JP2007501310A - 改良型アミノデキストラン組成物及び複合体並びにその製造及び使用方法 - Google Patents

改良型アミノデキストラン組成物及び複合体並びにその製造及び使用方法 Download PDF

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Abstract

１０ｍｇ/ｍｌの濃度で水溶液に可溶である、多分散アミノデキストラン・ポリマー分子を含む組成物。当該分子は、１１５ｎｍを超える平均的な分子の水力学的直径、０．１０〜０．４７の他分散性指数、３００万ダルトンを超える平均分子量（ＭＷ）、及び１分子あたり５０個のアミンを超えるアミン含有量を特徴とする狭いサイズ分布を有する。類似する可溶性の組成物は、７００万ダルトンを超える平均ＭＷを有するポリマー分子を含む。これらの組成物は、細胞標識用のタンパク質と結合させることにより試薬を形成する際に有用である。これらの組成物及び試薬を、アミノデキストラン・ポリマーの慣用の混合物から、これらの組成物及び試薬を作成する方法は、カラム・クロマトグラフィーでの分画を含む。

Description

本発明は、狭いサイズの分布の多分散性アミノデキストラン・ポリマー分子を含む組成物であって、水又は水性溶液中に可溶性である組成物を提供する。
発明の背景
アミノデキストラン（「Ａｍｄｅｘ」と略されることが多い）は、化学的に導入されたペンダント型アミノ基を伴うグルコース残基の主に直鎖を含む高分子量のポリマーである。これらのアミノ基は活性化させてさまざまなタンパク質に結合させることができる。細胞に結合するその低い非特異的バックグラウンド、その高い水溶性及び反応条件の調整によりそのアミン含有量を変動させることのできるその能力を理由として、アミノデキストランは長い間、ストレプトアビジン又はモノクローナル抗体といったようなタンパク質との増幅標識付き複合体の１成分として有用であった。かかる複合体における好ましい標識は蛍光標識である。フィコエリスリンといったような蛍光標識も同様にアミノデキストラン・ポリマーに対し多数付着され、高い特異性及び増強された蛍光強度をもつ試薬を生産してきた。数多くのこのような粒子が、フローサイトメトリ用途向けの細胞標識において使用するための試薬として記述されてきた。例えば、なかんづく米国特許第５，８９１，７４１号；５，９９４，０８９号及び６，３８７，６２２号を含めた本発明者の以前の公報並びにO.Sliman et al, 1999 Bioconj Chem., 10(6): 1090-1106を参照のこと。
アミノデキストラン及びアミノデキストラン−タンパク質複合体のその他に用途については、例えば、高血圧症を治療するためのアデノシンデキストラン複合体に言及している米国特許第５，４２４，２９７号；その他の水溶性複合体及び試薬に言及している米国特許第５，５４３，３３２号；及びワクチン及びアシュバントとして使用するための免疫原性デキストラン−ポリマー複合体について記述する米国特許第６，２８７，５６８号の中で記述されており；米国特許第６，２０７，３８５号は、デキストラン担体高分子に結合された核酸について記述している。T.M. Hansen, 2003 IVD Technol., pp. 35-40は、定量検定で使用するための蛍光デキストラン複合体について記述している。国際特許出願第００／０７０１９号（２０００年２月１０日）は、水溶性架橋複合体の調製方法について記述している。
米国特許第５，６２７，０７８号は、沈殿試験で使用するための多価デキストラン試薬について記述している。この多価試薬は、１０ｋＤａから最高で約２０００ｋＤａの溶解度限界までのＭＷをもつデキストランを利用し、好ましくは２０〜５００ｋＤａのＭＷを利用している。これらの試薬は約１：５〜１：５０のデキストラン：結合分子比を有する。C, W. Cairo et al, 2002 J. Am, Chem. Soc. 123,1615-19も同様に参照のこと。これらの文書及び上述の文書は、現在知られているアミノデキストラン及びアミノデキストラン複合体及びその他の形態におけるその使用についての情報を提供するために援用される。
しかしながら、アミノデキストラン複合体の使用に付随する問題としては、複合体の調製ロット間でさらには１つのロット内のクロマトグラフィ画分の間で収量及び増幅が変動し一貫性のないことが含まれる。アミノデキストラン・ポリマーのこのような一貫性のないロットを使用することにより、結果として、細胞標識が関与する診断手順のために望まれるものよりも効率の低い標識をもたらされた。
かくして、当該技術分野には、細胞標識試薬としてのその有用な品質を保持しながら、現在利用されているアミノデキストラン複合体の欠陥を克服する方法及び組成物に対するニーズが存在している。
発明の要約
１つの態様においては、本発明は、水又は水溶液中に可溶である、狭いサイズ分布の多分散アミノデキストラン・ポリマー分子を含む組成物を提供する。該組成物中に存在する多分散分子は、１１５ｎｍより大きい平均的な分子の平均水力学的直径、０．１０〜０．４７の間の多分散性指数、３００万ダルトンを超える平均分子量（ＭＷ）及び一分子あたり５０アミンを超えるアミン含有量を特徴とする狭いサイズ分布を有している。驚くべきことに、７ＭＤａを超える平均分子量をもつこのような組成物でさえ、水に可溶性である。
もう１つの態様において、本発明は、選択された標識付きタンパク質又は蛍光タンパク質に結合された本明細書に記述されている狭いサイズ分布の多分散アミノデキストラン・ポリマーを含む細胞標識用試薬及び複合体を含む組成物を提供している。
さらにもう１つの態様では、本発明は、アミノデキストラン分子が狭いサイズ分布を有する多分散アミノデキストラン組成物と細胞標識用試薬／複合体の生産方法を提供している。結果として得られた組成物は、水溶液中で可溶性である。
本発明のその他の態様及び利点は、その好ましい実施形態についての以下の詳細な説明の中でさらに記述されている。
本発明者らは、商業的供給業者によって供給されたものであるか本発明者により作られたものであるかに関わらずアミノデキストランが分子量（ＭＷ）又は鎖長のきわめて不均質な混合から成っていることを理由として、アミノデキストラン複合体の使用に付随する上述の問題が発生するということを見極めた。例えば、標準的なアミノデキストラン混合物は、混合型ＭＷの種のポリマーを含有し、約２５ｋＤａ〜公称３，９００ｋＤａの間という混合物についての平均的ＭＷを提供する。これらの標準的アミノデキストランの多分散性指数は、例えば下表２に見られるように、０．４０より大きい。同様に、これらの標準的混合物中のこのようなアミノデキストラン分子は、下表１及び２の両方に見られるように、約１１５ｎｍ未満の平均的な平均水力学的直径（すなわち、２×環動半径×０．７）を有していた。さらに、利用可能な公称で最高のＭＷのデキストラン種のいくつかは、水中でわずかに可溶であるか又は不溶性である傾向をもつ。例えば、５〜４０ＭＤａの平均ＭＷの市販の工業品質のデキストラン（ＳｉｇｍａＤ５５０１）は、水又は水性溶媒中でわずかに可溶であるか又は不溶性である。
ＭＷが高い種になればなるほど蛍光タンパク質といったようなタンパク質分子の活性化及び結合のための部位が多くなることから、複合体として使用するための所望の材料は、可能なかぎり高いＭＷをもつアミノデキストラン・ポリマーである。発明者らは、現在調製されているように、標準的な利用可能なアミノデキストランに対してタンパク質を結合の後、比較的ＭＷの低い複合体を所望の最高ＭＷの複合体から完全には分離できない、ということを見極めた。生物学的細胞の標識において使用されている間、比較的ＭＷの低い鎖はＭＷの高い鎖に比べて溶液中でより移動度が高く、はるかに数が多い。従って、細胞は、低ＭＷの材料で優先的に標識されることになり、その結果、蛍光強度は低くなる。
アミノデキストラン・ポリマーの使用に付随する問題のいくつかの原因を同定したことから、本発明は、改良型多分散アミノデキストラン・ポリマー組成物といった新規の組成物及びそれを含有する複合体と試薬を提供している。これらの改良型ポリマー組成物は、より高いＭＷのポリマーのみを含み、従って新規試薬は、蛍光性（又はその他の）タンパク質と結合する能力が増加した実質的に全てより高いＭＷの複合体によって特徴づけされる。かかる高いＭＷの試薬はかくして、それらを利用した診断プロセスを改善することになる。なぜなら、アミノデキストランのより高いＭＷの画分が細胞に結合するより前に、より低いＭＷの画分が細胞に結合するという通常の選好性を除くためである。高ＭＷのアミノデキストランを含有する改良型アミノデキストラン組成物を用いると、タンパク質及び／又は色素とのアミノデキストラン複合体は、より均質でかつ細胞に対し類似の結合活性で結合する。さらに、かつ驚くべきことに、かかる高ＭＷの試薬は、以下の実施例の中で実証される通り、水溶液中で可溶である。
本発明の１つの態様は、多分散アミノデキストラン・ポリマー分子を含む組成物を提供する。組成物は、１０ｍｇ／ｍｌの濃度で水溶液中で可溶である。組成物中の多分散アミノデキストラン分子は、狭いサイズ分布を有する。本明細書で使用する「狭いサイズ分布」というのは、組成物中のアミノデキストラン分子が、１１５ｎｍより大きい平均的な分子の平均水力学的直径、０．１０〜０．４７の多分散性指数、３００万ダルトンを超える平均分子量（ＭＷ）及び１分子あたり５０アミンを超えるアミン含有量を有することを意味する。１つの態様においては、多分散アミノデキストラン組成物の平均ＭＷは、４００万より大きい。もう１つの実施形態において、平均ＭＷは、５ＭＤａより大きい。もう１つの実施形態においては、平均ＭＷは６ＭＤａより大きい。さらにもう１つの実施形態においては、平均ＭＷは、７ＭＤａより大きい。さらなる実施形態においては、平均ＭＷは８ＭＤａより大きい。かかる分子量は、適切には、屈折率、粘度及び光散乱を用いる三重検出器（triple detection)方法（Viscotek, Inc., Houston, TX）；又はCoulter N4MD型サブミクロン粒子分析装置を用いて実施されるような光子相関分光法（ＰＣＳ）；又はCoulter Doppler電気泳動光散乱分析装置（ＤＥＬＳＡ）上で実施されるような粒子電気泳動法といったような単数又は複数の従来の技術を使用することで適切に測定可能である。
