JP4102835B2 - フィコビリソーム、誘導体およびその使用 - Google Patents
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Description
フィコビリソームは、青緑藻類や紅藻類において主たる発色アンテナとして機能する、フィコビリタンパク質と無色のポリペプチドの錯体である(非特許文献1)。これら錯体の機能の保全性についての主な基準は、これらが、例えばPorphyridium cruentum フィコビリソームにおいて、フィコビリタンパク質成分の間で、フィコエリスリン(PE)からフィコシアニン(PC)、そして最終的にはアロフィコシアニン(APC)への高度に効率的なエネルギー伝達を示すことである。無色のポリペプチドは、適切な安定とエネルギー伝達のため、フィコビリソームの中でフィコビリタンパク質の組立と位置設定に関与する。
本発明の目的は、特異結合アッセイ用ラベルとして有用な可溶性フィコビリソームを提供することである。
フィコビリソームが、種々のアッセイやフォーマットで無傷のまま使用できるよう、安定化、抱合化、そして修飾できるというのは、本発明者の発見である。フィコビリソームは、構成要素たるフィコビリタンパク質の高い量子収率に加えて、とりわけその大きな分子量、吸光係数およびエネルギー移動効率のため、高感度なラベルとなる。フィコビリソーム内での方向性のあるエネルギー伝達は、一またはそれ以上の検知性のある種から末端のアクセプタにかけて起こる。検知性のある種は、第2の(「アクセプタ」あるいは「エミッタ」)発蛍光団を励起させる放出ピークを有する第1の発蛍光団である。このようなエネルギー伝達は、均質な特異結合アッセイと不動性のフィコビリソームを含むトランスデューサに適用することができる。
1Tijssen,P.(1985年),「Practice and Theory of Enzyme Immunoassays」;R.H.Burdon and P.H.van Knippenberg編,Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular biology,第15巻,Elsevier,New York.2Wong,S.S.(1991年),「Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking」,CRC Press,Boca Raton.
3Pierce Catalog & Handbook(1994年),Cross-linking/Protein Modification,第155〜200頁.
フィコビリソームを広範な単細胞藻類から単離する際の一般的な手法は、例えば Gantt外(1979年),「Plant Physiology」,第63巻:第615-620 頁に記載されている。フィコビリソームは、GanttおよびLipschultz(1972年),「Journal of Cell Biology」,第54巻:第313-324頁に記載された方法に変更を加えたものによって、紅藻類(例えばPorphyridium cruentum)および青緑藻類(例えばAnabaena variabilis,Spirulina plantensis)から単離される。バイオマスは、湿潤重量で24gまでは、最終的なスクロース勾配超遠心分離工程において、SW27ロータを6本の35ml遠心分離管を使って手軽に扱うことができる。フィコビリソームの回収率は、最初のバイオマスの0.1〜1.0%のオーダーである。
培養仕立てないし凍結仕立て(−20℃ないし−70℃)の藻類を、40〜500リットルの攪拌タンク中で独立栄養方式で培養し、連続的に蛍光を照射して遠心分離により収穫する。Porphyridium cruentum(P.cruentum)は、塩化ナトリウム、Tadros Metals 、即席海洋およびDunaliellaビタミンを含む人工的な海水媒体(pH8.0)中で20〜22℃で成長させることができる。またAnabaena variabilis は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム、クエン酸、クエン酸アンモニウム第二鉄、A5 Metals(pH7.8)を含む二重強度のBG-11 媒体中で25℃で成長させることができる。
