたゲルろ過にて分離し、４０
３ｎｍのピークを分取、限外ろ過にて濃縮した。
【００３５】次に、２．３ｍｌの０．１Ｍりん酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ６）に溶解した２３ｍｇのヤギ抗ウサ
ギＩｇＧに０．１Ｍ cysteamine hydrochlorideを３１
１μｌ加え３７℃、１．５時間反応させた。反応物はセ
ファデックスＧ２５にてゲルろ過し、２８０ｎｍのピー
クを集め限外ろ過にて濃縮した。これらの濃縮物を混合
し、４℃、１８時間反応させた。反応物をウルトロゲル
ＡｃＡ４４にてゲルろ過し、各分画の２８０ｎｍ、４０
３ｎｍの吸光度を測定した。両波長の吸収を持つ高分子
量画分が酵素抗体複合体であった。
ウム緩衝液（ｐＨ６）に溶解した２３ｍｇのヤギ抗ウサ
ギＩｇＧに０．１Ｍ cysteamine hydrochlorideを３１
１μｌ加え３７℃、１．５時間反応させた。反応物はセ
ファデックスＧ２５にてゲルろ過し、２８０ｎｍのピー
クを集め限外ろ過にて濃縮した。これらの濃縮物を混合
し、４℃、１８時間反応させた。反応物をウルトロゲル
ＡｃＡ４４にてゲルろ過し、各分画の２８０ｎｍ、４０
３ｎｍの吸光度を測定した。両波長の吸収を持つ高分子
量画分が酵素抗体複合体であった。
【００３６】
【実施例３】（酵素抗体複合体の製造２）１．２ｍｌの
０．１Ｍりん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解
した２ｍｇの西洋ワサビペルオキシダーゼとポリＬリジ
ンの複合体に３００μｌのＤＭＦに溶解した１５ｍｇの
ＥＭＣＳを加え室温で３０分間反応させた。反応物をセ
ファデックスＧ２５を用いたゲルろ過にて分離し、４０
３ｎｍのピークを分取、限外ろ過にて濃縮した。
０．１Ｍりん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解
した２ｍｇの西洋ワサビペルオキシダーゼとポリＬリジ
ンの複合体に３００μｌのＤＭＦに溶解した１５ｍｇの
ＥＭＣＳを加え室温で３０分間反応させた。反応物をセ
ファデックスＧ２５を用いたゲルろ過にて分離し、４０
３ｎｍのピークを分取、限外ろ過にて濃縮した。
【００３７】ヤギ抗ウサギＩｇＧは、公知の方法によ
り、そのF(ab')2断片を調製した。１ｍｌのりん酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ６）に溶解した５ｍｇのヤギ抗ウサ
ギＩｇＧF(ab')2に０．１Ｍ cysteamine hydrochloride
を１１１μｌ加え３７℃、１．５時間反応させた。反応
物はセファデックスＧ２５にてゲルろ過し、２８０ｎｍ
のピークを集め限外ろ過にて濃縮した。これらの濃縮物
を混合し、４℃、１８時間反応させた。反応物をウルト
ロゲルＡｃＡ４４にてゲルろ過し、各分画の２８０ｎ
ｍ、４０３ｎｍの吸光度を測定した。両波長の吸収を持
つ高分子量画分が酵素抗体複合体であった。
り、そのF(ab')2断片を調製した。１ｍｌのりん酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ６）に溶解した５ｍｇのヤギ抗ウサ
ギＩｇＧF(ab')2に０．１Ｍ cysteamine hydrochloride
を１１１μｌ加え３７℃、１．５時間反応させた。反応
物はセファデックスＧ２５にてゲルろ過し、２８０ｎｍ
のピークを集め限外ろ過にて濃縮した。これらの濃縮物
を混合し、４℃、１８時間反応させた。反応物をウルト
ロゲルＡｃＡ４４にてゲルろ過し、各分画の２８０ｎ
ｍ、４０３ｎｍの吸光度を測定した。両波長の吸収を持
つ高分子量画分が酵素抗体複合体であった。
【００３８】
【実施例４】（免疫組織化学における実施例３で調製し
た酵素抗体複合体と従来法で調製した酵素標識抗体の比
較）第一抗体としてウサギ抗Ｓ−１００ポリクローナル
抗体（ニチレイ）を用い、胃の組織切片の染色を行っ
た。まず、組織を薄切しスライドに付着させた。その
後、脱パラフィン処理及び脱ペルオキシダーゼ処理を行
い上記第一抗体と室温で１時間反応させた。ＰＢＳでよ
くすすいだ後、第二抗体を滴下した。第二抗体は実施例
３で作製したものを２μｇ／ｍｌの濃度で用いた。ま
た、従来法でペルオキシダーゼ標識した抗体も同濃度で
使用した。標識方法は酵素免疫測定法第３版医学書院ｐ
８６〜９２に従い、用いた原料及び試薬はすべて実施例
３と同様のものを用いた。これらの第二抗体とは室温で
３０分間反応させた。
た酵素抗体複合体と従来法で調製した酵素標識抗体の比
較）第一抗体としてウサギ抗Ｓ−１００ポリクローナル
抗体（ニチレイ）を用い、胃の組織切片の染色を行っ
た。まず、組織を薄切しスライドに付着させた。その
後、脱パラフィン処理及び脱ペルオキシダーゼ処理を行
い上記第一抗体と室温で１時間反応させた。ＰＢＳでよ
くすすいだ後、第二抗体を滴下した。第二抗体は実施例
３で作製したものを２μｇ／ｍｌの濃度で用いた。ま
