CN1181111A - 藻胆体及其衍生物和应用 - Google Patents

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Abstract

提供可在灵敏的指示试剂盒(例如,用于检测血污染)、特异性结合测定(例如,可见光、光度和荧光免疫测定)和光电器件(例如,生物传感器、光电转换器)中将修饰的或完整的藻胆体用作极有效的标记的方法和组合物。

Description

藻胆体及其衍生物和应用
技术背景
藻胆体是藻胆蛋白和无色多肽的复合物，该复合物在蓝绿藻和红藻中起主要集光天线的作用。Gantt，“Phycobilisomes：light harvesting pigmentcomplexes”，BioScience，25：781-788，(1975)。这些复合物的功能完整性(functional integrity)的主要标准表现在它们在藻胆蛋白成分之间进行高效能量转移，例如在Porphyridium cruentum藻胆体中从藻红蛋白(PE)转移至藻蓝蛋白(PC)，并最终转移至别藻蓝蛋白(APC)。无色多肽参与藻胆体内藻胆蛋白的装配和定位，以进行适当的稳定和能量转移。
不同有机体的藻胆体具有许多共同的特性，包括：(1)极高的“复合物分子量”(5-20×106道尔顿)，即，由多个分子组成的藻胆体复合物的一摩尔的重量；(2)在电磁光谱可见区域中的重复吸收最大值；(3)高摩尔吸收系数(emax＞107M-1cm-1)；(4)在藻胆蛋白成分之间高效的(＞90％)定向振动能量转移，通常从一个或多个敏化种类转移至能够发荧光的末端受体；(5)相对分离藻胆蛋白的大的斯托克(Stoke)位移；(6)藻胆蛋白成分的高量子产额；(7)在水性缓冲液中的高溶解性；和(8)含别藻蓝蛋白的核心结构。
分离的藻胆体在所有的但最有利的条件下，容易地解离成游离的藻胆蛋白和各种藻胆蛋白复合物。将离子强度调低(＜0.5M磷酸盐)、低藻胆体浓度(＜1mg/ml)和低温导致藻胆体的解离。Katoh，(1988)Methods inEnzvmology 162：313-318，；Gantt等，(1979)Plant Physiology 63：615-620。也有报告说将藻类冷冻会导致藻胆体破坏。Gantt等，(1979)Journal of CellBiology 54：313-324。
藻胆体在形态学上是以称作“杆(rods)”的有序堆排列的寡聚藻胆蛋白圆盘的复合物。一般而言，一些臂状杆从也是由杆组成的核心中辐射状伸出。不同有机体的藻胆体在形态学和计量学上各不相同，具有不同数目和类型的藻胆蛋白成分和杆。一般而言，外周杆由藻红蓝蛋白(phycoerythrocyanin)、藻红蛋白、和/或藻蓝蛋白组成，而核心由别藻蓝蛋白和关联的连接蛋白组成。
作为藻胆体荧光蛋白成分的分离的藻胆蛋白已在免疫测定中用作标记物。参见Stryer等的美国专利U.S.4,520,110和Kronick等的ClinicalChemistry 29：1582-1586(1983)。然而，由于在分离和操作完整的藻胆体上存在困难，本领域的技术人员尚不认为，这些大分子可同样地利用。由于藻胆体可提供的信号在理论上远大于分离藻胆蛋白，因此，本领域需要有处理藻胆体的方法以使它们可在测定和其他应用中用作宿主的可检测的标志。
发明概述
本发明的一个目的是提供可用作特异性结合测定的标记的可溶性藻胆体的制剂。
本发明的另一目的是提供包含与配体、受体或其他有用分子共价连接的藻胆体的藻胆体缀合物的制剂。
本发明的又一目的是提供适合在特异性结合测定中使用的固定化藻胆体的制剂。
本发明的还有一个目的是提供用藻胆体作为可检测的标志进行测定的方法。
本发明的这些和其他目的通过一个或多个下述实施方式实现。在本发明的一个实施方式中，提供了分离的和可溶性的稳定藻胆体的均相制剂。该藻胆体在1×g的条件下24小时内不沉降。而且，在1000×g的条件下离心5分钟后，55％以上的藻胆体仍留在上清液中。
本发明的另一实施方式提供了与一分子种类共价连接的藻胆体的制剂。该分子种类选自配体、受体和信号发生分子。
在本发明的又一实施方式中，提供了藻胆体非共价结合在多特异性的多价配体或受体上的分离的藻胆体的制剂。
本发明的另一实施方式提供了分离的、具有完整功能的且固定在固相载体上的藻胆体的制剂。
本发明的还有一个实施方式提供了利用分析物与特异性结合配偶体(配体或受体)特异性结合的能力测定分析物的特异性结合测定方法。如此处所提供的，用藻胆体标记分析物的类似物或分析物的特异性结合配偶体中的一个。
本发明的这些和其他实施方式为本领域提供了用非同位素检测的方法测定分析物的极灵敏的手段。与酶标记物不同，藻胆体可定量检测而无需辅助的底物、色原、辅助因子或定时温育。最佳实施方式的详细描述
本发明的发现是，可使藻胆体稳定、缀合或修饰。以使它们在各种测定和形式中完整地使用。尤其由于藻胆体极大的分子量、消光系数和能量转移效率以及藻胆蛋白成分的高量子产额，藻胆体提供高灵敏度的标记。在藻胆体内的定向能量转移发生在从一个或多个“敏化种类”至末端受体。敏化种类是具有可激发第二(“受体”或“发射体”)荧光团的发射峰的第一荧光团。这些能量转移在均相特异性结合测定和包含固定化藻胆体的转导物中具有应用价值。
提供分离的和可溶性的稳定藻胆体的均相制剂的制备方法。藻胆体制剂的均相性可通过在1×g的条件下温育24小时不沉降来证明。溶解性可通过离心来评定。“可溶性藻胆体制剂”是指在1000×g的条件下离心5分钟后，55％以上的藻胆体仍留在上清液中。理想的是，65％、75％、85％、甚至90％以上的藻胆体在上述离心后仍留在上清液中，使用本发明的方法可达到这样的水平。通常，通过温和的交联处理，如使用甲醛或很低浓度的戊二醛等使藻胆体稳定化。也可使用其他中-、短-或零长度的交联剂。与天然的藻胆体相比，稳定的藻胆体即使在稀释的离子强度(＜0.5M)和蛋白质浓度(＜1mg/ml)的条件下仍稳定。此外，它们在丙三醇、蔗糖和聚乙二醇的存在下稳定。功能上完整的藻胆体在末端受体的波长时具有主要的发射峰。
通过用包括但不限于半胱氨酸、赖氨酸、谷氨酸和葡糖胺等的合适物质猝灭(quenching)稳定化反应，可往藻胆体中加入特殊的化学基团。这些化学基团可用于不同分子种类如受体、配体或信号发生分子与藻胆体的进一步偶合。还可用加入的官能团使藻胆体二聚化或多聚化，以用作稳定的可分离的复合物。
连接的分子种类可以但不必须通过加入的化学基团与藻胆体缀合。此外，可在稳定化反应的过程中，可将它们与甲醛或戊二醛等直接连接。还可通过不同的间隔臂将它们连接，以改变分子种类与藻胆体之间的空间和立体化学关系。配体包括但不限于兴奋剂、拮抗剂、半抗原、抗原、药物、激素递质、辅助因子、维生素、毒素、寡聚苷酸和将这些分子的任一个与第二个分子连接而成的缀合物。受体包括但不限于抗体、抗体片段、抗体模拟物、分子识别单位、粘着分子、可溶性受体、核酸、膜受体、细胞受体和药物受体。信号发生分子包括但不限于藻胆蛋白、染料分子、胶体、荧光团、酶、发光化合物、氧化或还原化合物，甚至其他藻胆体。
分子种类与藻胆体的连接可以是位点特异性的，即，与藻胆体的特定部分连接，以使本发明的集光性定向。这尤其可通过使用对藻胆体蛋白质成分中的一个具有特异性的多价受体，如抗体等而达到，多价受体含二个或多个与其配体的结合位点。在本发明中使用的多价受体可以是多特异性的，即，它们可含与二个或多个不同的配体结合的位点。因此，多特异性受体可用于将藻胆体与另一分子种类连接。还可通过蛋白质缀合领域公知的许多方法(参见本文引作参考的Tijssen1、Wong2和Pierce3以及其中的参考文献)将藻胆体与受体或配体共价连接。
1Tijssen，P.(1985).Practice and Theory of Enzyme Immunoassays.R.H.Burdon and P.H.van Knippenberg(Eds.)Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology，Volume 15，Elsevier，New York.
