KR100452177B1 - 피코빌리좀,유도체및이의용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 민감한 모니터링 키트(즉, 혈액 오염을 위한), 특이적인 결합 검정(즉, 가시적, 광도계적 및 형광계적 면역검정) 및 광전자 장치(즉, 바이오센서, 광전기적 변환기)에서 강력한 효능의 표지로서, 변형된 피코빌리좀 또는 완전한 피코빌리좀을 사용하는 방법 및 조성물을 제공한다.

Description

피코빌리좀, 유도체 및 이의 용도
피코빌리좀(phycobilisome)은 남조류와 홍조류에서 주요 광 수거 안테나(light harvesting antennae)로서 작용하는 무색 폴리펩타이드와 피코빌리단백질의 복합체이다[참조: Gantt, (1975) "Phycobilisomes: light harvesting pigment complexes," BioScience 25:781-788]. 이러한 복합체의 작용적 통합성에 대한 주요 범주는, 이들이 피코빌리단백질 성분들간에 매우 효율적으로 에너지를 전달하는 것을 입증하는 것인데, 예를 들어, 포르피리듐 크루엔튬(Porphyridium cruentum) 피코빌리좀에 있어서는 피코에리트린(PE)로부터 피코시아닌(PC)으로 그리고 최종적으로는 알로피코시아닌(APC)으로 에너지를 전달한다. 무색 폴리펩타이드는 적절한 안정성과 에너지 전달을 위해 피코빌리좀내에서 피코빌리단백질을 조립하고 위치시키는데 관여한다.
상이한 유기체로부터의 피코빌리좀은 (1) 매우 높은 "복합체 분자량"(5 내지 20 x 106 달톤) 즉, 다중 분자를 포함하는 피코빌리좀 복합체 1몰의 중량; (2) 전자기 스펙트럼의 가시 범위에서 최대의 다중 흡수; (3) 높은 몰 흡수성(emax > 107M-1cm-1); (4) 하나 이상의 감작화 종으로부터 형광성일 수 있는 말단 수용체에 이르는 피코빌리단백질 성분중에서 효율적인(>90%) 직접적 진동 에너지; (5) 분리된 피코빌리단백질보다 큰 스토크 이동(Stoke's shift); (6) 피코빌리단백질 성분의 높은 양자 수율; (7) 수용성 완충액중에서 높은 가용성 및 (8) 알로피코시아닌을 포함하는 코어 구조를 포함하는 다수의 일반적인 특징을 공유한다.
분리된 피코빌리좀은 가장 양호한 조건하에서 유리 피코빌리단백질과 각종의 피코빌리단백질 복합체로 용이하게 분리된다. 저 이온 강도(<0.5M 포스페이트), 저 피코빌리좀 농도(<1mg/ml) 및 저온은 피코빌리좀이 분해되도록 한다[참조: Katoh, (1988) Methods in Enzymology 162:313-318; Gantt et al., (1979) Plant Physiology 63:615-620]. 조류의 동결 또한 피코빌리좀을 파괴시키는 것으로 보고되었다[참조: Gantt et al., (1972) Journal of Cell Biology 54:313-324].
형태학적으로 피코빌리좀은 "로드(rod)"라고 언급되는 정돈된 더미로 정렬된 올리고머성 피코빌리단백질 디스크의 복합 조립체이다. 일반적으로, 수개의 팔-형(arm-like) 로드는, 또한 로드로 구성되는 코어 조립체로부터 방사상으로 퍼져 있다. 상이한 유기체로부터의 피코빌리좀을 형태학적으로 및 입체화학적으로 다양하며, 상이한 수 및 유형의 피코빌리단백질 및 로드의 성분을 갖는다. 일반적으로, 주변 로드는 피코에리트로시아닌, 피코에리트린 및/또는 피코시아닌으로 구성되며, 코어는 알로피코시아닌으로 구성되어 있고 링커 단백질과 연합되어 있다.
피코빌리좀의 형광성 단백질 성분인, 분리된 피코빌리단백질은 면역검정에서 표지로 사용되어 왔다[참조: Stryer et al., U.S. 4,520,110 and Kronick et al. (1983) Clinical Chemistry 29:1582-1586]. 그러나, 완전한 피코빌리좀을 분리하고 조작하는데 있어서의 어려움으로 인하여, 당해 분야에서는 이러한 거대 분자 조립체가 유사하게 이용될 수 있음을 인지하지 못하였다. 피코빌리좀이 제공할 수 있는 시그날은 이론적으로 분리된 피코빌리단백질보다 훨씬 크기 때문에, 피코빌리좀이 수많은 검정 및 기타 적용 분야에 있어 검출 마커로서 사용될 수 있도록 당해 분야에서 피코빌리좀을 처리하는 방법이 요구되었다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 특이적 결합 검정을 위한 표지로써 유용한 가용성 피코빌리좀 제제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 리간드, 수용체 또는 기타 유용한 분자에 공유적으로 부착된 피코빌리좀을 포함하는 피코빌리좀 접합체의 제제를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 특이적인 결합 검정에 사용하기에 적합한 고정화된 피코빌리좀 제제를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 검출가능한 표지로써 피코빌리좀을 사용하여 검정을 수행하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 상기 및 기타 목적은 하나 기술한 하나 이상의 양태에 의해 제공된다. 본 발명의 한 양태에서는, 분리된 가용성의 안정화된 피코빌리좀의 균질한 제제가 제공된다. 피코빌리좀은 1xg에서 24시간내에 침강되지 않는다. 더우기, 1,000xg에서 5분간 원심분리시, 55% 이상의 피코빌리좀이 상층액중에 잔류한다.
본 발명의 다른 양태에 따라서, 분자 종에 공유적으로 부착된 피코빌리좀의 제제가 제공된다. 분자 종은 리간드, 수용체 및 시그날-생성 분자로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
본 발명의 다른 양태에서는, 피코빌리좀이 다특이적인, 다가 리간드 또는 수용체에 비공유적으로 결합되어 있는 분리된 피코빌리좀의 제제가 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에 따라서, 피코빌리좀이 고체 지지체상에 고정화되어 있는 분리된, 기능적으로 완전한 피코빌리좀의 제제가 제공된다.
본 발명의 다른 양태에 따라서, 분석물을 특이적인 결합 파트너(리간드 또는 수용체)에 특이적으로 결합하는 능력에 의해 측정하는 특이적인 결합 검정을 수행하는 방법이 제공된다. 본원에 제공된 것으로서, 피코빌리좀은 분석물의 동족체 또는 분석물의 특이적인 결합 파트너를 표지시키는데 사용된다.
본 발명의 상기 및 기타 양태는 분석물을 검정하기 위한 극도로 민감한 비동위원소적 검출 방법을 제공한다. 효소적 표지와는 달리, 피코빌리좀은 보조 물질, 색원체, 공인자 또는 정해진 항온처리없이 정량적으로 검출할 수 있다.
본 발명에 의해 피코빌리좀이 각종의 검정 및 체제에서 완전하게 사용될 수 있도록 피코빌리좀을 안정화시키거나, 접합시키거나 또는 변형시킬 수 있음이 밝혀졌다. 피코빌리좀은 특히, 이들의 극도로 높은 분자량, 흡광 계수 및 에너지 전달 효율과, 또한 피코빌리단백질 성분의 높은 양자 효율에 기인한 고 감도의 표지를 제공한다. 피코빌리좀내 직접적인 에너지 전달은 하나 이상의 "감작화 종"으로부터 말단 수용체로 일어난다. 감작화 종은 제 2("수용체" 또는 "방사체") 형광단을 여기할 수 있는 방사 피크를 갖는 제 1의 형광단이다. 이러한 에너지 전달은 고정화된 피코빌리좀을 포함하는 변환기 및 균질한 특이적 결합 검정에서 적용된다.
분리된 가용성의 안정화 피코빌리좀의 균질한 제제를 제조하는 방법이 제공된다. 피코빌리좀 제제의 균질성은 1xg에서 24시간 항온처리하는 동안 가라앉지 않는 것으로 증명될 수 있다. 가용성은 원심분리에 의해 추정할 수 없다. "가용성 피코빌리좀 제제"는 1,000xg에서 5분간 원심분리시, 55% 이상의 피코빌리좀이 상층액중에 잔류하는 것을 의미한다. 65%, 75%, 85% 및 심지어 90% 이상의 피코빌리좀이 이러한 원심분리후 상층액중에 잔류하는 것이 바람직하며, 이러한 수준은 본 발명의 방법을 사용하는 경우 가능하다. 통상적으로, 피코빌리좀은 포름알데하이드 또는 저 농도의 글루타르알데하이드와 같은 온화한 가교결합 처리에 의해 안정화된다. 기타 중간 길이, 짧은 길이 또는 길이가 없는 가교결합 시약을 또한 사용할 수 있다. 안정화된 피코빌리좀은 천연 피코빌리좀과 비교하여, 심지어 희석된 이온 농도(<0.5M) 및 단백질 농도(<1mg/ml)의 조건에서도 안정하다. 또한, 이들은 글리세롤, 슈크로즈 및 폴리에틸렌 글리콜의 존재하에서 안정하다. 기능적으로 완전한 피코빌리좀은 말단 수용체의 파장에서 주요 방사 피크를 갖는다.