この改良型多分散アミノデキストラン組成物は同じく水への溶解度によっても特徴づけされる。１の実施態様においては、本発明の組成物は、１０ｍｇ／ｍｌの最小濃度で水に可溶である。もう１つの実施形態においては、組成物は、約１０〜５０ｍｇ／ｍｌの間の濃度で完全に水溶性である。もう１つの実施形態においては、組成物の水溶性は２０〜４０ｍｇ／ｍｌである。驚くべきことに、これらの改良型多分散組成物は、その水溶性を３００万ダルトンの平均分子量よりはるかに高い分子量で保持している。以下の実施例で実証される通り、８ＭＤａの平均ＭＷの改良型多分散組成物でさえ水溶性である。本発明の改良型アミノデキストラン組成物は、水又は水性溶媒中で可溶でありかくしてストレプトアビシン、モノクローナル抗体、フィコエリスリン及そのタンデム誘導体といったようなタンパク質分子のための大型ポリマー担体として有用であるべき３〜８ＭＤａの高ＭＷの初めてのデキストラン誘導体を代表している。
本発明の改良型多分散アミノデキストラン組成物のさらにもう１つの特徴は、それらが、アミノデキストラン分子１個につき５０アミンを超えるアミン含有量を有するという点にある。もう１つの実施形態においては、アミン含有量は、アミノデキストラン分子１個あたり約７０アミンである。さらにもう１つの実施形態においては、アミン含有量は、アミノデキストラン分子１個あたり約９０アミンである。さらにもう１つの実施形態においては、アミン含有量は、アミノデキストラン分子１個あたり約１１０アミンである。もう１つの実施形態においては、本発明の改良型Ａｍｄｅｘのアミン含有量は、アミノデキストラン分子１個あたり約１３０アミンである。アミン含有量は、ニンヒドリン方法を用いて測定可能である。（J. M. Stewart and J. D. Young, 「ポリペプチドの固相合成」、W. H. Freeman & Co.,編、San Francisco, CA 1969, pp-57-58）。
狭いサイズ分布の改良型アミノデキストランのさらにその他の特徴は、組成物中の平均的な分子の平均水力学的直径が１１５ｎｍより大きいという点にある。１実施形態においては、２×環動半径Ｒg×０．７として測定される組成物の平均的な分子の平均水力学的直径は１２５より大きい。もう１つの実施形態においては、組成物の平均的な分子の平均水力学的直径は１５０より大きい。
本発明の改良型多分散アミノデキストラン組成物の付加的な特徴は、これらの組成物が各々、０．１０〜０．４７の間の多分散性指数を有するという点にある。
本明細書を通して使用されている「改良型アミノデキストラン」又は「精製済みアミノデキストラン」という用語は、上述のような狭いＭＷ分布、多分散性、アミノ含有量及び溶解度を特徴とする本発明のアミノデキストラン組成物を意味する。
１実施形態においては、これらの高ＭＷアミノデキストラン組成物は、例えば下表１に示されているように３４．４ｋＤａ〜３，９１１ｋＤａの範囲の平均ＭＷをもつアミノデキストラン・ポリマーの現在利用可能な広いサイズ分布の混合物から、多分散性の高ＭＷアミノデキストラン・ポリマー分子を精製することに関与する方法によって調製され得る。商業的に供給されたアミノデキストラン及び合成されたアミノデキストランの両方共、かかる広い分子量分布を有することが発見された。アミノデキストランを調製するための原料として使用されるデキストラン（Sigma又はPharmacia）は、広いＭＷ分布を有する。例えば商業的供給業者が約２ｍＤａの公称平均ＭＷを有すると述べている製品は、０．５〜３．９ｍＤａの範囲内のＭＷ混合物を含有する。デキストランのアミノ化のための反応条件は、同様に部分的鎖分解をも結果としてもたらし得る。製品のアミン含有量が高ければ高いほど、鎖分解は大きくなる。反応条件は、シグナルの充分な増幅も同様に可能にするべく可能なかぎり最高のＭＷを維持しながら、タンパク質例えばストレプトアビジン及びフィコエリスリンを飽和量で結合させることができるように適切なアミン含有量を提供するべく調整されなくてはならない。出発材料、デキストランは通常２００〜３００万ｇ／モル（Ｔ−２Ｍ）であり、なおも水溶性である。この品質は、Sigma及びPharmaciaといったような商業的供給元から入手可能である。
アミノデキストランのこのような広いサイズ分布混合物は、例えばMolecular Probes （ロットＭＰ８）から商業的に購入可能であり、そうでなければカルボキシメチル化段階及びアミノ化段階を用いて従来の反応により調製可能である。アミノデキストランの広いサイズ分布の組成物の製造方法は、このような技術に制限されず、このような広いサイズ分布のアミノデキストラン組成物を製造するためのあらゆる技術が本発明の実践範囲内に入るものと想定されている。これらの混合物は、一般に、出発デキストラン及びアミノ化条件を変えることによって調製される。米国特許第５，４６６，６０９号及び米国特許第５，５２７，７１３号を参照のこと。これらの不均質組成物について既知の最も高い分子量は、０．４０以上の多分散性指数及び１１５ｎｍ未満の平均的平均水力学的直径で、２〜３ＭＤａの公称平均ＭＷである。
かくして、本発明の改良型アミノデキストランのための生産方法には、１１５ｎｍ未満の平均的な分子の平均水力学的直径及び０．４０を超える多分散性指数を特徴とする広いサイズ分布の多分散アミノデキストラン粒子の第１の混合物から、１１５ｎｍを超える平均的な分子の平均水力学的直径、０．１０〜０．４７の間の多分散性指数、３００万ダルトンを超える平均分子量（ＭＷ）及び１分子あたり５０アミンを超えるアミン含有量を特徴とする狭いサイズ分布を有する第２の混合物を分離させることを含む。分離された分子の該第２の混合物は１０ｍｇ／ｍＬの濃度で水溶液中に可溶であり、貯蔵のために凍結乾燥可能である。凍結乾燥される場合、これらの改良型アミノデキストラン組成物は、硝酸ナトリウム水溶液といったような水溶液中で再度溶解し得る。再溶解の後、例えば上述の通りの光散乱といったような光学的測定を、改良型組成物の特徴を確認する目的で実施することができる。
狭いサイズ分布の改良型多分散アミノデキストランを調製するための本発明のプロセスには、従来のアミノデキストラン混合物内の低分子量の種からの高分子量デキストランのろ過又は分画に適した分離段階が含まれる。例えば、発明者らは、ゲルろ過又はサイズ排除カラムクロマトグラフィによる分画を利用した。サイズ排除カラムクロマトグラフィ又はゲルろ過の使用により、問題の高分子量の画分の単離に成功することができる。同様にして、類似の商業規模のプロセスが同じ結果を提供するものと予想されている。以下の実施例では、（フィコエリスリンとの複合体にとって特に望ましいことが発見された）クロマトグラフィカラム内でアガロースゲル材料が利用されているものの、その他のゲルろ過媒質も使用することができる。有用なアガロースゲルビーズの一例は、例えばＳＥＰＨＡＲＯＳＥ４Ｂ(商標)又はＳＥＰＨＡＲＯＳＥ２Ｂ(商標)といった商標でAmersham Pharmacia Biotechから又はＢ１０ＧＥＬ(商標)Ａ１５ｍという商標でBio Rad Laboratoriesから市販されている。有用なゲルろ過材料は、商標ＳＥＰＨＡＲＹＬＳ−４００(商標)、Ｓ−５００(商標)又はＳ−１０００(商標)及びＳ米国特許第ＥＲＯＲＥ６(商標)（Amersham Biosciences Corp.）として販売されている。この精製方法は、低ＭＷの種から高ＭＷのアミノデキストランを分離するのに使用された特定の手順によって制限されるものではない。類似の要領で、同じ精製を達成するために、既知の分析遠心分離を利用することが可能であると思われる（例えばJ. L. Cole, 1999 J. Biomolec, Tech. 10:163参照）。もう１つの有用な方法は、J. C. Giddings, 1993 Science, 260:1456に記述されているような沈降場流動分画法（field flow fractionation)である。
１つの実施形態においては、市販のＡｍｄｅｘ MP8といったようなさまざまなＭＷの広い分布をもつアミノデキストラン・ポリマーの不均質混合物が、４％のアガロースゲルビーズのクロマトグラフィカラム全体にわたり通過させられる。高ＭＷのアミノデキストラン分子の狭い分布に対応する最も早期のクロマトグラフィ画分は同定され、カラムから溶出するたびにプールされる。これらの画分は、従来通り脱塩され凍結乾燥される。一般に、材料の先に流出する約３分の１体積に、本発明において有用なアミノデキストランの高ＭＷの分量が含まれる。この材料の使用は結果としてフローサイトメトリ分析のための細胞マーカーとして使用するのに適した均一で高増幅高収量の複合体をもたらす。
以下の実施例中でより詳細に記述されているように、不均質混合物からより高いＭＷアミノデキストランを精製するための本発明者らの方法は、不均質アミノデキストランの低分子量画分を多く含むアミノデキストランの広い分布を含有する不均質な混合物とは異なり潜在的な細胞標的との相互作用における干渉を回避する改良型組成物を結果としてもたらす。本発明の改良型アミノデキストランは、狭いサイズ分布のより均質な生成物複合体及び１アミノデキストラン分子あたり一定の数のタンパク質分子（例えば標識又はマーカー）を提供する。さらに、本発明の改良型アミノデキストラン組成物の中に存在する狭いサイズ分布のより大きなアミノデキストランは、より多数の検出可能なタンパク質がアミノデキストランと結合することを可能にする。かかる複合体は、以下の実施例の中で示されているように、フローサイトメトリにおけるターゲティングされた細胞についてより大きい蛍光増幅比を提供できる。
先行技術のアミノデキストラン組成物の低ＭＷポリマーフラグメントは、モルベースではるかに数が多く、細胞の標識においてより高い移動度を有し、従って、優先的に標的部位と反応する。以下の比較例で例示されているように、小さい低ＭＷのフラグメントは、低い蛍光増幅を提供する低いフィコビリプロテイン（例えばフィコエリスリン）含有量を有する。これとは対照的に、本発明に従った精製された高いＭＷのアミノデキストランを用いると、明確にされるべき余剰のＰＥ及びストレプトアビジン（ＳＡ）からの複合体の複数回の分離が可能となり、低ＭＷのアミノデキストランフラグメント内へのＰＥ及びＳＡの損失が低減される。本発明によって記述されたとおりの低ＭＷ範囲の市販のアミノデキストラン組成物からの高ＭＷのアミノデキストランの分離は、同様に、デキストランの発酵生産において形成された可能性のある内毒素といったようなあらゆる汚染性微生物タンパク質を除去する。