公知の方法(例えばGantt とLipschultz(1972年)前掲およびGantt外(1979年)前掲)によるフィコビリソーム単離の簡便性、規模およびコストパフォーマンスには、勾配超遠心分離との対比によって厳しい基準がある。フィコビリソームの大規模で経済的な生産を可能ならしめるため、フィコビリソームを、種々の有機体から、勾配超遠心分離によらずに単離する手順が開発された。Triton X-100による安定化とPEG による沈殿を使ってAnabaena variabilis のフィコビリソームを単離する方法は、他の有機体、特にP.cruentumからは、無傷のフィコビリソームを得ることはできなかった。Triton X-100とPEG の除去中にP.cruentumのフィコビリソームを保護するためには、さらに処理工程が必要である。スクロースあるいはホルムアルデヒドのどちらを処理する方法も有効であることが分った。以下に要点を示したのは、スクロースの処理手順である。これは、修正を加えれば、rhodophytes(例えばP.cruentum)とcyanophytes(例えばAnabaena variabilis,Spirulina platensis)の両方に有効であることが分った。調製の規模は、遠心分離機とロータの組み合わせを選択し、容積を調整すれば、容易に変更できる。
公知の文献(例えばKatoh(1988年)「Phycobilisome stability」,「Methods in Enzymology」,第167巻,第313〜318頁,Academic Press;およびGantt 外(1979年)前掲書)によれば、単離されたフィコビリソームは、不安定で、タンパク質濃度とイオン強度が減少していく。フィコビリソーム内エネルギー伝達は、濃度に関連した545nmの励起線による666/573nm蛍光放出比の減少によって示されるように、蛋白質または(約1mg/ml以下)の緩衝液(約0.5M KPi以下)希釈後の数分間に中断される。
リジンで消光させ、ケルクロマトグラフィーで精製された、FAで処理したフィコビリソームとフィコビリソーム抗体抱合体(「修飾したフィコビリソーム」)は、共有結合または受動吸収によって均一なラテックス粒子に不動化される。培養はすべて、室温で回転させながら行う。蛍光性および非蛍光性のカルボキレートで修飾したラテックス微粒子(粒径0.03〜1μm)は、1〜10mg/mlの最終濃度で使用した。
不動化は、以下のプロトコルに従って室温下で行った。
アミンで修飾したBioMag(高磁性体)を、10mMのリン酸ナトリウム(NaPi; pH 7.35)の激しい渦巻き流中で5回洗浄し、粒子濃度が5〜10mg/ml となるように磁性体を分離した。最終洗浄の後、湿潤下ケーキは、6.25%のGA(Sigma)中で25mg/mlの濃度に再懸濁させ、室温下で3時間攪拌する。このGAで処理した粒子はNaPi中で6回洗浄した。洗浄を終えた、GAで活性化させた粒子は、タンパク質を含むPBS(pH 7.2-7.4)で、3〜10mg/mlに不動化させ、BioMag 1mg当り100〜160μgタンパク質を産生すべく、再懸濁させた。BSAは、BioMag粒子上のイムノ反応体間の間隔を調整するドーピング剤として含有させる。タンパク質溶液の一部は、不動化効率を測定するために保存しておく。タンパク質と粒子を含むスラリーは、室温で16〜24時間攪拌する。粒子は、磁気を使って分離する。上澄み液はデカントし、残留するタンパク質の推測を行うために保存しておく。未反応のGA基は、粒子を、1Mのグリシン(pH 8.0)中で約10mg/mlの濃度に再懸濁させることによって消光させ、その後1時間攪拌した。消光させた粒子はPBS(pH 7.4)中で2度洗浄し、2mg/mlのBSAを含むPBS中で2〜4時間攪拌して粘着させた。粘着させた粒子は、1mg/mlのBSAを含むPBS中で3度洗浄し、粒子濃度が10mg/mlとなるまで再検索させ、2〜8℃で保存した。一方、使用する方は、不動化させた試薬を長期にわたる保存中の浸出から保護するため使用する前に、粒子濃度が約1mg/mlのアッセイ緩衝液中で激しい渦巻き流により3回洗浄した。