2Wong，S.S.(1991).Chemistry of Protein Coniugation and Crosslinking，CRC Press，Boca Raton.
3Pierce Catalog & Handbook(1994)Cross-linking/Protein Modification，pp.155-200.
还可将藻胆体固定化在制备的固体载体如微量滴定盘、微颗粒、高分子珠、高分子基质、合成膜、脂质体等上。所述固定化并不包括通过类囊体膜中的特异性受体而如生理学上所发生的藻胆体与类囊体膜的连接。首先，从藻类细胞中分离出藻胆体，然后将它们连接在固体载体上，或者，可在连接之前，将它们修饰、缀合或稳定化。连接可以是共价的或非共价的、特异性的或非特异性的。可将连接的方法最优化以使藻胆体较好地在固体表面上定位。可将单一类型的藻胆体蛋白成分，即连接蛋白或藻胆蛋白中的一个用作与固体载体的连接部分。就某些应用而言，可能最好将藻胆体以有序排列，如以网格或其他样式连接。
本发明的藻胆体尤其适合在特异性结合测定中使用。这些测定可以是免疫学测定、免疫组织化学、细胞计量学、细胞分选、配体或受体结合测定、蛋白质-蛋白质结合测定和蛋白质-核酸结合测定，甚至可以是核酸-核酸结合(杂交)测定。通常，将藻胆体用于标记参与测定的特异性结合配偶体中的一个。例如，可用藻胆体标记与需测定的分析物特异性结合的配体或受体。此外，可用藻胆体标记试剂分子，所述试剂分子是同分析物竞争与其特异性结合配偶体特异性结合的配体或受体。标记可以是直接的，即，将藻胆体连接在与分析物特异性结合或竞争的第一配体或受体上。此外，标记可以是间接的，即，将藻胆体连接在与第一配体或受体特异性结合的第二配体或受体上。藻胆体与特异性结合配偶体的连接可以是共价的或非共价的。藻胆体还可以是部分产生信号的体系，在所述体系中，其他荧光团在定向能量从藻胆体转移后即发出光。可在藻胆体与特异性结合配偶体连接之前将其稳定化，或者将其直接与特异性结合配偶体缀合。制备藻胆体的其他可选择的手段包括冷冻、冷冻-干燥和其他脱水方法。藻胆体的冷冻最好在蔗糖的存在下，在0.1-1M的浓度进行。可使用其他稳定剂，如糖、盐、聚合物和共溶剂。尤其有用的试剂包括海藻糖、山梨糖醇和葡聚糖。
为在特异性结合测定中使用，可一步法、二步法或多步法将藻胆体与配体、受体、和/或信号发生分子缀合。一步戊二醛法可有效和方便地进行藻胆体的依序稳定化和缀合而无需插入纯化步骤。
可使用本领域公知的任何测定形式，包括但不限于均相测定、非均相测定、竞争性测定和夹心测定。在均相测定中，二个结合配偶体(例如，配体和受体)的结合影响标记物的活性；不需要将结合的和未结合的试剂分离。在非均相测定中，需要将结合的试剂与游离的试剂分离以测定已发生的结合的量。这些测定的定量可用光度测定法、荧光测定法或光电子学方法进行。此外，可通过目测检查来得到定量结果。由于天然的藻胆体在常规的缀合和测定条件下自发地解离，必须在以大多数通常的测定形式使用之前将它们稳定化。
在非均相特异性结合测定中，反应混合物通过使液体介质同包含与特异性结合配偶体连接的藻胆体的标记缀合物接触而形成。形成所述标记缀合物的结合相和游离相。在二相中的标记缀合物的相对比率是液体介质中配体的存在和量的函数。然后将结合相和游离相分离。通过检测或测定结合相或游离相中的藻胆体来测定液体介质中的配体。
也可容易地进行均相特异性结合测定。在一优选的方法中，将藻胆体标记的配体或受体与第二荧光团标记的特异性结合配偶体合用。在藻胆体内的定向能量转移使它们在这些荧光能量转移测定中可用作有效的光子供体或受体。
基于藻胆体的测定可通过电化学方法和荧光测定方法来检测，提示“藻胆体电极”作为在测量电流的免疫传感器中通常使用的酶电极的替代物的用途。此外，藻胆体与非常明确的微电子器件(例如，光电极管、电荷藕合器件)的定向和紧密藕合可提供在亚微米级有效地进行光电子信号转导的手段。此处拟定的是微型“生物转导器”，如对来自固定化的结构定向的藻胆体的定向光能转移响应的光电转换器、晶体管、开关和放大器等。
本发明的可溶性的稳定藻胆体具有许多不需要与特异性结合配偶体缀合的用途。例如，它们可在稀释和灌流研究中用作灵敏的示踪剂和作为分析技术中的分子大小标准参照物。在一优选的实施方式中，可将它们用于检测可能危险的溢出物。可在其用于产生小于约百万分之10份的藻胆体最终浓度之前，将藻胆体与可能危险的物质混合。然后在危险物质从正常位置意外溢出或移出的情况下检测藻胆体。可检测的藻胆体的存在指示溢出的发生。
根据本发明，藻胆体是包含至少一个杆的藻胆蛋白和连接蛋白的自装配的复合物。本发明的藻胆体可由原核蓝细菌(蓝绿海藻)或真核红藻而得到。藻类可以是野生型的、突变体、杂交体或可表达藻胆体成分的基因重组体。藻类可由天然环境收集(野生的)或在人工控制的条件下培育。这些人工条件可以模拟天然环境，或者可将它们设计成诱导色适应，例如，调节藻胆体的组合物。人工条件可要求自养、兼养或异养生长。
可在细胞破碎之前原位稳定化之后或在细胞破碎后以膜结合的形式，从生产有机体中分离出藻胆体。此外，可在体外稳定化或缀合或固定化之前将藻胆体完整地分离出来。在另一操作模式中，可将藻胆蛋白和连接蛋白分离出来并在体外恢复以形成藻胆体。
包含在本发明中的稳定化方法包括共价以及非共价的手段。共价的方法包括交联和跨越至少二个藻胆体蛋白质成分的聚合物的多点连接。交联剂可以是零长度的(包含二个藻胆体基团的直接连接而无需插入间隔臂)或它们可包括各种长度的间隔臂。非共价的稳定化可通过使用盐和糖等共溶剂、与某些聚合物或多价受体的相互作用等基于亲和的相互作用、或冷冻或脱水等物理状态的变化来完成。
为得到藻胆体与其他分子种类的缀合物，可使用本领域公知的任何缀合方法。可使用直接连接或插入二级结构，如间隔臂或载体分子等。
可用共价键或非共价键的手段将藻胆体固定在固体载体上。非共价的方法包括被动吸附、基于亲和的方法、胶囊化、截留和可控沉积。固定化可产生结构有序的产物。可以特定的方式将藻胆体在固体载体上定位(例如，“向着核心增加(core up)”或“向着核心减少(core down)”)。此外，可确定固体载体上藻胆体之间的间隔或形成图案，例如，形成二维排列或网格。
本发明的特异性结合测定可以是定性的或定量的。可使用小分子(包含单个结合位点)或大分子(包含多个结合位点)作为分析物。确定结合测定结果的检测方式可以是目测检查法、光度测定法、荧光测定法或电化学方法。藻胆体分离
从大范围的单细胞藻类中分离藻胆体的一般方法业已有论述(例如，Gantt等，(1979)Plant Physiol.63：615-620)。可用Gantt和Lipschultz的方法(J.Cell Biol.54：313-324(1972))的改进法从红藻(例如，Prophyridiumcruentum)和蓝绿藻(例如，Anabaena variabilis、Spirulina platensis)中分离藻胆体。在最后的蔗糖梯度超离心步骤中，在SW27转子中使用6个35ml离心管即可方便地处理达24克湿重的生物量。藻胆体回收率在初始生物量的0.1-1.0％等级上。用梯度超离心法从红藻和蓝绿藻中分离藻胆体
可通过连续荧光照明将新培养或冷冻(-20℃或-70℃)的藻类在40-500L搅拌釜中自养培养并通过离心加以收集。Prophyridium cruentum(P.cruentum)可在20-22℃于含钠盐、Tadros Metals、Instant Ocean和杜氏藻属(Dunaliella)维生素的人工海水培养基(pH8.0)中生长。Anabaena variabilis可在25℃于含钠盐和钾盐、硫酸镁、氯化钙、柠檬酸铁铵和A5金属的双强度BG-11培养基(pH7.8)中生长。