本発明の改良型高ＭＷのアミノデキストラン組成物は、試薬、特にアミノデキストランが既知の用途をもつ細胞標識用試薬を調製する上で有利である。例えば本発明の組成物は、選択された標識済みタンパク質に結合された改良型可溶性多分散アミノデキストランを含む複合体を内含している。かかる標識されたタンパク質は、蛍光タンパク質又は以下で記述するような蛍光タンパク質で標識されたタンパク質であり得る。該細胞標識用試薬をさらに、１０ｍｇ／ｍＬの濃度で水溶液中に可溶である多分散アミノデキストラン・ポリマー分子を含むものとして描写することができる。該組成物のデキストラン分子は、１１５ｎｍ以上の平均的な分子の平均水力学的直径、０．１０〜０．４７の間の多分散性指数、３００万ダルトンを超える平均分子量（ＭＷ）及び１分子あたり５０アミンを超えるアミン含有量により特徴づけされる狭いサイズ分布を有する。これらのデキストラン分子は、選択された標識付きタンパク質に対しアミンを介して結合される。例えば、これらの改良型アミノデキストラン組成物を、フローサイトメトリ分析において使用するための検出可能マーカーと結合させることができる。フィコビリプロテイン、タンデム色素、或る種の蛍光タンパク質、小化学分子及びその他の手段で検出可能な或る種の分子は全て、フローサイトメトリ分析用のマーカーとみなすことができる。例えば、蛍光プローブ及び研究用化学物質便覧、第６版、R, P. Haugland, Molecular Probes Inc., Eugene OR (1996)二記載されるマーカーを参照のこと。
「フィコビリプロテイン」というのは、紅藻及び藍藻中に見られる高分子ファミリである。ビリプロテイン（「ビリプロテイン」という用語は「フィコビリプロテイン」という用語と同義である）は、少なくとも約３０，０００ダルトン、より通常は少なくとも約４０，０００ダルトンの分子量を有し、６０，０００ダルトン以上という高いものであり得、通常は約３００，０００ダルトンを超えない。ビリプロテインは、２〜３個の異なるサブユニットから成り、ここでサブユニットは約１０，０００〜約６０，０００分子量の範囲内でありうる。ビリプロテインは通常、さまざまな藻類及び藍色細菌からその天然の形状で得られたまま利用される。ビリプロテイン中のタンパク質の存在は、アミノデキストラン分子に対する結合のための広範囲の官能基を提供する。存在する官能基には、アミノ、チオール及びカルボキシルが含まれる。本発明のアミノデキストランでの結合のために有利なフィコビリプロテインの例としては、フィコシアニン、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、アロフィコシアニンＢ、フィコエリスリン（ＰＥ）そして好ましくはＲ−フィコエリスリンがある。タンデム色素は、フィコビリプロテイン及びもう１つの色素から形成されうる非天然分子である。例えば、米国特許第４，５４２，１０４号及び米国特許第５，２７２，２５７号を参照のこと。本発明中で有用であるタンデム色素の例としては、フィコエリスロシアニン又はＰＣ５（ＰＥ−Ｃｙ５、フィコエリスリン−シアニン５．１；励起、４８６〜５８０ｎｍ、発光６６０〜６８０ｎｍ）（A. S. Waggoner et al., 1933 Ann N. Y. Acad. Sci., 677-185-193及び米国特許第５，１７１，８４６号）及びＥＣＤ（フィコエリスリン−テキサスレッド；励起、４８６〜５７５ｎｍ、発光６１０〜６３５ｎｍ）（米国特許第４，５４２，１０４号及び米国特許第５，２７２，２５７号。その他の既知のタンデム色素は、ＰＥ−Ｃｙ７、ＡＰＣ−Ｃｙ５、及びＡＰＣ−Ｃｙ７（M. Roederer et al., 1996 Cytometry, 24:191-197）である。タンデム色素ＰＣ５及びＥＣＤは、色素のイミノチオラン活性化が関与する複数の方法によりアミノデキストランに直接うまく結合されてきた。
本発明の改良型アミノデキストランに対しさらにその他のマーカーを直接結合することができる。かかるマーカーの例としては、フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）、緑色蛍光タンパク質、及び青色蛍光タンパク質がある。その他のものは、先に引用した便覧中に列挙されている。ビリプロテイン及びタンデム色素は、Coulter International Corporation, Miami, FL, Molecular Probes, Inc., Eugene, OR及びProzyme, Inc., San Leandro, CAを含むさまざまな販売元から市販されている。上述のその他のマーカー又は標識を既知の供給源から得ることができる。好ましくは蛍光発光は、フローサイトメトリ分析により測定される。
類似の要領で、高ＭＷのアミノデキストランの改良型組成物は、同じく細胞標識を目的として既知の方法により抗体と結合され得る。
かくして、本発明のこれらの改良型アミノデキストラン組成物は、フローサイトメトリのための細胞標識用試薬として有用なさまざまな複合体を調製するための方法において有用であり得る。例えば、本発明の狭いＭＷ分布のアミノデキストラン組成物を用いて抗体−アミノデキストラン−フィコビリプロテイン複合体又はその他の類似の要領で標識された複合体例えばストレプトアビジンアミノデキストラン−フィコビリプロテイン複合体を調製することが可能である。かかる方法は、実施例で詳述され本明細書に要約されているステップを含め、かかる複合体を作るための既知の技術を利用している。かかるステップには、イミノチオランを用いて選択された抗体を（選択された細胞上の細胞表面抗原に対して）活性化し、その後、活性化された抗体を精製することが含まれる。フィコビリプロテインは類似の要領で、イミノチオランで活性化され次に精製され得る。活性化され精製された抗体及びフィコビリプロテインが反応させられる。本発明の改良型アミノデキストランは、スルホ−ＳＭＣＣで活性化され、次に精製される。全ての活性化された成分を約１６〜２４時間混合することにより反応がひき起こされ、その後、該混合物は例えばサイズ排除クロマトグラフィなどによりその成分へと精製される。かかる複合体を生成するためのさらにその他の方法も、上述の特許文献内で教示されている。
もう１つの態様に従うと、本発明の精製済み又は改良型アミノデキストランは、さまざまな既知の検定において生物学的物質を検出するための方法において使用可能である。かかる方法の１つの実施形態例には、複合体の抗体が該物質と結合して複合体を形成できるようにするべく、検出すべき物質を含む試料と抗体−アミノデキストランフィコビリプロテイン複合体を混合する段階が含まれる。その後、複合体の各々のフィコビリプロテイン分子を励起して蛍光を発生させることができる。複合体から蛍光シグナルを得るため励起放射より蛍光をひき起こすことが可能である。その後、複合体からの蛍光シグナルが検出される。
かくして、本発明の複合体は、本明細書の背景において引用されている文書の中で記述されているもののような多様なやり方で使用可能である。例えば、個々の分子としてか又はウイルス、細胞、組織、細胞小器官例えばプラスチド、核などといったより複雑な組織の中のいずれかで存在する、抗原の検出、診断、測定及び研究のための既知の方法を増強させるために使用される。このような方法により検出すべき好ましい「物質」としては、フローサイトメトリを用いる血液細胞及び粒子がある。当該複合体のもう１つの用途は、当該ビリプロテインが蛍光標識として役立つ免疫検定又は競合的タンパク質結合検定におけるものである。ここで、該ビリプロテイン複合体は、リガンド又はレセプタのいずれか、好ましくは抗体に結合可能である。
その他の用途並びに改良型アミノデキストランと会合できるその他のタンパク質については、なかでも米国特許第５，５２７，７１３；５，６５８，７４１；５，８９１，７４１；５，９４５，２９３；５，９９４，０８９；６，０７４，８８４及び６，３８７，６２２；並びにD. Siiman et al., 1999 Btoconj. Chem., 10(6):1090-1106を参照のこと。これらの特許及び刊行物は、アミノデキストランを用いるための既知の方法及び組成物を教示する目的で本明細書に援用されている。このような方法及び用途は全て、当該技術分野にとって既知でかつ入手可能な標準的不均質アミノデキストラン組成物の代りに本発明の改良型アミノデキストラン組成物を使用することによって増進される。
これらの実施例は、本発明の方法及び組成物の使用及びその分析を実証している。これらの実施例中で報告されるデータは、本発明の改良型組成物及び方法が細胞標識用試薬として有用でかつ改良型試料分析を可能にする性能パラメータを有することを実証している。これらの実施例は、例示を目的としており、その範囲を制限するものではない。当業者であれば、特定の試薬及び条件が以下の実施例で概略的に説明されているものの、本発明の組成物又はその使用方法を提供するべく上述の通りの修正を加えることも可能であるということを認識することであろう。
実施例１：高分子量の改良型アミノデキストランの調製
Ａ． アミノデキストランの生産
公称分子量２ＭＤａのアミノデキストランの不均質混合物を数ロット、Molecular Probes, Incから得た（ＭＰ８、ＭＰ８−２及びＭＰ８−３）。さらに、本発明者らは、それぞれSigma及びPharmaciaにより供給された公称分子量２ＭＤａのデキストランを用いて、独自のアミノデキストラン調製物ロット９〜８５及びロット１６２２−２９及び１６２２−３３を生産した。生産プロセスは以下の通りであった。
１１．６ｇのクロロ酢酸、ナトリウム塩を１００ｍｌの水中で溶解させ、３６ｍｌの１ＭのＮａＯＨ中の２ＭＤａのＭＷをもつ１１．２ｇのデキストランの溶液に添加し、４０℃で２０時間攪拌する。その後、１ＭのＨＣｌでｐＨを４の値まで調整し、回転蒸発器上で５０ｍｌの体積まで濃縮させる。形成するカルボキシメチルデキストランをｐＨ５の５０ｍｌの２Ｍエチレンジアミンジヒドロクロリド中に溶解させ、６０分以内に分量の形で３ｇのＮ−エチル−Ｎ’（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドモノヒドロクロリドを添加する。それを、４．７という恒常のｐＨ値で室温でさらに３時間攪拌し、こうして、滴定装置を用いて１ＭのＮａＯＨ水溶液又は１ＭのＨＣｌ水溶液を加える。生成物を２回脱イオン水に対して透析し、その後凍結乾燥させる。
Ｂ． 精製
ＢＩＯＧＥＬ(商標)Ａ１５ｍ（BioRad）、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ(商標)４Ｂ（Amersham Biosciences）又はＡＢＴ４％ゲル（Agarose Bead Technologies）といったような商用カラム媒質を用いて本発明の方法に従ってアミノデキストランを精製した。ＵＶ監視装置（２８０ｎｍの波長での吸収度、Uvicord S又はＳＩＩ、Amersham Biosciences）及びチャート式記録計（ＢＤ４１、Kipp & Zonen）により測定されるような最初に溶出するバンドの下で収集された画分をプールし（最高分子量材料を含有する画分）、濃縮し、タンパク質の結合において使用した。
