JPH10507997A

JPH10507997A - Ｔ細胞の活性化および増殖を誘導するための抗ｃｄ３抗体−アミノデキストラン結合体

Info

Publication number: JPH10507997A
Application number: JP7501915A
Authority: JP
Inventors: ウェイドイーボルトン; ジョンエイメイプルズ; オラヴィーシーマン; ノーマスーケニオン; シンシアジーヘリー
Original assignee: クールターコーポレイション
Priority date: 1993-06-11
Filing date: 1994-06-01
Publication date: 1998-08-04
Also published as: EP0702793A1; EP0702793A4; CA2164646A1; WO1994029724A1; AU6920194A; DE69433087T2; DE69433087D1; EP0702793B1; US5527713A; US5658741A

Abstract

(57)【要約】本発明は複数のモノクローナル抗体に結合する約５〜20重量％のアミン基を含む新規アミノデキストラン化合物の使用について開示する。得られた抗体―アミノデキストラン化合物は選択した哺乳類細胞の活性化および増殖を誘導するのに用いることができる。特定例には、Ｔ細胞の活性化および増殖を誘導するための薬剤として、それぞれ、約５重量％および16重量％のアミン基を含むアミノデキストランに結合した抗 CD3モノクローナル抗体を用いることを示す。

Description

【発明の詳細な説明】Ｔ細胞の活性化および増殖を誘導するための抗CD3抗体−アミノデキストラン結合体技術分野本発明は白血球の活性化および増殖の誘導に用いる新規な抗体−アミノデキストラン結合体の使用に関する。特に、本発明はアミノデキストランに共有結合した抗CD3モノクローナル抗体の使用に関する。共有結合した抗体−アミノデキストラン結合体は種々の病態、例えば、AIDSおよび他の免疫不全、感染症、ガン、自己免疫疾患、およびアトピー性疾患を伴う患者の免疫細胞機能の分析に用いることができる。さらに、この技術を用いることにより、移植細胞および／または移植組織の受容者からの白血球を機能的に評価することができる。発明の背景医薬または疾病により誘導される免疫抑制は、Ｔ細胞および／または補助細胞の機能に変調を起こすことがある。例えば、AIDS患者が分裂促進剤、自己抗原、同種抗原、および可溶性抗原に対する不応答を現すことが示された。この変調した免疫反応性は反応（Ｔ細胞）細胞群と刺激（単球および樹状細胞）細胞群との双方の欠陥に原因がある。AIDS患者から得られた単球にはCD4発現の減少が見られるが、単球数の減少は観察されなかった。また、免疫抑制剤も抗原提示細胞の機能を変化させることがある。これらの観察結果から、単球または樹状細胞の存在に依存しない、Ｔ細胞を特異的に刺激する方法が好ましいことがわかった。Ｔ細胞を活性化するには多数の方法があるが、最適な方法は抗体、またはレクチンのような他の受容体結合種の、Ｔ細胞表面上のＴ細胞抗原受容体／CD3複合体（以下TCR/CD3と称す）との多価相互作用を必要とすると考えられる。〔A．Al tman et al.，「Crit．Revs．in Immunol．10:347-391（1990）〕。しかし、抗体が結合したTCR/CD3複合体を架橋するための機構が存在する場合、CD3特異モノクローナル抗体は高度に精製された、休止Ｔ細胞に増殖を誘導することができ J．Exp．Med．158:988-999(1983)」およびD．A．Hafler et al.,「J．Immunol． 142:2590-2596(1989)」〕、ポリスチレンビーズ〔S．Panzer et al.，「Scand． J．Immunol．32:359-371(1990)」、または組織培養ディッシュに、抗体を結合することにより、架橋条件を満足させることができることを示している。国際特許出願公開第WO 90/04633号明細書には、Ｔ細胞活性化およびＴ細胞の増殖の誘導のための、固体に支持されたモノクローナル抗体が記載されている。補助細胞、例えば、単球も、Ｔ細胞結合抗CD3モノクローナル抗体がFc受容体を媒介する単球細胞表面への結合により、架橋のための必要条件を満たすことができる。細胞活性化を評価するのに用いるパラメータは、A．Altman et al.，「Crit． Revs．in Immunol．10:347-391(1990)」に記載されている。細胞活性化は核酸合成、タンパク質または糖タンパク質合成、細胞のサイズおよび形態、膜の完全性、細胞構成物の発現、細胞機能、細胞成長、細胞分化および細胞成分の放出の変化により測定されている。これらの細胞変化は、種々の多数の方法により検出されるが、そのうちの多くは本明細書に引用する特許明細書および出版物に記載されている。歴史的に、免疫不全病態の診断は、種々の刺激をＴ細胞に与えて、インビトロでこれらの細胞が活性化されるかどうかを測定する実験室試験を用いて行われている。Ｔ細胞の不十分な反応性は、分裂促進剤、同種抗原および可溶性抗原で刺激することにより試験されている〔R．Hongの「Manual of Clinical Im munology、第２版、N．R．RoseおよびH．Friedman編」（American Society for Microbiology 1980)、第３章、833-849頁〕。しかし、これらの方法はＴ細胞のすべてに対して特異的ではない。分裂促進剤はＴ細胞およびＢ細胞のいずれをも活性化する。同種抗原は適当な受容体種を有する選定されたＴ細胞だけを活性化する。可溶性抗原、例えば破傷風毒素に対する応答は、患者の免疫処置歴により影響を受けることがある。本発明の抗CD3アミノデキストラン結合体は特にすべてのCD3陽性細胞を活性化し、従ってこれらの問題を回避する。CD3抗原は実質的にすべての成熟末梢Ｔリンパ球に見出される。この抗原はＴ細胞受容体複合体の成分であり、Tiと称する、多形の、クローン型構造に非共有結合する。CD3表面構造に対する抗体は、免疫担当Ｔリンパ細胞にだけ発現するＴ細胞受容体の定常部のためのプローブとしてはたらく。結果として、この抗体を用いる免疫担当Ｔ細胞の定量は迅速かつ効果的である。前述した同時係属出願に加え、デキストランまたはデキストラン誘導体でコーティングした粒子が、R．J．Mrsny et al.による「Eur．J．Cell．Biol．45:200 -208(1987)」（ウアバイン−アミノデキストラン−金粒子）；J．W．M.Bulte et al.による「Magn．Reson．Med．25:148-157(1992)」（ビオチン化デキストラン −磁性粒子）に記載されている。抗体−デキストラン型物質を担体として使用することはU．Manabe et al.，による「J．Lab Clin．Med．104:445-454(1984)」（抗体−ポリアルデヒドデキストラン−メトトレキサート）；A．R．Oseroff et al.，による「Proc．Natl．Acad．Sci．USA 83:8744-8748(1986)」（抗体−アミノデキストラン−塩素）；およびS．Rakestraw et al.,による「Proc．Natl． Acad．Sci．USA 87:4217-4221(1990)（抗体−デキストランヒドラジド−Sn(IV) 塩素）に記載されている。他の結合種および架橋種は、S．S．Wangによる「"Che mistry of Protein Conjugation and Crosslinking"」（米国、フロリダ州、ボカラトン所在のCRCプレス社）およびH．Maeda et al.,による「Bioconjugate Ch em．3:351-362(1992)」に記載されている。デキストランにアミン基を導入する標準的方法は、ポリアルデヒド−デキストランを生成するために、最初に糖類の環状構造を切断することである。次の工程は、切断した環状構造をエチレンジアミンまたは1,3-ジアミノプロパンのようなジアミンと反応させてシッフ塩基複合体を形成することである。