た、従来法でペルオキシダーゼ標識した抗体も同濃度で
使用した。標識方法は酵素免疫測定法第３版医学書院ｐ
８６〜９２に従い、用いた原料及び試薬はすべて実施例
３と同様のものを用いた。これらの第二抗体とは室温で
３０分間反応させた。
【００３９】さらに、ストレプトアビジン・ビオチン法
（ＳＡＢ法）とも比較するため、第二抗体としてビオチ
ン標識抗ウサギポリクローナル抗体（ニチレイ）とも反
応させた。その場合、第二抗体と１０分間反応させた
後、洗浄しペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン
（ニチレイ）を滴下、５分間反応させた。その後いずれ
の場合もよく洗浄し、基質溶液（ジアミノベンチジン、
過酸化水素）を滴下し反応させ精製水で洗浄、封入を行
い顕微鏡にて検鏡した。その結果を下に示した。実施例
３で作製した酵素抗体複合体は直接それらを標識したも
のと比較して染色強度が格段に優れており、また増幅操
作をおこなうＳＡＢ法よりも優れていた。得られた結果
を下記表に示す。
（ＳＡＢ法）とも比較するため、第二抗体としてビオチ
ン標識抗ウサギポリクローナル抗体（ニチレイ）とも反
応させた。その場合、第二抗体と１０分間反応させた
後、洗浄しペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン
（ニチレイ）を滴下、５分間反応させた。その後いずれ
の場合もよく洗浄し、基質溶液（ジアミノベンチジン、
過酸化水素）を滴下し反応させ精製水で洗浄、封入を行
い顕微鏡にて検鏡した。その結果を下に示した。実施例
３で作製した酵素抗体複合体は直接それらを標識したも
のと比較して染色強度が格段に優れており、また増幅操
作をおこなうＳＡＢ法よりも優れていた。得られた結果
を下記表に示す。
【００４０】
Ａ：従来法の酵素標識抗体 Ｂ：実施例３の酵素抗体複
合体 Ｃ：ストレプトアビジン・ビチオン法
合体 Ｃ：ストレプトアビジン・ビチオン法
【００４１】
【実施例５】（エンザイムイムノアッセイにおける実施
例３で調製した酵素抗体複合体と従来法で調製した酵素
標識抗体の比較）９６穴マイクロタイタープレートにヤ
ギ抗ウサギＩｇＧを１０μｇ／ｍｌの濃度で１００μｌ
を加え、室温で２時間インキュベートした。生理食塩水
で洗浄後、１％ウシ血清アルブミンを２００μｌ加え２
時間インキュベートした。所定の濃度（０〜２００ｐｇ
／ｍｌ）のウサギＩｇＧを１００μｌ加え２時間インキ
ュベートし、生理食塩水で洗浄後、実施例３で調製した
酵素抗体複合体あるいは従来法で調製した酵素標識抗体
をいずれも抗体量換算で２μｇ／ｍｌの濃度で１００μ
ｌ加え３０分インキュベートした。さらに生理食塩水で
洗浄し、基質溶液（テトラメチルベンチジン、過酸化水
素）を１００μｌ加え１５分反応させ、１Ｎ硫酸５０μ
ｌ加えて反応を止めた。呈色の程度をマイクロプレート
リーダーで測定した。結合は図１の通りで、実施例３で
調製した酵素抗体複合体が従来法で調製した酵素標識抗
体と比較して著しく優れていた。
例３で調製した酵素抗体複合体と従来法で調製した酵素
標識抗体の比較）９６穴マイクロタイタープレートにヤ
ギ抗ウサギＩｇＧを１０μｇ／ｍｌの濃度で１００μｌ
を加え、室温で２時間インキュベートした。生理食塩水
で洗浄後、１％ウシ血清アルブミンを２００μｌ加え２
時間インキュベートした。所定の濃度（０〜２００ｐｇ
／ｍｌ）のウサギＩｇＧを１００μｌ加え２時間インキ
ュベートし、生理食塩水で洗浄後、実施例３で調製した
酵素抗体複合体あるいは従来法で調製した酵素標識抗体
をいずれも抗体量換算で２μｇ／ｍｌの濃度で１００μ
ｌ加え３０分インキュベートした。さらに生理食塩水で
洗浄し、基質溶液（テトラメチルベンチジン、過酸化水
素）を１００μｌ加え１５分反応させ、１Ｎ硫酸５０μ
ｌ加えて反応を止めた。呈色の程度をマイクロプレート
リーダーで測定した。結合は図１の通りで、実施例３で
調製した酵素抗体複合体が従来法で調製した酵素標識抗
体と比較して著しく優れていた。
【００４２】図１は上記の結果を示すものである。図
中、横軸はウサギＩｇＧの濃度、縦軸は４５０ｎｍの吸
光度を示すものである。○は実施例３で作製した酵素抗
体複合体、●は従来法で作製した酵素標識抗体である。
中、横軸はウサギＩｇＧの濃度、縦軸は４５０ｎｍの吸
光度を示すものである。○は実施例３で作製した酵素抗
体複合体、●は従来法で作製した酵素標識抗体である。
【００４３】
【発明の効果】本発明の酵素抗体複合体は、特に免疫組
織化学、エンザイムイムノアッセイにおける酵素標識抗
体（第１抗体はもとより第２抗体としても）として有用
であり、感度の高い免疫測定を可能にするものである。
織化学、エンザイムイムノアッセイにおける酵素標識抗
体（第１抗体はもとより第２抗体としても）として有用
であり、感度の高い免疫測定を可能にするものである。
【図１】本発明の実施例５の結果を示す図である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(56)参考文献 特開 平３−158758（ＪＰ，Ａ)