タンパク質は、以下のプロトコルに従って、表面を修飾したポリスチレン製微小滴定プレートに受動吸収される。抗原と抗体は、ホウケイ酸ガラス管または50mlのポリプロピレン製遠心分離管において、50mMのカーボネート緩衝液(pH9.6)または10mMのリン酸ナトリウム(Ph 7.4)中で、使用の直前に2〜20μg/mlに希釈した。透明なポリスチレン製のImmulon 4(商品名)または白色のMicrolite 2(商品名)(平底の微小滴定プレ(Dynatech))を、1皿当り100μリットルの割合で、37℃で2時間、室温(20〜23℃)で4時間、または2〜8℃で15〜24時間かけて、抗原・抗体を塗布した。プレートはデカントし、洗浄緩衝液(BSAを1mg/ml含むPBS(pH 7.4))を充填して1度だけ洗浄した後、またデカントした。プレートは、1時間かけて、2mg/mlのBSAを含むPBS200μリットルでブロッキングを施し、さらに洗浄緩衝液で5回洗浄した。
実施例1:非共有結合によるフィコビリソーム−抗体抱合体特異結合アッセイ
末修飾のフィコビリソームは、特異結合試薬の調製と使用に用いる典型的な条件下では急速に解離するため、非共有結合によるフィコビリソーム抱合体は、プロセスの各工程において、フィコビリソームの濃度と反応条件に注意が必要であった。0.5〜20IgG2b/フィコビリソームのモル比を得るため、IgG2b サブタイプ(Sigma Chemical Company 製造)のネズミのモノクローナル抗体による抗フィコエリスリン抗体を、激しく攪拌しながら、2.5mg/mlのBSAを含む0.6MのKPi(pH 7.2)中のP.cruentumのフィコビリソーム(5.6mg/ml)に滴下した。反応は、室温下で30分間進行させた。免疫学的抱合体形成は、常磁性粒子上に不動化されたヤギ抗マウスIgG2b 抗体を使うと、IgG2b-フィコビリソーム複合体が特異的に補足されることによって示される。50μリットルのBioMag-IgG2b(1%のBSAを含む0.75M KPi で洗浄され、濃度は30mg/ml)を、200μgのフィコビリソームを含む40μリットルの抱合体混合物に添加した。補足試薬を添加した後、アッセイ混合物は、6.7mg/mlのBSAを含む0.66MのKPi中に拘束されたIgG2bとともにまたはこれなしで、2.2mg/mlのフィコビリソームを含む。この混合物は、室温下で30分間培養し、磁気を帯びたプレート(Corning社製)上に分離した。そして、0.75MのKPi中で40倍に希釈した上澄み液を使って、545nmにおける吸光度を測定した。IgG2bを増加させると、その投与量に応じて吸光度が減少した。これは、BioMag-IgG2bを介して特異結合によりフィコビリソーム-IgG2b複合体が生じたことを示している。特異結合が最大(26%)になるのは、IgG2bが1〜3μgのときで、これを超えると、固体相の容量が不足するため結合割合は減少する。
フィコビリソームを検出する試薬として使用する場合は、このフィコビリソームは通常、構造的には無傷(「非解離状態」)にとどまらなければならない。非均質の特異結合アッセイ(測定前は、結合した首都遊離した種は無傷のまま分けてられていなければならない)に使用するには、フィコビリソームは、縫合、精製、アッセイならびに製品の製造、輸送および貯蔵の間、自発的な解離を防ぐため、安定化されていなければならない。共有結合による安定化方法は、フィコビリソームが、溶解度を損なうことなく、エネルギー結合および/または構造的な一体性を保存するように開発された。制御なく重合や中和を行ったときに生ずる沈殿を防ぐため注意深く最適化した条件の下では、架橋剤を使用した。最適化の際重要なパラメータには、架橋剤の型と反応性、絶対試薬と相対試薬ならびにフィコビリソームの濃度、反応時間、pHならびに反応終結と精製の方法が含まれる。P.cruentumのフィコビリソームを用いて例示したホルムアルデヒドによる安定化は、以下のように行った。