次にこのシッフ塩基を水素化ホウ素ナトリウムで還元することにより安定化する。前述した文献で記載されているような”アミノデキストラン”化合物は、代表的に元素分析または平均分子量測定を欠いており、記載が不十分である。さらに、これらの出版物に記載されたような過ヨウ素酸酸化法でアミノデキストランを調製すると、分子当たりのアミノ基の割合が低くなる。その割合は４〜５％未満であった。高度のアミン置換は従来技術の通常の条件下には不可能であった。その理由は、高濃度のジアミンが、デキストラン中の糖類環状構造間のグルコシド結合に広範囲のアミノ分解を起こし、著しく低い分子量のフラグメントを生成するからである。結果として、一層高いアミン置換度を求める場合、重合性アミノデキストラン誘導体の収率は低く、しかも劇的に減少した。アミノデキストランを製造する他の方法では、クロロ酢酸中で糖残基の水酸基をカルボキシメチル化し、次いでエチレンジアミンのようなジアミンをカルボジイミドカップリングする。M．Brunswick et al．による「J．Immunol．140:3364 -3372(1988)」およびP．K．A．Mongini et al．による「J．Immunol．148:3892- 3902(1992)」は、この方法を用いて、67個のグルコース残基当たりに約１個のアミン基(1/67)を有するアミノデキストランを生成した。次に、これらの著者はこのアミノデキストランを用いて、Ｂ細胞の活性化および増殖を誘導するのに用いる抗Ig抗体−アミノデキストラン結合体を調製した。本発明はＴ細胞の特異的な刺激を提供するための方法として、アミノデキストランに結合した抗CD3モノクローナル抗体を使用することを教示する。Ｔ細胞機能の分析は免疫不全の診断にとって臨界的である。例えば、本明細書に記載した CD3アミノデキストラン結合体は、AIDS患者におけるＴ細胞分析のために用いるＴ細胞を活性化するための唯一の特異的方法を提供する。M．Clerci et al．による「J．Clin．Invest．84:1892-1899(1988)」では、インビトロでのヘルパＴ細胞(T_H)アッセイが”HIV感染の経過の初期で多数の段階の免疫規制不全(immune dysregulation)を検出することができる”ことが見出されている。前述したような選択性の問題を有する、破傷風毒素および同種抗原を、Ｔ細胞のための刺激として用いている。S．C．Muluk et al.による、「Transplantation Proceeding s 23:1274-1276(1991)」には、Ｔ細胞の監視が移植患者における免疫抑制剤の効力を測定するのに有用となることが示されている。本発明は、特にアミン置換度またはアミン置換割合が高いアミノデキストランを、抗体を架橋し、かつ得られた抗体−アミノデキストラン結合体を用いてＴ細胞の活性化および増殖を誘導する手段として、使用することを教示する。本明細書に記載した同時係属出願でアミノデキストランを用いて、ポリスチレンミクロスフィアならびに磁性および非磁性粒子、例えばフェライトおよび金属金粒子をコーティングした。次に、このアミノデキストランコーティング粒子を用いて種々のモノクローナル抗体を共有結合させる。アミン置換度およびデキストランの重合度を変更し、得られたコーティング粒子の最適な形態を決定することができ、この粒子に抗体を結合することができる。抗体−アミノデキストランコーティング粒子と細胞との間の非特異的相互作用は、過剰の架橋剤でアミン基をブロックし、次いでこの過剰の架橋剤もブロックすることにより最小にされる。発明の開示本発明は、モノクローナル抗体の架橋剤として５〜20重量％を有するアミノデキストランを使用し、哺乳類細胞、特にヒト細胞の誘導および活性化に有用な抗体−アミノデキストラン結合体を生産することに関する。特に、この結合体はヒトＴ細胞およびＢ細胞の活性化および増殖を誘導するのに有用である。本発明の好適例は、Ｔ細胞の活性化および増殖を誘導するための、アミノデキストランに結合した抗CD3モノクローナル抗体の調製および使用である。さらに本発明では、かかる結合体を形成するのに、高いアミン置換度（10％より高い）を有する新規アミノデキストランを使用することを記載し、代表的に約４〜５％のアミン置換を有する、この技術で通常知られているアミノデキストランを用いて形成した結合体での結果と比較する。比較した結果、アミン含量が高いアミノデキストランを使用するのが好ましいことをがわかった。また、本発明は、哺乳類Ｔ細胞、特にヒト細胞を分析する方法に関する。Ｔ細胞を含むか、または含むと考えられる試料を、本明細書に記載したように調製したアミノデキストラン／抗Ｔ細胞モノクローナル抗体と反応させる。得られたアミノデキストラン−抗体−細胞複合体を、適当な時間インキュベーションした後、分析して、Ｔ細胞の機能またはＴ細胞機能の変化を評価することができる。かかる分析で用いることができる試験には、核酸（DNAまたはRNA）の合成、タンパク質または糖タンパク質の合成、細胞サイズおよび細胞の形態、膜の完全性、細胞構成物の発現、ならびに分析する細胞を含む培地への細胞成分の放出の変化が含まれる。この種の分析が行える代表的な疾病または疾患は、AIDS、他の非AIDS 免疫不全症、感染症、ガン、自己免疫疾患およびアトピー性疾患である。また、この方法を用いて、組織、器官または細胞移植の受容者である患者からのＴ細胞を試験することができる。移植を含むような場合では、Ｔ細胞分析に先立ち、非Ｔリンパ球細胞およびそれらの未熟前駆体を刺激して、移植から生じる症状に関連するさらなる試験を容易に行うことができる。この非Ｔ細胞には、Ｂ細胞、マクロファージ／単球、樹状細胞、好中球、好酸球、好塩基球、細胞障害性エフェクター細胞、造血幹細胞およびこれら各細胞の未熟前駆細胞が含まれる。かかる非Ｔ細胞およびそれらの前駆細胞を刺激する方法は、本明細書に引用した出版物に記載されている。図面の簡単な説明図１には、活性化していない対照Ｔ細胞を含む試料の細胞の分布を、横軸対縦軸散点ヒストグラムで示す。図２には、抗CD3／１×−Amdex結合体を用いることにより活性化したＴ細胞を含む試料の細胞の分布を、横軸対縦軸散点ヒストグラムで示す。図３には、抗CD3／５×−Amdex結合体を用いることにより活性化したＴ細胞を含む試料の細胞の分布を、横軸対縦軸散点ヒストグラムで示す。図４では、活性化した幼若細胞の形成における、選択した抗CD3／Amdex結合体の効果をグラフで比較する。図５は、抗CD3／Amdex結合体で刺激していない対照培養Ｔ細胞のDNA含量を示す。図６は、抗CD3／１×−Amdex結合体で活性化したＴ細胞のDNA含量を示す。図７は、抗CD3／５×−Amdex結合体で活性化したＴ細胞のDNA含量を示す。図８では、CD25、CD71、およびPCNA陽性細胞の割合における、選択した抗CD3 ／Amdex結合体の効果をグラフで示す。発明を実施するための最良の形態架橋した抗体は、G₀／G₁期で休止しているＴ細胞を誘導し、このＴ細胞を、DN A合成を含む、容易に観察される細胞周期、S、G₂／Ｍ期に進める能力が高められることを示す。アミノデキストランのような、種々のコロイド粒子をコーティングするために用いられる可溶性重合体は、Ｔ細胞の増殖を開始させ、維持するのに用いる抗体に適した架橋剤である必要がある。アミノデキストランはＢ細胞の刺激を調節する結合体として用いられるが、これらのアミノデキストランはＴ細胞には用いられなかった。本明細書では、特に10％より高いアミン置換を有するアミノデキストランを調製するための優れた方法、およびこれらのアミノデキストランを抗体−アミノデキストラン結合体の形成において使用すること、次に哺乳類細胞の活性化および増殖の刺激、特にＴ細胞の活性化および増殖を刺激するために使用することを記載する。アミン置換度およびデキストラン重合度をいずれも変更して、最適の形態のアミノデキストランを見出すことができ、このアミノデキストランを抗体担体および架橋剤として用いることができる。本明細書に記載した実施例は、本発明を例示するもので、本発明を制限するものと解釈すべきではない。例えば、本明細書の実施例では、ヒトＴ細胞の活性化および増殖の誘導を記載しているが、適切に選択した抗体により、他の細胞、例えば、Ｂ細胞、および他の哺乳類種、例えばネコ、イヌまたはウマにまで本発明の有用性を広げることができる。