시스테인, 라이신, 글루탐산, 글루코스아민 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 적합한 물질로 안정화 반응을 퀀칭시킴에 의해 특이적인 화학 그룹을 피코빌리좀에 가할 수 있다. 이러한 화학 그룹은 수용체, 리간드 또는 시그날-생성 분자와 같은 개개의 분자 종을 피코빌리좀에 추가로 커플링시키는데 유용할 수 있다. 가해진 기능성 그룹은 또한 안정화된 분리가능한 복합체로서 사용하기 위해 피코빌리좀을 이량체화하거나 중합시키는데 사용할 수 있다.
부착된 분자 종은, 반드시는 아니지만, 가해진 화학 그룹을 통해 피코빌리좀에 접합될 수 있다. 또한, 이들은 포름알데하이드 또는 글루타르알데하이드를 사용하는 안정화 반응동안에 직접 부착시킬 수 있다. 이들은 또한 상이한 스페이서 암을 경유해 부착시킴으로써 분자 종과 피코빌리좀간의 공간적 또는 입체화학적 관계를 변경시킬 수 있다. 리간드는 효능제, 길항제, 합텐, 항체, 약물, 호르몬 전달자, 보조 인자, 비타민, 독소, 올리고뉴클레오타이드 및 제 2의 분자에 이러한 분자를 부착시킴에 의해 형성된 접합체를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 수용체는 항체, 항체 단편, 항체 모사체, 분자 인지 단위, 접착 분자, 가용성 수용체, 핵산, 막 수용체, 세포 수용체 및 약물 수용체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 시그날-생성 분자는 피코빌리단백질, 염료 분자, 콜로이드, 형광단, 효소, 발광 화합물, 산화 및 환원 화합물 및 심지어 기타 피코빌리좀을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
피코빌리좀에 대한 분자종의 부착은 부위 즉 피코빌리좀의 특수 부위에 대해 부위-특이적이어서, 본 발명의 광 수집 특성을 정확하게 확인할 수 있다. 이것은 특히, 피코빌리좀의 성분 단백질중 하나에 대해 특이적인 항체와 같은 다가 수용체를 사용하여 달성할 수 있다. 다가 수용체는 이러한 리간드에 대해 2개 이상의 결합 부위를 포함한다. 본 발명중에 사용된 다가 수용체는 다특이적일 수 있으며, 따라서, 이들은 2개 이상의 명확한 리간드에 대한 결합 부위를 포함할 수 있다. 즉 다특이적 수용체를 사용하여 분자의 다른 종에 피코빌리좀을 결합시킬 수 있다. 피코빌리좀은 또한 단백질 접합 분야에 잘 공지된 다수의 방법으로 수용체 또는 리간드에 공유 부착시킬 수 있다(참조: Tijssen, P. (1985), Practice and Theory of Enzyme Immunoassays. R. H. Burdon and P.H. van Knippenberg (Eds.) Laboratory Techniques in biochemistry and Molecular Biology, Volume 15, Elsevier, New York; Wong, S.S. (1991). Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking, CRC Press, Boca Raton; 및 Pierce Catalog & Handbook (1994) Cross-linking/Protein Modification, pp. 155-200, 이들 문헌은 본원에 참조로 인용되었다].
피코빌리좀은 또한 미세역가 디쉬, 미세입자, 중합체성 비드, 중합체 매트릭스, 합성 막, 리포좀 등과 같은 제조된 고체 지지체에 고정화시킬 수 있다. 이러한 고정화는 틸라코이드 막내에 특이적인 수용체를 경유하여 생리학적으로 일어나는 경우와 같이 틸라코이드 막에 피코빌리좀을 부착시키는 것을 포함하지 않는다. 피코빌리좀은 우선 조류 세포로부터 분리된 후 고체 지지체에 부착되거나, 이들은 부착전에 변형되거나, 접합되거나 또는 안정화될 수 있다. 이러한 부착은 공유적 또는 비공유적, 특이적 또는 비특이적일 수 있다. 부착 방법은 고체 표면에 대해 피코빌리좀의 바람직한 배향이 이루어지도록 최적화시킬 수 있다. 단일 유형의 피코빌리좀 단백질 성분, 즉 링커 단백질 또는 피코빌리단백질을 고체 지지체에 대한 부착 잔기로써 사용할 수 있다. 일부 적용에 있어서, 격자 또는 기타 패턴에서와 같은 정렬된 배열로써 피코빌리좀을 부착시킴이 바람직할 수 있다.
본 발명의 피코빌리좀은 특이적 결합 검정에서 사용하기에 매우 적합하다. 이것은 면역학적 검정, 면역조직화학, 혈구계산, 세포 분류, 리간드- 또는 수용체-결합 검정, 단백질-단백질 결합 검정, 단백질-핵산 결합 검정 및 심지어, 핵산-핵산 결합(하이브리드화) 검정일 수 있다. 피코빌리좀은 통상적으로 검정중에 포함된 특이적 결합 파트너중 하나를 표지하는데 사용된다. 예를 들어, 피코빌리좀을 사용하여 리간드 또는 검정할 분석물에 특이적으로 결합하는 수용체를 표지할 수 있다. 또한, 피코빌리좀을 사용하여 특이적인 결합 파트너에 특이적으로 결합하기 위해 분석물과 경쟁하는 수용체 또는 리간드인 시약 분자를 표지할 수 있다. 표지화는 직접적일 수 있거나(여기서, 피코빌리좀은, 분석물에 특이적으로 결합하거나 이와 경쟁하는 수용체 또는 제 1 리간드에 부착된다), 달리는, 표지화는 간접적일 수 있다(여기서, 피코빌리좀은 제 1 리간드 또는 수용체에 특이적으로 결합하는 수용체 또는 제 2 리간드에 부착된다). 특이적인 결합 파트너에 대한 피코빌리좀의 부착은 공유결합이거나 비공유결합일 수 있다. 피코빌리좀은 또한, 형광단이 피코빌리좀으로부터 직접적인 에너지의 전달시 빛을 방사하는 시그날-생성 시스템의 일부일 수 있다. 피코빌리좀은 특이적인 결합 파트너에 부착시키기 전에 안정화시키거나 이에 직접 접합시킬 수 있다. 피코빌리좀을 제조하는 다른 방법은 동결, 동결-건조 및 탈수의 기타 방법을 포함한다. 피코빌리좀의 동결은 0.1 내지 1M 농도의 슈크로즈 존재하에 수행하는 것이 바람직하다. 슈가, 염, 중합체 및 공용매와 같은 기타 안정화제를 사용할 수 있다. 특히 유용한 제제는 트레할로즈, 솔비톨 및 덱스트란이다.
특이적인 결합 검정에 사용하기 위해서는, 피코빌리좀을 1 단계, 2 단계 또는 다중 단계의 방법에 의해 리간드, 수용체 및/또는 시그날-생성 분자에 접합시킬 수 있다. 1 단계 글루타르알데하이드 방법이 중간 중간의 정제 단계없이 피코빌리좀을 연속적으로 안정화시키고 접합시키는데 효율적이고 편리함이 입증되었다.
동종 검정, 이종 검정, 경쟁적 검정 및 샌드위치 검정을 포함하는, 당해 분야에 공지된 어떠한 검정 방식도 제한 없이 이용될 수 있다. 동종 검정에서는 2개의 결합 파트너(즉, 리간드 및 수용체)의 결합이 표지의 활성에 영향을 미치며, 결합되거나 비결합된 시약을 분리할 필요가 없다. 이종 검정에서는, 결합된 시약과 유리된 시약의 분리가 발생한 결합의 양을 측정하는데 요구된다. 이러한 검정의 정량은 광도분석, 형광분석 또는 광전자공학적 수단에 의해 달성할 수 있다. 달리는, 가시적 관찰에 의해 정량적 결과를 수득할 수 있다. 천연의 피코빌리좀은 일정한 접합 및 검정 조건하에서 자발적으로 분해되기 때문에, 이들은 대부분의 통상적인 검정 방식에서 사용하기 전에 안정화되어야 한다.
이종의 특이적 결합 검정에 있어서는, 액체 매질과 특이적인 결합 파트너에 부착된 피코빌리좀을 포함하는 표지된 접합체와 접촉시킴에 의해 반응 혼합물을 형성시킨다. 상기 표지된 접합체의 결합된 상과 유리된 상이 형성된다. 2개 상중 표지된 접합체의 상대적인 비율은 리간드 매질중 리간드의 존재 및 양의 함수이다. 다음 결합된 상과 유리된 상을 분리한다. 액체 매질중에서의 리간드는 결합된 상또는 유리된 상중에서 피코빌리좀을 검출하거나 측정함으로써 결정한다.