除非另有说明，所有制备性步骤可在室温(20-23℃)于含0.05％叠氮化钠的0.75M磷酸钾缓冲液(KPi缓冲液，pH7.0-7.2)中进行。将24克(湿重)收集细胞重新悬浮在48ml KPi缓冲液中。然后加入PMSF(1mM)、苄脒(5mM)和DNA酶I(无RNA酶的10U/ul贮存液10ul)，以15ml的增量体积使悬浮液通过以1000-1250p.s.i运转的弗氏压碎器(Aminco公司产品)4次。加入Triton X-100(2％)，将破碎细胞混合物搅拌20分钟。通过使用SS34转子在Sorvall RC-5B冷冻超速离心机中以15,000rpm离心45分钟来除去颗粒物质。用注射器从飘浮的叶绿素部分下面取出上清液，将约9ml放置在含(从底层至顶层)均在0.75M PKi缓冲液中的2M蔗糖(4ml)、1M蔗糖(8ml)、0.5M蔗糖(7ml)和0.25M蔗糖(7ml)的6个缓冲了的蔗糖阶梯梯度的各层上。在SW27转子中将梯度系统以25,000rpm离心12-18小时。离心后，可辨别具有各种清晰度的绿色、棕色、棕红色、紫红色、紫色和澄清层(顶层至底层)。仅保留紫红色片条(杆和藻胆蛋白聚集物)和紫色片条(藻胆体)。用巴氏吸管吸出紫红色片条，合并后在2-8℃贮存。稳定和缀合的杆可从该部分制备，并通过色谱法进行纯化，然后固定化。从1.0M蔗糖层中取出紫色藻胆体片条，合并，用KPi缓冲液稀释4倍并用SS34转子以15,000rpm离心40分钟。将所得上清液与粒状沉淀(若有的话)分离，并用VTi50转子以30,000rpm离心2小时。迅速和小心地吸出最终的上清液，并将含藻胆体的沉淀重新悬浮在最小体积的KPi缓冲液中。可用Lowry等的方法(1951)测定蛋白质浓度。可以牛血清白蛋白作为具有蔗糖和Triton X-100干扰的适合对照的参照物，用福林苯酚试剂(J.Biol.Chem.193：265-275)进行蛋白质测定。用岛津UV-160型记录分光光度计测定吸收光谱。用与Compudyne PC联结的Spex FluoroMax荧光光度计于室温在4ml石英样品池中测定吸收光谱。
一般而言，通过在远端敏化藻胆蛋白的最大吸收激发藻胆体(例如，就P.cruentum B-PE而言，为545nm)，可得到藻胆体发射光谱。可用常规方法给出藻胆体的特征：1)每毫克蛋白质的峰值吸收(例如，P.cruentum为AU545/mg)，2)每确定浓度的荧光信号(例如，对10ng/ml完整的藻胆体而言，cps在Emax)，和3)一个或多个反映藻胆蛋白之间能量转移的效率的荧光比率(例如，作为APC/B-PE偶联的指数，P.cruentum为666/573nm)。无需梯度超离心的藻胆体大规模分离
用常规方法进行方便的、上规模的和低成本的藻胆体分离(例如，Gantt和Lipschultz(1972)，同上；Gantt等，(1979)，同上)由于需要梯度超离心而受到严重的限制。为能进行上规模的和经济的藻胆体生产，开发了从不同有机体中分离藻胆体而无需梯度超离心的方法。在以Anabaena variabilis为对象的那些方法的基础上形成的使用Triton X-100溶解和PEG沉淀的方法不能从其他有机体，尤其是不能从P.cruentum中产生完整的藻胆体。在除去Triton X-100和PEG的过程中需要另外的保护P.cruentum藻胆体的处理步骤。业已发现，蔗糖处理或甲醛处理均有效。下面归纳的是蔗糖处理方法，该方法经改进后已被确认对红藻门(例如，P.cruentum)和蓝藻门(例如，Anabaena variabilis、Spirulina platensis)均有效。通过选择不同的离心和转子组合，可容易地变化制备规模并可由此调节体积。
将细胞悬浮在0.75M KPi(pH6.8)中，比例为5ml/g湿重。加入PMSF和苄脒，使它们的最终浓度分别为1mM和5mM，并使悬浮液在1000-1250p.si通过弗氏压碎器3次。搅拌下，通过用含2％Triton X-100的0.75M KPi(pH6.8)处理20分钟，使膜关联的藻胆体溶解。用SS34转子在Sorvall RC-5B冷冻超速离心机中将破碎细胞制剂以15,000rpm离心20分钟，除去膜碎片和颗粒碎屑。通过从飘浮的叶绿素层下面吸取来收集上清液。弃去沉淀。往上清液中加入聚乙二醇8000，使其浓度达到15％(wt/vol)。搅拌混合物1小时并用SS34转子以15,000rpm离心20分钟。弃去上清液。通过在温和搅拌下加入含2M蔗糖的0.75M KPi缓冲液，直至其最终浓度达到1.5M蔗糖，使沉淀重新悬浮。加入蔗糖后30分钟，用0.75MKPi(pH6.8)将悬浮液稀释约4倍，并用VTi50转子在Beckman L8-M超离心机中以40,000rpm于20℃离心3小时。弃去上清液。将沉淀重新悬浮在最小体积的0.75M KPi(pH6.8)中，通过蛋白质、吸收和荧光测定(参见上面)给出特征，并根据藻胆体的来源将其冷藏贮存或在室温下贮存。藻胆体的稳定化
与已报道的研究(例如，Katoh(1988)Phycobilisome stability.In：Methods in Enzymology Vol.167，pp.313-318，Academic Press；和Gantt等，1979，同上)一致，分离出来的藻胆体显示不稳定，出现蛋白质浓度和离子强度下降。如在545nm激发的666/573nm荧光发射比率的浓度依赖性下降所显示的，藻胆体内能量转移在蛋白质(在约1mg/ml以下)或缓冲液(在约0.5M KPi以下)稀释后的数分钟内被破坏。
为能重复制备稳定的用藻胆体标记的配体和受体以在通常的特异性结合测定构型中使用，可先将藻胆体稳定化。稳定化方法包括但不限于下面讨论的那些：1)可通过藻胆体内(亚单位之间)的交联，最好通过使用在蛋白质修饰领域公知的短长度或零长度的二官能团试剂来进行共价稳定(例如，Wong，(1991)，Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking，CRC Press)。2)也可通过天然的或合成的聚合物，如碳水化合物、脂质、寡核苷酸、蛋白质、肽、聚氨基酸，以及氨基酸、核苷酸、糖或其他小的有机分子的无规或有规共聚物等的多位点连接来达到共价稳定。该藻胆体亚单位共价相互连接的方法可使用一步法或二步法技术来进行。在优选的二步法方案中，在步骤一中激活第一个反应物(藻胆体或桥连的聚合物)。除去多余的试剂后，在步骤二中将激活的反应物连接在第二个反应物的天然官能团上。3)可使用共溶剂、洗涤剂或其他使藻胆体在热动力学上不适宜地解离的缓冲液添加剂来达到非共价稳定。4)也可使用对跨越至少二个藻胆体亚单位的功能结合位点具有明确的亲和性的分子或分子组来进行非共价的基于亲和的稳定。可通过从由天然产生的、修饰的或合成的抗体或抗体片段、寡核苷酸、肽、蛋白质、凝集素、碳水化合物或小的有机分子的聚合物组成的组中随机筛选或组合的方法来选择具有适当亲和性的分子。
可通过使用短或中等链长的交联剂进行一步反应来使藻胆体稳定化。选择试剂和反应条件以使藻胆体内的交联速度大于藻胆体之间的聚合。中等链长的同二官能团的二醛、戊二醛(GA)、和短链长的单醛、甲醛(FA)在保护藻胆体免受稀释诱导的能量转移解偶联上均有效。使用GA而得到的藻胆体的最大稳定伴随有仅在离心或长期贮存后才变得明显的部分不溶。可通过GA和藻胆体浓度以及反应时间的共优化来使GA诱导的不溶减少至最小。此外，可调节条件以产生GA稳定的藻胆体，该藻胆体留在均相悬浮液中，但当以8000g离心2分钟时则完全沉淀。可通过在低GA/藻胆体质量比率(例如，0.027％GA/0.727％藻胆体)下的藻胆体依序处理以及随后的用缓冲了的GA稀释反应混合物以增加GA/藻胆体比率(例如，增加至0.10％GA/0.10％藻胆体)，来改善GA的稳定效果。与GA处理相比，可使用更短链长的交联剂(例如，FA)来得到最大效果的稳定化而不会出现溶解的藻胆体由于聚集或沉淀而损失的情况。
为测定稳定化和缀合方法对藻胆体制剂的大小分布和浮力密度的影响，评价反应前体和产物在与藻胆体分离中所用的相似的不连续蔗糖梯度中的作用。将用赖氨酸猝灭的、用GA稳定的藻胆体、未纯化的藻胆体-抗体缀合物和未修饰藻胆体各0.5mg加至由含2.0M、1.0M、0.5M和0.25M蔗糖的0.75M KPi(pH7.35)各2.5ml依序构成的10ml蔗糖梯度中。将梯度系统在70.1Ti转子中以50,000rpm离心20小时(18℃)。紫红色片条(杆和B-PE聚集物)出现在未修饰藻胆体梯度层上半部分，表明天然藻胆体在这些条件下出现一些破裂。与之相比，GA稳定的藻胆体和藻胆体-抗体缀合物梯度在1.5M蔗糖区域形成单一的片条。这些结果提示，1)GA处理成功地防止了藻胆体在超离心过程中解离，2)一步GA稳定/缀合法并不产生藻胆体或缀合物的无控制聚合，和3)稳定的藻胆体和缀合物在用此处所述的方法共价交联后仍可溶。将修饰藻胆体固定在乳胶微球体上