２種の形態のアミノデキストランを用いて、本明細書に記載した結合体を形成した。以下に１×−アミノデキストラン（「１×−Amdex」と略記）として記載する、第１のアミノデキストランは、約１／32（糖残基当たりに２個の1,3-ジアミノプロパン）に等しい置換度、および約1,000,000ダルトンの平均分子量を有する。以下に５×−アミノデキストラン（「５×−Amdex」と略記）として記載する、第２のアミノデキストランは、約１／７に等しい置換度、および約350,00 0ダルトンの平均分子量を有する。本発明で用いる抗CD3モノクローナル抗体を、米国、フロリダ州、マイアミ所在のCoulter Corporationから入手し、標準的方法を用い、イミノチオラン(imin othiolane）により活性化して、アミノデキストランに結合した。抗CD3モノクローナル抗体または他のＴ細胞活性化モノクローナル抗体の供給源は、本発明にとって絶対的ではなく、本明細書に記載した供給源に代えて、他の供給源からのかかる抗体を用いることができる。活性化した抗体と結合するに先立ち、これらのアミノデキストランを、異種二官能価試薬スルホ−SMCC〔スルホスクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル）シクロヘキサン-1-カルボキシレート〕で活性化した。本発明は、活性化剤としてイミノチオランおよびスルホ−SMCCを使用するだけに止まらない。当業者なら、他の試薬、例えば、米国特許第5,169,754号明細書および他の関連する出願に記載されている他の試薬を、本発明で使用したイミノチオランおよびスルホ−SMCCに代えて用いることができると思われる。本明細書および同時係属している米国特許出願第07/968,158号および第07/827 ,347号明細書に記載した方法Ａ〜Ｃを用いて、０より多く約20％までの範囲のアミン含量を有するアミノデキストランを調製することができる。方法Ｃは、５％より多いアミン基を有するアミノデキストラン；特に、10％より多いアミン基を有するアミノデキストランを調製するのに用いるのが好ましい。本明細書に記載した中空繊維カートリッジを使用して、かかるカートリッジを用いて調製したアミノデキストランの分子量下限が5,000ダルトンになるように設定する。この下限は、この処理で用いるカートリッジの選択を変更することにより、高くしたり、または低くしたりすることができる。アミノデキストラン生成物の最大分子量は、出発デキストラン物質の分子量に制限される。この技術で既知の酸化切断法により調製したアミノデキストランは最大４〜５％のアミン基を有する。この技術分野で記載されているアミノデキストランのアミン基より300〜400％多いアミン基を有するアミノデキストランを、本明細書で記載した方法により調製することができる。本明細書で記載したCoulter T3抗体以外の抗体も本発明に用いることができた。これらの抗体には、抗CD2抗体（Coulter T11、IgG1）、および、特にＴ細胞受容体のガンマ鎖に発現する85,000ダルトンの種に対する抗体（Coulter TiGamma 、IgG1）が含まれる。T3のような抗CD3モノクローナル抗体が好ましい。本発明を非Ｔ細胞およびそれらの前駆細胞を刺激する方法に関連させて用いる場合、用いる方法は技術文献に見出され、当業者に知られている。例えば、Ｔ細胞だけでなくＢ細胞を分析し、および／または評価する場合、M．Brunswick et al．による、「J．Immunology 140：3364-3372(1988)」に記載されているような抗IgD抗体および抗IgMモノクローナル抗体を用いることができる。かかる場合には、Brunswick et al.により用いられたデキストランまたはフィコール(Ficoll) をこの明細書で開示したアミノデキストランに置き換えることができる。マクロファージを刺激し活性化する場合には、H．Maeda et al．による「Bioconjugate Chemistry 3:351-362(1992)」に教示されたようなポリ（スチレン−コ−マレイックｎ−ブチルエステル）−結合ネオカルチノスタチンを用いることができる。Ｉ．アミノデキストランの調製方法Ａ．アミノデキストランの少量調製デキストランのグルコピラノースリングを部分的に切断し酸化してアルデヒド官能基を生成させ、これらのアルデヒド基を1,3-ジアミノプロパンと結合させてシッフ塩基結合を形成させ、シッフ塩基結合を還元して安定な炭素−窒素結合を形成させることにより、アミノデキストランを調製した。代表的な方法では、20 gのデキストランを50mMの酢酸カリウム緩衝液、pH6.5の150mLに溶解した。25mL の蒸留水に2.14gの過ヨウ素酸ナトリウムを加えた溶液を、激しく磁気的に混合することにより、約10分にわたりデキストランに滴加した。得られた溶液を室温、15〜27℃で、約1.5時間かき混ぜ、次に蒸留水に対して透析した。20mLの1,3- ジアミノプロパンを20mLの蒸留水と混合し、この混合物を氷浴上で冷却し、強くかき混ぜ、氷酢酸を添加することにより、pHを約15分にわたり約11.5〜約8.7に調整した。代表的に、15〜20mLの氷酢酸を用いた。透析したデキストラン溶液を冷却したジアミン溶液に約15〜20分にわたり滴加した。添加し終えた後、得られた溶液を室温で約2.25時間かき混ぜた。0.8gの水素化ホウ素ナトリウムを0.1mM の水酸化ナトリウム10mLに溶解した還元性溶液を、このデキストラン反応混合物に約15分にわたり室温で添加した。この反応混合物を水素化ホウ素塩の添加中にかき混ぜて、発泡の大部分を追い出した。粗アミノデキストラン溶液を、流出液の導電率が３〜４μmho/cmになるまで、蒸留水に対し徹底的に透析した。次に、透析した溶液を0.2μmのフィルタで濾過し、モデルTDS-00030-A、Dura-Dry【表８／】テムズインコーポレーション）〕で24時間にわたり凍結乾燥して薄片状の、淡い黄色の結晶を21％の収率で製造した。方法Ｂ．アミノデキストランの大量調製方法Ａの操作をアミノデキストランを大量に調製するため、およびデキストランに導入するアミン基の数を増加させるために変更した。中空繊維膜濾過を透析に置き換え、一層小さなジアミン−過ヨウ素酸モル比を用い、糖ポリマーがさらに切断されて低分子量フラグメントになるのを防止した。また、これらの変更は、過剰の低分子量試薬を除去する間の、過剰のジアミンと置換デキストランとの間の接触時間を短縮させるようにはたらく。これらの変更を行わないと、高分子量のデキストラン（例えば、デキストランT-2M）中のグルコシド結合のアミノ分解が極めて広範囲に起こり、5,000ダルトンのカットオフ分子量より上の、アミノデキストランの収率が劇的に減少した。中空糸カートリッジ〔ポリスルホン、３ft²（約0.28m²）膜表面積、１mm繊維直径、および5,000MWカットオフモデルUF P-5-E-6、A/G Technology Corp．（エー／ジーテクノロジーコーポレーション）〕を、保留物線中で５〜10psi（約0.35〜0.7kg/cm²ゲージ圧）に対応する15〜20 psi（約1.05〜1.4kg/cm²ゲージ圧）を出す入力パワーポンプ（２個のポン大流速）と垂直に装着した。濾液を50〜100mL／分で収集した。20〜30リッターの蒸留水を用いて約６〜８時間にわたり洗浄した。導電率は約３〜４μmho/cmに減少し、pHは6.0〜6.5であった。脱塩中、供給量を２リッターに維持し、次に酸化したデキストランの第１洗浄では800mLに、さらにアミノデキストランの第２洗浄では400mLに濃縮した。標準的な大量調製では、80gのデキストランを、600mLの蒸留水を含む１クォート〔リッター〕のグラスブレンダーボウルに移した。この固体を中速度で約２〜５分間混合し、すべてのデキストランを溶解した。8.56gの過ヨウ素酸ナトリウムを100mLの蒸留水に溶解し、激しく磁気的に混合することにより、得られた溶液を約10分にわたりこのデキストラン溶液に滴加した。添加し終えた後、得られた混合物を室温でさらに３時間かき混ぜた。