동종 특이적인 결합 검정은 또한 용이하게 수행할 수 있다. 바람직한 방법에서는, 피코빌리좀-표지된 리간드 또는 수용체를 제 2의 형광단-표지된 특이적인 결합 파트너와 함께 사용한다. 피코빌리좀내 직접적인 에너지 전달은 이러한 형광성 에너지 전달 검정에서 효과적인 양성자 공여체 또는 수용체로서의 이들의 용도를 가능케한다.
피코빌리좀-기준한 검정은 전자화학적으로 및 형광분석적으로 검출할 수 있으며, 이는 전류 면역센서중에 일반적으로 사용된 효소 전극에 대한 대안으로서 "피코빌리좀 전극"의 용도를 제시한다. 또한, 잘 확립된 미세전극 장치(즉, 광전 다이오드, 전하-커플링된 장치)에 대한 피코빌리좀의 직접적이고 치밀한 커플링은 아마이크론 단위의 효율적인 광전자 신호 변환을 위한 수단을 제공할 수 있다. 본원에 의해 고정화된, 구조적으로 배향된 피코빌리좀으로부터 직접적인 빛 에너지 전달에 대해 반응성인 광전기적 변환기, 트랜지스터(transistor), 스위치 및 증폭기와 같은 미세축소된 "생변환기"가 고려된다.
본 발명의 가용성의 안정화된 피코빌리좀은 특이적인 결합 파트너에 대한 접합을 필요로 하지 않는 다수의 용도를 갖는다. 예를 들어, 이들은 희석 및 관류 연구를 위한 민감성 트레이서로서 및 분석 기술을 위한 분자 크기 마커로서 사용될 수 있다. 바람직한 양태에서, 이들은 잠재적으로 위험한 유출액을 검출하는데 사용할 수 있다. 피코빌리좀을 사용하기 전에 잠재적으로 위험한 물질과 혼합하여 약 10ppm 미만의 피코빌리좀의 최종 농도를 수득한다. 다음 피코빌리좀을 위험한 물질이 갑자기 엎질러지거나 또는 이의 적절한 위치에서 제거되는 경우에 검출할 수 있다. 검출가능한 피코빌리좀의 존재는 유출액이 존재함을 나타낸다.
본 발명에 따른 피코빌리좀은 하나 이상의 로드를 포함하는 링커 단백질과 피코빌리단백질의 자가-조립 복합체이다. 본 발명의 피코빌리좀은 원핵세포성 시아노박테리아(녹조류) 또는 진핵세포성 홍조류로부터 수득될 수 있다. 조류는 피코빌리좀 성분을 발현할 수 있는 야생형, 돌연변이체, 하이브리드 또는 유전적 재조합체일 수 있다. 조류는 천연 환경으로부터 수거되거나(야생형) 또는 인공적으로 조절된 환경하에 성장된다. 이러한 인공적 환경은 천연 환경을 모사할 수 있거나 또는 염색체적 변화를 유발하도록, 예를 들면, 피코빌리좀의 조성을 변화시키도록 설계될 수 있다. 인공 조건은 독립영양, 혼합영양 또는 유기영양적 성장을 필요로 할 수 있다.
피코빌리좀은 세포 파괴 또는 막-결합된 형태에 이은 세포 파괴전에 원위치 안정화된 후 생성 유기체로부터 분리될 수 있다. 달리는, 피코빌리좀을 시험관내에서 안정화시키거나, 접합시키거나 또는 고정화시키기 전에 완전히 분리할 수 있다. 또 다른 작동 모드에서는, 피코빌리단백질 및 링커 단백질을 분리하여 시험관내에서 재구성함으로써 피코빌리좀을 형성할 수 있다.
본 발명에 포함되는 안정화 방법은 공유결합 및 비공유결합을 포함한다. 공유결합 방법은 2개 이상의 피코빌리좀 성분 단백질에 확장되어 있는 중합체를 가교결합시키고 다중-부착시키는 것을 포함한다. 가교결합제는 길이가 없거나(스페이서 원자의 관여 없이 2개의 피코빌리좀 그룹이 직접 부착된 것 포함) 또는 각종 길이의 스페이서 암을 포함할 수 있다. 비 공유결합 안정화는 염 및 슈가와 같은 공용매, 특정의 중합체 또는 다가 수용체를 사용하는 것과 같은 친화성 기초한 상호작용 또는 해동 또는 탈수와 같은 물리적 상태에서의 변화를 동반할 수 있다.
피코빌리좀을 다른 분자 중에 접합시키기 위해서는, 당해 분야에 공지된 어떠한 접합 방법도 사용 가능하다. 직접적인 부착을 사용하거나 스페이서 암 또는 담체 분자와 같은 2차 구조물을 삽입시킬 수 있다.
고체 지지체에 대한 피코빌리좀의 고정화는 공유결합 또는 비공유결합에 의해 달성할 수 있다. 비공유결합 방법은 수동적 흡착, 친화성 기초한 방법, 봉입, 포획 및 조절된 침착을 포함한다. 고정화로 구조적으로 정렬된 생성물을 수득할 수 있다. 피코빌리좀은 고체 지지체에 대하여 특수한 방식[즉, "코어 엎(core up)" 및 "코어 다운(core down)"]으로 배향될 수 있다. 달리는 고체 지지체상의 피코빌리좀들간의 공간을 정의하거나 패턴화하여 예를 들면, 2차원적 배열 또는 격자를 형성할 수 있다.
본 발명에 따른 특이적 결합 검정은 정량적 또는 정성적일 수 있다. 소 분자(단일 결합 부위 포함) 또는 거대 분자(1개 이상의 결합 부위 포함)를 분석물로써 사용할 수 있다. 결합 검정의 결과를 측정하기 위한 검출 수단은 가시적 관측, 광도측정, 형광측정 또는 전기화학 방법일 수 있다.
피코빌리좀 분리
광범위한 단세포 조류로부터 피코빌리좀을 분리하기 위한 일반적인 방법은 기술되어 있다[참조: Gantt et al. (1979) Plant Physiol. 63: 615-620]. 피코빌리좀은 간트 및 립스휼츠의 방법으로부터 변형된 방법[참조: Gantt and Lipschultz(1972) J. Cell Biol. 54:313-324]에 의해 홍조류(예: Porphyridium cruentum) 및 녹조류(예: Anabaena variabilis, Spirulina platensis)로부터 분리될 수 있다. 슈크로즈 구배 원심분리의 최종 단계를 위하여 SW27 로터내 6개의 원심분리 튜브를 사용하여 24g 이하의 습윤 질량의 생물량을 편리하게 취급할 수 있다. 피코빌리좀의 회수는 초기 생물량의 0.1 내지 1.0% 정도이다.
구배 초원심분리에 의한 홍조류 및 녹조류로부터 피코빌리좀의 분리
신선하게 배양되거나 동결된(-20℃ 또는 -70℃) 조류를 40 내지 500L의 교반된 탱크 중에서 연속 형광 조사하에 독립 영양적으로 배양시키고 원심분리하여 수거한다. 포르피리듐 크루엔튬(P. cruentum)을 나트륨 염, 타드로스 메탈, 인스탄트 오션 및 두날리엘라 비타민을 함유하는 인공 해수 매질(pH 8.0) 중에서 20 내지 22℃에서 성장시킬 수 있다. 아나바에나 바리아빌리스를 나트륨 및 칼륨 염, 황산마그네슘, 염화칼슘, 시트르산, 철 암모늄 시트레이트 및 A5 메탈(pH 7.8)을 함유하는 2중 농도 BG-11 배지중에서 25℃에서 성장시킬 수 있다.