初期のランを、１００ｍｇのアミノデキストラン−ＭＰ８のスケールで実施し、小カラム（２．５ｃｍ×４８ｃｍ）上で分離し、結果として得た第１の１／３ピークの画分をプールし濃縮した。濃縮物を３０ｍｇのアミノデキストランを含有するものと仮定し、２つの同等の分量に分割し、かくして各々の結合について仮定上１５ｍｇのアミノデキストランが使用されるようにした。
ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ４Ｂ（２Ｌ、７．５ｃｍ×４０ｃｍ）を詰めたカラム上で１．００ｇのアミノデキストラン−ＭＰ８のより大規模な精製を行なった。カラムから１×ＰＢＳで溶出した広い第１のバンド内の最初の１／３のピークの画分を濃縮し、Centri - Prep管内でＤＩ（脱イオン）水で洗浄し、凍結乾燥して０．１２ｇの精製済みアミノデキストランを白色固体として得た。３つの異なるアミノデキストランロット、ＭＰ８、ＭＰ８−２及びＭＰ８−３の３回の試行及びアミノデキストランロット１６２２−３３についてのクロマトグラムが、図１Ａ−１Ｄに個別に示されている。
１画分につき３．８ｍｌを収集する小カラム上の１００ｍｇスケールでの分画から、画分番号１８〜２２で高ＭＷの材料を得た。２０ｍｌの画分を収集する１．００スケールでの２Ｌカラム上の分画から、画分３０〜３９で高ＭＷ材料を得た。
実施例２：高分子量のアミノデキストランについての３重検出器の結果
以上で同定したアミノデキストランの商用不均質混合物を、商事会社すなわちViscotek, Incに対し、水性溶媒中の重量平均分子量、固有粘度及び屈折率の測定のために送付した。同様に、セファローズ４Ｂ上でクロマトグラフィに付され実施例１で記述した通りその後の凍結乾燥のために高分子量画分を選択するロットＭＰ８及び１６２２−３３からの精製済みアミノデキストランを同じく同じ３重検出器測定に付した。データは表１に要約されている。
Figure 2007501310
本発明の精製済みアミノデキストランの２つの試料すなわちＭＰ８及びロット１６２２−３３についてのこの３重検出器データは、それぞれ８．０及び７．０ＭＤａという非常に高い平均ＭＷを示した。次に、付加的なデータの結果を、２５〜３，９００ｋＤａの間の広範囲の分子量をもつアミノデキストラン（アミノデキストラン−ＭＰ、１Ｘ−アミノデキストラン及び５Ｘ−アミノデキストラン）についてのlog（固有粘度、ＩＶｗ）対log（重量平均分子量、Ｍｗ）及びlog（環動半径、Ｒｇ）対log（Ｍｗ）のMark-Houwinkプロットに対して添加した。旧新両方のデータを含む図２及び３を参照のこと。新データは、log（Ｍｗ）の６〜７の範囲内で最も右手側の点として図２及び３に見られる。
図２及び３内のlog-logプロットは、非常に高ＭＷのアミノデキストランが関連性をもつことを示唆した。１０6Ｄａと１０7Ｄａの間の高分子量データは、２つのプロット内でそれぞれ０．２１と０．４０の勾配を示す。２つのグラフは、異なる勾配の３つの領域に関して分析することができる。すなわち、１）図２は中間の５．２〜６．２領域と最も左側の領域において０．４６と０．８０の勾配を示す；２）図３は類似の領域内で０．４８と０．６５の勾配を示す。高ＭＷのアミノデキストランは、ＭＷの増加に伴ってアミノデキストランのサイズの非常にわずかな変化しか示さず、ランダムコイル直鎖多糖に会合された約０．５０の勾配の中間領域内のアミノデキストランに比べてより密度の高いコンパクトなランダムコイル構造を標示している。さらに、約１０〜３０ＭＤａの水溶性デキストランを含有する１５％のシロップである未変性デキストラン（B. Antonimi et al., 1964 Biopolymers 2:27; L. H. Arond及びH. P. Frank 1954 J. Phys. Chem. 58,953）が市販されている（Amersham Biosciences）。５〜４０ＭＤａの平均ＭＷの市販の工業グレードのデキストラン（Sigma Ｄ５５０１）は、水又は水性溶媒中でわずかに可溶であるか又は不溶性である。上述のアミノデキストランは、１０ｍｇ／ｍｌの最低濃度で水及び水性溶媒中で完全に可溶でありかくしてストレプトアビジン、モノクローナル抗体、フィコエリスリン及びそのタンデム誘導体といったタンパク質分子のための大きいポリマー担体として有用である３〜８ＭＤａの間の高ＭＷの第１のデキストラン誘導体を表わしている。
実施例３：高分子量のアミノデキストランについての動的光散乱の結果
ＣＯＵＬＴＥＲ(商標)Ｎ４ＭＤ型サブミクロン粒子分析装置での精製の前後に、アミノデキストラン（ＭＰ８、ＭＰ８−２、及びＭＰ８−３）のスルホ−ＳＭＣＣ誘導体の希釈（最高１ｍｇ／ｍＬ）緩衝（１×ＰＢＳ）溶液について準弾性光散乱（ＱＥＬＳ）測定を実施した。スルホ−ＳＭＣＣ誘導体は、活性化されたタンパク質との結合の直前に溶液中に存在する分子種であることから、これらを測定した。同様に、これらの誘導体は、ｐＨ７．２〜７．３の１×ＰＢＳ中の正に帯電したアミノデキストランとは異なり水溶液中で中性である。平均的な平均水力学的直径、検定間標準偏差（ＳＤ）及び多分散性指数を含む９０°散乱角での単一モード分析の結果が表２に表示されている。
Figure 2007501310
多分散性指数（例えば「粒度分析」N. G. Stanley Wood及びR. W. Lines, eds.,王立化学学会、ケンブリッジ、ＵＫ、１９９２中のB. B. Weiner 「ＱＥＬＳの２７年：ＱＥＬＳでの粒度決定の利点及び欠点の再考」を参照のこと）は、単一モード分析の中で収集された自己相関関数のキュムラント分析からの相対的第２モーメント（μ2／Ｔ2）として定義づけされる。静的光散乱測定に比べ１００ｎｍ以上高い平均水力学的直径、約４７〜５７ｎｍの大きい検定内標準偏差及び０．１より大きい多分散性指数値は、全て、１×ＰＢＳ中のアミノデキストランの懸濁液内の凝集体の存在を指摘している。０．０と０．１の間の多分散性指数は単一モードのサイズ分布を標示するものとみなされる。０．１〜１．０の範囲の指数値は、広いサイズ分布又は多モードのサイズ分布を示すものと考えられる。ＳＤＰ強度分析は、９０°の光散乱が用いられた場合２モード分布を標示し、低角度２２．８°の光散乱が用いられた場合（９０°で失なわれた直径１〜５ミクロンの成分を含む）３モード分布を標示すると思われる。
実施例４：ストレプトアビジン−アミノデキストラン−フィコエリスリン複合体の合成
ＰＥ、ＰＣ又はＥＣＤといったようなフィコビリプロテインとアミノデキストランを逐次的に結合させ、次にストレプトアビジン、ＣＤ４及びＣＤ８β抗体を導入して抗体−アミノデキストラン−ＰＥ、−ＰＣ５及び−ＥＣＤ複合体を形成することによって、細胞標識のための三元複合体を形成した。
Ａ． カラム調製
ＰＥ濃縮物のためには、Sephadex Ｇ−５０（細）（Amersham Biosciences Cat: No. ７−００４２−０２）アガロースゲルを利用してカラム（１．５ｃｍ×２８ｃｍ）に詰めた。Ｇ−５０ゲルを予めＤＩ水中で膨潤させた。
以下で記述する通りの使用に先立ち、３本の付加的なＧ−５０カラム（１．５ｃｍ×２８ｃｍ）を上述の通りに調製し、ＰＢＳ−ＥＤＴＡ（ＩＬのＰＢＳ中に０．７５ｇのＥＤＴＡ２ナトリウム：２Ｈ2Ｏを溶解させることによって調製されたもの）で平衡化した。
以下の手順で使用されるもう１本のカラムは、セファロース４Ｂ（Amersham Pharmacia Biotech AB, Cat No. １７−０１２０−０１）アガロースゲルを、底から４８ｃｍまで充填されるまで２．５ｃｍ×５０ｃｍのカラム内に注ぎ込むことによって作製した。溶離剤がＰＢＳに等しい伝導率読取り値（最高１５ｍＳ）を有するまでＰＢＳ又はＰＢＳ−０．１％ＮａＮ３を用いて、カラムを洗浄した。
Ｂ． フィコエリスリン（ＰＥ）濃縮物の調製
ＰＥ保存用緩衝液を以下の通りに調製した。すなわち、９５０ｍｌの脱イオン（ＤＩ）水に対して、３．４０ｇのリン酸水素２カリウム（ＣＭＳロットＭ２４６ＫＥＴＤ）、４．３５ｇのリン酸水素２カリウム（ＣＭＳロットＭ２４４ＫＥＮＮ）及び０．７５ｇのＥＤＴＡ２ナトリウム：２Ｈ2Ｏ（ＥＭScienceロット３３２３８３３８）を添加した。この混合物を、塩が溶解するまで攪拌し、１．００Ｌまでの十分量で５０％の水酸化カリウム（ＫＯＨ：約５０ｍｌ）を用いてｐＨを７．００に調整した。
その後、３０〜６０分間２０ｍｇ／ｍｌ入りのＲ−フィコエリスリンボトル（Ｒ−ＰＥ；Prozyme, Inc., San Leandro, CA, lot２９１，０５３）をローラー混合することによって、ＰＥ緩衝液交換を実施する。Ｒ−ＰＥ（２．５ｍｌ）を４本の５０ｍｌ入り使い捨て遠心分離管の各々の中にピペットで取り、各々の管を２５ｍｌのＰＥ保存緩衝液（合計ＰＥ＝２００ｍｇ）で希釈させた。３０分間、アルミニウムホイルで被覆された管をローラー混合する。その後、管を３０分間３２００ＲＰＭで遠心分離し、２時間冷蔵庫の中で冷却した。不溶性材料の小さいペレットが見られた。２本の管の中味を同量で４つのCentriprep濃縮装置（Amicon Centriprep ＹＭ−３０、１５ｍｌ容量の管、Cat. No.４３０７）に添加した。これらの試料を２０分間２０００ＲＰＭで遠心分離し、ろ過液を除去し、再度２０分間遠心分離に付した。残りの２本管の中味を同じ４つのCentriprep濃縮装置に同量ずつ添加し２０分間２０００ＰＲＭで遠心分離した。ろ過液を除去し、２０分間再び遠心分離に付した。４つのCentriprep濃縮装置からの濃縮物を、小規模の洗浄と共にCentriprep濃縮装置の１つの中へと組合せ、濃縮物が最高２ｍｌになるまで遠心分離させた。
段落（Ａ）に記述されているSephadexカラムをＰＥ保存緩衝液で平衡化させた。ＰＥ濃縮物をカラム上に置き、これをアルミホイルでカバーしてカラムを光から保護した。ＰＥバンドを溶出させ、新しいCentriprep管内に収集した。ＰＥを最高１ｍｌまで濃縮させた。ＰＥを、体積を測定しながら、３回小規模な測定洗浄を伴って、アルミホイルでカバーされた１５ｍｌ入りの使い捨て遠心分離管に移した。最終的ＰＥ濃縮物は、個々の体積（最高２ｍｌ）を加算することで計算される既知の体積を有している。
２０μｌの試料を８００倍の最終希釈度まで連続希釈し、ＰＥプログラム（Ａ280、Ａ565の吸収度）を用いて分光光度計内で読取りし、ＰＥ濃度を計算した。ＰＥ濃度に８００を乗じるとＰＥ濃度が得られた（記録濃度は７０〜９５ｍｇ／ｍｌでなくてはならない）。回収は、濃度に測定体積を乗じることで計算した。回収は約９０％であった。結果として得たこのＰＥ濃縮物を冷蔵庫の中に保存した。
Ｃ． アミノデキストランの活性化及び精製