フィコビリソームは、0.05% のアジ化ナトリウムを含む0.75M KPi(pH 7.3)を用いて、濃度を2〜10mg/ml、好ましくは約8.0mg/mlに調整する。ついで、GA(0.75M KPi中で0.2-1.0%)を、その容量の10〜50%を2分間かけて滴下するか、あるいは3時間までかけてさらに3〜6分画を追加した。FAの添加後、反応混合物を室温下で1〜18時間放置した。修正した一工程GA法による抱合化に先立って設計した好ましい安定化プロトコルにおいては、7.27mg/mlのフィコビリソームと0.023%のGAを含む反応混合物は、第一アミンを含むリガンド(例えば抗原)またはレセプタ(例えば抗体)の添加前に、室温下で3時間培養する。あるいは、GAによる安定化反応は、過剰の第一アミン(例えば100mMのリジン、アルギニン、グリシン、シスチンまたはグルタミン酸)を添加すれば終結する。GAによる安定化の好ましいプロトコルにより、遊離アルデヒド以外の基を介して抱合化または不動化をする前に、フィコビリソーム(7.27mg/ml)をまず1〜2時間かけて0.023%のGAに使って安定化し、ついで、0.05〜0.15%のGAを先の5〜10%の容量を使用し1〜4時間かけて培養を行った。反応は、100mMのリジン、グリシン、シスチン、グルタミン酸または他の第一アミンを含有する消光剤を添加して終結させた。GAで安定化されたフィコビリソームは、未修飾のフィコビリソームとFAで安定化したフィコビリソームについて用いた方法により、吸光係数と蛍光を測定することによって同定した。P.cruentumから得た安定化フィコビリソームは、以下の性質について再現性があった:
−吸光係数: >4AU545/mg(平均は約5.0)
−蛍光信号(666nm): >104cps(1 ng/ml当り;545nmで励起)
−蛍光比: 666/573nm 放射比>3.0(545nmで励起)
試薬追加工程を除去する手段として多くの診断テストやキットに用いる際には、再現性を改善し、また寿命を延ばすためには、乾燥試薬の形が好ましい。試薬を長期保存のため乾燥するには、凍結乾燥が一般的な方法である。文献によれば、フィコビリソームは凍結に対して不安定である(例えばGantt とLipschultz(1972年)「Phycobilisomes of Porphyridium Cruentum」,J.Cell Biol.第54巻,第313-324頁;Canaani 外(1980年)「Reassembly of Phycobilisomes from Allophycocyanin and a Phycocyanin-Phycoerythrin Complex」,FEBS Letters,第115(2)巻,第225-229 頁)。フィコビリソームと抱合体の凍結乾燥は、乾燥試薬フィコビリソーム製品フォーマットの実現可能性を確立するために行った。
すべての工程は、室温下(20〜23℃)で行った。P.cruentumから単離したフィコビリソームは、アジ化ナトリウム(2mM)を含む0.75M KPi(pH 7.35)中で、濃度8mg/mlに規格化した。そして、GA濃度が0.023%でフィコビリソーム自身の濃度が7.27mg/mlの反応混合物を生成させるため、その10%の容量のGA(0.25%)を、攪拌しながら2分間にわたって滴下した。反応混合物は、2時間放置した。親和力で精製したFcに特異的なヤギの抗マウスIgG(GAM;OEM概念;10mMリン酸塩で緩衝した0.1%のアジ化ナトリウムを含む等張生理食塩水2mg/ml)を、GAM/フィコビリソームのモル比が12:1(フィコビリソーム1mgに対してGAMが128μg)となるよう、攪拌しながら滴下した。4時間の培養後、その10%の量の1.1M L−リジンを添加して反応を終結させた。消光した反応物は、回転させながら1時間にわって混合した。この反応混合物の5容量%に当る新しく調製したばかりのホウ化水素ナトリウム(Aldrich;0.1mM のNaOH中で濃度 5mg/mlのもの)を、攪拌しながら反応混合物に加え、さらに5分後に同じ溶液を10容量%加えた。ホウ化水素塩で還元した反応混合物は、遠心分離または、好ましくは150mMのNaClと0.05%のNaN3を含む100mMのKPi(pH 7.35)で平衡化したSephacryl S300もしくはSepharose CL-6B(Pharmacia 社製)ゲルクロマトグラフィーで精製するまで2〜8℃で貯蔵した。