달리 언급하지 않는 한, 모든 제조 단계는 0.05% 나트륨 아지드(KPi 완충액)를 함유하는 0.75M 인산칼륨(pH 7.0 내지 7.2) 중에서 실온에서 수행할 수 있다. 패킹된 세포 24g(습윤 중량)을 48mL KPi 완충액중에 재현탁시킨다. 이어서, PMSF(1mM), 벤즈아미딘(5mM) 및 DNase I(10μ /㎕에서 RNase-유리된 스톡 10㎕)를 가하고 현탁액을 1000 내지 1250p.s.i에서 작동하는 프렌치 압력 셀(Amicon)을 통해 15ml 증분으로 4회 통과시킨다. 트리톤 X-100(2%)를 가하고 파괴된 세포 혼합물을 20분 동안 교반한다. 입상 물질을 SS34 로터를 사용하는 소르발 RC-5B 레프리저레이티드 슈퍼스피드 센트리퓨즈 속에서 15,000rpm으로 45분 동안 원심분리하여 제거한다. 상층액을 부유하는 클로로필 분획 하부로부터 주사기를 사용하여 회수하고, 대략 9ml를 모두 0.75M KPi중의 2M 슈크로즈(4ml), 1M 슈크로즈(8ml), 0.5M 슈크로즈(7ml) 및 0.25M 슈크로즈(7ml)를 함유하는(하단에서 상단까지) 6개의 완충된 슈크로즈 단계 구배 각각에 층으로 만든다. 구배들을 SW27 로터 중에서 25,000rpm으로 12 내지 18시간 동안 원심분리한다. 원심분리한 후에, 녹색, 갈색, 갈적색, 자적색, 자주색 및 투명 층(상부에서 하부로)은 재용해의 변화로써 구별할 수 있다. 자적색(로드 및 피코빌리단백질 응집체) 및 자주색(피코빌리좀) 밴드만이 보유된다. 자적색 밴드는 파스퇴르 피펫을 사용하여 흡입 여과하여 회수하고, 풀링한 다음 2 내지 8℃에서 저장한다. 안정화되고 접합된 로드를 이러한 분획으로부터 제조하고, 겔 크로마토그래피로 정제한 다음, 고정화할 수 있다. 1.0M 슈크로즈 층중의 자주색 피코빌리좀 밴드를 회수하고, 풀링하고 KPi 완충제로 4배 희석한 다음 SS34 로터 중에서 15,000rpm으로 40분 동안 원심분리한다. 생성된 상층액을 펠렛화된 침전물(존재하는 경우)로부터 회수하고 VTi50 로터중에서 30,000rpm으로 2시간 동안 원심분리한다. 최종 상층액을 신속하고 조심스럽게 흡입시키고, 피코빌리좀 함유 펠렛을 최소 용적의 KPi 완충제중에 재현탁시킨다. 로우리 등의 방법(1951)을 사용하여 단백질 함량을 측정할 수 있다. 단백질 측정은 슈크로즈 및 트리톤 X-100 간섭에 대한 적합한 대조를 갖는 표준으로서 소 혈청 알부민을 사용하는 폴리 페놀 시약(참조: J. Bio. Chem. 193:265-275)를 사용하여 수행한다. 시마즈 모델 UV-160 기록용 분광광도계를 사용하여 흡광도 스펙트럼을 측정한다. 형광 스펙트럼은 컴퓨다인 PC에 커플링된 스펙스 플루오로멕스 불소측정기를 사용하여 4ml 석영 쿠베트 속에서 실온에서 기록한다.
일반적으로, 말단 민감성 피코빌리단백질(예: 피. 크루엔툼 B-PE의 경우, 545nm)의 최대 흡수에서 피코빌리좀을 여기시킴으로써 피코빌리좀 방사 스펙트럼을 수득할 수 있다. 피코빌리좀은 1) 단백질 mg당 피크 흡수(예: 피. 크루엔툼의 경우 AU545/mg), 2) 정해진 농도당 형광 신호(예: 10ng/ml에서 완전한 피코빌리좀에 대한 Emax에서의 cps) 및 3) 내부 피코빌리단백질 에너지 이동의 효율을 반영하는 하나 이상의 형광 비(예: APC/B-PE 커플링 지수로써 피. 크루엔툼에 대한 666/573nm 방사)로 통상적으로 특성화할 수 있다.
구배 초원심분리를 사용하지 않는 피코빌리좀의 대량 분리
통상적인 방법[참조: Gantt and Lipschultz(1972) 상기 참조, Gantt et al(1979) 상기 참조]에 의한 피코빌리좀 분리의 편리성, 스케일 및 비용 효율성은 구배 초원심분리에 의해 매우 한정된다. 피코빌리좀을 대량으로 경제적으로 생산하기 위하여, 구배 초원심분리하지 않고 상이한 유기체로부터 피코빌리좀을 분리하는 방법이 개발되었다. 트리톤 X-100 용해 및 PEG 침전을 사용하는 아나베나 배리어빌리스에 대한 것을 기본으로 하는 방법은 기타 유기체, 특히 피. 크루엔툼으로부터 완전한 피코빌리좀을 생성하지 못한다. 트리톤 X-100 및 PEC의 제거 동안에 피. 크루엔툼을 보호하기 위한 추가의 단계가 필요하다. 슈크로즈 처리 또는 포름알데히드 처리 모두 효과적인 것으로 밝혀졌다. 다음에 요약한 것은 로도파이트(예: 피. 크루엔툼) 및 시아노파이트(예: 아나베나 바리아빌리스, 스피룰리나 플라텐시스) 모두에 대하여 변형시켜 적합하게 만든 슈크로즈 처리 방법이다. 제조 스케일은 상이한 원심분리 및 로터 조합을 선택하고 이에 따라 용적을 조정함으로써 용이하게 변화시킬 수 있다.
세포를 습윤 중량g당 5ml 0.75M KPi(pH 6.8) 중에 현탁시킨다. PMSF 및 벤즈아미딘을 각각 1mM 및 5mM의 최종 농도로 가한 다음, 현탁액을 1000 내지 1250p.s.i.에서 프렌치 압력 셀을 통해 3회 통과시킨다. 막 혼합된 피코빌리좀을 교반하면서 20분 동안 0.75M KPi(pH 6.8) 중의 2% 트리톤 X-100으로 20분 동안 처리하여 용해시킨다. 파괴된 세포 제제를 SS34 로터를 사용하는 소르발 RC-5B 레프리저레이티드 슈퍼스피드 센트리퓨즈 속에서 15,000rpm에서 20분 동안 원심분리하여 막 단편과 입상 파편을 제거한다. 상층액을 부유하는 클로로필 층 하부로부터 흡입시킴으로써 회수한다. 펠렛을 버린다. 폴리에틸렌 글리콜 8000을 상층액에 15%(중량/용적)의 농도로 가한다. 혼합물을 1시간 동안 교반하고 SS34 로터 속에서 15,000rpm에서 20분 동안 원심분리한다. 상층액을 버린다. 펠렛을 부드럽게 교반하면서 0.75M KPi 중에서 2M 슈크로즈를 첨가하여 1.5M 슈크로즈의 최종 농도로 재현탁시킨다. 슈크로즈를 첨가한 다음 30분 경에, 현탁액을 0.75M KPi(pH 6.8)을 사용하여 대략 4배로 희석시키고 VTi50 로터를 사용하는 벡크만 L8-M 울트라센트리퓨즈 속에서 40,000rpm(20℃)으로 3시간 동안 원심분리한다. 상층액을 버린다. 펠렛을 단백질, 흡광도 및 형광 측정(상기 참조)으로 특징지워지는 0.75M KPi(pH 6.8)의 최소 용적중에서 재현탁시키고 피코빌리좀의 공급원에 따라, 동결하에 또는 실온하에 저장한다.
피코빌리좀의 안정화
공개된 논문[참조: Katoh(1988) Phycobilisome stability. In: Methods in Enzymology Vol. 167, pp. 313-318, Academic Press: and Gantt et al., 1979, 상기 참조]에 기재된 바와 같이, 분리된 피코빌리좀은 단백질 농도 및 이온 강도의 감소에 대해 불안정한 것으로 밝혀졌다. 피코빌리좀내 에너지 이동은, 545nm 여기시킨 666/573nm의 형광성 방사 비의 농도-의존 감소로 나타낸 바와 같이, 단백질(약 1mg/ml) 또는 완충제(약 0.5M KPi 이하)의 희석 다음에 수분내에 중단된다.
통상적인 특이적 결합 검정 순서에 사용하기 위한 안정한 피코빌리좀-표지된 리간드 및 수용체를 재생적으로 제조할 수 있도록 하기 위하여, 먼저 피코빌리좀을 안정화시킬 수 있다. 안정화 방법은 다음과 같은 것들이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다: 1) 공유결합 안정화는 피코빌리좀내(소단위내) 가교결합, 바람직하게는 단백질 변형의 분야에 잘 공지된 단-길이 또는 길이가 없는 이작용성 시약의 사용을 통해 달성할 수 있다[참조: Wong (1991) Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking, CRC Press.]. 2) 공유결합 안정화는 탄수화물, 지질, 올리고뉴클레오타이드, 단백질, 펩타이드, 폴리아미노산, 아미노산, 뉴클레오사이드, 슈가 또는 기타 소 유기 분자의 랜덤 또는 규칙적인 공중합체와 같은 천연 또는 합성 중합체의 다중-부위 부착에 의해 달성될 수 있다. 피코빌리좀 소단위의 공유 내부연결 방법은 1단계 또는 2단계 기술을 사용하여 수행할 수 있다. 바람직한 2 단계 방법에서는, 제 1 반응제(피코빌리좀 또는 브릿지 중합체)를 1 단계로 활성화시킨다. 과량의 시약을 제거한 후에, 활성화된 반응제를 제 2 단계에서 제 2 반응제 상의 천연 작용 그룹에 부착시킨다. 3) 비공유결합 안정화는 피코빌리좀 분해를 열역학적으로 불량하게 하는 공용매, 세제 또는 기타 완충 보조제를 사용하여 달성할 수 있다. 4) 비공유결합적인, 친화-기준한 안정화는 또한 2개 이상의 피코빌리좀 소단위에서 뻗쳐있는 작용성 결합 부위에 대해 친화성이 우수한 분자 또는 분자의 그룹을 사용하여 달성할 수 있다. 적합한 친화성을 갖는 분자는 천연적으로 존재하는, 변형된 또는 합성 항체 또는 항체 단편, 올리고뉴클레오타이드, 펩타이드, 단백질, 렉틴, 탄수화물 또는 소 유기 분자의 중합체로 이루어진 그룹으로부터 랜덤 스크리닝 또는 조합 방법에 의해 선택될 수 있다.