１０ｍｇ分量の精製、分画、脱塩、凍結乾燥されたアミノデキストランＭＰ８（実施例１参照）を検量し、１５ｍｌ入りの使い捨て遠心分離管中で１．００ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）とボルテックス混合することによって溶解させた。スルホスクシニミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート（スルホ−ＳＭＣＣ；Pierce, Prod. No. ２２３２２）試料を秤量し（２．５〜４．０ｍｇ）、ボルテックス混合によりＰＢＳ中（１０ｍｇ／ｍｌの懸濁液、１ｍｇのＳＳＭＣＣあたり１００μｌのＰＢＳを用いて）で懸濁させた。アミノデキストラン溶液に対してスルホ−ＳＭＣＣ懸濁液０．２４０ｍｌを添加し、室温（Ｒ．Ｔ．）で１０時間反応をローラー混合し、結果として活性化されたアミノデキストラン溶液を得た。
Pharmacia Biotech UVICORD検出器、２８０ｎｍ、時定数＝２、範囲−１ＡＵ及びKipp & Zonen BD４１チャート式記録計、速度＝１ｍｍ／分、感度＝２０ｍＶに接続されたＧ−５０カラム（段落Ａ参照）の上に活性化されたアミノデキストラン溶液を設置した。約１２ｍｌの空隙容量の後、記録計は、アミノデキストラン−ＳＳＭＣＣがはがれ始めるのを示し、ピークを後端部の約２分の１から３分の２まで取って生成物を１５ｍｌ入り遠心分離管内に収集し、約７〜１０ｍｌの精製済みアミノデキストランＳＳＭＣＣを得た。
Ｄ． ストレプトアビジンの活性化及び精製
ストレプトアビジン（ＳＡ）を以下のように活性化した：アミノデキストラン活性化の開始から約２０分後に、ストレプトアビジン（Scripps Laboratories, San Diego, CA; Prod. No. S1214）の試料を検量し（２．０〜３．０ｍｇ）、１５ｍｌ入りの遠心分離管に移した。ＳＡを、１ｍｇのＳＡにつき１００μｌのＰＢＳ−ＥＤＴＡを用いてＰＢＳ−ＥＤＴＡ中に溶解させ、１０ｍｇ／ｍｌの溶液を得た。２−イミノチオランヒドロクロリド（ＩＴ）（Sigma, Cat No.Ｉ−６２５６）試料を検量し（１．５〜３．０ｍｇ）、ＰＢＳ−ＥＤＴＡ中に溶解させて２ｍｇ／ｍｌの溶液を得た。１ｍｇのＳＡにつきＩＴ溶液（０．０５４２ｍｌ）をストレプトアビジン溶液に添加し、この混合物をＲ．Ｔ．で１．０時間ローラー混合した。
ストレプトアビジン−ＩＴを、段落（Ａ）で記述した第２のＧ−５０カラム及び上述のセットアップを用い、感度を５００ｍＶに設定して精製した。ストレプトアビジン−ＩＴ生成物を約０．５ｍｌのＰＢＳ−ＥＤＴＡで希釈し、カラム上に設置した。約１４ｍｌの空隙体積の後、生成物ピークは、チャート式記録計上で見られ、生成物を収集し、約５〜６ｍｌを得た。簡単に言うと、ＳＡ−ＩＴ溶液をボルテックスに付し、光路長１ｃｍのセル及びＰＢＳ−ＥＤＴＡブランクを用いてＡ280の分光光度計上で読取った。Ａ280読取り値を３で除してＳＡ−ＩＴ濃度を得た。ＳＡ−ＩＴの回収を計算し、体積で乗じた濃度として記録した。回収は約６０〜７０％であった。
以上で計算したＳＡ−ＩＴの濃度に基づいて１．００ｍｇのＳＡ−ＩＴ（１／conc. ＳＡ−ＩＴ）を含有するのに必要とされるＳＡ−ＩＴ溶液の体積を計算した。この体積を、段落（Ｂ）のアミノデキストラン−ＳＳＭＭＣ溶液に添加し、Ｒ．Ｔ．で２時間ローラー混合した。
Ｅ． フィコエリスリンの活性化及び精製
フィコエリスリンを以下の通りに活性化させた。アミノデキストラン−ＳＳＭＣＣ−ＳＡ−ＩＴ反応の開始から約３０分後に、ＰＥ活性化を開始した。１５ｍｇのＰＥを得るのに必要とされるＰＥ濃縮物の体積（以上からの１５／ＰＥ濃度）を計算し、アルミホイルでカバーされた１５ｍｌ入りの遠心分離管にピペットで取った。ガラス培養管から０．１３０ｍｌのＰＢＳ−ＥＤＴＡを吸い上げ、それをＰＥ試料に添加することにより、ピペット先端部を洗い流した。（ＰＥ濃縮物は粘性でねばついていたことから先端部を洗い流して移送損失を低減させた）。２−イミノチオラン（ＩＴ）（Sigma, Cat. No１−６２５６）試料を検量し（１．５〜３．０ｍｇ）、ＰＢＳ−ＥＤＴＡ中に溶解させて２ｍｇ／ｍｌの溶液を得た。ＩＴ溶液（０．０９６７ｍｌ）をＰＥ溶液に添加し、この混合物をＲ．Ｔ．で１．０時間ローラー混合した。
ＰＥ−ＩＴを以下の通りに精製した。すなわち、アルミホイルでカバーした段階（Ａ）の第３のＧ−５０カラム及び上述のセットアップを用い、感度が１０００ｍＶに設定された状態で、ＰＥ−ＩＴを０．５ｍｌのＰＢＳ−ＥＤＴＡで希釈させ、カラム上に設置した。約１４ｍｌの空隙容量の後、チャート式記録計上にＰＥ−ＩＴピークが見え、これを５〜６ｍｌの体積で、アルミホイルでカバーされた１５ｍｌ入りの遠心分離管内に収集した。短かいボルテックスの後、２０μｌの試料を９８０μｌのＰＢＳ−ＥＤＴＡ中に希釈した（５０倍希釈）。ＰＥ濃度を計算するＡ280、Ａ565でのＰＥのプログラムを用いて、分光光度計上で、この試料を読み取った。該濃度に５０を乗じてＰＥ−ＩＴ濃度が得られる。回収は、ＰＥ−ＩＴ濃度に体積を乗じたものとして計算した。回収は９０〜１００％の間であった。
Ｆ． アミノデキストラン、ストレプトアビジン及びフィコエリスリンの結合反応アミノデキストラン−ＳＳＭＣＣ＋ＳＡ−ＩＴの反応混合物とＰＥ−ＩＴの全てを組合わせることによって、アミノデキストラン−ＳＳＭＣＣ＋ＳＡ−ＩＴとＰＥ−ＩＴの反応を形成した。混合物をＲ．Ｔ．で一晩ローラー混合した。
結合の後、あらゆる反応基を遮断するために以下の段階が利用される。Ｌ−システイン（Sigma, Cat. No. Ｃ−７７５５）溶液をＰＢＳ中５ｍｇ／ｍｌで調製した。Ｌ−システインの試料（１３〜２０ｍｇ）を検量し、計算された体積のＰＢＳ（Ｌ−Cysの重量／５）の中で溶解させた。反応混合物に添加すべきＬ−システイン溶液の体積を、反応混合物の体積の０．１２０倍となるように計算した（反応体積は、成分の体積を合計することで計算した）。Ｌ−システインを添加し、Ｒ．Ｔ．で３０分間ローラー混合物した。ＰＢＳ中２０ｍｇ／ｍｌのヨードアセトアミド（ＩＡ，Sigma, Cat. No.Ｉ−６１２５）溶液を調製した。ヨードアセトアミド（５０〜６０ｍｇ）を秤量し、計算された体積のＰＢＳ（ＩＡの重量／２０）中で溶解させた。反応混合物に添加すべきＩＡ溶液の体積を、反応混合物の体積の０．１２０倍として計算した（以上からの反応体積にＬ−システイン溶液の体積を加えたもの）。ヨードアセトアミドを添加し、Ｒ．Ｔ．で３０分間混合物をローラー混合した。
Ｇ． ＳＡ−アミノデキストラン−ＰＥ複合体の精製と濃縮
段落下の反応混合物をCentriprep濃縮装置内に置き、最高１．５〜２．０ｍｌまで濃縮した。濃縮物をセファロース４Ｂカラム、２．５ｃｍ×４６ｃｍ上に設置し、平衡化し、ＰＢＳ又はＰＢＳ−０．１％ＮａＮ３を用いて溶出させた。カラムを上述の通り検出器及びチャート式記録計に連結し、出力端を画分収集装置（液滴計数器を伴うPharmacia ＬＫＢ−ＦＲＡＣ−１００）に連結した。画分収集装置に１２×７５のガラス培養管を装てんし、管１本につき１２０滴（最高３．８ｍｌ）を収集するようにプログラミングした。流速は管１本あたり約２．７５〜３．５０分であった。カラムをアルミホイル中に包み込んだ。チャート式記録計の感度は５０ｍＶに設定した。複合体は画分１７で溶出し始め、大きい複合体ピークに対応する画分２４まで続いた。画分６２によるものであった小さい分子の溶出に至るまで、カラムをランさせた。結果として得られた小ピークは、未反応ＰＥ及びＳＡに対応し、最終ピークは低分子量材料を含有していた。主要生成物バンドはこの感度ではオフスケールであったが、遊離ＰＥ及びストレプトアビジンバンドはオンスケールであった。１つのランについての試料のクロマトグラムが図６Ａに示されており、精製されていないアミノデキストランＭＰ８が使用されたもう１つのラン図６Ｂと比較されている。生成物の画分（通常１７〜２３）を標識し、光から保護した。これらの複合体画分を短時間ボルテックスに付し、以下で記述するＰＥプログラムを用いて分光光度計内でＡ280及びＡ565ｎｍで測定した。画分を希釈せず、光路長１ｍｍのセル内で読みとった。計算はこれらの測定に基づいている（以下参照）。読取りの後、各試料をその管に戻した。管に栓をし、冷蔵庫の中で保管した。
Ｈ． 複合体画分の分析
分光光度計は、Ａ280、Ａ565、Ａ280／Ａ565、Ａ565／Ａ280、タンパク質濃度（ＰＥについて補正されたＡ280から計算される）及びＰＥ濃度を与える。読取りは光路長１ｍｍのセル内であったことから、タンパク質及びＰＥ濃度値に１０が乗じられる。合計ＰＥ濃度を得るためには、ＰＥ濃度値が合計される。この値に画分体積（３．８ｍｌ）を乗じて、合計回収済みＰＥ（ｍｇ単位）を得る。合計回収済みＰＥを回収され結合反応で使用されたＰＥ−ＩＴ量で除すると、ＰＥに基づく「収率」が得られる（標準的に７０〜７５％）。結合のために用いられたアミノデキストランの量（１０ｍｇ）をその分子量（３重検出器方法で決定されたもの−２．７×４×１０6ｇ／ｍ）で除して、分子アミノデキストラン量（３．６５７６ｎmol）を得る。２４０，０００で合計回収済みＰＥの量を除すると、複合体内のＰＥのモル量（すなわち最高１０．５ｍｇ＝４４ｎmol）が得られる。ＰＥｎmol／アミノデキストランｎmolの比は、アミノデキストラン分子あたりのＰＥ分子の概数（すなわち最高１１）を提供する。
各画分についてのタンパク質濃度値（１０で乗じたもの）を３（すなわちストレプトアビジンの吸収係数）で除すると、「モノクローナル抗体（ＭＣＡ）当量濃度」が得られる。ＭＣＡ当量濃度は、フロー分析のために細胞を染色するために使用されるべき試薬の用量を決定する上での１つの指針として用いられる。
計算に用いられた分光光度計公式は、以下の通りである：
ＰＥConc.＝Ａ565×０．１２２４４
タンパク質濃度＝Ａ280−（Ａ565×０．１７１４）
Ｉ． プロセス条件の選択
モノクローナル抗体及びフィコエリスリン（ＰＥ）のアミノデキストラン複合体を用いた実験から、最良の増幅を得るためには比較的少量の抗体が必要であり、残りのアミノデキストラン結合部位がＰＥで占有されるべきである（理論的には、１アミノデキストラン鎖あたり１つの抗体が必要とされる）ということがわかった。Ｐ２４複合体でのその他の研究作業においては、ＳＡがうまく反応しないか又はアミノデキストランに対する結合時点で部分的に阻害されていることから、ストレプトアビジンが抗体に比べ幾分か高いレベルで使用される必要があるということがわかった。又、まず最初にスルホ−ＳＭＣＣで活性化されたアミノデキストラン（ジスルフィド架橋を結果としてもたらしうる２−イミノチオランでの活性化よりも優れている）を比較的少量の２−イミノチオラン−活性化ＳＡ（ＳＡはジスルフィド結合を全くもたず、モノクローナル抗体について好まれるＤＴＴ方法ではなくむしろ２−イミノチオランを用いて活性化されなくてはならない）と反応させ、その後余剰の２−イミノチオラン−活性化ＰＥと反応させる方が良いことが発見された。