50μリットルの試料(アッセイ緩衝液)マウスのイムノグロブリン(MIgG)の濃度は変化させてもさせなくてもよい)を、側方引き出し磁気ベース(Corning社製)を備えたMagicTMセパレータに配置した12×75mmのガラス製試験管に添加した。粒子濃度が0.3〜10mg/mlで洗浄したばかりのBioMag-MIgG を100μリットル添加した。試験管は攪拌し、50μリットルのフィコビリソーム−GAM抱合体(GAM/フィコビリソームのモル比は1.5〜18)を、1〜100μg/ml(5〜500mAU/ml)のフィコビリソーム濃度で添加した。反応混合物は攪拌し、室温で1時間培養した。粒子は、MagicTMラックをその磁気ベースに5分間乗せたところ、分離された。アッセイ用の上澄み液160μリットルを、12×75mmのガラス製試験管に移し、ついで100mMのKPi(pH 7.35)で希釈し、光度計を使うアッセイ用には1mlを、蛍光計を使うアッセイ用には3mlを用意した。
特異結合の%割合は、粒子濃度を増加させたところ、急激に増加した。
アッセイは、実施例6の方法に従って行った。ただし、試薬の濃度は、蛍光検出に適するように変えた。下に示すデータは、1回の試験当り250ngのフィコビリソーム−GAM抱合体と、1回の試験当り250ng のBioMag-MIgG を使用して得たものである。蛍光は、545nm で励起して記録した。
洗浄したBioMag−ウサギIgG(BioMag-RIgG)を、フィコビリソーム−GAM抱合体(GAM/フィコビリソームのモル比が5/1)で、攪拌しながら室温下で2時間予備処理した。予備結合した試薬混合物は、アッセイ緩衝液で3回洗浄し、粒子濃度が400μg/mlとなるように再懸濁させた。予備結合した試薬500μリットルを、12×75mmの試験管に注入した。アッセイは、50μリットルの試料を混合物に添加し、攪拌して60分間室温で培養することにより行った。磁気を使った分離後、500μリットルの上澄み液を、蛍光測定のため、2.5ml の0.1M KPiに移した。
MIgGをフィコビリソーム−GAM抱合体を使って予備培養し、ついでフィコビリソームGAM−MIgG複合体をBioMag−ウサギの抗マウス抗体(BioMag−RAM)で補足することによって、逆サンドイッチアッセイを行った。このプロトコルは、主な(動的)イムノ反応を溶液中で進行させ、アッセイ動態を完全にして立体障害を最小にすることによって、アッセイの感度を最大にする。一方、フィコビリソーム−GAM抱合体は、以下のように、不動化したウサギのIgG(RIgG)に結合したモノクローナル抗体を検出するラベルを付した第2の抗体として使用することができる。
競合アッセイ:白色のポリスチレンMicroliteTM2微小滴定プレート(Dynatech 社製)に、10mMのリン酸ナトリウム(pH 7.35)中に2−20μg/ml溶解したMIgGを、2〜8℃で15時間、受動吸収によって塗布した。上澄み液は吸引した。微小滴定用の液溜めは、200μg/lのブロック緩衝液(100mMのリン酸カリウム(pH 7.35)、2mHのアジ化ナトリウムおよび2mg/mlのBSAを含む10mMのリン酸塩で緩衝した等張生理食塩水(PBS,pH 7.4))で、60分間室温で培養し、250μリットルの洗浄緩衝液(1mg/mlのBSAを含むPBS)で6回洗浄した。最後の洗浄後、プレートはペーパータオルの上に逆さまに置き、しっかりと水をふき取った。各液溜めには、50μlのフィコビリソーム−GAMを各液溜めにつき0.5〜10μgの濃度で添加した後、50μlのアッセイ用緩衝液(100mMのリン酸カリウム(pH 7.35)を含むPBS)、2mMのアジ化ナトリウムおよび1mg/mlのBSA、あるいはMIgG(各液溜めのアッセイ用緩衝液中に10-1000ng 含有させる)を添加した。プレート(液溜め)は、室温下で1時間攪拌しながら培養した後デカントし、アッセイ用緩衝液で3回洗浄する前と後で検査を行った。不動化したMIgGに結合したフィコビリソーム−GAM抱合体は以下の条件下においては、プレートの底部および下方側壁において紫がかったピンク色の塗膜として、目視で識別できる(プレート洗浄の前も後も)。