次に、得られた粘性反応混合物を蒸留水で２リッターに希釈し、中空繊維カートリッジを用いて脱塩した。初期の導電率は1.5mmho/cm以上であり、初期のpHは4.0であった。最終的pHが6.0〜6.5の溶液を得るために、約18〜22リッターの蒸留水を用いた。洗浄した、酸化デキストラン溶液の最終的な量は800mLであった。洗浄した、酸化デキストラン溶液に、80mLの無色の、液体1,3-ジアミノプロパンを室温で約10分にわたりゆっくり添加した。次に、得られた混合物をさらに３時間室温でかき混ぜた。かき混ぜ終えた後、１mMの水酸化ナトリウム水溶液40mL に溶解した3.2mgの水素化ホウ素ナトリウムを、約５分にわたり室温のアミノデキストラン反応混合物に磁気的にかき混ぜながら添加した。水素化ホウ素ナトリウムを添加し終えた後、得られた混合物をさらに１時間かき混ぜ、次に、中空繊維カートリッジを用いて脱塩した。初期の導電率は5.0mmho/cm以上であり、初期のpHは約12.0であった。この導電率を約３〜４μmho/cmに減少させ、pHを6.0〜6 .5に減少させるのに、約20〜25リッターの蒸留水を必要とした。最終的なアミノデキストラン溶液の量は400mLであった。この溶液を0.2μmの滅菌酢酸セルロースフィルタユニットに通し、次に、48時間にわたり凍結乾燥して、48グラムの薄片状の、淡い黄色の結晶を収率52％で得た。元素分析結果（Ｃ、Ｈ、Ｎ）を、上述の方法によりデキストランT-2Mから調製した２種のアミノデキストラン試料について得た。分析結果を次に示す：試料１． 20g規模のデキストラン、方法Ａ（透析による脱塩）測定値：Ｃ，43.04；Ｈ，6.60；Ｎ，1.09；Ｏ（差引による），49.27 Ｃ₄₆Ｈ₇₉ＮＯ₃₇３Ｈ₂Ｏの計算値：Ｃ，42.76；Ｈ，6.63；Ｎ，1.08；Ｏ，49.53 試料２． 80g規模のデキストラン、方法Ｂ（膜濾過による脱塩）測定値：Ｃ，42.53；Ｈ，6.52；Ｎ，1.01；Ｏ（差引による），49.94 Ｃ₄₉Ｈ₈₄ＮＯ₄₀３Ｈ₂Ｏの計算値：Ｃ，42.61；Ｈ，6.57；Ｎ，1.01；Ｏ，49.81 ２種の調製物におけるアミノデキストランの分析結果は非常に類似しており、結果として、脱塩を透析により行おうが、もしくは膜濾過により行おうが、または酢酸緩衝液を用いようが、もしくは用いまいが、いずれでも同一の生成物が得られたことを示した。しかし、アミノデキストランの収率は、方法Ｂで方法Ａよりも31％だけ上昇した。試料１について得られた実験式、Ｃ₄₆Ｈ₈₄ＮＯ₄₀は、グルコース（Ｃ₆Ｈ₁₀Ｏ₅）の29単位、十分にジアミン置換した糖類環状構造の１単位（Ｃ₁₂Ｈ₂₈Ｎ₄Ｏ₃、糖類１モル単位当たり２モルのジアミン）および12単位の水に基づく式、Ｃ₄₆Ｈ₇₉ＮＯ₃₇３Ｈ₂Ｏに極めて類似している。したがって、デキストランにおける糖残基のジアミン置換度は、100％過ヨウ素酸塩切断および酸化−還元平衡式によるジアミン置換に基づく理論値１／12に比べ、試料１では１／30であった。試料２について得られた実験式、Ｃ₄₉Ｈ₉₀ＮＯ₄₃は、グルコースの31単位、十分にジアミン置換した糖類環状構造の１単位および12単位の水に基づく式、Ｃ₄₉Ｈ₈₄ＮＯ₄₀３Ｈ₂Ｏに極めて類似している。デキストランのジアミンによる置換度は、試料２については１／32であった。これと同様の結果は、１×（１×＝糖残基の置換が3.3％）、２×(6.6％)、３ ×(9.9％)および５×(16.5％)モル量のアミノ基を有する、平均分子量が10,000 、40,000および2,000,000ダルトン（T-10、T-40およびT-2M）のアミノデキストランを用いて得られた。すべてのアミノデキストランを最初に、デキストランの１×酸化で用いられる過ヨウ素酸ナトリウムの２および３倍量を用いる方法ＡおよびＢにより調製した。シッフ塩基の生成に用いる1,3-ジアミノプロパンの量を一定に保持した。アミノデキストランを調製する方法ＡおよびＢに変更を加えた。これらの方法は、最初に米国特許出願第07/827,347号明細書に開示されている。これらの変更は、米国特許出願第07/968,158号明細書に開示されており、過ヨウ素酸陰イオン、ジアミン添加およびシッフ塩基の水素化ホウ素ナトリウム還元を用いたデキストラングルコース環状構造の酸化および切断が含まれる。この変更により、アミノデキストラン、特に、従来の方法により５％未満の収率しか得られない５×アミノデキストランの収率を高めることができる。一般に、第１の変更は、以前開示した化学量論で２：１のジアミン：過ヨウ素酸塩のモル比に対し10パーセント（10％）だけ過剰なジアミンを用いた。第２の変更では、ジアミン付加反応を約５〜10℃の範囲の温度で行った。第３の変更では、シッフ塩基形成のための近紫外線(UV)領域で、ジアミン付加反応を分光器により監視した。シッフ塩基形成は、連続スペクトル分析がプラトーに達したことを示した場合に、完了したと考えた。次にこの反応を水素化ホウ素ナトリウムの添加によりクエンチングし、シッフ塩基結合を炭素−窒素単結合に還元し、任意の未反応アルデヒド基をアルコール基に還元した。これらの変更は、重合性糖基を低分子量フラグメントにするアミノ分解を減少させ、これにより、高収率の生成物が、中空繊維膜濾過により精製し濃縮した後に得られた。３ft²（約0.28m²）の膜表面積、5,000カットオフ分子量の１mmの繊維直径を有するポリスルホンカートリッジを用いて、中空繊維濾過を行った。このカートリッジは、２個のポンプヘッドを有し、No.18 Norpre 20psi（約1.05〜1.4kg/cm²ゲージ圧）を出す入力パワーポンプに垂直に装着した。この配置では、保留物線中の圧力は約５〜10psi（約0.35〜0.7kg/cm²ゲージ圧）であった。濾液を50〜100mL／分で収集した。20〜30リッターの蒸留水を用いて約６〜８時間にわたり洗浄した。次に、すべてのアミノデキストランを調製することができる変更方法を例示するために、５×アミノデキストランの調製方法を示す。方法Ｃ．５×アミノデキストランの調製 T-2Mデキストラン〔50g、0.308モル、米国、ミズーリ州、セントルイス所在の Sigma（シグマ社）、または米国、ニュージャージー州、ピスカタウニ所在のPha rmacia（ファルマシア社）から入手〕を、300mLの蒸留水を含む１クォートまたは１リッターのグラスブレンダボールに添加した。この混合物をすべてのデキストランが溶解するまで、代表的に約３〜５分の間、最大速度でブレンドした。30 0mLの蒸留水に26.75g（0.125モル）のNaIO₄を溶かした溶液を、このデキストラン溶液に約10分間にわたり、激しく磁気的に混合しながら添加した。過ヨウ素酸塩を添加し終えた後、反応混合物を室温でさらに約３時間かき混ぜた。３時間後、600mL容量の反応物は9.7mmho/cmの初期導電率および2.5の初期pHを有した。この反応混合物を蒸留水で２リッターに希釈し、中空繊維カートリッジを用いて脱塩した。約15〜18リッターの蒸留水を用いて洗浄し、導電率が10μmho/cmで、pH が6.7の、洗浄し、酸化したデキストラン溶液600mLを得た。この酸化デキストラン溶液を、氷浴を用いて約８℃に冷却し、23.2mL（0.275 モル）の1,3-ジアミノプロパンを、この酸化デキストラン溶液に約10分にわたり添加した。得られた反応混合物をかき混ぜ、氷浴の温度で維持した。黄色のシッフ塩基の形成を、10〜15分毎に、抽出試料の335nmの近紫外線吸収を測定することにより監視した。以下には、代表的な実験における、１mm透過距離のセルを用いた335nmの測定結果を示す：吸光度がプラトーに達した後、１mMの水酸化カリウム水溶液19.3mLに19.3g（0 .500モル）の水素化ホウ素ナトリウムを溶かした溶液を、この反応混合物に約10 分にわたり、環境室温で磁気的に混合しながら添加した。水素化ホウ素ナトリウムの添加を終えた後、この反応混合物を環境室温でさらに約２時間かき混ぜた。かき混ぜ終えた後、１cmの経路長さのセルを用いた335nmでの分光測定は0.067単位の吸光値を与え、この値はシッフ塩基化合物が本質的に消失したことを示した。次に、約1,000mL容量の反応混合物を中空繊維カートリッジにより脱塩した。