ＳＡ−ＩＡとＰＥ−ＩＴの添加の間の１０分待機と２時間待機を比較すると、類似ではあるが２時間待機でより優れた結果が得られた。０．５ｍｇ、１．０ｍｇ及び２．０ｍｇのＳＡ−ＩＴを比較すると、１．０ｍｇのＳＡ−ＩＴを用いて得られた結果が最良であった。ＰＥ−ＩＴはつねに１３〜１５ｍｇで使用され、こうして、わずかな量の未反応ＰＥを残すだけで１０ｍｇのスルホ−ＳＭＣＣ−アミノデキストランのほぼ飽和が得られる。
実施例５：抗体−アミノデキストラン−フィコビリプロテイン複合体の調製
Ａ． 材料
他に識別されている場合を除き、実施例４で言及された材料は、同じ供給源により提供される。
リン酸緩衝生理食塩水、１×ＰＢＳ、ｐＨ７．１〜７．３、及び伝導度１３，５００−１５，５００μｍｈｏ−ｃｍ-1を、２６．９ｇｄｍ-3のＫ2ＨＰＯ4、６．４ｇｄｍ-3のＫＨ2ＰＯ4及び１７０．０ｇｄｍ-3のＮａＣｌを含む２０×ＰＢＳの原液から精製水での希釈により調製した。
ＣＤ４抗体（ＣＤ４クローンＳＦＣＩ１２Ｔ４Ｄ１１（ＩｇＧＩ））及びＣＤ８β抗体（ＣＤ８βクローン２段階８．５Ｈ７（ＩｇＧ２ａ））、ＣＤ８β−ＰＣ５、抗−ＣＤ４−ＰＥ及び抗ＣＤ４−ＥＣＤは、Beckman Coulter細胞分析部門、Miami, FLの製品である。
Ｂ． 抗体−アミノデキストラン−フィコビリプロテイン複合体の調製
手順は、抗体−アミノデキストラン−ＰＥ複合体を調製するための、本明細書中に援用されている米国特許第５，７９１，７４１号に記述されたものと同様であった。ここでは、イミノチオラン−活性化ストレプトアビジン又はジチオスレイトール（ＤＴＴ）（Sigma）−活性化モノクローナル抗体そしてその後イミノチオラン−活性化蛍光タンパク質、ＰＥ、ＰＣ５又はＥＣＤを段階的にスルホ−ＳＭＣＣ−活性化アミノデキストランに結合させた。ＩＴ対ＳＡ、ＤＴＴ対ＭＣＡ、及びＩＴ対ＰＥ（ＰＣ５、ＥＣＤ）モル比は、ＳＡ又はＭＣＡ活性と又はＰＥ（ＰＣ５、ＥＣＤ）蛍光活性と干渉しないようにそれぞれ１５．５０及び２２．５で最大限にした。
Ｃ． ＣＤ８β抗体−アミノデキストラン−ＰＣ５複合体
４３：４．３：１＝ＰＣ５：ＣＤ８β抗体：実施例１の精製済みアミノデキストラン−ＭＰ８、のモル比で結合を実施した。重量比は１０ｍｇのアミノデキストランスケールで１２．８５６：０．８５８：１０であった。
以下の通りにスルホ−ＳＭＣＣでアミノデキストランを活性化した。１×ＰＢＳ中の１０ｍｇ／ｍＬのスルホ−ＳＭＣＣ溶液０．１８０ｍＬで１×ＰＢＳ中の６．６３ｍｇ／ｍＬのアミノデキストラン溶液１．５８ｍＬを活性化させた。混合物を室温で約１時間ローラー混合した。混合が完了した後、１×ＰＢＳで平衡化した６０ｍＬ（１．７ｃｍ×２８ｃｍ）のＧ−５０Sephadexカラムの上部に直ちに反応混合物を適用した。１×ＰＢＳを用いて試料を溶出させ、約２ｍＬの画分中にこれを収集した。２８０ｎｍで吸収する第１のバンドの画分は、集束された可視光ビームを伴うTyndall散乱装置（６５０型、Cambridge Instruments, Inc., Buffalo, NY）により確認された通り、高分子量の活性化されたアミノデキストランを含んでいた。これらの画分をプールし、約３．３ｍＬの合計スルホ−ＳＭＣＣ−活性化アミノデキストランを得た。
０．０８１ｍＬのＣＤ８β濃縮物（６１．６７ｍｇ／ｍＬ）に対し、１×ＰＢＳ、２ｍＭのＥＤＴＡ中の５ｍｇ／ｍＬのＤＴＴ溶液０．０４８ｍＬ及び０．８７１ｍＬの１×ＰＢＳ、２ｍＭのＥＤＴＡを添加することによって、ＣＤ８βモノクローナル抗体を活性化した。５ｍｇ／ｍＬの抗体濃度及び５０倍大きいＤＴＴモル濃度をもつ結果としての溶液を、約１時間周囲温度で混合した。その後、１×ＰＢＳ、２ｍＭのＥＤＴＡで平衡化した６０ｍＬ（１．７ｃｍ×２８ｃｍ）Ｇ−５０Sephadexカラム上で反応混合物をクロマトグラフィに付し、１×ＰＢＳ、２ｍＭのＥＤＴＡを用いて試料を溶出させた。第１のバンドのピーク画分は、合計３．７２ｍｇのＤＴＴ活性化ＣＤ８β抗体誘導体を含有する約１０ｍＬの３．７２２ｍｇ／ｍＬの抗体溶液を生み出した。
０．８５８ｍｇのＭＣＡ、１０ｍｇのアミノデキストラン重量比を反応させ、３．７２ｍｇ／ｍＬＤＴＴ−ＣＤ８β溶液０．２３１ｍＬを３．３ｍＬのスルホ−ＳＭＣＣ−アミノデキストラン溶液中に添加することにより、ＤＴＴ−ＣＤ８βのスルホ−ＳＭＣＣ−アミノデキストランに対する結合が起こった。混合物を２時間ローラー混合した。
０．３０２ｍＬのＰＣ５濃縮物（５９．７ｍｇ／ｍＬ）に対して、１×ＰＢＳ中の２ｍｇ／ｍＬのイミノチオラン溶液０．１１６ｍＬ及び１×ＰＢＳ０．０３２ｍＬを添加することにより、ＰＣ５を活性化した。４０ｍｇ／ｍＬのＰＣ５濃度及び２２．５倍大きいイミノチオランモル濃度を有する結果として得た溶液を約１時間室温で混合した。その後、反応混合物を、１×ＰＢＳで平衡化された６０ｍＬ（１．７ｃｍ×２８ｃｍ）のＧ−５０Sephadexカラムの上部に適用し、試料を１×ＰＢＳで溶出させた。第１のバンドピーク画分は、５．６２３というＡ565／Ａ280比で約４．１４ｍＬの４．００５ｍｇ／ｍＬのＰＣ５を提供し、これは、合計１６．５８１ｍｇのＩＴ−ＰＣ５を含有していた。
ＤＴＴ−ＣＤ８β＋スルホ−ＳＭＣＣ−アミノデキストラン反応混合物に対するＩＴ−ＰＣ５の結合は以下のように起こった。すなわち、ＤＴＴ−ＣＤ８β及びスルホ−ＳＭＣＣ−アミノデキストランを２時間混合した後、１２．８５６ｍｇのＩＴ−ＰＣ５を表わす４．００５ｍｇ／ｍＬのＩＴ−ＰＣ５を３．２１０ｍＬ、混合物に添加し、これを１６〜２４時間にわたり一晩ローラー混合した。混合が完了した後、混合物の合計体積を決定し、この体積の０．１２０倍の１×ＰＢＳ中５ｍｇ／ｍＬのＬ−システインを結合混合物に添加した。その後、さらに１５分間Ｌ−システイン含有混合物を混合して、あらゆる未反応スルホ−ＳＭＣＣ部分の遮断をもたらした。最後に、合計混合物体積の０．１２０倍の量の１×ＰＢＳ中の２０ｍｇ／ｍＬのヨードアセトアミド、及び合計混合物体積の０．０２０倍の量のｐＨ９．８の１Ｍのホウ酸塩緩衝溶液を各混合物に添加した。結果として得た混合物を約３０分間混合してあらゆる未反応スルフヒドリル基を遮断した。
ＣＤ８β−アミノデキストラン−ＰＣ５複合体の精製は以下の通りに達成された。ＬＥＣCentra−８遠心分離機を用いて２０００ｒｐｍで約３０分間、試料の入ったAmicon Centri-Prep３０管を遠心分離することにより、約２．０ｍＬまで、遠心分離混合物の合計体積を削減した。試料を、１×ＰＢＳで平衡化したBio-Gel A-15mアガロースカラム（Bio Rad Laboratories, Inc., ２．５ｃｍ×４８ｃｍ）の上面に置き、溶離剤として１×ＰＢＳを用いてクロマトグラフィに付した。約３．６ｍＬ体積の溶離剤画分を、液滴収集モードで作動するPharmacia ＬＫＢＦＲＡＣ−１００を用いて収集した。２８０ｎｍで作動するＬＫＢ２１３８Uvicordモニターを用いて画分を監視した。
画分＃１９〜＃２３内のカラムから溶出された第１の充分に分離した狭く強力なバンドは、ＣＤ８β−アミノデキストラン−ＰＣ５複合体を含有していた。通常この第１の狭いバンドと重複しこれに後続している広いこぶは、広いサイズ分布を有していたアミノデキストランの低分子量の汚染物質のほぼ全ての除去に起因して不在であった。およそ画分＃４７にピークをもつ第２の強力なバンドが余剰のＰＣ５を含み、およそ画分＃６２にピークをもつ中−低強度の充分に分離した第３のバンドは、低分子量の余剰の遮断用試薬のせいであるとされた。ＣＤ８β−アミノデキストラン−ＰＣ５複合体のために収集された画分を、光路長１ｍｍのセルを用いて５６５．５及び２８０ｎｍの波長で分光光度法で分析した。複合体中のｍｇ／ｍＬ単位のＰＣ５の濃度は、Ａ565.5／8,167という公式を用いることにより、５６５．５ｎｍでの吸収度から導出された。第１の狭いピーク下の画分１９〜２３についてのデータは、複合体中の６．２６４ｍｇの合計ＰＣ５を提供した。複合体中で１２．８５６ｍｇのＩＴ−ＰＣ５が使用されたことから、収率は４８．７％であった。
Ｄ． ＣＤ４抗体−アミノデキストラン−ＥＣＤ複合体
手順は、抗−ＣＤ４抗体がＤＴＴで活性化されＣＤ８β抗体の代りに結合する間に使用され、ＰＣ５の代りにタンデムＰＥ−Texasレッド又はＥＣＤ蛍光染料が使用されたという点を除いて、抗−ＣＤ８β−アミノデキストラン−ＰＣ５複合体の調製について概略的に説明されたものと類似していた。試行２では、ＤＴＴ−ＣＤ４（０．８５８ｍｇ）を、結合における最初の２時間段階の間にそれぞれ０．１４１及び１．６４７ｍｇ／ｍＬの濃度でスルホ−ＳＭＣＣ−アミノデキストラン（１０ｍｇ）と混合した。その後、ＩＴ−ＥＣＤ（１２．８５６ｍｇ）５．１０２ｍＬを混合物に添加し、これを１６〜２４時間にわたり一晩さらにローラー混合した。ＩＴ−ＥＣＤ（Ａ565.5／Ａ280）比は４．９６８であった。結合混合物を、約１．０ｍＬまで濃縮し、セファロース４Ｂカラムの上面にこれを適用した。試行２で第１の狭いピークの下で１画分につき約３．６ｍＬの割合で収集された画分１９−２３についてのデータは、複合体中６．０９８ｍｇの合計ＥＣＤを提供した。結合においては、１２．８５６ｍｇのＩＴ−ＥＣＤが使用されたことから、収量は４７．４％であった。
セファロース４Ｂカラム、２．５ｃｍ×４６ｃｍに適用され、平衡化され、１×ＰＢＳで溶出されたＣＤ４抗体−アミノデキストラン−ＰＥ複合体のクロマトグラムに対するアミノデキストラン−ＭＰ８精製の一例が、図６Ｂに示されている。
以上の実験においては、複合体中のフィコビリプロテインの量がきわめて大量であることから、２８０及び５６５ｎｍでの吸収度測定から抗体濃度の通常の計算を高い信頼性で実施することができなかった。しかしながら、抗体−アミノデキストラン−ＰＥの反応（複合体）単位の濃度は、５６５ｎｍでの吸収度から決定されたＰＥ濃度を、ＰＥ対アミノデキストランの正規化されたモル比で除することによって得られた。第１にモルＰＥは、第１の狭い複合体バンドの下の画分内のＰＥ濃度を合計し、１画分あたりの体積を乗じ、ＰＥのＭＷで除することによって計算された。第２のアミノデキストランの全てが、反応し第１のバンド内に保持されるものと仮定された。使用されたアミノデキストランの質量を決定された８．０ＭＤａのＭＷで除することにより、アミノデキストランモルを計算した。
実施例６：改良型ＡＭＤ実施例を用いたフローサイトメトリ分析
Ａ． 実施例５の複合体の使用
ＣＤ８β−ＰＣ５（２００３ Beckman Coulter, Inc.,細胞分析カタログ中、品番６６０７１０９として市販）及びＣＤ８β−アミノデキストラン−ＭＰ８（標準的ＭＰ８及び改良型（又は予備精製済み）ＭＰ−８の両方）−ＰＣ５複合体の画分を、管１本につき２．５、１．２５及び０．６２５μｇの複合体内抗体を用いて滴定した。滴定量に対する抗体の量を、直接結合された複合体については補正済みＡ280値から決定し、アミノデキストラン−架橋複合体については以下で記述する間接的方法によって決定した。全血１００μＬに対し希釈物を添加し、室温で１０分間インキュベートした。