将用赖氨酸猝灭并通过凝胶色谱法纯化过的FA处理的藻胆体和藻胆体-抗体缀合物(修饰的藻胆体)用共价方法或被动吸附的方法固定在均匀的乳胶颗粒上。所有温育在搅拌下于室温进行。使用直径在0.03-1um之间的用荧光的或非荧光的羧酸酯修饰的乳胶微球体，使用的最终浓度为1-10mg/ml。
在微球体上的被动吸附可在100mM磷酸盐缓冲液(pH7.2)中以在20-200ug/mg之间的固定化率(μg蛋白质/mg颗粒)进行。通过在含150mM氯化钠的100mM KPi中以8000×g重复离心来洗涤修饰的藻胆体-乳胶悬浮液。
在一步法中使用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺(EDAC)在100mM MES中的溶液(pH6.8)以相同的蛋白质/颗粒比率进行共价固定化。搅拌下将修饰的藻胆体迅速拌入颗粒悬浮液中，让其反应1-2小时并通过离心进行洗涤。
为长期贮存，将固定化藻胆体用含1％FA的100mM KPi(pH7.4)进行后处理，并用赖氨酸猝灭，用氰基硼氢钠还原，然后用含150mM氯化钠和0.05％叠氮化钠的100mM KPi洗涤。抗原和抗体在顺磁颗粒上的固定化
按下述步骤在室温进行固定化。
在剧烈搅拌下于10mM磷酸钠溶液(NaPi；pH7.35)中以5-10mg/ml的颗粒浓度洗涤胺修饰的BioMag(Advanced Magnetics公司产品)5次并进行磁分离。最后一次洗涤完毕后，将湿饼重新悬浮在6.25％GA(Sigma公司产品)中，使其浓度达到25mg/ml，并在室温旋转3小时。将GA处理的颗粒在NaPi中洗涤6次。用含3-10mg/ml待固定化的蛋白质的PBS(pH7.2-7.4)使洗涤的、GA活化的颗粒重新悬浮，使蛋白质/BioMag比率为100-160ug/mg。添加BSA作为掺杂剂以调节BioMag颗粒上的免疫反应物的间隔。留下蛋白质溶液的等分试样以进行固定化效率的测定。将蛋白质-颗粒料浆在室温旋转16-24小时。磁分离颗粒。滗出上清液并留下以进行残余蛋白质的评估。用颗粒的再悬浮液将未反应的GA基团猝灭至约10mg/ml(在1M甘氨酸中，pH8.0)，接着旋转1小时。将猝灭颗粒在PBS(pH7.4)中洗涤2次，并通过在含2mg/ml BSA的PBS中旋转2-4小时进行封闭。将封闭颗粒在含1mg/ml BSA的PBS中洗涤3次，并重新悬浮至10mg/ml的颗粒浓度，然后在2-8℃贮存。在使用之前以约1mg/ml的颗粒浓度将使用等分试样在充分搅拌下于测定缓冲液中洗涤3次以防止固定化剂在长期贮存中受到浸提。将抗原和抗体固定在微量滴定孔上
按下述步骤用被动吸附法使蛋白质被动吸附至表面修饰的聚苯乙烯微量滴定板上。在临用之前，在硼硅酸盐玻璃管或50ml聚丙烯离心管中用50mM碳酸盐缓冲液(pH9.6)或10mM磷酸钠缓冲液(pH7.4)将抗原和抗体稀释至2-20ug/ml。将透明的聚丙烯ImmulonTM或白色的MicroliteTM2平底微量滴定板(Dynatech公司产品)以每孔100u1在37℃包被2小时，在室温(20-23℃)包被4小时或在2-8℃包被15-24小时。倾析滴定板，并通过往孔中注入洗涤缓冲液(含1mg/ml BSA的PBS(pH7.4))然后倾析来对滴定板进行一次洗涤。用200ul含2mg/ml BSA的PBS封闭孔1小时并用洗涤缓冲液再洗涤5次。
实施例实施例1：使用非共价藻胆体-抗体缀合物的特异性结合测定
由于未修饰的藻胆体在通常用于制备和使用特异性结合试剂的条件下迅速解离，非共价藻胆体缀合要求在操作的各步骤中对藻胆体浓度和反应条件给予充分的注意。搅拌下往在含2.5mg/ml BSA的0.6M KPi(pH7.2)中的P.cruentum藻胆体(5.6mg/ml)中滴加IgG2b亚型的鼠单克隆抗藻红蛋白抗体(Sigma Chemical Company产品)，使IgG2b/藻胆体的摩尔比率达到0.5-20。让反应在室温进行30分钟。通过用固定在顺磁颗粒上的山羊抗小鼠lgG2b抗体进行IgG2b-藻胆体复合物的特异性捕获来证明免疫缀合物的形成。将50ml BioMag-GAM IgG2b(30mg/ml，在含1％BSA的0.75MKPi中洗涤过)加至含200ug藻胆体的40ul缀合物混合物中。捕获剂添加完毕后，测定混合物含在含6.7mg/ml BSA的0.66M KPi中的2.2mg/ml藻胆体，并具有或不具有结合的IgG2b。将该混合物在室温温育30分钟并在磁性底座(Corning公司产品)上进行分离。用以0.75M KPi稀释40倍的测定上清液测定在545nm的吸收值。观察到吸收值随着IgG2b的增加而呈剂量依赖性下降，表明藻胆体-IgG2b复合物被BioMag-GAMIgG2b特异性结合。最大特异性结合(26％)在1-3ug/试验IgG2b出现，当高于该浓度时，由于固相容量不足，结合量下降。实施例2：使用甲醛制备稳定的修饰的藻胆体试剂
就作为检测剂的藻胆体的大多数应用而言，藻胆体必须在结构上保持完整(“非解离的”)。为在非均相特异性结合测定(其中，结合的和游离的种必须在测定之前完整地分离)中使用，必须使藻胆体稳定化以防止其在缀合、纯化、测定、产品制造、运输和贮存过程中自发性地解离。开发了共价稳定化方法以维持藻胆体的高能偶合和/或结构完整性而不危害溶解性。在小心地优化了的条件下使用交联剂以避免由于无控制聚合或电荷中和而出现沉淀。关键的优化参数包括交联剂类型和反应性、绝对和相对试剂以及藻胆体浓度、反应时间、pH、终止方法和纯化方法。以P.cruentum藻胆体为例说明的甲醛稳定化按下述步骤进行。
将分离的藻胆体在含0.05％叠氮化钠的0.75M KPi(pH7.2)中的蛋白质浓度调整至8.0mg/ml。搅拌下滴加10％体积的FA(11％，在0.75MKPi中)，使其终止浓度为1.0％。让反应混合物在室温静置18小时，然后用1ML-赖氨酸猝灭。为长期贮存，用氰基硼氢钠还原并通过用含150mM氯化钠和0.05％叠氮化钠的100mM KPi(pH7.2)平衡了的SepharoseCL-6B进行纯化。
藻胆体在稀释后的解离易感性通过以时间依赖性和剂量依赖性的方式进行了FA处理而得以防止。在进行吸收和荧光测定(545nm激发)之前，将在各种FA浓度处理了18小时的制剂在0.75M KPi(pH7.2)中分别以65ug/ml和0.6ug/ml温育2小时。
[FA](％)      AU545   荧光发射(@0.6ug/ml)                   比率
(×18小时)  (@65ug/ml)E666(cps×10-6)E573(cps×10-6)  E666/E573
0 FA对照      0.302        1.07           1.22               0.88
0.015         0.326        1.26           1.14               1.11
0.05          0.359        1.38           0.63               2.19
0.15          0.338        1.43           0.40               3.58
0.50          0.368        1.45           0.38               3.82
1.00          0.357        1.46           0.36               4.06
能量转移的最佳维持在1％FA中得到。用2％FA处理5小时可提供相等的保护。
需要相似的FA处理条件来对藻胆体进行稳定化以使其在还原性离子强度缓冲液中不解离。将FA处理的藻胆体用0.1M KPi稀释至约0.75ug/ml并在室温静置40小时。将为增加间隔用1％FA处理过的制剂的荧光数据归纳如下：
                 -荧光-
处理时间  (cps×106@0.75ug/ml)   比率