この初期の導電率は43mmho/cmであり、初期のpHは11.0であった。約18〜20リッターの蒸留水を洗浄溶液として用いて、４〜６μmho/cmの導電率および6.5〜7.0 のpHを有する約300mLの５×−アミノデキストラン溶液を製造した。この５× −アミノデキストラン溶液を0.2μmの硝酸セルロースフィルタで濾過し stems，Inc．）で48時間にわたり凍結乾燥して、24g（収率48％）の薄片状の、淡い黄色の結晶を製造した。元素分析値：Ｃ＝45.83％、Ｈ＝7.00％、Ｎ＝4.49 ％、Ｏ（差引による）＝42.68％。Ｃ₁₂Ｈ₂₂Ｏ_8.25Ｎの計算した分析値：Ｃ＝46. 15％、Ｈ＝7.10％、Ｎ＝4.48％、Ｏ＝42.26％実際の分析に基づく実験式はＣ₁₂Ｈ₂₂Ｏ_8.3Ｎであり、十分にジアミン置換した糖類環状構造（Ｃ₁₂Ｈ₂₈Ｎ₄Ｏ₃）の１単位当たり６単位のグルコースに基づく式、Ｃ₁₂Ｈ₂₂Ｏ_8.25Ｎと極めて類似している。したがって、デキストラン中のジアミン置換度は、100％の過ヨウ素酸塩切断およびジアミン置換に基づく１／2 .5の理論値に比べ、１／７であった。 100gおよび300gのデキストランの初期投入量を用いた繰り返し実験で前記と同一の置換度を有する５×−Amdex 生成物を製造した。また、１×−Amdex の調製も、方法Ｃを用いて100gおよび300gのレベルまでスケールアップした。300gの規模では、中空繊維カートリッジを8.5ft²（約0.79m²）の表面積、公称5,000カットオフ分子量を有する１mm繊維直径のポリスルホン膜（モデルUFP-5-E-35、A/G Technology Corp.）に変えた。このカートリッジを酸化デキストランおよび最終的アミノデキストラン生成物の限外濾過のために用い、塩および低分子量試薬または副生成物を除去した。300g規模での、５×−Amdex生成物および１×−Amdex 生成物の収率は、それぞれ、135g（45％）および162.1g（57％）であった。これらの生成物の元素分析結果を次に示す：１×−Amdex、300g規模のデキストラン測定値：Ｃ，43.58；Ｈ，6.50；Ｎ，0.82；Ｏ（差引による），49.10 Ｃ₆₂Ｈ₁₀₅ＮＯ₅₀２Ｈ₂Ｏの計算値：Ｃ，43.79；Ｈ，6.46；Ｎ，0.82；Ｏ，48.92 ５×−Amdex、300g規模のデキストラン測定値：Ｃ，45.67；Ｈ，6.90；Ｎ，4.04；Ｏ（差引による），43.39 Ｃ₁₃Ｈ₂₄Ｏ₉Ｎの計算値：Ｃ，46.15；Ｈ，7.15；Ｎ，4.14；Ｏ，42.56 ５×−Amdexについて得られた実験式、Ｃ₁₉Ｈ₂₄ＮＯ₉は、68単位のグルコースと十分にジアミン置換した糖類環状構造の１単位に基づく式、Ｃ_13.2Ｈ₂₄ＮＯ_9. ₅ と極めて類似している。したがって、デキストラン中の糖残基の置換度は、１／８であった。１×−Amdexについて得られた実験式Ｃ₆₂Ｈ₁₁₀ＮＯ₅₂は、39.3単位のグルコース、１単位の十分にジアミン置換した糖類環状構造および２単位の水に基づく式、Ｃ₆₂Ｈ₁₀₅ＮＯ₅₀２Ｈ₂Ｏと類似している。したがって、デキストラン中の糖残基の置換度は、１／40であった。ＩＩ．抗CD3抗体−アミノデキストラン結合体の調製１．スルホ−SMCCを用いたアミノデキストランの活性化 25mgの１×−Amdexおよび５×−Amdexを別々の、密封性の15mL管内の１×PBS の6.667mL部分に溶解し、3.75mg/mLの濃度を有する溶液を得た。１×PBSは、同時係属している米国特許出願第07/961,057号明細書に記載されているように、２リッターの蒸留水中に53.8gのK₂HPO₄、12.8mgのKH₂PO₄および340gのNaClを含む2 0×PBS溶液を希釈することにより作成する。１×−Amdexは、１×−AmdeX溶液１ミリリッター当たりに13.5μLの10mg/mLスルホ−SMCC溶液（総量0.090mLのスルホ−SMCC溶液）を添加することにより活性化した。５×−Amdexは、５倍量のスルホ−SMCC溶液（0.450mL）を用いることにより活性化した。スルホ−SMCC溶液をピペットでそれぞれの管に加え、渦巻き混合して良く混合し、次に、約２時間ローラー混合した。混合し終えた後、各反応混合物を、１×PBSで平ラフィにかけた。試料を１×PBSを用いて溶出し、約４mLの画分に集めた。280nm で吸収を示す最初のバンド画分は、集束光線を用いたチンダル散乱により確認したように、高分子量の活性化アミノデキストランを含んでいる。これらの画分をプールし、各場合に約10〜11mLの総スルホ−SMCC活性化アミノデキストランを得た。第２の、このカラムから溶出した一層大きなバンドはチンダル散乱を示さなかった。この第２のバンドは過剰量の低分子量スルホ−SMCC試薬を含んでいることがわかった。２．抗体の活性化 T3モノクローナル抗体（Coulter Corporationにより販売されている抗CD3抗体）は、２mg/mLイミノチオランの１×PBS溶液0.323mLと1.587mLの１×PBSとを含む溶液に1.423mLのT3濃縮物（35.14mg/mL）を添加することにより活性化した。1 5mg/mLの抗体濃度および15倍のモル濃度のイミノチオランを有する得られた溶液を、約１時間環境温度で混合した。次に、全反応混合物を１×PBSで平た。第１のバンドピーク画分の約５mL容量を組合せて、全量で49.847mgのイミノチオラン−誘導化T3抗体（IT-T3と略記）を含む約10.2mLの4.887mg/mL抗体溶液を得た。３．スルホ−SMCC−アミノデキストランとイミノチオランT3抗体との結合体 4.887mg/mLのIT-T3溶液（約24.435mL抗体）5mLを10.4mLのスルホ−SMCC−１× −Amdex（約25mgの１×−Amdex）溶液と約２時間混合した。これと同様にして、 4.887mg/mLのIT-T3溶液５mLを11.2mLのスルホ−SMCC−５×-Amdex（約25mgの５ ×−Amdex）溶液と混合した。混合し終えた後、各混合物の全量を測定し、１×P BS中に溶かしたL-システイン５mg/mL溶液を、この容量の0.120倍容量で各結合体混合物に添加した。次に、このL-システイン含有混合物をさらに15分間混合し、未反応スルホ−SMCC部分をブロックした。最後に、20mg/mLのヨードアセトアミドの１×PBS溶液を、全混合物容量の0.120倍量で、さらにpH9.8の1Mホウ酸塩緩衝液を、全混合物容量の0.120倍量で、各混合物に添加した。得られた混合物を約30分間混合し、任意の未反応スルホヒドリル基をブロックした。４．抗CD3−アミノデキストラン結合体の精製 Beckman J-6B遠心機を用いて、試料を含むAmocon Centripep-30管を約20分間約2,500 rpmで遠心分離することにより、各結合体混合物の全量を約7.5mLに濃縮した。遠心分離後、濃縮した容量の混合物を、１×PBSで平衡化した Bio-Gel いてクロマトグラフィを行った。滴下収集モードで操作するPharmacia LKB Frac -100コレクタを用いて、溶離剤の約４mL容量画分を収集した。これらの画分を、 280nmで操作するLKB 2138 Uvicord Sモニタを用いて監視した。カラムから溶出した第１の広いバンドには、T3抗体−アミノデキストラン結合体が含まれる。第１のバンドの強度の半分未満の良く分離した一層弱いバンドは、過剰のIT-T3によるもので、この理由は、このバンドがチンダル効果を示さず、ゲル濾過カラムる。強い、よく分離した第３のバンドは、低分子量の過剰なブロッキング試薬によるものであった。１×−Amdexおよび５×−Amdexから形成した結合体を比較すると、T3抗体−５×−Amdex結合体は、一層長い保留時間を示す一層狭い第１のバンドおよび極めて弱い第２のバンドを有していた。各結合体について収集した画分を１cmの経路長さのセルを用いて280nmで分析した。0.160より大きな吸光度を示す画分をプールした。収量は、0.301mg/mLのT 3抗体濃度を有するT3−１×−Amdex結合体が55mLであり、0.317mg/mLのT3抗体濃度を有するT3−５×−Amdex結合体が54mLであった。