フローサイトメータ（ＣＯＵＬＴＥＲ(商標)ＥＰＩＣＳ(商標)４色ＸＬ−ＭＣＬ(商標)）上での分析のために、血液混合物をＣＯＵＬＴＥＲ(商標)Ｑ−Prep(商標)ワークステーション上でＣＯＵＬＴＥＲ(商標)Immuno Prep(商標)試薬系を用いて溶解、急冷させ、１×ＰＢＳで一回洗浄し（１×ＰＢＳ２ｍＬの添加、５分間５００ｇでの遠心分離、上清廃棄）、細胞ペレットを１ｍＬの１×ＰＢＳ中で再懸濁させた。順方向光散乱装置対９０℃光散乱装置を用いて、リンパ球細胞集団を区別し、電子ゲートし、単一パラメータヒストグラム上で表示した（ｙ軸＝蛍光事象の数（計数）；Ｘ軸＝蛍光強度）。フローサイトメータ計器設定値は、蛍光強度について４ディケードログスケール上の第１の１０進内でのみ非染色陰性リンパ球亜集団を表示するように調整された。
図１０は、１つの抗体につきわずか１つのＰＣ５しか含まずアミノデキストランを全く含まない直接結合されたＣＤ８β−ＰＣ５複合体を用いて得られたものに比べて陽性細胞集団の平均チャネルＰＣ５蛍光強度（ＭＦＩ）を増強させる、デキストラン分子１個あたり２個を超えるＰＣ５分子を含む蛍光マーカーとしてのＣＤ８β−アミノデキストラン−ＰＣ５複合体の能力を示している。これは、蛍光増幅が測定される対照である。ここでも又、データは、標準的ボトル入り製品とは異なり増幅されたＣＤ８β試薬を用いた蛍光強度の有意な改善を実証している。
図７Ａ及び７Ｂは、標準的アミノデキストラン−ＭＰ８及び精製済みアミノデキストラン−ＭＰ８との架橋複合体がＣＤ８β＋リンパ球上でそれぞれ最高３．５倍及び１０倍高い蛍光強度を有することを示すヒストグラムである。同じ計器設定値で、対照、ＣＤ８β−ＰＣ５、及び試料、ＣＤ８β−アミノデキストラン−ＭＰ８（標準及び精製済み）−ＰＣ５の滴定量がランされ、結果つまり平均チャネルＰＣ５蛍光強度及び同じ滴定量での試料画分対対照のＭＦＩ比が表３及び４に提示されている。
Figure 2007501310
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ＣＤ４−ＥＣＤ及びＣＤ４−アミノデキストラン−ＭＰ８（標準及び精製済み）−ＥＣＤ複合体の画分を、前述の説明と同じ要領で管１本あたり２．５、１．２５及び０．６２５μｇで滴定した。結果は、直接結合された抗体−ＥＣＤ複合体及び架橋抗体−ＥＣＤ複合体でのＣＤ４+リンパ球についての陽性集団平均チャネルＥＣＤ蛍光強度（ＭＦＩ）に関して、図６Ａ及び６Ｂに示されている。２０．８及び２７．２で最大となるＭＦＩ比は、表５及び６で表示されているように、ＣＤ４−ＥＣＤ（０．５μｇ）の飽和ボトル入り製品用量と比べた各々のアミノデキストラン試料の平均チャネル位置から計算された。
Figure 2007501310
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表３〜６中のデータは、画分についてテストされた全ての用量で、ＣＤ４及びストレプトアビジンの両方の複合体について、標準偏差（ばらつき）が、本発明の分画され精製されたアミノデキストランに比べて標準アミノデキストランについて著しく高く、これは両方の分画され精製されたアミノデキストラン複合体についてより均質な生成物とそれに相応してさらに大きい収率を標示している、ということを実証している。ＣＤ８β複合体については、結果は、分画され精製されたアミノデキストランと標準アミノデキストランを比べて基本的に同等であった。
Ｂ． 実施例４の複合体の使用
リンパ球を標識するためにストレプトアビジン−アミノデキストラン−ＭＰ８（標準及び精製済み）を用いて、複数の試験を実施した。まず最初にリンパ球をＣＤ４−ビオチンに結合し、その後洗浄した。フローサイトメトリにより全血中のＣＤ４＋細胞について標識し分析するため、ビオチン化されたＣＤ４一次抗体を伴う間接的二次試薬として、複合体を使用した。特定的には、（予めビオチン化ＣＤ４抗体で染色し一回洗浄した）１００μＬの全血を伴う０．６２５、１．２５、及び２．５μｇという滴定量のストレプトアビジン−ＰＥ対照複合体及びアミノデキストラン架橋複合体を溶解、急冷、洗浄させ、分析した。
１）（２００３ Beckman Coulter Inc. 細胞分析カタログから品番６６０３８５０として市販されている）ＣＤ４−ＰＥで直接的にマーキングされたドナー由来のリンパ球と、２）ＣＤ４−ビオチン及びボトル入り製品ＳＡ−ＰＥで間接的にマーキングされた同じドナー由来のリンパ球に対する、蛍光強度を比較した。通常２人の異なるドナーを使用した。
結果は、図８Ａ及び８Ｂの重ね合わせたヒストグラムの中に示されている。本発明の精製済みアミノデキストラン画分から調製された複合体は、直接的に標識された細胞に比べた場合１０〜１５倍高い蛍光を有し、間接的に標識された細胞に比べた場合最高４倍高い蛍光を有していた。表７及び８も同様に参照のこと。
Figure 2007501310
Figure 2007501310
図９及び表９は、Immuno Trol (商標) CL（Beckman Coulter Inc.）でランされた終点滴定についてのフローサイトメトリデータを明らかにしている。表は、使用された試薬、試薬の質量、ストレプトアビジン−Ａｍｄｅｘ−ＰＥ又は対照ＣＤ４−ＰＥを列挙している。滴定量が試験１回についてのマイクログラム数で記録され、平均蛍光強度（ＭＦＩ）が記録されている。抗−ＣＤ４−ＰＥ、Cat. No. ＩＭ０４４９、ロット４７が２．５μｇ／ｍＬの抗体濃度、０．９９のＦ／Ｐ比を有していたことに留意されたい。同様に、ＥＣＤ安定比緩衝液を添加する前の増幅試薬のプールされた画分内のストレプトアビジン及びＰＥの濃度は、それぞれ０．１０４ｍｇ／ｍＬ及び０．６３３ｍｇ／ｍＬであった。
Figure 2007501310
図９の滴定曲線中で最初に水平域（つまり細胞上の抗原部位の最初の飽和）に近づいた時点でのＰＥ質量（μｇｓ）は、直接結合されたＣＤ４−ＰＥ複合体については約０．３であるのに対し、ストレプトアビジン−Ａｍｄｅｘ−ＰＥ複合体については約１４である。かくして、後者の滴定量曲線内で飽和を得るためには、４６．７倍多いＰＥが使用された。同時に、ＰＥ蛍光増幅係数は１９８．１／１４．２＝１３．９５である。この係数は、質量比より３．３という係数だけ劣っている。同じ細胞に結合しているＣＤ４−ＰＥ複合体の量と比べて３分の１少ない、使用された滴定量での同量の細胞試料に対し添加されたビオチン化−ＣＤ４＋ＳｔｒＡｖ−Ａｍｄｅｘ−ＰＥ複合体が、細胞のターゲティングされた抗原部位に結合している。ＣＤ４−ＰＥ結合データの以前の分析（米国特許第５，８１４，４６８号中の表ＩＩ参照）は、結合曲線上の類似の点における０．１１〜０．３６の間で可変的な結合済み複合体画分を示した。かくして、複合体の一部は溶解状態にある。
以上で引用された全ての文書は、本明細書に援用されている。本発明の組成物及びプロセスは、添付のクレームの範囲内に包含されるものと考えられている。
図１Ａ−１Ｄは、先行技術において利用可能な又は従来の合成によって入手できる標準アミノデキストランの３の異なるロット、ＭＰ８、ＭＰ８−２、ＭＰ８−３、及びアミノデキストラン・ロット１６２２−３３についてのクロマトグラムのグラフであり、ここで各々のクロマトグラムは、従来の分画カラムにより生成されたものである。各クロマトグラフ中のＹ軸は、２８０ｎｍにおける相対的吸光度であり、各クロマトグラフ中のＸ軸は、カラム由来の画分番号を示す。実施例１を参照のこと。 図１Ａ−１Ｄは、先行技術において利用可能な又は従来の合成によって入手できる標準アミノデキストランの３の異なるロット、ＭＰ８、ＭＰ８−２、ＭＰ８−３、及びアミノデキストラン・ロット１６２２−３３についてのクロマトグラムのグラフであり、ここで各々のクロマトグラムは、従来の分画カラムにより生成されたものである。各クロマトグラフ中のＹ軸は、２８０ｎｍにおける相対的吸光度であり、各クロマトグラフ中のＸ軸は、カラム由来の画分番号を示す。実施例１を参照のこと。 図２は、２５〜３０００ｋＤａの間の広範囲の分子量をもつアミノデキストラン（例えばＡｍｄｅｘ-ＭＰ、１Ｘ−Ａｍｄｅｘ、及び５Ｘ−Ａｍｄｅｘ）についての、log（ＩＶW）対log（ＭW）のマーク・ホゥウィンク（Mark Houwink）プロットであり、これは本明細書中に援用されるO. Siiman et al, 1999 Bioconjugate Chem., 10(6), 1090-1106内で以前に記述された。このプロットは、新しいデータを付加することにより、刊行物中の記載から修正されている。新しいデータは、図２では、log（Ｍｗ）の６〜７範囲内で最も右側の点として現われている。このデータについては、本明細書中の実施例２で論述される。 図３は、さまざまなアミノデキストラン及びデキストランのためのlog（Ｒg）対log（ＭW）のMark Houwinkプロットである。新しいデータは、図３ではlog（ＭW）の６〜７範囲内で最も右側の点として現われている。このデータについては以下の実施例２で論述する。 図４Ａは、分画カラム上で従来のアミノデキストランを用いて作られたストレプトアビシン（ＳＡ）−アミノデキストラン−フィコエリスリン複合体を適用することによって生成されたクロマトグラムである。多大な低ＭＷの複合体を含有するきわめて広いピークがおよそ画分番号２０〜４０において存在することに留意されたい。 図４Ｂは、分画カラム上に、本発明者らが精製した狭いサイズ分布の多分散アミノデキストラン（「改良型Ａｍｄｅｘ」とも呼ばれる）を用いて作られたストレプトアビシン（ＳＡ）−アミノデキストラン−フィコエリスリン（ＰＥ）複合体を適用することによって生成されたクロマトグラムである。高ＭＷの複合体を含む非常に狭い均質なピークが画分番号２０の近くに存在するという点に留意されたい。 図５Ａは、分画カラム上に従来のアミノデキストランを用いて作られたＣＤ４抗体（ＣＤ４Ａｂ）−アミノデキストラン−フィコエリスリン（ＰＥ）複合体を適用することによって生成されたクロマトグラムである。多大な低ＭＷの複合体を含む非常に広いピークが画分番号２２〜４０の近くに存在するという点に留意されたい。図５Ｂは、分画カラム上に、本発明者らが精製した狭いサイズ分布の多分散アミノデキストランを用いて作られたＣＤ４抗体（ＣＤ４Ａｂ）−アミノデキストラン−フィコエリスリン（ＰＥ）複合体を適用することによって生成されたクロマトグラムである。高ＭＷの複合体を含む非常に狭い均質なピークがおよそ画分番号１８〜２１の近くに存在するという点に留意されたい。 