(小时)     E666      E573     E666/E573
0          0.45       6.25       0.07
2          1.88       1.02       1.84
5          2.06       1.00       2.06
18         2.31       0.91       2.54
为测定FA的稳定化作用是否伴随有交联的藻胆体的大的不溶性聚合物形成，通过离心评估FA诱导的沉淀。用浓度达3.0％的FA处理藻胆体。让反应物在室温静置2-18小时。通过对充分搅拌过的制剂的545nm吸收值与以8000×g离心2分钟后得到的上清液进行比较来评估可溶性的修饰的藻胆体的回收率。将FA处理过的制剂的回收百分率从未处理的对照值中减去，评估制剂的相对百分率。仅用高浓度的FA长期处理过的制剂产生显著的沉淀。[FA](％)  经下述时间处理后的回收率(％)经下述时间处理后的沉淀(相对％)
       2小时    5小时   16小时   2小时   5小时  16小时0 FA对照   95.7     96.0    95.4      0      0       00.5％      93.5     -       97.0      2.2    -       01.0％      93.7     96.6    94.6      2.0    0       0.82.0％      -        92.4    -         -      3.6     -3.0％      92.0     78.6    40.1      3.7    17.4    55.3
将FA修饰的藻胆体(2％FA×5小时)在室温静置18周，未观察到沉淀。此外，使用在搅拌的条件下和在不搅拌的条件下制得的FA处理的藻胆体，在回收率、缀合效率或免疫测定性能方面未出现明显差异。这些结果表明，用FA处理的藻胆体制剂具有可作为在蛋白质修饰、纯化、免疫测定和长期贮存中使用的均相溶液的性能。
按常规方法将FA稳定的藻胆体在室温贮存。将对照试样冷藏(2-8℃)以进行稳定性比较。分别用岛津UV-160型记录分光光度计和SpexFluoroMax荧光光度计测定FA稳定的藻胆体的吸收光谱和荧光光谱，给出它们的特性。实施例3：使用戊二醛制备稳定的修饰的藻胆体试剂
用含0.05％叠氮化钠的0.75M KPi(pH7.3)将藻胆体浓度调节至2-10mg/ml，最好约为8.0mg/ml。搅拌下用2分钟时间滴加10-50％体积的GA(0.2-1.0％，在0.75M KPi中)，或者用达3小时的时间进行3-6次增量添加。添加GA后，让反应混合物在室温静置1-18小时。在设计为用一步GA法进行缀合的优选的稳定化方案中，在加入含伯胺的配体(例如，抗原)或受体(例如，抗体)之前，将含7.27mg/ml藻胆体和0.023％GA的反应混合物在室温温育3小时。此外，加入过量的伯胺(例如，100mM赖氨酸、精氨酸、甘氨酸、半胱氨酸或谷氨酸)来终止GA稳定化反应。在一通过游离的醛以外的基团进行缀合或固定化之前进行GA稳定化的优选方案中，先用0.023％GA使藻胆体(7.27mg/ml)稳定化，然后加入5-10体积的0.05-0.15％GA温育1-4小时。加入100mM赖氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、谷氨酸或其他含伯胺的淬灭剂来终止反应。按测定未修饰的藻胆体和FA稳定的藻胆体的吸收光谱和荧光光谱的方法给出GA稳定的藻胆体的特性。来自P.cruentum的稳定的藻胆体具有再现性地符合下述规格：
吸收系数         ＞4AU545/mg(平均约5.0)
荧光信号(666nm)：＞104cps(在545nm激发，浓度为1ng/ml)
荧光比率：       666/573nm发射比率＞3.0(在545nm激发)
用下述方法滴定GA的稳定化效果。搅拌下往在0.75M KPi中的藻胆体滴加GA(0.03-3.0％，在0.75M KPi中)，产生含10mg/ml藻胆体和浓度在0.03-0.3％之间的GA的反应混合物。在室温反应12小时后，用100mM甘氨酸猝灭反应并在评估之前在室温贮存2周。
通过将所得制剂在0.75M KPi(pH7.2)中以10ug/ml温育不同的时间来测定稀释对稳定性的影响。将浓缩的藻胆体贮存物在时间为零时稀释至10ug/ml。在545nm进行激发，将稀释的制剂的发射光谱以各种时间间隔进行记录。荧光数据用E666/E573之比表示。未处理的对照物在时间零时的比率(稀释后30秒钟)平均为2.10，而用0.03％GA处理过的藻胆体则为3.21，表明在30秒钟内对照物有显著的稀释依赖性解离。
处理 经验结果 吸收：主要峰     AU545(10ug/ml)            稀释后E666/E573之比t＝1小时        t＝18小时         变化
0 GA对照 均相紫色液体 545＞565     0.052     1.04     0.70    -33％
0.003％GA 无显著变化 545＞565     0.049     1.31     0.98    -25％
0.01％GA 无显著变化 545＞565     0.051     2.05     1.72    -16％
0.03％GA 略混浊微沉淀 545＞565＞350     0.055     3.04     3.01    -1％
0.10％GA 由于凝集而混浊 545＞350     0.051     3.41     3.23    -5％
0.30％GA 沉淀变色 550＞350     0.033     未测定     未测定    未测定
用下述方法评定由GA的部分沉淀浓度而产生的还原性离子强度对稳定性的影响：监测对照物对0.03％GA处理过的藻胆体的荧光光谱，然后用各种去离子水和0.75M KPi的混合液稀释。0.03％GA处理的稳定化效果在稀释后1小时内显著出现：
              藻胆体发射(E666×10-7cps)
                     在545nm激发后
〔KPi〕  (mM)      未处理        GA处理
750                 1.68          1.69
250                 1.47          1.67
100                 1.11          1.68
30                  0.65(肩峰)    1.66
10                  0.50(无峰)    1.61
0.75(H2O稀释剂)    0.46(无峰)    1.56
GA(和FA)稳定化操作中的猝灭、还原和纯化步骤的详细情况由于不同的应用而异。醛处理的藻胆体的特性可通过使用不同氨基酸(例如，甘氨酸、D-精氨酸、L-赖氨酸)的猝灭反应而变化。此外，选择合适的淬灭剂可容易地导入新的化学基团(例如，选择L-半胱氨酸可导入巯基，选择葡糖胺可导入糖基)。例如，将藻胆体用0.023％GA处理、用10mML-半胱氨酸猝灭以及将其贮存以供下面使用或按下述方法进行还原、纯化和缀合。用30mM二硫赤藓糖醇将用半胱氨酸猝灭过、用GA处理过的藻胆体还原，然后通过用含100mM氯化钠的100mM KPi(pH7.4)平衡了的Sepharose CL-6B进行纯化。按已建立的方法使用在100mM磷酸钠(pH7.4)中的SPDP，以SPDP/链霉抗生物素蛋白摩尔比为10制备由吡啶基衍生的链霉抗生物素蛋白。通过在相同缓冲液中透析来纯化产物，并使其以2-10之间的链霉抗生物素蛋白/藻胆体摩尔比与巯基藻胆体反应。还原后，立即将巯基藻胆体加至缀合反应物中。用Sepharose CL-6B纯化链霉抗生物素蛋白-藻胆体缀合物。使用固定在作为捕获剂的顺磁颗粒上的生物素化BSA来证明生物素特异性结合。实施例4：藻胆体和修饰的藻胆体以脱水形式的贮存