1.MIgGの塗布濃度が0.5μg/液溜めより大きいこと;
2.フィコビリソーム−GAM抱合体の濃度が1μg/液溜めより大きいこと;
3.競合する可溶性MIgGの濃度が10ng/ 液溜めより小さいこと。
1.RAMの塗布濃度が0.2μg/液溜めより大きいこと;
2.MIgGの濃度が10ng/液溜めより大きいこと;
3.フィコビリソーム−GAM抱合体の濃度が、RAMとMIgGの濃度に対応して、1.5〜10μg/液溜であること。
競合アッセイの方法: MIgGを、以下のようにして、アルデヒドで処理した修飾済ポリスルホン膜上の局所領域に共有結合で不動化させた。有効孔径0.8μMのUltrabindTM US800 不支持膜(Gelman Sciences社製)を20cm×6cmに切断した。MIgG(10mMのリン酸塩で緩衝した等張る生理食塩水(PBS)中に2〜10mg/ml溶解したもの;pH 7.2;アジ化ナトリウムを0.1%含む)を、先細りのキャピラリーピペット(Drummond Scientific社製)を使い、先の切断片の中程(各縁から3cm)に鉛筆で引いた線に沿って1cm当り4μlの量だけ、手でスポットを垂らした。30分間風乾した後、膜は、10mMのPBS(pH 7.4)中に1%のBSAを含むブロック緩衝液50ml中で、穏やかに攪拌しながら1時間室温下で培養し、0.1%のBSAを含む100mlのPBS(pH 7.4)で2度すすぎ、3時間風乾した。すすぎと乾燥を終えた膜はついで、0.2%のTween 20を含むPBS(pH 7.2)中で、1時間攪拌しながら洗浄し、室温下で一晩乾燥させた。
Claims (60)
- フィコビリソームヘテロ抱合体を含む組成物であって、該ヘテロ抱合体は互いに共有結合した2つの化学種を含有し、第1の該化学種はフィコビリソームであり、第2の該化学種は、リガンド、レセプタ、信号発生分子、部位特異的分子、および製造された固体サポートからなる群より選択される、組成物。
- フィコビリソームが固体サポートに固定化されている、請求項1記載の組成物。
- 固定化したフィコビリソームが安定化しており、安定化されたフィコビリソームが以下の性質を有する、請求項2記載の組成物。
吸光係数: >4AU 545 /mg
蛍光信号(666nm):>10 4 cps(1ng/ml当り;545nmで励起)
蛍光比: 666/573nm放射比>3.0(545nmで励起) - 固定化したフィコビリソームが、規定された方向で固体サポートに固定化されている、請求項2記載の組成物。
- 固定化したフィコビリソームが少なくとも1つのロッドを含む、請求項2記載の組成物。
- 固定化したフィコビリソームが、共有結合を介して所望の化学成分により修飾されている、請求項2記載の組成物。
- 化学成分が、固定化したフィコビリソームの特定のタンパク質に結合している、請求項6記載の組成物。
- 固定化したフィコビリソームが、リガンド、レセプタ、および信号発生分子からなる群より選択される分子種に結合している、請求項2記載の組成物。
- 分子種が、フィコビリソームを構成するタンパク質の1つの型に結合している、請求項8記載の組成物。
- 分子種が、フィコビリソームを構成するタンパク質の1つの型に、多価リガンドまたは多価レセプタを介して結合している、請求項9記載の組成物。
- 分子種が、固定化したフィコビリソームに共有結合している、請求項8記載の組成物。
- フィコビリソームが、末端アクセプタの波長において主要な放出ピークを保持している、請求項2記載の組成物。
- フィコビリソームヘテロ抱合体が固体サポートに固定化されている、請求項1記載の組成物。
- フィコビリソームヘテロ抱合体が安定化しており、安定化されたフィコビリソームが以下の性質を有する、請求項1記載の組成物。
吸光係数: >4AU 545 /mg
蛍光信号(666nm):>10 4 cps(1ng/ml当り;545nmで励起)