これらの結果は、それぞれ、66％および68％の出発抗体が結合体生成物に組み込まれたことを示す。結合体中のT3のための、ELISA固相アッセイは、T3−１×−Amdexにおいて0.045mg/mLの T3抗体濃度を示し、T3−５×−Amdexにおいては0.112mg/mLのT3抗体濃度を示した。Ａ₂₈₀値に比べて一層低いELISA T3値は、アミノデキストランへの結合により、活性T3抗体部位の若干のブロッキングがあるか、またはスルホ−SMCC試薬から生じる余分の吸光度寄与によりＡ₂₈₀の読みが若干干渉されることを示しているかもしれない。また、T3−１×−AmdexおよびT3−５×−Amdex結合体は光子相関分光法を用いる光散乱測定（90°）により分析した。分子量およびサイズ分布プロセッサ(S て、これらの試料を分析した。10mg/mLの濃度でデキストランT-2M、１×−Amdex および５×−Amdex試料を分析した。平均分子量は3.1×10⁶ダルトン（92％、デキストランT-2M）、1.0×10⁶ダルトン（100％、１×−Amdex）および3.5×10⁵ダルトン（100％、５×−Amdex）であった。光散乱測定を行う前に、前述のように調製したT3抗体−アミノデキストランを総量10mLに濃縮した。平均分子量はT3− １×−Amdexについては3.6×10⁶ダルトン、T3−５×−Amdexについては1.4×10⁶ ダルトンであった。これらの結果を用い、T3抗体：１×−Amdexモル比を、(3,60 0,000−1,000,000)÷160,000＝16：１のように評価し、さらにT3抗体：５×Amde xモル比を、(1,400,000−350,000)÷160,000＝6.6：１のように評価した。５．アミノデキストランに対する飽和T3抗体結合体約１：１の抗体：アミノデキストラン重量比を用いて結合を行う場合、T3−１ ×−AmdexおよびT3−５×−Amdex結合体の初期調製物のクロマトグラムは、あるとしても、わずかな、過剰のT3抗体を示すにすぎなかった。結果として、３：１のT3抗体：アミノデキストラン重量比および同量の各アミノデキストランを用いて、追加の実験を行った。活性化、結合、ブロッキングおよびクロマトグラフィ法は上述の方法と同一であった。しかし、クロマトグラフィ中の、狭く、強いバンドは、各場合において一層広いT3抗体−アミノデキストランバンドを引きずる過剰の遊離IT-T3によるものであった。IT-T3バンドはT3アミノデキストランバンドに十分近いため、各場合に約半分の第１バンドが分離されるにすぎない。結果として、T3−１×−Amdex調製物は、0.576mg/mLのT3のT3−１×-Amdex溶液75m Lを生じ、0.466mg/mLのT3のT3−５×−Amdex溶液40mLを生じた。ELISA固相アッセイは、それぞれ0.392および0.301mg/mL T3抗体を与えた。光散乱の結果は、それぞれ6.9×10⁶ダルトンおよび3.6×10⁶ダルトンの平均分子量を示した。結合体におけるT3抗体：アミノデキストランモル比をT3−１×−Amdexについて(6,900, 000−1,000,000)÷160,000＝37：１のように評価し、さらにT3−５×Amdexについて(3,600,000−350,000)÷160,000＝20：１のように評価した。ＩＩＩ．末梢血Ｔ細胞の抗CD3−アミノデキストラン結合体を用いた活性化Ａ．末梢血単核細胞(PBMC)の単離この明細書で用いた方法を室温で行った。正常な全血をEDTA（エチレンジアミン四酢酸）を含む管に収集した。これらの管を500gで10分間遠心分離した。無菌技術を用いて軟膜を収集し、１×PBSを用いて１：２（細胞：溶媒）に希釈して分離し、PBMCインターフェースを収集し、１×PBSで希釈した。希釈した試料を3 00gで10分間遠心分離し、次に、ペレットを再懸濁し、１×PBSで希釈して300gで 10分間遠心分離することにより、１×PBSで２回洗浄した。１×PBS中での最後の再懸濁の後、これらの細胞を計数し、細胞の生存を確かめた。これらの細胞を２つの部分に分け、上述のように遠心分離して、次の工程のための適当な媒体に再懸濁させた。Ｂ．抗CD3−アミノデキストランを用いたＴ細胞の培養と活性化対照細胞として用いるための非活性化細胞を10％(V/V)のCPSR-2血清代替物を度は2.5×10⁶細胞／mLであった。Ｔ細胞活性化のための培養物を、前記と同一の培地に２〜４ ng/mLのホルボール12−ミリステート13−アセテート(PMA)および0.125〜0.5μg/mLの抗CD3−アミノデキストランを添加した培地中で確立した。活性化培養物をT3−１×−AmdexおよびT3−５×−Amdexを用いて確立した。これらの細胞懸濁物を37℃、５％ CO₂条件で72時間、T-150フラスコ中でインキュベーションした。Ｃ．対照細胞および活性化細胞のハーベスト対照細胞ならびにT3−１×−AmdexおよびT3−５×−Amdex活性化細胞をディスポーザブルスクレーパーを用いて組織培養フラスコの底を擦ることによりハーベストし、これらの細胞をピペットを用いて収集し、遠心管に入れた。これらの細胞を計数し、300gで10分間遠心分離し、前記したように１×PBSで２回洗浄した。Ｄ．Ｔ細胞活性化のイムノフルオレセンス染色およびフローサイトメトリー分析Ｔ細胞の活性化の程度を、細胞のイムノフルオレセンス染色、次いで、活性化関連抗原（CD71、トランスフェリン受容体およびCD25、IL2受容体）および増殖関連現象〔DNAおよび増殖性細胞核抗原(PCNA)〕の発現に関する染色細胞のフローサイトメトリー分析により測定した。１×10⁶個の細胞を含む各培養物のアリコートを６つの標識した試料の管（３組の６つの管）に入れた。各培養物の組の１つの管を、Coulter Corporationにより販売されている次の試薬で染色した。管１：IgG2a−FITCアイソタイプ対照管２：IL−2R1−FITC(IgG2a、CD25) 管３：IgM−FITCアイソタイプ対照管４：T9−FITC(IgM、CD71) 管５：IgG1、アイソタイプ対照およびヨウ化プロピディウム（DNAを標識するため）管６：PCNA(IgG1)およびヨウ化プロピディウム各組の細胞（対照、T3−１×−Amdex活性化およびT3−５×−Amdex活性化）について、細胞表面の染色のために、これらの細胞を適当なFITC結合モノクローナル抗体と15分間室温でインキュベーションすることにより、管１〜４を処理した。次に、インキュベーションした細胞を１×PBSで希釈し、300gで10分間遠心分離し、懸濁させ遠心分離し最後に１mLの１×PBSで再懸濁させることにより１ ×PBSで洗浄した。細胞内抗原を染色するために、20μg/mLのリゾホスファチジルコリンを含む１％パラホルムアルデヒド溶液１mLに、対照細胞または活性化細胞ペレットを懸濁させ、得られた懸濁物を２分間室温でインキュベーションすることにより、管５および６中の細胞を処理した。インキュベーション後、これらの細胞を１mLの約 10℃の無水メタノールに再懸濁させ、氷上で約10分間インキュベーションし、遠心分離した。次に、得られたペレットを１mLの0.1％NP-40（Sigma Chemicalから入手し得る）中で、約５分間約０℃でインキュベーションし、遠心分離し、次に、IgG1（管５）およびPCNA（管６）モノクローナル抗体と一緒に、約15分間室温で再びインキュベーションした。これらの細胞を１×PBSで洗浄し、FITCに結合したヤギ抗マウス免疫グロブリンと一緒に、さらに15分間室温でインキュベーションした。１×PBSで洗浄した後、１mLのヨウ化プロピディウムを各管に添加した。試料を488nmのAr⁺イオンレーザラインおよびパワーパックアップグレードをルオレセンス信号を収集した。FL1はFITCフルオレセンス発光を示し、FL3はヨウ化プロピディウムによるフルオレセンス発光を示す。横方向光散乱(FS)は細胞サイズを示し、90°光散乱（LSS＝縦対数散乱）は、細胞の複雑性または粒度の指標を与える。単一パラメータ分析（CD25およびCD71）に際しては、リニアカーソルをアイソタイプ対照ヒストグラム上に配置することによって、細胞の２％がカーソルに含まれ、大部分の細胞が除外されるようにした（陰性対照）。