피코빌리좀은 중간 쇄-길이의 가교결합제에 의해 보다 짧은 1단계 반응을 통해 안정화시킬 수 있다. 시약 및 반응 조건은 피코빌리좀내 중합화보다 피코빌리좀 내 가교결합을 용이하게 하도록 선택된다. 중간 쇄-길이의 동일한 이작용성 디알데하이드, 글루타르알데하이드(GA) 및 단쇄-길이 모노알데하이드, 포름알데하이드(FA)는 모두 에너지 전달의 희석-유도된 비커플링으로부터 피코빌리좀을 보호하는데 있어 모두 효과적이다. GA를 사용한 피코빌리좀의 최대 안정화는 원심분리 또는 장기간의 저장후에만 명백해지는 부분적 불용성에 의해 달성된다. GA-유도된 불용성은 GA 및 피코빌리좀 농도의 공-최적화 및 반응시간을 통해 최소화할 수 있다. 달리는, 조건을 조정하여 균질한 현탁액중에 존재하지만 8000g에서 2분간 원심분리시 완전히 침강하는 GA-안정화된 피코빌리좀을 수득할 수 있다. GA의 안정화 효과는 낮은 GA/피코빌리좀 질량 비(즉, 0.027% GA/0.727% 피코빌리좀)에서 피코빌리좀을 연속적으로 처리한 후 완충된 GA로 반응 혼합물을 희석시켜 GA/피코빌리좀 비를 증가(즉, 0.10% GA/0.10% 피코빌리좀)시킴에 의해 개선될 수 있다. GA처리와는 대조적으로, 단쇄 가교결합제(즉, FA)를 사용하여 최대로 효과적인 안정화가 응집 또는 침전에 대한 가용성 피코빌리좀의 상실없이 달성될 수 있다.
피코빌리좀 제제의 크기 분포 및 부력 밀도에 있어 안정화 및 접합 공정의 효과를 측정하기 위하여, 반응 전구체 및 생성물의 반응을 피코빌리좀 분리에 사용된 것과 유사한 불연속 슈크로즈 구배상에서 평가한다. 0.5mg 분취량의 라이신-퀸칭된, GA-안정화된 피코빌리좀, 비정제된 피코빌리좀-항체 접합체 및 변형되지 않은 피코빌리좀을 0.75M KPi(pH 7.35) 중 2.0M, 1.0M, 0.5M 및 0.25M 슈크로즈의 2.5ml 단계를 포함하는 슈크로즈 구배 10ml에 적용시킨다. 구배를 70.1 Ti 로터내 50,000rpm에서 20시간 동안(18℃) 원심분리한다. 적자주색 밴드(로드 및 B-PE 응집체)는 변형되지 않은 피코빌리좀 구배의 상부의 반에서 나타나며, 이는 이러한 조건하에서 천연 피코빌리좀이 일부 파괴됨을 나타낸다. GA-안정화된 피코빌리좀 및 피코빌리좀-항체 접합체 구배는 대조적으로 1.5M 슈크로즈 영역내에서 단일 밴드를 형성한다. 이 결과는 1) GA 처리가 한외원심분리동안 피코빌리좀 분해를 완전히 방지하며, 2) 1 단계 GA 안정화/접합 방법이 피코빌리좀 또는 접합체의 조절되지 않는 중합을 수득하지 않음을 나타내고, 3) 안정화된 피코빌리좀 및 접합체가 본원에 기술된 방법에 의한 공유 가교결합후에 가용성으로 유지됨을 제안한다.
라텍스 미세구체에 대한 변형된 피코빌리좀의 고정화
라이신으로 퀀칭시키고 겔 크로마토그래피로 정제한 FA-처리된 피코빌리좀 및 피코빌리좀-항체 접합체("변형된 피코빌리좀")을 공유결합적으로 또는 수동 흡착에 의해 균일한 라텍스 입자상에 고정화시킨다. 모든 항온처리를 회전시키면서 실온에서 수행한다. 직경이 0.03 내지 lμ M 범위인 형광성 및 비형광성 카복실레이트-변형된 라텍스 미세구체를 1 내지 10mg/ml의 최종 농도에서 사용한다.
미세구체에 대한 수송 흡수는 20 내지 200㎍/mg 범위의 고정화 비율(㎍ 단백질/mg 입자)에서 100mM 포스페이트(pH 7.2) 중 1 내지 16시간 동안 수행한다. 변형된 피코빌리좀-라텍스 현탁액을 150mM 염화나트륨을 포함하는 100mM KPi 중 8000xg에서 반복적으로 원심분리함으로써 세척한다.
공유 고정화는 100mM MES(pH 6.8) 중에서 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카보디이미드(EDAC)를 사용하는 1 단계 방법에서 동일한 단백질/입자 비에서 수행한다. 변형된 피코빌리좀을 혼합하면서 입자 현탁액내로 신속하게 넣어 1 내지 2시간 동안 반응시키고 원심분리로 세척한다.
장기간 저장을 위해, 고정화된 피코빌리좀을 100mM KPi(pH 7.4) 중 1% FA를 사용하여 후-처리하고, 라이신으로 퀸칭시키며, 나트륨 시아노보로하이드라이드로 환원시키고 150mM 염화나트륨 및 0.05% 나트륨 아지드를 함유하는 100mM KPi로 세척한다.
상자성 입자상에서 항원 및 항체의 고정화
고정화를 하기 프로토콜에 따라서 실온에서 수행한다.
아민-변형된 BioMag(Advanced Magnetics)을 격렬하게 와동시키면서 5 내지 10mg/ml의 입자 농도에서 10mM 인산나트륨(NaPi, pH 7.35) 중에서 자기 분리함에 의해 5회 세척한다. 최종 세척후, 습윤 케이크를 6.25% GA(Sigma) 중 25mg/ml로 재현탁시키고 실온에서 3시간 회전시킨다. GA-처리된 입자를 NAPi로 6회 세척한다. 세척된, GA-활성화된 입자를 3 내지 10mg/ml에서 고정화시킬 단백질을 함유하는 PBS(pH 7.2-7.4)로 재현탁시켜 BioMag mg당 100 내지 160㎍의 단백질을 수득한다. BSA는 BioMag 입자상에서 면역반응제의 스페이싱을 조절하기 위한 도핑제로서 포함된다. 분취량의 단백질 용액을 고정화 효능의 측정을 위해 유지시킨다. 단백질-입자 슬러리를 16 내지 24시간 동안 실온에서 회전시킨다. 입자는 자기적으로 분리한다. 상층액을 버리고 잔류 단백질의 평가를 위해 유지시킨다. 반응하지 않은 GA 그룹은 입자를 1M 글라이신(pH 8.0) 중 약 10mg/ml로 현탁시킴에 이어서 1시간 동안 회전시킴에 의해 퀀칭시킨다. 퀀칭된 입자를 PBS(pH 7.4) 중에서 2회 세척하고 2mg/ml BSA를 함유하는 PBS 중에서 2 내지 4시간 동안 회전시킴에 의해 차단시킨다. 차단된 입자를 1mg/ml BSA를 함유하는 PBS 중에서 3회 세척하고, 10mg/ml의 입자 농도로 재현탁시키고 2 내지 8℃에서 저장한다. 작업중인 분취량을 장기간 저장동안 고정화된 시약의 용해에 대해 보호하는데 사용하기 전에 약 1mg/ml의 입자 농도에서 와동을 통해 검정 완충액중에서 3회 세척한다.
미세역가 웰에 대한 항원 및 항체의 고정화
단백질을 하기 프로토콜에 따라 수송적 흡착에 의해 표면-변형시킨 폴리스티렌 미세역가 플레이트에 수동적으로 흡착시킨다. 항원 및 항체를 사용전 즉시 보로실리케이트 유리 튜브내 또는 50ml짜리 폴리프로필렌 원심분리 튜브내 10mM 인산나트륨(pH 7.4) 또는 50mM 카보네이트 완충액(pH 9.6) 중에서 2 내지 20㎍/ml로 희석시킨다. 선명한 폴리스티렌 임뮬론(ImmulonTM) 4 또는 백색 마이크로라이트(MicroliteTM) 2 평편 바닥 미세역가 플레이트(Dynatech)를 웰당 100㎕에서 37℃에서 2시간 동안, 실온(20 내지 23℃)에서 4시간 동안 또는 2 내지 8℃에서 15 내지 24시간 동안 피복시킨다. 플레이트를 따라버리고 웰을 세척 완충액(1mg/ml의 BSA를 함유하는 PBS(pH 7.4))으로 웰을 충전시킴에 의해 1회 세척하고 따라버린다. 웰을 2mg/ml BSA를 함유하는 200㎕의 BSA로 1시간 동안 차단시키고 세척 완충액으로 다시 5회 세척한다.