蛍光比: 666/573nm放射比>3.0(545nmで励起) - フィコビリソームヘテロ抱合体が、規定された方向で固体サポートに固定化されている、請求項1記載の組成物。
- フィコビリソームヘテロ抱合体が少なくとも1つのロッドを含む、請求項1記載の組成物。
- 第2の化学種がフィコビリソームに共有結合している、請求項1記載の組成物。
- 第2の化学種が特定のフィコビリソームタンパク質に結合している、請求項17記載の組成物。
- 第2の化学種が、フィコビリソームを構成するタンパク質の1つの型に結合している、請求項18記載の組成物。
- 第2の化学種が、フィコビリソームを構成するタンパク質の1つの型に、多価リガンドまたは多価レセプタを介して結合している、請求項19記載の組成物。
- フィコビリソームヘテロ抱合体が、フィコビリソームヘテロ抱合体に特異的に結合する多特異性リガンドまたは多特異性レセプタに非共有結合により結合している、請求項1記載の組成物。
- フィコビリソームヘテロ抱合体が、単離されたフィコビリタンパク質、単離されたリンカータンパク質、またはその混合を含む混合物から再構成されている、請求項1記載の組成物。
- フィコビリソームヘテロ抱合体が、信号発生系に対するエネルギードナーまたはアクセプタである、請求項1記載の組成物。
- フィコビリソームヘテロ抱合体が、突然変異種、ハイブリッド、およびフィコビリソーム構成要素を発現可能な遺伝子組換え種からなる群より選択される藻類より得られる少なくとも1つのタンパク質を含む、請求項1記載の組成物。
- 分析物を含むサンプルを特異結合相手に接触させ、特異結合相手に特異的に結合する能力によってサンプル中に存在する分析物の量を測定する特異結合アッセイを実施するための方法であって、アッセイ成分が、検出可能なようにラベル付けされており、該アッセイ成分は、特異結合相手、特異結合相手に特異的に結合するために分析物と競合する試薬分子、および分析物と同じ結合特異性を有する試薬分子からなる群より選択され、検出可能なラベルは、請求項1記載のフィコビリソームヘテロ抱合体を含む信号発生系であることを特徴とする、方法。
- フィコビリソームヘテロ抱合体が特異結合相手に結合している、請求項25記載の方法。
- フィコビリソーム抱合体が、アッセイ成分に特異的に結合するリガンドまたはレセプタに結合している、請求項25記載の方法。
- フィコビリソームヘテロ抱合体が、非共有結合的手段でアッセイ成分に結合している、請求項25記載の方法。
- フィコビリソームヘテロ抱合体が、共有結合によりアッセイ成分に結合している、請求項25記載の方法。
- アッセイが、結合済みの特異結合相手を、未結合の特異結合相手から分離せずに、特異結合相手に対する分析物の結合を測定する均質アッセイである、請求項25記載の方法。
- 信号発生系が2つまたはそれ以上のフィコビリソームヘテロ抱合体を含む、請求項25記載の方法。
- フィコビリソームヘテロ抱合体がエネルギードナーまたはアクセプタである、蛍光エネルギー移動をさらに含む請求項25記載の方法。
- 使用目的で、フィコビリソームヘテロ抱合体を凍結または脱水により調製する、請求項25記載の方法。
- 分析物を含むサンプルを特異結合相手に接触させる段階と、特異結合相手に特異的に結合する能力によってサンプル中に存在する分析物の量を測定する段階とを含む、特異結合アッセイを実施するための方法であって、検出可能なように、フィコビリソームのヘテロ抱合体を含む信号発生系によってアッセイ成分がラベル付けされており、該フィコビリソームはフィコビリタンパク質とリンカータンパク質とが自ら組み合わさってできており、そのフィコビリソームの各々は少なくとも1つのロッドを含み、該アッセイ成分は、特異結合相手、分析物と同じ結合特異性を有する試薬分子、および特異結合相手に特異的に結合するために分析物と競合する試薬分子からなる群より選択される、方法。
- 特異結合相手、分析物と同一の化学的性質を有する試薬分子、および特異結合相手に特異的に結合するために分析物と競合する試薬分子からなる群より選択されるアッセイ成分が固相に結合している、請求項34記載の方法。
- 固相が、合成膜、ポリマー、ポリマー性ビーズ、ポリマー性母材、微粒子、およびガラスからなる群より選択される、請求項34記載の方法。