結果として、CD25およびCD71陽性細胞を、十分なフルオレセンス光を放射し、カーソルにより規定される領域内に入るような細胞と定義した。PCNAおよびDNAについての２パラメータ分析では、矩形分析領域をアイソタイプ対照ヒストグラム上に描くことにより、２％の細胞がこの矩形内に含まれ、大部分の細胞が除外されるようにした（陰性対照）。したがって、PCNA陽性細胞を十分なフルオレセンス光を放射し、規定領域内に入るような細胞と定義した。DNAの量が増加すると、細胞に取り込まれるヨウ化プロピディウムの量も増加する。G₀／G₁、Ｓ、G₂／Ｍ期の分析結果は、T3−５×−Amdex（飽和）結合体の刺激により、幼若細胞形成、細胞表面活性化マーカー（CD25およびCD71）の発現、DNA合成および増殖関連抗原(PCNA)の発現により測定されるような最適なＴ細胞活性化が起こることを示す。図１〜４、および表２を検討することにより決定することができるように、増加した横軸光散乱および90°光散乱により測定したような、活性化幼若細胞の割合は、T3−５×−Amdex結合体を用いて刺激した後に、最大であった。また、D よりサイクリング細胞の最大割合が得られることを示した（図５〜７および表２）。これと同様に、CD25、CD71およびPCNA陽性細胞の割合は、図８および表２に示すようにT3−５×−Amdexを用いた活性化後に最適であった。Ｔ細胞の抗CD3誘導活性化および増殖は、Ｔ細胞表面上でのCD3分子の架橋を必要とする。この条件は単球細胞表面上での抗CD3のFc媒介結合によって満たされる場合がある。表２および図１〜８に示すデータは、単球含有培養物から得た。Ｔ細胞を精製し、T3モノクローナル抗体単独、または、観察されたＴ細胞活性化および増殖の増強が５×−Amdex結合体の使用のためであることを確認するために、５×アミノデキストランに結合したT3抗体と一緒に培養した。末梢血単核を、90分間にわたりプラスチックに接着させることにより除去した。Ｂ細胞および残りの単球をB4およびMo2結合磁性ビーズを用いて減少させ、本質的に純粋な（イムノフルオレセンス分析により95％より高いとされた）Ｔ細胞を前述のように培養した。表３に示す、これらの結果は、単球を含む培養物がT3単独の存在下に活性化されるが、精製したＴ細胞調製物では活性化されないことを示す。両細胞調製物では、T3−５×−Amdexを添加することにより同様の活性化が得られた。精製Ｔ細胞を用いた他の実験により、１×結合体に対する５×の卓越性に関する前記知見を確認した。かかる実験の結果を表４に示す。次の表に示すデータは表示された図に対応する。請求の範囲を次に示す：

【手続補正書】特許法第１８４条の７第１項【提出日】１９９４年１０月２５日【補正内容】請求の範囲１．約７〜20重量％のアミン基を有する水溶性アミノデキストラン化合物上に存在するアミン基に共有結合した抗体が含まれ、前記抗体が多重抗体キレート化剤としてはたらくことを特徴とする抗体−アミノデキストラン結合体。２．前記アミノデキストランが約15〜17重量％のアミン基を有する請求項１に記載の結合体。３．前記抗体がモノクローナル抗体である請求項１に記載の結合体。４．前記抗体が抗CD3モノクローナル抗体である請求項３に記載の結合体。５．選択した哺乳類細胞の活性化および増殖を誘導するのに用いることができるモノクローナル抗体と前記抗体が結合する７〜20重量％のアミン基を有する水溶性アミノデキストランとが含まれ、前記抗体が多重抗体キレート化剤としてはたらくことを特徴とする抗体−アミノデキストラン結合体。６．前記抗体とアミノデキストランとが架橋基により共有結合されている請求項５に記載の結合体。７．前記アミノデキストランが10〜17重量％のアミン基を含む請求項５に記載の結合体。８．前記アミノデキストランが15〜17重量％のアミン基を含む請求項７に記載の結合体。９．前記哺乳類細胞がＴ細胞、Ｂ細胞である請求項５に記載の結合体。 10．前記細胞がＴ細胞である請求項９に記載の結合体。 11．前記モノクローナル抗体がＴ細胞およびＢ細胞よりなる群から選択した細胞上に存在する抗原を標的にする請求項６に記載の結合体。 12．前記抗体がＴ細胞上の抗原を標的にする請求項１１に記載の結合体。 13．前記抗体が抗CD3モノクローナル抗体である請求項１２に記載の結合体。 14．前記抗体がフルオレセンス標識を有する請求項５に記載の結合体。 15．選択した哺乳類細胞の活性化および増殖を誘導するにあたり、 (a)複数のモノクローナル抗体を７〜20重量％のアミン基を有するアミノデキストラン分子に結合し；前記抗体が多重抗体キレート化剤としてはたらき；(b )前記結合体を前記選択哺乳類細胞を含む試料と反応させて前記結合抗体を前記選択細胞に結合させ、これにより前記細胞の活性化および増殖を誘導し；および前記試料を得られた結合抗体−選択細胞種について分析する工程を含むことを特徴とする細胞の活性化および増殖を誘導する方法。 16．前記抗体を抗Ｔ細胞モノクローナル抗体および抗Ｂ細胞モノクローナル抗体よりなる群から選択する請求項１５に記載の方法。 17．前記モノクローナル抗体がＴ細胞上のCD3部位に特異的である請求項１６に記載の方法。 18．前記アミノデキストランが10〜17重量％のアミン基を含む請求項１５に記載の結合体。 20．哺乳類Ｔ細胞機能を分析するにあたり、 (a)哺乳類Ｔ細胞を含む試料をアミノデキストラン／抗Ｔ細胞モノクローナル抗体結合体と反応させ、前記アミノデキストランが７〜20重量％のアミン基を有し；前記抗体が多重抗体キレート化剤としてはたらき；および (b)工程(a)の生成物を分析して、核酸合成の変化、タンパク質または糖タンパク質合成の変化、細胞サイズおよび形態の変化、膜完全性の変化、細胞内構成物の発現の変化、細胞機能の変化、細胞成長の変化、細胞分化の変化および細胞を含む培地への細胞成分の放出の変化よりなる群から選択した少なくとも１種の変化についての試験を用いることによりＴ細胞機能を評価する工程を含むことを特徴とする哺乳類Ｔ細胞の機能を分析する方法。 21．前記分析が、AIDS、非AIDS免疫不全、感染症、ガン、自己免疫疾患およびアトピー性疾患よりなる群から選択した少なくとも１種の疾病または疾患についてのものである請求項２０に記載の方法。 22．前記試料中のＴ細胞を移植細胞、移植組織、移植器官の受容者から得る請求項２０に記載の方法。 23．請求項２０の工程(b)に先立ち、非Ｔ白血球細胞およびそれらの未熟前駆体を選択した薬剤で刺激して、前記疾病または疾患のためのさらなる試験を促進することができる請求項２１に記載の方法。 24．請求項２０の工程(b)に先立ち、非Ｔ白血球細胞およびそれらの未熟前駆体を選択した薬剤で刺激して、前記移植に関するさらなる試験を促進することができる請求項２２に記載の方法。 25．前記アミノデキストランが10〜17重量％のアミン基を含む請求項２０に記載の方法。 26．前記アミノデキストランが15〜17重量％のアミン基を含む請求項２５に記載の方法。 27．前記非Ｔ白血球を、Ｂ細胞、マクロファージ／単球、樹状細胞、好中球、好酸球、好塩基球、細胞障害性エフェクタ細胞、造血幹細胞およびそれらの細胞の未熟前駆細胞よりなる群から選択する請求項２３に記載の方法。【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９５年６月１２日【補正内容】請求の範囲１．約７〜20重量％のアミン基を有する水溶性アミノデキストラン化合物上に存在するアミン基に共有結合した抗体が含まれ、前記抗体が多重抗体キレート化剤としてはたらき、前記アミノデキストランが抗体の分子量より大きな分子量を有し、および前記抗体対前記アミノデキストランのモル比が２以上であることを特徴とする抗体−アミノデキストラン結合体。２．前記アミノデキストランが約15〜17重量％のアミン基を有する請求項１に記載の結合体。３．前記抗体がモノクローナル抗体である請求項１に記載の結合体。４．前記抗体が抗CD3モノクローナル抗体である請求項３に記載の結合体。５．選択した哺乳類細胞の活性化および増殖を誘導するのに用いることができるモノクローナル抗体と前記抗体が結合する７〜20重量％のアミン基を有する水溶性アミノデキストランとが含まれ、前記抗体が多重抗体キレート化剤としてはたらき、前記アミノデキストランが抗体の分子量より大きな分子量を有し、さらに前記抗体対前記アミノデキストランのモル比が２以上であることを特徴とする抗体−アミノデキストラン結合体。