作为省去试剂添加步骤的手段，对许多诊断试验和试剂盒而言，最好使用干试剂形式，以改善再现性和增加使用寿命。冷冻干燥是进行长期贮存时干燥试剂的常用方法。(参见例如，Gantt和Lipschultz“Phycobilisomes ofProphyridium cruentum”，J.Cell Biol.54：313-324(1972))；Canaani等，“Reassembly of Phycobilisomes from Allophycocyanin and a Phycocyanin-Phycoerythrin Complex”，FEBSLetters，115(2)：225-229，(1980))。对藻胆体和缀合物进行冷冻干燥以将藻胆体产品制成干试剂形式。
在0.75M KPi中以8.8-9.5mg/ml从P.cruentum中分离出藻胆体。将3-20ml的等分试样(45-190μg)快速冷冻并真空喷涂在微量滴定孔中。将干燥的藻胆体在室温贮存0-4周，重新悬浮，稀释，然后移至3ml小池中以进行吸收和荧光测定。使用贮存在缓冲液中的藻胆体(8.8-9.8mg/ml，在含0.05％叠氮化钠的0.75M Kpi中)作为参照物。
吸收不受影响、而荧光则略受影响。未修饰的藻胆体经受了冷冻干燥和4周的贮存而在吸收方面无变化。与未处理的对照物相比，经冷冻干燥和4周贮存后在荧光强度和666/573nm发射比均有15-20％减少。仅在时间0-1周之间在冻干制剂的荧光方面出现显著减少。在1-4周的贮存期间未观察到显著变化。
共价稳定的藻胆体(藻胆体-抗体缀合物)在含150mM氯化钠和0.05％叠氮化钠的100mM KPi中冷冻干燥后，即经受了实质性降解。在666nm的荧光发射减少约60％，666/573发射比减少5倍，吸收光谱受到干扰。在冷冻干燥之前加入1M蔗糖使降解的所有信号缓和。在补充了蔗糖的KPi中冷冻干燥4周后的缀合物与液体对照物或时间零的冻干缀合物相比，其荧光或吸收特性无显著变化。实施例5：藻胆体-抗体缀合物的制备
在室温(20-23℃)完成所有步骤。将从P.cruentum中分离出来的藻胆体用含叠氮化钠(2mM)的0.75M KPi(pH7.35)调整至8mg/ml的浓度。涡旋下用2分钟时间滴加10％体积的GA(0.25％)，使反应混合物含7.27mg/ml藻胆体和0.023％GA。让反应混合物静置2小时。涡旋下滴加亲和纯化的、Fc特异性的山羊抗小鼠IgG(GAM；OEM Concepts公司产品；2mg/ml，在10mM磷酸盐-含0.1％叠氮化钠的缓冲等渗盐水中)，使GAM/藻胆体的摩尔比为12∶1(128ug GAM/mg藻胆体)。4小时温育后，加入10％体积的1.1M L-赖氨酸以终止反应。旋转1小时以混合猝灭反应物。涡旋下将5％体积新制备的硼氢化钠(Aldrich公司产品；5mg/ml，在0.1mM氢氧化钠中)加至反应混合物中，5分钟后加入加入10％体积的相同溶液。将硼氢化物还原的反应混合物在2-8℃贮存直至进行纯化，纯化方法可以是超离心，或最好是使用用含150mM氯化钠和0.05％叠氮化钠的100mM KPi(pH7.35)平衡了的Sephacryl S300或SepharoseCL-6B(Pharmacia公司产品)进行的凝胶色谱法。
在下述基础上评估缀合物：回收率(作为藻胆体原料百分比的可溶性藻胆体缀合物的得率，将流程损失计算在内)；吸收系数(AU/mg)；荧光(浓度-归一化发射强度；峰比率)；在使用BioMag-MIgG作为固相捕获剂的竞争性荧光免疫测定中的特异性结合。
对超离心纯化的缀合物评定的可溶性物质的回收率在72-100％之间，平均约为90％。由单一批号藻胆体制得的十二个缀合物的E666/E573之比为2.92-3.55(平均值＝3.16)。归一化荧光强度(输入量固定时的E666)在缀合物浓度1ug/ml时平均为4.15×106cps。
用准过量的固相试剂(未拟用完全饱和的)举例说明缀合物与BioMag-MIgG高达60％的特异性结合。代表性的结合数据如下所示。将50μl藻胆体-GAM缀合物(80ug/ml)加至内容50ul缓冲液的试管中，所述缓冲液中含有或无MigG和100ul BioMag-MigG(1mg/试验)。涡旋试管并将其在室温温育60分钟。用磁分离后得到的160ul测定上清液在体积3ml的小池中测定荧光。
    MIgG(质量/试验)   上清液E666(cps×10-5)     结合(％)   MIgG抑制(cps×10-5)
    0      22.44     42.1       -
    1ng      27.91     28.0      5.47
    10ug      38.77     0.0      16.33
也使用GA以使GAM抗体与FA稳定的藻胆体缀合。用2％FA处理藻胆体4小时，然后用1ML-赖氨酸猝灭，用Sepharose CL-6B进行色谱法分离。用GA处理出现在空体积中的稳定的藻胆体，使其与抗体以12∶1的摩尔比反应过夜。赖氨酸猝灭、硼氢化物还原和纯化按GA缀合方法(见上)进行。所得缀合物的666/573比率在3.0以上，与BioMag-MigG的特异性结合为60％。以10mM KPi为主要成分的测定缓冲液以使用浓度在室温贮存过夜或以10mM KPi为主要成分的测定缓冲液贮存1周后，未发现荧光强度(E666)或免疫活性(％结合率)有显著减少。实施例6：使用光度检测的竞争性免疫测定
将50μl试样(具有或不具有各种浓度的小鼠免疫球蛋白(MIgG)的测定缓冲液)加至排列在具有侧拉式磁性底座的MagicTM分离器(Corning公司产品)上的12×75mm玻璃试管中。将100μl新洗过的BioMag-MIgG以0.3-10mg/ml的颗粒浓度加入。涡旋试管，将50ul藻胆体-GAM缀合物(GAM/藻胆体的摩尔比为1.5-18)以1-100ug/ml(5-500mAU/ml)之间的藻胆体浓度加入。涡旋反应混合物并在室温温育1小时。将MagicTM架在其磁性底座上放置5分钟，使颗粒分离。将测定上清液的160μl等分试样移至12×75mm玻璃试管中，然后用100mM KPi(pH7.35)稀释至1ml以进行光度测定或稀释至3ml以进行荧光测定。
下列数据显示了藻胆体-GAM缀合物和BioMag-MIgG的棋盘式共滴定，表明结合是固相限定的。结合百分比随着颗粒浓度的逐渐增加而显著上升。
         上清液吸收(mAU/ml)        在[BioMag]的结合(％)＝
  PB-GAM(ug/试验)   MIgGug/试验   BioMag＝30ug/试验   BioMag＝100ug/试验   BioMag＝300ug/试验 30ug/试验 100ug/试验 300ug/试验
    40     10     210     212     213
    40     0     210     200     173     0.0     4.7     18.8
    12     10     66     68     66
    12     0     63     54     44     4.5     20.6     33.3
    3     10     12     12     12
    3     0     12     10     4     0.0     16.7     66.7
在独立的试验中，在高10倍的缀合物浓度和固相的条件下使用时，缀合物结合显著增加。测得分析灵敏度在100ng/ml MIgG以下。实施例7：使用荧光检测的竞争性免疫测定
按实施例6的方法进行测定，所不同的是，改变试剂浓度以适应荧光测定。下列数据是使用250ng/试验的藻胆体-GAM缀合物和250μg/试验的BioMag-MIgG而得到的。用545nm激发记录荧光。
[MIgG](ng/试验)    E666(cps×10-5) ％结合   抑制(cps×10-5)
0                     3.74            24.3          -
1                     4.00            19.0         0.26