실시예 1
비공유결합성 피코빌리좀-항체 접합체를 사용한 특이적 결합 검정
변형되지 않은 피코빌리좀은 특이적인 결합 시약의 제조 및 사용에 통상적으로 사용되는 조건하에서 신속하게 분해되기 때문에, 비공유결합성 피코빌리좀 접합체는 공정의 각 단계에서의 피코빌리좀 농도 및 반응 조건에 크게 주의를 기울여야할 필요가 있다. IgG2b 아형의 쥐 모노클로날 항-피코에리트린 항체(Sigma Chemical Company)를 와동시키면서 2.5mg/ml BSA를 함유하는 0.6M KPi(pH 7.2) 중 피. 크루엔툼(P. cruentum) 피코빌리좀(5.6mg/ml)에 가하여 0.5 내지 20IgG2b/피코빌리좀 범위의 몰비를 수득한다. 이 반응을 실온에서 30분간 지속시킨다. 면역원성 접합체 형성은 상자성 입자상에 고정화된 염소 항-마우스 IgG2b 항체를 사용한 IgG2b-피코빌리좀 복합체의 특이적 포획에 의해 입증된다. 50㎕의 BioMag-GAM IgG2b(30mg/ml, 1% BSA를 함유하는 0.75M KPi중에 세척됨)를 200㎍의 피코빌리좀을 함유하는 복합체 혼합물 40㎕에 가한다. 포획제를 첨가한 후, 검정 혼합물은 6.7mg/ml BSA를 함유하는 0.66M KPi 중에 결합된 IgG2b가 있거나 없이 2.2mg/ml의 피코빌리좀을 함유한다. 이 혼합물을 실온에서 30분간 항온처리하고 자기 기재(Corning)상에 분리한다. 0.75M KPi 중에 40배로 희석된 검정 상층액을 사용하여 545nm에서의 흡광도를 측정한다. IgG2b가 증가하면서 흡광도에 있어서 용량 의존적인 감소가 관측되며, 이는 BioMag-GAMIgG2b에 의한 피코빌리좀-IgG2b 복합체의 특이적 결합을 나타낸다. 최대 특이적 결합(26%)은 1-3㎍/시험 IgG2b에서 일어나며, 이 이상에서는 불충분한 고체상 수용력에 기인하여 결합이 감소된다.
실시예 2
포름알데하이드를 사용한, 안정하고 변형된 피코빌리좀 시약의 제조
검출 시약으로서 피코빌리좀의 대부분의 용도를 위하여, 피코빌리좀은 구조적으로 완전("비분해된")하여야 한다. 이종 특이적인 결합 검정(여기서, 결합된 종 및 유리된 종은 측정하기 전에 손상되지 않은 상태로 분리되어야 한다)시 사용하기 위해서는, 피코빌리좀이 안정하여 접합, 정제, 검정, 제품 제조, 선적 및 저장 동안 자발적으로 분해되지 않아야 한다. 공유결합성 안정화 방법이 가용성을 손상시킴없이 피코빌리좀의 에너지 발생적 커플링 및/또는 구조적 통합성을 보존하도록 개발되었다. 조절되지 않는 중합화 또는 전하 중화로부터 발생되는 침전을 피하기 위하여 조심스럽게 최적화된 조건하에서의 가교결합제가 사용된다. 주요 최적화 매개변수는 가교결합제 유형 및 반응성, 절대적 및 상대적 시약과 피코빌리좀 농도, 반응시간, pH, 종결 방법 및 정제 방법을 포함한다. 피. 크루엔툼 피코빌리좀을 사용하여 예시된 포름알데히드 안정화는 다음과 같이 수행된다.
분리된 피코빌리좀을 0.05% 나트륨 아지드를 함유하는 0.75M KPi(pH 7.2) 중 8.0mg/ml의 단백질 농도로 조정한다. FA(0.75M KPi 중 11%)를 10% 용적중에서 와동시키면서 적가하여 1.0%의 최종 농도를 수득한다. 이 반응 혼합물을 실온에서 18시간 동안 정치시키고 1M L-라이신으로 퀀칭시킨다. 장기간의 저장을 위하여 FA-처리된 피코빌리좀을 나트륨 시아노보로하이드라이드로 환원시키고 150mM 염화나트륨 및 0.05% 나트륨 아지드를 함유하는 100mM KPi(pH 7.2)로 평형화시킨 세파로즈 CL-6B위에서 정제한다.
희석 후 분해에 대한 피코빌리좀의 감수성을 시간- 및 용량-의존적인 방식으로 FA 처리함에 의해 방지한다. 18시간 동안 각종 FA 농도에서 처리된 제제를 흡광도 및 형광성 측정(545nm 여기)전에 0.75M KPi(pH 7.2) 중 각각 65㎍/ml 및 0.6㎍/ml에서 2시간 동안 항온처리한다.
에너지 전달의 최적의 보존은 1% FA에서 수득된다. 2% FA의 5시간 처리는 동등한 보호를 제공한다.
유사한 FA 처리 조건이 감소된 이온 강도 완충액중에서의 분해에 대해 피코빌리좀을 안정화시키는데 요구된다. FA-처리된 피코빌리좀을 0.1M KPi 중 대략 0.75㎍/ml로 희석시키고 실온에서 40시간 동안 정치시킨다. 간격을 증가시키기 위해 1% FA로 처리한 제제에 대한 형광성 데이터를 하기에 요약한다:
FA의 안정화 효과가 가교결합된 피코빌리좀의 거대한 불용성 중합체의 형성에 의해 달성되는지를 측정하기 위해, FA-유도된 제제를 원심분리에 의해 평가한다. 피코빌리좀을 3.0% 이하의 FA 농도로 처리한다. 반응을 실온에서 2 내지 18시간 동안 정치시킨다. 가용성의 변형된 피코빌리좀의 회수는 완전히 혼합된 제제의 545nm 흡광도와 8000xg에서 2분간 원심분리한 후 수득한 상층액과 비교함에 의해 평가한다. 비처리된 대조군으로부터 FA-처리된 제제의 회수 %를 감함으로써 제제의 상대침전%를 측정한다. 고 FA 농도로 장기간 처리한 것이 현저한 침전을 나타냈다.
실온에서 18주 동안 정치시 FA-변형된 피코빌리좀(2% FA x 5시간)에서 침전은 관측되지 않았다. 또한, 혼합 및 혼합없이 제조된 FA-처리된 피코빌리좀을 사용한 경우 회수, 접합 효율 또는 면역검정 수행능에 있어 명백한 차이는 없었다. 이러한 결과는 FA-처리된 피코빌리좀 제제가 단백질 변형, 정제, 면역검정 및 장기간의 저장의 목적을 위한 균질한 용액으로 됨을 나타낸다.
FA-안정화된 피코빌리좀은 통상 실온에서 저장된다. 참조 샘플을 안정성 비교를 위하여 저온 보관(2 내지 8℃)한다. FA-안정화된 피코빌리좀은 Shimadzu Model UV-160 기록 분광광도계 및 SPEX FluoroMax 형광계를 사용한 흡광도 및 형광성 측정에 의해 특성화한다.
실시예 3
글루타르알데하이드를 사용한 안정한, 변형된 피코빌리좀 시약의 제조
피코빌리좀을 2 내지 10mg/ml, 바람직하게는 약 8.0mg/ml의 농도로 0.05% 나트륨 아지드를 함유하는 0.75M KPi(pH 7.3)를 사용하여 조정한다. GA(0.75M KPi 중 0.2% 내지 1.0%)를 10 내지 50% 용적에서 2분에 걸쳐 와동시키면서 적가하거나 달리는, 3시간 이하의 연장된 기간에 걸쳐 3 내지 6배 증가시켜 첨가한다. GA를 첨가한 후, 반응 혼합물을 실온에서 1 내지 18시간 동안 정치시킨다. 변형된 1단계 GA 방법에 의해 접합을 진행시키도록 설계된 바람직한 안정화 프로토콜에 있어서, 7.27mg/ml 피코빌리좀 및 0.023% GA를 포함하는 반응 혼합물을 1차 아민을 함유하는 수용체(즉, 항체) 또는 리간드(즉, 항원)의 첨가전에 3시간 동안 실온에서 항온 처리한다. 달리는, GA 안정화 반응을 과량의 1차 아민(즉, 100mM 라이신, 아르기닌, 글라이신, 시스테인 또는 글루탐산)을 첨가함에 의해 종결한다. 유리 알데히드 이외의 그룹을 통한 접합 또는 고정화전에 GA 안정화를 위한 바람직한 프로토콜에서는, 피코빌리좀(7.27mg/ml)을 우선 0.023% GA로 1 내지 2시간 동안 안정화시킨 후 0.05 내지 0.15% GA 5 내지 10용적과 함께 1 내지 4시간 항온처리함으로써 안정화시킨다. 이 반응은 100mM 라이신, 글라이신, 시스테인, 글루탐산 또는 다른 1차 아민-함유 퀀칭제를 첨가함으로써 종결시킨다. GA-안정화된 피코빌리좀은 변형되지 않은 피코빌리좀 및 FA-안정화된 피코빌리좀에 사용된 방법에 따른 흡광도 및 형광성 측정에 의해 특성화된다. 피. 크루엔툼으로부터의 안정화된 피코빌리좀은 하기 범위를 재생적으로 충족시킨다:
흡광도: > 4 AU545/mg(평균 약 5.0)
형광성 시그날(666nm): 545nm에서의 여기를 사용한 1ng/ml에서 >104 cps
형광성 비: 545nm에서의 여기를 사용한 666/573nm 방사 비 >3.0.