図６Ａは、以下の実施例６Ａで論述されている通りのリンパ球の標識を示すフローサイトメトリーヒストグラムである。このヒストグラムは、タンパク質に対し直接つまりアミノデキストラン無しで結合された標識抗体（ＣＤ４−ＥＣＤ；Beckman Coulter Incより市販される）と比較して、本発明の改良型多分散アミノデキストランを用いて作られた増幅済み抗体−アミノデキストラン−フィコビリプロテイン複合体（ＣＤ４−Ｄｅｘ−ＥＣＤ）を直接的標識として使用した細胞標識の結果を示す。ＣＤ４−ＥＣＤは、複合体が飽和以上で細胞試料と混合された場合すなわち細胞表面上でターゲティングされている全ての抗原部位が占有されている場合にアミノデキストラン架橋複合体ＣＤ４−Ｄｅｘ−ＥＣＤの蛍光強度がそれに対して測定される１つの対照として使用される。この図は、本発明の改良型Ａｍｄｅｘを用いて作られた複合体が、対照と同じ細胞数について著しく強い蛍光を提供することを実証している。画分は実質的に同一である。 図６Ｂは、標準的アミノデキストランを用いて作られた増幅済み抗体−アミノデキストラン−フィコビリプロテイン複合体（ＣＤ４−Ｄｅｘ−ＥＣＤ）を直接的標識として使用する細胞標識の結果を示す類似のヒストグラムである。製品の２つの画分のヒストグラムが示されている。図６Ａと比較すると、２つの画分は、複合体内の非均質アミノデキストランに起因して変動する。 図７Ａは、以下の実施例６Ａ中で論述されている通りのリンパ球の標識を示すフローサイトメトリーヒストグラムである。このヒストグラムは、本発明の改良型アミノデキストランを用いて作られた増幅済み抗体−アミノデキストラン−フィコビリプロテイン複合体（ＣＤ８β−Ｄｅｘ−ＰＣ５）を直接的標識として使用した細胞標識の結果を示す。図７Ａは、改良型アミノデキストランが使用された場合に得られる結果の一貫性を示す。すなわち該プロセスにより生成される画分は同等であり、生成されるヒストグラムは重ね合わせることができる。 図７Ｂは、以下の実施例５Ａ中で論述されている通りのリンパ球の標識を示すフローサイトメトリーヒストグラムである。このヒストグラムは、先行技術の従来の不均質アミノデキストランを用いて作られた増幅済み抗体−アミノデキストラン−フィコビリプロテイン複合体（ＣＤ８β−Ｄｅｘ−ＰＣ５）を直接的標識として使用した細胞標識の結果を示す。図３Ｂは、ＣＤ８β−Ｄｅｘ−ＰＣ５のこれらの２つの画分が、明らかに同等ではなく、かくして非均質生成物のものであることが明らかである、ということを実証している。 図８Ａは、以下の実施例６Ｂ内で論述されている通りのリンパ球の標識を示すフローサイトメトリーヒストグラムである。このヒストグラムは、ビオチン化されたＣＤ４（ＣＤ４−ビオチン）を直接的標識として用いかつ本発明の改良型アミノデキストランで作られた増幅済みストレプトアビジン−アミノデキストラン−フィコビリプロテイン複合体（ＳＡ−Ｄｅｘ−ＰＥ）を間接的又は二次的標識として使用した細胞標識の結果を示す。このデータは、改良型アミノデキストランを用いて得られた異なる画分が事実上同一であることを示している。 図８Ｂは、以下の実施例６Ｂ内で論述されている通りのリンパ球の標識を示すフローサイトメトリーヒストグラムである。このヒストグラムは、ビオチン化されたＣＤ４（ＣＤ４−ビオチン）を直接的標識として用いかつ先行技術の従来の不均質アミノデキストランを用いて作られた増幅済みストレプトアビシン−アミノデキストラン−フィコビリプロテイン複合体（ＳＡ−Ｄｅｘ−ＰＥ）を間接的又は二次的標識として使用した細胞標識の結果を示す。図８Ａとは対照的に、これらのデータは、標準的方法を用いて得られた２つの画分の間の明確な差異を示す。その上、図８Ｂの画分１に見られる２つのピークは、特異性に関するいくつかの問題を発生させることになり、場合によって抗原の数量を測定するその画分の全体的精度についての懸念を浮上させる。 図９は、ＰＥのマイクログラム単位で測定されたＰＥ複合体と平均蛍光強度の関係をプロットする、終点項目滴定を示すグラフである。本発明の改良型Ａｍｄｅｘを用いて作られたＣＤ４−ビオチン及びストレプトアビシン−Ａｍｄｅｘ−ＰＥ（◆）を対照のＣＤ４−ＰＥ（黒四角）と比較した。これらのデータは、蛍光強度に関して標準的なボトル入り製品に比べた改良型試薬の優位性、及びその強度が複合体内に含まれたＰＥの量といかに直接関係しているかを示している。 図１０は、本発明の改良型アミノデキストランを用いて作られた直接的に増幅された複合体ＣＤ８β−Ｄｅｘ−ＰＣ５と対照ＣＤ８β−ＰＣ５とを比較し、蛍光性に対して細胞数を比較する重ね合わせのヒストグラムを示す。これらのデータは、標準的なボトル入り製品とは異なり、増幅済み改良型試薬を用いた蛍光強度の有意な改善を実証している。

Claims (23)

  1. 多分散アミノデキストラン・ポリマー分子を含む組成物であって、１０ｍｇ／ｍｌの濃度で水溶液に可溶であり、当該分子が、１１５ｎｍより大きい平均的な分子の平均水力学的直径、０．１０〜０．４７の多分散性指数、３００万ダルトンを超える平均分子量（ＭＷ）及び一分子あたり５０個のアミンを超えるアミン含有量を特徴とする狭いサイズ分布を有している、前記組成物。
  2. 前記平均ＭＷが４ＭＤａより大きい、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記平均ＭＷが５ＭＤａより大きい、請求項１に記載の組成物。
  4. 前記平均ＭＷが６ＭＤａより大きい、請求項１に記載の組成物。
  5. 前記平均ＭＷが７ＭＤａより大きい、請求項１に記載の組成物。
  6. 前記平均ＭＷが８ＭＤａより大きい、請求項１に記載の組成物。
  7. 前記アミン含有量が１分子あたり５０〜１３０個のアミンである、請求項１に記載の組成物。
  8. １０〜５０ｍｇ／ｍｌの濃度で水溶液に可溶である、請求項８に記載の組成物。
  9. 前記平均的な分子の平均水力学的直径が１２５ｎｍより大きい、請求項１に記載の組成物。
  10. 前記平均的な分子の平均水力学的直径が１５０ｎｍより大きい、請求項１に記載の組成物。
  11. １１５ｎｍ未満の平均的な分子の平均水力学的直径、及び０．４０を超える多分散性指数を特徴とする広いサイズ分布の多分散アミノデキストラン粒子の第１混合物から、１１５ｎｍを超える平均的な分子の平均水力学的直径、０．１０〜０．４７の多分散性指数、３００万ダルトンを超える平均分子量（ＭＷ）及び１分子あたり５０個のアミンを超えるアミン含有量を特徴とする狭いサイズ分布を有する多分散アミノデキストラン・ポリマー分子の第２混合物を分離することによって調製され、分離された分子の上記第２混合物が、１０ｍｇ／ｍＬの濃度で水溶液に可溶である、請求項１に記載の組成物。
  12. 前記分離が、分画によって実施される、請求項１１に記載の組成物。
  13. 前記分画がカラムクロマトグラフィを用いて行われる、請求項１０に記載の組成物。
  14. 選択された標識タンパク質に結合される、請求項１に記載の可溶性多分散アミノデキストラン分子を含む複合体を含む組成物。
  15. 前記標識タンパク質が、蛍光タンパク質又は蛍光タンパク質で標識されるタンパク質である、請求項１４に記載の組成物。
  16. 前記蛍光標識付きタンパク質が蛍光分子又は染料で標識された抗体である、請求項１５に記載の組成物。
  17. 多分散アミノデキストラン・ポリマー分子を含む組成物を含む細胞標識試薬であって、当該組成物が１０ｍｇ/ｍｌの濃度で水溶液に可溶であり、上記分子が、１１５ｎｍより大きい平均的な分子の平均水力学的直径、０．１０〜０．４７の多分散性指数、３００万ダルトンを超える平均分子量（ＭＷ）、及び１分子あたり５０個のアミンを超えるアミン含有量を特徴とする狭いサイズ分布を有し、ここで、上記分子が、選択された標識タンパク質に上記アミンを介して結合する、前記試薬。
  18. 前記標識タンパク質が蛍光分子又は色素で標識された抗体である、請求項１７に記載の試薬。
  19. 細胞標識用試薬を生産する方法であって、以下のステップ：
    （ａ） 多分散性アミノデキストラン・ポリマー分子を含む組成物であって、当該組成物が１０ｍｇ/ｍｌの濃度で水溶液に可溶であり、当該分子が、１１５ｎｍより大きい平均的な分子の平均水力学的直径、０．１０〜０．４７の多分散性指数、３００万ダルトンを超える平均分子量（ＭＷ）、及び一分子あたり５０個のアミンを超えるアミン含有量を特徴とする狭いサイズ分布を有している、上記組成物を提供し、
    （ｂ） 上記分子を、選択された標識タンパク質に上記アミンを介して結合する、
    を含む、前記方法。
  20. 前記提供ステップ（ａ）にはさらに、以下のステップ：
    ｉ． １１５ｎｍ未満の平均的な分子の平均水力学的直径、及び０．４０を超える多分散性指数を特徴とする広いサイズ分布の多分散アミノデキストラン粒子の第１の混合物から、１１５ｎｍを超える平均的な分子の平均水力学的直径、０．１０〜０．４７の多分散性指数、３００万ダルトンを超える平均分子量（ＭＷ）、及び１分子あたり５０アミンを超えるアミン含有量を特徴とする狭いサイズ分布を有する第２の混合物を分離し、ここで、分離された分子の当該第２の混合物が１０ｍｇ／ｍＬの濃度で水溶液に可溶であり；
    ｉｉ． 上記組成物（ｉ）を凍結乾燥し；そして
    ｉｉｉ． 前記凍結乾燥済み組成物を水溶液中に再度溶解させる、
    を含む、請求項１９に記載の方法。
  21. 改良型アミノデキストラン組成物の製造方法であって、以下のステップ：
    １１５ｎｍ未満の平均的な分子の平均水力学的直径及び０．４０を超える多分散性指数を特徴とする広いサイズ分布の多分散アミノデキストラン粒子の第１の混合物から、１１５ｎｍを超える平均的な分子の平均水力学的直径、０．１０〜０．４７の間の多分散性指数、３００万ダルトンを超える平均分子量（ＭＷ）、及び１分子あたり５０個のアミンを超えるアミン含有量を特徴とする狭いサイズ分布を有する第２の混合物を分離させ、ここで、分離された分子の上記第２の混合物が１０ｍｇ／ｍＬの濃度で水溶液に可溶である、
    を含む、前記方法。
  22. 以下のステップ：
    − 前記分離された組成物を凍結乾燥させ；そして
    − 前記凍結乾燥された組成物を水溶液中に再度溶解させる、
    をさらに含む、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記分離ステップが、クロマトグラフィカラム上で前記第１混合物を分画し、そして当該カラムから溶出する前記狭いサイズ分布の前記アミノデキストラン分子に対応する選択されたクロマトグラフィ画分を収集し、プールするステップを含む、請求項２１に記載の方法。
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