10                    4.39            11.1         0.65
100                   4.90            0.8          1.16
1000                  4.94            0.0          1.20实施例8：使用与固定抗原预结合的藻胆体的顶替测定
将洗过的BioMag-兔IgG(BioMag-RIgG)用藻胆体-GAM缀合物(GAM/藻胆体的摩尔比为5/1)在室温于混合下预处理2小时。将预结合的试剂混合物用测定缓冲液洗涤3次，然后重新悬浮，使其颗粒浓度为400ug/ml。将预结合试剂的500μl等分试样加至12×75mm试管中。往混合物中加入50ul试样(具有或不具有MIgG的缓冲液)，涡旋，在室温温育60分钟，由此进行测定。磁分离后，将500ul上清液移入2.5ml 0.1M Kpi中以进行荧光测定。
                   荧光(cps×10-5)
[MIgG](ng/试验)    E666   顶替    最大顶替(％)
0                  10.53    -
1                  10.72    0.19    6.1
10                 10.85    0.32    10.4
100                11.62    1.09    35.3
1000               12.46    1.93    62.5
10000              13.62    3.09    100.0
使用相同的预结合在RIgG包被的孔上的藻胆体-GAM缀合物(20ug/ml)进行微量滴定板测定，得到相似的结果。与顺磁颗粒相比，可顶替信号较小是由于微量滴定孔的固相结合容量较小。
               荧光(cps×10-5)[MIgG](ng/试验)    E666   顶替    最大顶替(％)
0              3.43    -
1              4.11    0.68    36.8
10             4.78    1.35    73.0
100            5.25    1.82    98.4
1000           5.28    1.85    100.0实施例9：夹心免疫测定
将MIgG与藻胆体-GAM缀合物预温育，然后用BioMag-兔抗小鼠抗体(BioMag-RAM)捕获藻胆体-GAM-MIgG复合物，由此进行反向夹心测定。该方案通过让初级(动态的)免疫反应在溶液中进行，改善测定动力学来使分析灵敏度最大化，并使空间约束最小化。此外，将藻胆体-GAM缀合物用作标记的第二抗体，以按下述方法检测与固定化的兔IgG(RIgG)结合的单克隆抗体。
将50μl缓冲液或小鼠抗兔抗体(MAR)与50ul藻胆体-GAM缀合物(20-80ug/ml)预温育30分钟。加入100ul颗粒浓度为10mg/ml的新洗过的BioMag-RIgG，捕获免疫复合物。在磁分离之前，让反应进行60分钟。稀释/将160ul测定上清液移至2.84ml 0.1M Kpi中后，进行荧光测定。〔MAR〕1ug/试验藻胆体-GAM 2ug/试验藻胆体-GAM 4ug/试验藻胆体-GAM(ng/试验) E666×10-6  结合(％)  E666×10-6结合(％)  E666×10- 结合(％)
                                                       6
0       1.483        0           2.400      0        4.147      0
0.1     1.392        6.1         2.322      3.3      4.196      0
1.0     1.142        23.0        1.786      25.6     3.430      17.3
10      0.823        44.5        1.289      46.3     2.107      49.2
100     0.697        53.0        0.992      58.7     1.709      58.8
1000    0.615        58.5        0.967      59.7     1.511      63.6实施例10：使用肉眼检测的基于微量滴定的免疫测定
竞争性测定：通过被动吸附的方法，用含2-20ug/ml MIgG的10mM磷酸钠(pH7.35)溶液将二个白色聚苯乙烯MicroliteTM微量滴定板(Dynatech公司产品)在2-8℃包被15小时。吸出上清液。将滴定孔与200ul封闭缓冲液(含100mM磷酸钾(pH7.35)、2mM叠氮化钠和2mg/mlBSA的10mM磷酸缓冲盐等渗溶液(PBS，pH7.4))在室温温育60分钟，然后用250ul洗涤缓冲液(含1mg/ml BSA的PBS)洗涤6次。最后一次洗涤后，将滴定板翻转在纸巾上并仔细擦干。往各滴定孔中加入50μl测定缓冲液(含100mM磷酸钾(pH7.35)、2mM叠氮化钠和1mg/ml BSA的PBS)或MIgG(10-1000ng/孔，在测定缓冲液中)，然后以0.5-10ug/孔的加入量加入50ul藻胆体-GAM。将滴定板在振荡下于室温温育1小时，倾析，在用测定缓冲液洗涤3次之前和之后进行检查。在下述条件下可用肉眼辨别作为在滴定孔底部和内下部淡紫红色包被物的与固定MIgG结合的藻胆体-GAM(洗涤滴定板之前和之后均可)：
1.MIgG包被物浓度＞0.5ug/孔；和
2.藻胆体-GAM缀合物＞1ug/孔；和
3.竞争的〔可溶性MIgG〕＜10ng/孔。
即使在藻胆体-GAM浓度最高的情况下，在洗过的滴定板中未出现肉眼可观察到的显著的非特异性结合(在1ug/孔可溶性MIgG的结合颜色)。可肉眼观察到的特异性结合(色差±1ug/孔MIgG)最显著地出现在用最高包被物和缀合物浓度(10-20ug/ml包被物×5-10ug/孔藻胆体-GAM)处理过的滴定孔中。在这些条件下，MIgG的目测检查极限是10-100ng/试验，与10-12-10-13摩尔/试验(约10-9M MIgG)一致。
夹心测定：用含2-20ug/ml亲和纯化的RAM(H+L)抗体的10mM磷酸钠(pH7.35)将白色聚苯乙烯MicroliteTM微量滴定板(Dynatech公司产品)在2-8℃包被15小时。吸出上清液，将滴定孔与200ul封闭缓冲液(与竞争性测定中使用的相同)在室温温育1小时，然后用250ul洗涤缓冲液(含1mg/ml BSA的PBS)洗涤6次。最后一次洗条后，将滴定板翻转在纸巾上并仔细擦干。往各滴定孔中加入100μl测定缓冲液或MIgG(10-1000ng/孔，在测定缓冲液中)，然后在室温温育1小时，吸出。用250ul测定缓冲液洗涤滴定孔3次。以0.5-10ug/孔的加入量加入100ul藻胆体-GAM，振荡下将滴定板在室温温育2小时，倾析，在用测定缓冲液洗涤3次之前和之后进行检查。在下述条件下，可在暴露于MIgG的滴定孔中用肉眼辨别出洗过的或未洗过的、结合的藻胆体-GAM：
1.RAM包被物浓度＞0.2ug/孔；和
2.〔MIgG〕＞10ng/孔；和
3.〔藻胆体-GAM〕在1.5-10ug/孔，取决于RAM和MIgG浓度。
在洗涤之前，与测定缓冲液比较的暴露于10ng/ml MIgG的滴定孔的肉眼辨别是勉勉强强的。洗涤仅使清晰度有少许改善。尚未有通过增加固相结合容量或缀合物浓度、选择亲和性更大的示踪抗体、变更测定方案或缓冲组合物、或确定在UV照明的条件下检查结合相的较佳条件来使免疫微量滴定分析的肉眼检测极限最优化。实施例11：使用肉眼检测的免疫色谱纤维素试纸