６．前記抗体とアミノデキストランとが架橋基により共有結合されている請求項５に記載の結合体。７．前記アミノデキストランが10〜17重量％のアミン基を含む請求項５に記載の結合体。８．前記アミノデキストランが15〜17重量％のアミン基を含む請求項７に記載の結合体。９．前記哺乳類細胞がＴ細胞である請求項５に記載の結合体。 10．前記細胞がＴ細胞である請求項９に記載の結合体。 11．前記モノクローナル抗体がＴ細胞上に存在する抗原を標的にする請求項６に記載の結合体。 12．前記抗体がＴ細胞上の抗原を標的にする請求項１１に記載の結合体。 13．前記抗体が抗 CD3モノクローナル抗体である請求項１２に記載の結合体。 14．選択した哺乳類細胞の活性化および増殖を誘導するにあたり、 (a)複数のモノクローナル抗体を７〜20重量％のアミン基を有するアミノデキストラン分子に結合し；前記抗体が多重抗体キレート化剤としてはたらき；(b) 前記結合体を前記選択哺乳類細胞を含む試料と反応させて前記結合抗体を前記選択細胞に結合させ、これにより前記細胞の活性化および増殖を誘導し；および前記試料を得られた結合抗体−選択細胞種について分析する工程を含むことを特徴とする細胞の活性化および増殖を誘導する方法。 15．前記抗体を抗Ｔ細胞モノクローナル抗体よりなる群から選択する請求項１４に記載の方法。 16．前記モノクローナル抗体がＴ細胞上のCD3部位に特異的である請求項１５に記載の方法。 17．前記アミノデキストランが10〜17重量％のアミン基を含む請求項１４に記載の方法。 18．哺乳類Ｔ細胞機能を分析するにあたり、 (a)哺乳類Ｔ細胞を含む試料をアミノデキストラン／抗Ｔ細胞モノクローナル抗体結合体と反応させ、前記アミノデキストランが７〜20重量％のアミン基を有し；前記抗体が多重抗体キレート化剤としてはたらき；および (b)工程(a)の生成物を分析して、核酸合成の変化、タンパク質または糖タンパク質合成の変化、細胞サイズおよび形態の変化、膜完全性の変化、細胞内構成物の発現の変化、細胞機能の変化、細胞成長の変化、細胞分化の変化および細胞を含む培地への細胞成分の放出の変化よりなる群から選択した少なくとも１種の変化についての試験を用いることによりＴ細胞機能を評価する工程を含むことを特徴とする哺乳類Ｔ細胞の機能を分析する方法。 19．前記分析が、AIDS、非AIDS免疫不全、感染症、ガン、自己免疫疾患およびアトピー性疾患よりなる群から選択した少なくとも１種の疾病または疾患についてのものである請求項１８に記載の方法。 20．前記試料中のＴ細胞を移植細胞、移植組織、移植器官の受容者から得る請求項１８に記載の方法。 21．請求項１８の工程(b)に先立ち、非Ｔ白血球細胞およびそれらの未熟前駆体を選択した薬剤で刺激して、前記疾病または疾患のためのさらなる試験を促進することができる請求項１９に記載の方法。 22．請求項１８の工程(b)に先立ち、非Ｔ白血球細胞およびそれらの未熟前駆体を選択した薬剤で刺激して、前記移植に関するさらなる試験を促進することができる請求項２０に記載の方法。 23．前記アミノデキストランが10〜17重量％のアミン基を含む請求項１８に記載の方法。 24．前記アミノデキストランが15〜17重量％のアミン基を含む請求項２３に記載の方法。 25．前記非Ｔ白血球を、Ｂ細胞、マクロファージ／単球、樹状細胞、好中球、好酸球、好塩基球、細胞障害性エフェクタ細胞、造血幹細胞およびそれらの細胞の未熟前駆細胞よりなる群から選択する請求項２１に記載の方法。

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Claims

【特許請求の範囲】１．約７〜20重量％のアミン基を有する水溶性アミノデキストラン化合物上に存在するアミン基に共有結合した抗体が含まれることを特徴とする抗体−アミノデキストラン結合体。２．前記アミノデキストランが約15〜17重量％のアミン基を有する請求項１に記載の結合体。３．前記抗体がモノクローナル抗体である請求項１に記載の結合体。４．前記抗体が抗CD3モノクローナル抗体である請求項３に記載の結合体。５．選択した哺乳類細胞の活性化および増殖を誘導するのに用いることができるモノクローナル抗体と前記抗体が結合する７〜20重量％のアミン基を有する水溶性アミノデキストラン化合物とが含まれることを特徴とする抗体−アミノデキストラン結合体。６．前記抗体とアミノデキストランとが架橋基により共有結合されている請求項５に記載の結合体。７．前記アミノデキストランが10〜17重量％のアミン基を含む請求項５に記載の結合体。８．前記アミノデキストランが15〜17重量％のアミン基を含む請求項７に記載の結合体。９．前記哺乳類細胞がＴ細胞、Ｂ細胞である請求項５に記載の結合体。 10．前記細胞がＴ細胞である請求項９に記載の結合体。 11．前記モノクローナル抗体がＴ細胞およびＢ細胞よりなる群から選択した細胞上に存在する抗原を標的にする請求項６に記載の結合体。 12．前記抗体がＴ細胞上の抗原を標的にする請求項１１に記載の結合体。 13．前記抗体が抗CD3モノクローナル抗体である請求項１２に記載の結合体。 14．前記抗体がフルオレセンス標識を有する請求項５に記載の結合体。 15．選択した哺乳類細胞の活性化および増殖を誘導するにあたり、 (a)複数のモノクローナル抗体を７〜20重量％のアミン基を有するアミノデキストラン分子に結合し；(b)前記結合体を前記選択哺乳類細胞を含む試料と反応させて前記結合抗体を前記選択細胞に結合させ、これにより前記細胞の活性化および増殖を誘導し；および前記試料を得られた結合抗体−選択細胞種について分析する工程を含むことを特徴とする細胞の活性化および増殖を誘導する方法。 16．前記抗体を抗Ｔ細胞モノクローナル抗体および抗Ｂ細胞モノクローナル抗体よりなる群から選択する請求項１５に記載の方法。 17．前記モノクローナル抗体がＴ細胞上のCD3部位に特異的である請求項１６に記載の方法。 18．前記アミノデキストランが10〜17重量％のアミン基を含む請求項１５に記載の方法。 19．前記アミノデキストランが15〜17重量％のアミン基を含む請求項１８に記載の方法。 20．哺乳類Ｔ細胞機能を分析するにあたり、 (a)哺乳類Ｔ細胞を含む試料を、アミノデキストラン／抗Ｔ細胞モノクローナル抗体結合体と反応させ、前記アミノデキストランが７〜20重量％のアミン基を有し；および (b)工程(a)の生成物を分析して、核酸合成の変化、タンパク質または糖タンパク質合成の変化、細胞サイズおよび形態の変化、膜完全性の変化、細胞内構成物の発現の変化、細胞機能の変化、細胞成長の変化、細胞分化の変化および細胞を含む培地への細胞成分の放出の変化よりなる群から選択した少なくとも１種の変化についての試験を用いることによりＴ細胞機能を評価する工程を含むことを特徴とする哺乳類Ｔ細胞の機能を分析する方法。 21．前記分析が、AIDS、非AIDS免疫不全、感染症、ガン、自己免疫疾患およびアトピー性疾患よりなる群から選択した少なくとも１種の疾病または疾患についてのものである請求項２０に記載の方法。 22．前記試料中のＴ細胞を移植細胞、移植組織、移植器官の受容者から得る請求項２０に記載の方法。 23．請求項２０の工程(b)に先立ち、非Ｔ白血球細胞およびそれらの未熟前駆体を選択した薬剤で刺激して、前記疾病または疾患のためのさらなる試験を促進することができる請求項２１に記載の方法。 24．請求項２０の工程(b)に先立ち、非Ｔ白血球細胞およびそれらの未熟前駆体を選択した薬剤で刺激して、前記移植に関するさらなる試験を促進することができる請求項２２に記載の方法。 25．前記アミノデキストランが10〜17重量％のアミン基を含む請求項２０に記載の方法。 26．前記アミノデキストランが15〜17重量％のアミン基を含む請求項２５に記載の方法。 27．前記非Ｔ白血球を、Ｂ細胞、マクロファージ／単球、樹状細胞、好中球、好酸球、好塩基球、細胞障害性エフェクタ細胞、造血幹細胞およびそれらの細胞の未熟前駆細胞よりなる群から選択する請求項２３に記載の方法。