GA의 안정화 효과는 다음과 같이 적정한다. GA(0.75M KPi에서 0.03 내지 3.0%)를 0.75M KPi 중 피코빌리좀에 혼합하면서 적가하여 10mg/ml 피코빌리좀 및 0.003% 내지 0.3% 범위 농도의 GA를 포함하는 반응 혼합물을 수득한다. 실온에서 12시간 후, 반응을 100mM 글라이신으로 퀀칭시키고 평가전 2주간 실온에 저장한다.
희석에 대한 안정성은 0.75M KPi(pH 7.2) 중 변화되는 시간 간격 동안 10㎍/ml에서 수득되는 제제를 항온처리함으로써 측정한다. 농축된 피코빌리좀 스톡을 0시간째에 10㎍/ml로 희석한다. 희석된 제제의 방사 스펙트럼을 545nm 여기를 사용한 변화하는 시간 간격에서 기록한다. 형광성 데이터는 E666/E573 비로 나타낸다. 0시간째(희석 후 30초)에 비는 비처리된 대조군의 경우 평균 2.10이며 이는 0.03% GA-처리된 피코빌리좀의 경우인 3.21과 비교되며, 이는 30초내 대조군의 현저한 희석-의존적 분해를 나타낸다.
아-침전 농도의 GA에 의한 감소된 이온 강도에 대한 안정화는 탈이온수와 0.75M KPi의 다양한 혼합물중에서 희석 후 대조군 대 0.03% GA=처리된 피코빌리좀의 형광성 스펙트럼의 모니터링에 의해 평가한다. 0.03% GA 처리의 안정화 효과는 희석 1시간내에 급격히 발생한다:
GA(및 FA) 안정화 방법의 퀀칭, 환원 및 정제 단계의 세부 사항은 다양한 적용에 따라 변한다. 알데히드-처리된 피코빌리좀의 특성은 반응을 상이한 아미노산(즉, 글라이신, D-아르긴니, L-라이신)을 사용한 퀀칭에 의해 변할 수 있다. 또한 신규한 화학 그룹은 적합한 퀀칭제(즉, 티올 그룹을 도입시키기 위한 L-시스테인, 슈가 그룹을 도입시키기 위한 글루코스아민)를 선택함에 의해 편리하게 도입시킬 수 있다. 예를 들어, 피코빌리좀은 0.023% GA로 처리한 후, 10mM L-시스테인으로 퀀칭시키고 후속 사용을 위해 저장하거나 환원, 정제 및 다음과 같이 접합시킨다. 시스테인-퀀칭된 GA-처리된 피코빌리좀을 30mM 디티오에리트리톨로 환원시키고 100mM NaCl(pH 7.4)을 함유하는 100mM KPi로 평형화시킨 세파로즈 CL-6B 위에서 정제한다. 피리딜-유도체화된 스트렙트아비딘은 10의 SPDP/스트렙트아비딘 몰비에서 100mM 나트륨 포스페이트(pH 7.4) 중 SPDP를 사용하는 확립된 방법에 의해 제조한다. 생성물을 동일한 완충액중에서 투석에 의해 정제하고 2 내지 10범위의 스트렙트아비딘/피코빌리좀 몰비에서 티올화된 피코빌리좀과 반응시킨다. 티올화된 피코빌리좀을 접합 반응물에 가한 즉시 환원시킨다. 스트렙트아비딘-피코빌리좀 접합체를 세파로즈 CL-6B 위에서 정제한다. 바이오틴-특이적인 결합은 포획 시약으로서 상자성 입자상에 고정화된 바이오티닐화된 BSA를 사용하여 입증한다.
실시예 4
탈수된 형태의 피코빌리좀 및 변형된 피코빌리좀의 저장
무수 시약 형이 시약 첨가 단계의 배제 수단으로서 많은 임상 시험 및 키트에 대해 바람직하고 재현성을 개선시키고 반감기를 증가시킨다. 동결건조는 장기간의 저장을 위해 시약을 건조시키는 일반적인 방법이다. 문헌은 피코빌리좀이 동결에 불안정함을 제안한다[참조: Gantt and Lipschultz(1972) "Phycobilisomes of Porphyridium Cruenttum", J. Cell Biol., 54:313-324; Canaani et al.(1980) "Reassembly of Phycobilisomes from Allophycocyanin and a Phycocyanin-Phycoerythrin Complex", FEBS Letters, 1155(2):225-229]. 피코빌리좀 및 접합체의 동결-건조는 무수-시약 피코빌리좀 제품 형의 실현가능성을 확립시켰다.
피코빌리좀을 8.8 내지 9.5mg/ml에서 0.75M KPi 중 피. 크루엔툼으로부터 분리한다. 3 내지 20㎕ 분취량(45 내지 190㎕)을 섬광-동결시키고 미세역가 웰내에서 진공 증발시킨다. 이 건조된 피코빌리좀을 실온에서 0 내지 4주간 저장하고, 재현탁시키고, 희석시키며 흡광도 및 형광성 측정을 위해 3ml의 큐벳에 이전시킨다. 완충 용액(0.05% 나트륨 아지드를 함유하는 0.75M KPi 중 8.8 내지 9.8mg/ml)중에 저장된 피코빌리좀을 참조 물질로 사용한다.
흡광도는 영향을 받지 않으나, 형광성은 약간 영향 받는다. 변형되지 않은 피코빌리좀은 흡광도에 있어 변화없이 동결-건조 및 4주간 저장에서 영향받지 않는다. 처리되지 않은 대조군과 비교시 동결-건조 및 4주간 저장에서 형광성 강도 및 666/573nm 방사 비 모두에서 15 내지 20%가 감소된다. 동결-건조된 제제의 형광성에 있어서의 단지 약간의 감소는 0 내지 1주째에 일어난다. 1주 내지 4주간의 저장시 현저한 변화는 관측되지 않는다.
공유적으로 안정화된 피코빌리좀(피코빌리좀-항체 접합체)은 150mM 염화나트륨 및 0.05% 나트륨 아지드를 함유하는 100mM KPi 중에서 동결-건조 후 실질적으로 분해된다. 666nm에서의 형광성 방사는 약 60% 감소되며 666/573 방사비는 5배 감소되고 흡광도 스펙트럼은 교란된다. 동결 건조전 1M 슈크로즈의 첨가는 분해의 모든 신호를 완화시킨다. 4주에 걸쳐 슈크로즈-보충된 KPi 중 동결-건조된 접합체는 액체 대조군 또는 0시간째 동결 건조된 접합체와 비교하여 형광성 또는 흡광도 특성에 있어 현저한 변화를 나타내지 않는다.
실시예 5
피코빌리좀-항체 접합체의 제조
모든 단계는 실온(20 내지 23℃)에서 수행한다. 피. 크루엔툼으로부터 분리된 피코빌리좀을 나트륨 아지드(2mM)을 함유하는 0.75M KPi(pH 7.35) 중 8mg/ml의 농도로 정상화시킨다. GA(0.25%)를 10% 용적으로 2분에 걸쳐 와동시키면서 적가하여 7.27mg/ml의 피코빌리좀과 0.023% GA를 함유하는 반응 혼합물을 수득한다. 이 반응 혼합물을 2시간 동안 정치시킨다. 친화-정제된, Fc-특이적인 염소 항-마우스 IgG(GAM: OEM Concepts; 0.1% 나트륨 아지드를 함유하는 10mM 포스페이트-완충된 등장성 염수중 2mg/ml)를 와동시키면서 적가하여 12:1의 GAM/피코빌리좀 몰비(피코빌리좀 mg당 GAM 128㎍)를 수득한다. 4시간 항온처리한 후, 반응을 1.1M L-라이신 10% 용적을 첨가함에 의해 종결시킨다. 퀀칭된 반응물을 1시간 동안 회전시킴에 의해 혼합한다. 새로이 제조된 나트륨 보로하이드라이드(Aldrich; 0.1mM MeOH 중 5mg/ml) 5% 용적을 와동시키면서 반응 혼합물내로 넣은 후, 5분 후에 동일한 용액 10% 용적을 가한다. 이 보로하이드라이드-환원된 반응 혼합물을 초원심분리 또는 바람직하게는 150mM NaCl 및 0.05% NaN3를 함유하는 100mM KPi(pH 7.37) 중에 평형화시킨 세파크릴 S300 또는 세파로즈 CL-6B(Pharmacia)를 사용한 겔 크로마토그래피에 의한 정제때까지 2 내지 8℃에 저장한다.