- 分析物が、核酸、薬剤、リガンド、抗原、ハプテン、抗体、および炭水化物からなる群より選択される、請求項34記載の方法。
- 信号発生系が2つまたはそれ以上のフィコビリソームを含む、請求項34記載の方法。
- フィコビリソームが安定化している、請求項34記載の方法。
- 以下の段階を含む、請求項1記載のフィコビリソームヘテロ抱合体の組成物を調製する方法:
a.フィコビリソームがフィコビリソーム内の架橋により安定化する、フィコビリソームを架橋する段階、および
b.安定な可溶性のフィコビリソームヘテロ抱合体を単離する段階。 - フィコビリソームヘテロ抱合体が共有結合架橋領域により安定化している、請求項40記載の方法。
- 架橋が消光により停止される、請求項41記載の方法。
- フィコビリソームヘテロ抱合体が二官能性多部位結合架橋試薬により安定化している、請求項41記載の方法。
- フィコビリソームヘテロ抱合体がグルタルアルデヒドとの架橋により安定化している、請求項41記載の方法。
- フィコビリソームヘテロ抱合体がホルムアルデヒドとの架橋により安定化している、請求項41記載の方法。
- 分析物を含むサンプルを特異結合相手に接触させ、特異結合相手に特異的に結合する能力によってサンプル中に存在する分析物の量を測定する特異結合アッセイを実施するための方法であって、アッセイ成分が、検出可能なようにラベル付けされており、該アッセイ成分は、特異結合相手、特異結合相手に特異的に結合するために分析物と競合する試薬分子、および分析物と同じ結合特異性を有する試薬分子からなる群より選択され、検出可能なラベルが、フィコビリソームを含む信号発生系であることを特徴とする、方法。
- フィコビリソームが特異結合相手に結合している、請求項46記載の方法。
- フィコビリソームが、アッセイ成分に特異的に結合するリガンドまたはレセプタに結合している、請求項46記載の方法。
- フィコビリソームが、非共有結合的手段でアッセイ成分に結合している、請求項46記載の方法。
- フィコビリソームが、共有結合によりアッセイ成分に結合している、請求項46記載の方法。
- アッセイが、結合済みの特異結合相手を、未結合の特異結合相手から分離せずに、特異結合相手に対する分析物の結合を測定する均質アッセイである、請求項46記載の方法。
- 信号発生系が2つまたはそれ以上のフィコビリソームを含む、請求項46記載の方法。
- フィコビリソームがエネルギードナーまたはアクセプタである、蛍光エネルギー移動をさらに含む請求項46記載の方法。
- 使用目的で、フィコビリソームを凍結または脱水により調製する、請求項46記載の方法。
- 分析物を含むサンプルを特異結合相手に接触させる段階と、特異結合相手に特異的に結合する能力によってサンプル中に存在する分析物の量を測定する段階とを含む、特異結合アッセイを実施するための方法であって、検出可能なように、フィコビリソームを含む信号発生系によってアッセイ成分がラベル付けされており、該フィコビリソームはフィコビリタンパク質とリンカータンパク質とが自ら組み合わさってできており、そのフィコビリソームの各々は少なくとも1つのロッドを含み、該アッセイ成分は、特異結合相手、分析物と同一の化学的性質を有する試薬分子、および特異結合相手に特異的に結合するために分析物と競合する試薬分子からなる群より選択される、方法。
- 特異結合相手、分析物と同一の化学的性質を有する試薬分子、および特異結合相手に特異的に結合するために分析物と競合する試薬分子からなる群より選択されるアッセイ成分が固相に結合している、請求項55記載の方法。
- 固相が、合成膜、ポリマー、ポリマー性ビーズ、ポリマー性母材、微粒子、およびガラスからなる群より選択される、請求項55記載の方法。
- 分析物が、核酸、薬剤、リガンド、抗原、ハプテン、抗体、および炭水化物からなる群より選択される、請求項55記載の方法。
- 信号発生系が2つまたはそれ以上のフィコビリソームを含む、請求項55記載の方法。
- フィコビリソームが安定化している、請求項55記載の方法。
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