特開 平２−201162（ＪＰ，Ａ)
特開 平３−89165（ＪＰ，Ａ)
特開 平３−89164（ＪＰ，Ａ)
特開 平２−66459（ＪＰ，Ａ)
特開 昭61−205863（ＪＰ，Ａ)
特開 昭63−101754（ＪＰ，Ａ)
特開 昭61−13156（ＪＰ，Ａ)
国際公開90／013029（ＷＯ，Ａ１)
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
G01N 33/535
Claims (7)
- 【請求項１】 担体として分子量が５，０００〜５０
０，０００のポリリジン又はアミノデキストランを用
い； （１）マレイミド基を導入した１分子以上の酵素とチオ
ール基を導入した担体とをこれらの基を介して共有結合
し； （２）上記（１）によって得た酵素−担体複合体に残存
する少なくとも１個のアミノ基にマレイミド基を導入
し； （３）還元することによって得た抗体あるいは抗体断片
上のチオール基を介して上記（２）によって得た酵素−
担体複合体のマレイミド基と共有結合してなること； を特徴とする酵素−担体−抗体複合体。 - 【請求項２】 請求項１の（１）において、チオール基
を導入した１分子以上の酵素とマレイミド基を導入した
担体とをこれらの基を介して共有結合してなること、を
特徴とする請求項１に記載の複合体。 - 【請求項３】 担体が１０，０００〜３００，０００の
分子量を有するものであること、を特徴とする請求項１
又は２に記載の複合体。 - 【請求項４】 抗体断片が抗体のＦ（ａｂ’）2である
こと、を特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載
の複合体。 - 【請求項５】 酵素が、西洋ワサビペルオキシダーゼ、
アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グ
ルコースオキシダーゼから選ばれる少なくともひとつで
あること、を特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に
記載の複合体。 - 【請求項６】 請求項１〜５のいずれか１項に記載の複
合体を含有すること、を特徴とする免疫測定用キット。 - 【請求項７】 アミノ基を有する担体を用い； （１）マレイミド基又はチオール基を導入した酵素と担
体とを共有結合して、酵素−担体複合体を形成せしめ； ｉ）その際、マレイミド基を導入した酵素の場合は、チ
オール基を導入した担体とチオール基を介して担体に酵
素を共有結合し；あるいは、 ii）チオール基を導入した酵素の場合は、マレイミド基
を導入した担体とマレイミド基を介して担体に酵素を共
有結合し； （２）上記（１）によって得た酵素−担体複合体に残存
する少なくとも１個のアミノ基にマレイミド基を導入
し；そして、 （３）還元することによって得た抗体あるいは抗体断片
上のチオール基を介して上記（２）によって得た酵素−
担体複合体のマレイミド基を共有結合すること； を特徴とする酵素−担体−抗体複合体の製造方法。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27931998A JP3524401B2 (ja) | 1998-09-16 | 1998-09-16 | 酵素抗体複合体およびその製造方法 |
| DK99105375T DK0992794T3 (da) | 1998-09-16 | 1999-03-16 | Enzym-antistofkompleks og en fremgangsmåde til fremstilling heraf |
| DE69903899T DE69903899T2 (de) | 1998-09-16 | 1999-03-16 | Enzym-Antikörper-Komplex und eine Methode zur Herstellung desselben |
| ES99105375T ES2183451T3 (es) | 1998-09-16 | 1999-03-16 | Complejo enzima-anticuerpo y un metodo para su fabricacion. |
| EP99105375A EP0992794B1 (en) | 1998-09-16 | 1999-03-16 | Enzyme-antibody complex and a method for manufacturing the same |
| US09/268,748 US6252053B1 (en) | 1998-09-16 | 1999-03-17 | Enzyme-antibody complex and a method for manufacturing the same |
Applications Claiming Priority (1)
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