竞争性测定组合：按下述方法将MIgG共价固定在醛处理的修饰聚砜膜上的定域区带上。将有效孔径为0.8uM的UltrabindTMUS800无载体膜(Gelman Science公司产品)切成20cm×6cm切片。用刻度毛细移液管(Drummond Scientific公司产品)沿铅笔画出的中点与各切片交叉的纵线(离任一边3cm)以每直线厘米4ul的点滴量手工点滴MIgG(2-10mg/ml，在含0.1％叠氮化钠的10mM pH7.2磷酸缓冲盐等渗溶液(PBS)中)。风干30分钟后，在温和振荡下将膜在50ml由含1％BSA的10mM PBS(pH7.4)组成的封闭缓冲液中于室温温育1小时，用含0.1％BSA的100mlPBS(pH7.2)漂洗2次，然后风干30分钟。将漂洗、风干过的膜在振荡下于含0.2％吐温20的PBS(pH7.2)中洗涤1小时，然后让其在室温干燥过夜。
按下述方法将藻胆体-GAM缀合物加至MIgG修饰的膜上。将干的洗过的膜切片横向地切成1×6cm片条。然后将10ul藻胆体-GAM缀合物(2.5AU545/ml)加至1×6cm片条的在其一端与固定MIgG的中心横线的中间的1平方厘米上，所述藻胆体-GAM缀合物包含在含0.1M蔗糖的0.5MKPi(pH7.35)中的约0.5mg/ml稳定的P.cruentum藻胆体和10ug/ml免疫活性的GAM。使用之前，将缀合物处理过的片条风干30分钟。
使干燥片条的缀合物处理过的末端与缓冲液(含1mg/mlBSA的PBS(pH7.4))接触并让试样在毛细管作用下渗湿片条，由此对免疫色谱MIgG纤维素试纸进行评价。当流体前缘朝缓冲液处理过的片条的上面移动了3.5cm时(约10分钟)，在固定MIgG线(3cm)上出现淡紫红色条带并随着片条被缓冲液完全饱和(约20分钟)而颜色逐渐变浓。在暴露于含MIgG的缓冲液的片条中未出现条带，表明藻胆体-GAM与固定MIgG的结合被可溶性MIgG基本抑制。
在暗室中于长波长(365nm)紫外照明下进行的片条检查未能在MIgG处理过的纤维素试纸中发现定域藻胆体-GAM荧光。在缓冲液处理过的纤维素试纸中，结合在固定MIgG上的藻胆体-GAM呈现为以深蓝色背景反衬的亮红色的荧光条带。该荧光条带在将片条风干后消失。若在干的、缓冲液处理过的片条的可视条带上滴上水，则可观察到明亮的定域红色(藻胆体)和流动橘黄色(B-PE)荧光相，提示GA处理的藻胆体经过干燥和重新湿润而部分解离。在冷冻干燥之前和之后对藻胆体-GAM缀合物进行荧光测定评估，得到相似的结果。545nm激发下的666/573nm发射之比在经过干燥和恢复之后显著减小，提示荧光能量转移的明显不联接，除非用蔗糖或其他保护剂将缀合物预处理过。由于分离出来的B-PE是比APC(P.cruentum藻胆体的末端受体)更强的荧光团，在缀合物结合和检测步骤之间的藻胆体的解离提供了放大荧光信号和增加测定灵敏度的手段。
夹心测定组合：用基本上与制备竞争性纤维素试纸的方法相同的方法制备免疫测量用的MIgG纤维素试纸，所不同之处在于，用亲和纯化的RAM抗体((H+L链)特异性的；OEM Concepts公司产品)代替MIgG，固定在UltrabindTMUS800膜上。横向地横过1×6cm切片，每直线厘米点滴10μl RAM(2mg/ml)，然后将切片封闭，漂洗，洗涤并按与MIgG固定的膜相同的方法切成1×6cm片条。将10ul藻胆体-GAM缀合物(5.1AU545/ml)按与竞争性纤维素试纸相同的方法加至一端与固定RAM的中间，然后在使用之前将片条风干，所述藻胆体-GAM缀合物包含在含0.2M蔗糖的0.5M KPi(pH7.35)中的约1mg/ml稳定的P.cruentum藻胆体和20ug/ml免疫活性的GAM。
使缀合物处理过的末端与含或不含MIgG(1ug/ml)的PBS-BSA缓冲液接触并让试样在毛细管作用下使片条饱和(约20分钟)，由此对夹心MIgG纤维素试纸进行评价。淡紫红色条带清楚地形成在MIgG处理过的纤维素试纸中的固定RAM上，而缓冲液处理过的对照物上则没有。这些结果证明了可溶性藻胆体缀合物在免疫测量分析中的特异性结合，其检测极限在6×10-9M以下。

Claims (30)

1.分离的稳定的藻胆体的均相制剂，其特征在于，所述藻胆体在1×g的条件下24小时内不沉降。
2.如权利要求1所述的制剂，其特征在于，所述藻胆体是可溶性的，而且，在1000×g的条件下离心5分钟后，55％以上的藻胆体仍留在上清液中。
3.如权利要求1所述的制剂，其特征在于，所述藻胆体已通过共价连接所需化学部分而修饰过。
4.如权利要求1所述的制剂，其特征在于，所述藻胆体连接在分子种类上，所述分子种类选自配体、受体和信号发生分子。
5.如权利要求4所述的制剂，其特征在于，所述分子种类连接在一种类型的藻胆体蛋白质成分上。
6.如权利要求1所述的制剂，其特征在于，在丙三醇的存在下是稳定的。
7.如权利要求1所述的制剂，其特征在于，所述藻胆体对冷冻稳定。
8.如权利要求1所述的制剂，其特征在于，所述藻胆体对脱水稳定。
9.包含藻胆体缀合物的制剂，其特征在于，所述缀合物是共价连接在分子种类上的藻胆体，所述分子种类选自配体、受体和信号发生分子。
10.如权利要求9所述的制剂，其特征在于，所述藻胆体缀合物对冷冻稳定。
11.如权利要求9所述的制剂，其特征在于，所述藻胆体缀合物对脱水稳定。
12.如权利要求9所述的制剂，其特征在于，所述分子种类连接在一种类型的藻胆体蛋白质成分上。
13.非共价结合在多特异性配体或多特异性受体上的分离的藻胆体的制剂，其特征在于，所述配体或受体特异性地与所述藻胆体结合。
14.固定在固体载体上的分离的、功能上完整的藻胆体的制剂。
15.如权利要求14所述的制剂，其特征在于，所述藻胆体被稳定化。
16.如权利要求14所述的制剂，其特征在于，所述藻胆体与分子种类共价连接，所述分子种类选自配体、受体和信号发生分子。
17.如权利要求14所述的制剂，其特征在于，所述藻胆体以有序排列固定在固体载体上。
18.如权利要求14所述的制剂，其特征在于，所述藻胆体以其一种类型的蛋白质成分固定在固体载体上。
19.进行特异性结合测定的方法，其中，利用分析物与特异性结合配偶体特异性结合的能力对其进行测定，将测定成分可检测地进行标记，所述测定成分选自：特异性结合配偶体、具有与分析物相同化学个性的试剂分子、和具有与分析物相同结合特异性的试剂分子，其特征在于，使用包含藻胆体的信号发生系统作为可检测的标记。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述藻胆体连接在所述特异性结合配偶体上。
21.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述藻胆体连接在所述具有与分析物相同化学个性的试剂分子上。
22.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述藻胆体连接在所述与分析物具有相同结合特异性的试剂分子上。
23.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述藻胆体连接在与所述测定成分特异性结合的配体或受体上。
24.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述藻胆体非共价连接在所述测定成分上。
25.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述藻胆体共价连接在所述测定成分上。
26.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述藻胆体已稳定化。
27.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述测定是均相测定，其中，所述分析物与特异性结合配偶体的结合无需将未结合的特异性结合配偶体与结合的特异性结合配偶体分离即可测定。
28.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述信号发生系统还包含可在定向能量从所述藻胆体上转移后即可发出荧光的末端受体分子。
29.如权利要求19所述的方法，其特征在于，将所述藻胆体冻干以备用。
30.如权利要求19所述的方法，其特征在于，将所述藻胆体脱水以备用。
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