접합체를 회수 %(피코빌리좀 출발 물질 %로서의 가용성 피코빌리좀 접합체의 수율, 공정중 상실에 대한 카운팅); 흡광성(AU/mg); 형광성(농도-정상화된 방사 강도; 피크비) 및 고체상 포획 시약으로서 BioMag-MIgG를 사용한 경쟁적 형광면역검정에 있어서의 특이적인 결합을 기준으로 평가한다.
초원심분리에 의해 정제된 접합체에 대해 평가된 가용성 물질의 회수는 72 내지 100%의 범위, 평균 약 90%이다. 피코빌리좀의 한 개의 로트로부터 제조된 12개의 접합체의 E666/E573 비는 2.92 내지 3.55(평균=3.16)이다. 정상화된 형광성 강도(고정된 유입량에서 E666)는 1㎍/ml의 접합체 농도에서 평균 4.15 x 106 cps이다.
BioMag-MIgG에 대한 접합체의 60% 이하의 특이적 결합은 위-과량(완전 포화는 시도되지 않았다)의 고체상 시약을 사용하여 입증한다. 대표적인 결합 데이터를 하기에 나타낸다. 50㎕의 피코빌리좀-GAM 접합체(80㎍/ml)을 MIgG 및 100㎕ BioBag-MIgG(1mg/시험)이 있거나 없는 50㎕의 완충액을 함유하는 시험 튜브에 가한다. 검정 튜브를 와동시키고 실온에서 60분 동안 항온처리한다.
형광성을 자기성 분리후 수거된 검정 상층액 160㎕를 사용하여 3ml의 용적에서 측정한다.
GA를 또한 사용하여 GAM 항체를 FA-안정화된 피코빌리좀에 접합시킨다. 피코빌리좀을 2% FA로 4시간 처리하고, 1M L-라이신으로 정지시키며 세파로즈 CL-6B위에서 크로마토그래피한다. 공극 용적으로 나타나는 안정화된 피코빌리좀을 GA로 처리하고 12:1의 몰비에서 항체와 밤새 반응시킨다. 라이신 퀀칭, 보로하이드라이드 환원 및 정제를 GA 접합 방법(상기 참조)으로 수행한다. 수득되는 접합체는 3.0 이상의 666/573 비를 나타내고 BioMag-MIgG에 대해 60%의 특이적 결합을 나타낸다. 10mM KPi-기준한 검정 완충액 작업 농도에서 밤새 실온 저장시 또는 100mM KPi-기준한 검정 완충액중에서 1주간 저장시 형광성 강도(E666) 또는 면역반응성(결합%)에 있어 현저한 감소는 관측되지 않는다.
실시예 6
광도계 측정을 사용한 경쟁적 면역검정
50㎕의 샘플(각종 농도의 마우스 면역글로불린(MIgG)이 있거나 없는 검정 완충액)을 사이드-풀 자기 기재(side-pull magnetic base; Corning)가 있는 MagicTM 분리기 단위내에 정렬된 12 x 75mm 유리 시험 튜브에 가한다. 100㎕의 새로이 세척한 BioMag-MIgG를 0.3 내지 10mg/ml 범위의 입자 농도에서 가한다. 튜브를 와동시키고, 50㎕ 피코빌리좀-GAM 접합체(1.5 내지 18 GAM/피코빌리좀의 몰비)를 1 내지 100㎍/ml(5 내지 500mAU/ml) 범위의 피코빌리좀 농도에서 가한다. 이 반응 혼합물을 와동시키고 실온에서 1시간 동안 항온처리한다. 입자를 5분간 이의 자기 기재상에서 MagicTM 랙을 위치시킴에 의해 분리한다. 160㎕ 분취량의 검정 상층액을 12 x 75mm 유리 튜브에 이전시키고 연속해서 광도계 검정을 위하여 100mM KPi(pH 7.35) 내지 1ml 또는 형광계 검정을 위해 3ml로 희석시킨다.
하기 나타낸 데이터는 피코빌리좀-GAM 접합체 및 BioMag-MIgG의 체커보드 공-적정(checkerboard co-titration)을 나타내며, 이는 결합이 고체상 제한됨을 증명한다. 결합%는 입자 농도에 있어서의 증식적 증가와 함께 현저하게 증가한다.
별개의 실험에서, 접합체 결합은 10배 높은 농도의 접합체 및 고체상에서 작업함에 의해 현저하게 증가된다. 검정 감도는 100ng/ml MIgG인 것으로 측정된다.
실시예 7
형광성 검출을 사용한 경쟁적 면역검정
시약 농도를 형광성 검출을 위해 채택하는 것외에는, 실시예 6의 방법에 따라 검정을 수행한다. 하기 나타낸 데이터는 BioMag-MIgG의 시험당 250㎍ 및 피코빌리좀-GAM 접합체 시험당 20ng을 사용하여 수득한다. 형광성은 545nm 여기를 사용하여 기록한다.
실시예 8
고정화된 항원에 예비결합된 피코빌리좀 접합체를 사용한 치환 검정
세척된 BioMag-토끼 IgG(BioMag-RIgG)를 실온에서 2시간 동안 혼합하면서 피코빌리좀-GAM 접합체(5/1 GAM/피코빌리좀의 몰비)로 예비처리한다. 예비결합된 시약 혼합물을 검정 완충액중에서 3회 세척하고 400㎍/ml의 입자 농도에서 재현탁시킨다. 500㎕의 미세역가 분취량의 예비결합된 시약을 12 x 75mm 시험 튜브에 가한다. 검정은 50㎕의 샘플(MIgG가 있거나 없는 완충액)을 가하고, 와동시키고, 실온에서 60분간 항온처리함에 의해 수행한다. 자기 분리후, 500㎕의 상층액을 형광성 측정을 위해 2.5ml의 0.1M KPi에 이전시킨다.
RIgG-피복된 웰에 예비결합된 동일한 피코빌리좀-GAM 접합체(20㎍/ml)를 사용한 치환 포맷에서의 미세역가 플레이트 검정으로 유사한 결과를 수득한다. 낮은 치환 시그날은 상자성 입자와 비교한 미세역가 웰의 낮은 고체상 결합력에 기인한다.
실시예 9
샌드위치(면역계) 면역검정
MIgG를 피코빌리좀-GAM 접합체와 함께 사전항온처리한 후 피코빌리좀 -GAM-MIgG 복합체를 BioMag-토끼 항-마우스 항체(BioMag-RAM)로 포획시킴으로써 역샌드위치 검정을 수행한다. 이 프로토콜은 용액중에서 제 1(동적) 면역반응이 진행되도록 하고, 검정 역학을 증진시키며 입체 장애를 최소화시킴에 의해 검정 감도를 최대화시킨다. 달리는, 피코빌리좀-GAM 접합체를 표지된 제 2 항체로서 사용하여 하기와 같이 고정화된 토끼 IgG(RIgG)에 대한 모노클로날 항체 결합을 검출한다.
50㎕의 완충액 또는 마우스 항-토끼 항체(MAR)를 30분 동안 50㎕의 피코빌리좀-GAM 접합체(20 내지 80㎕/ml)와 함께 사전항온처리한다. 면역 복합체를 10mg/ml의 입자 농도에서 새로이 세척된 BioMag-RIgG 100㎕를 첨가함에 의해 포획한다. 이 반응을 자기 분리전 60분 동안 진행시킨다. 형광성 측정을 2.84ml 0.1M KPi로 160㎕의 검정 상층액의 희석/전달 후 수행한다.
실시예 10
가시 검출을 사용한 미세역가-기준한 면역검정
경쟁적 검정: 백색 폴리스티렌 마이크로라이트(MicroliteTM) 플레이트(Dynatech)를 2 내지 8℃에서 10mM 나트륨 포스페이트(pH 7.35) 중 2 내지 20㎍/ml MIgG를 사용하여 15시간 동안 수동 흡착에 의해 피복한다. 상층액을 흡인제거한다. 웰을 실온에서 60분 동안 200㎕의 차단 완충액[100mM 칼륨 포스페이트(pH 7.35), 2mM 나트륨 아지드 및 2mg/ml BSA를 함유하는 10mM 포스페이트-완충된 등장성 염수(PBS, pH 7.4)]과 함께 항온처리하고 250㎕의 세척 완충액(1mg/ml BSA를 함유하는 PBS)으로 6회 세척한다. 최종 세척후, 플레이트를 종이 타월상에 거꾸로 놓고 격렬하게 블롯팅함으로써 배수시킨다. 50㎕의 검정 완충액[100mM 칼륨 포스페이트(pH 7.35), 2mM 나트륨 아지드 및 1mg/ml BSA를 함유하는 PBS] 또는 MIgG(검정 완충액중 10 내지 1000ng/웰)을 각각의 웰에 가한 후 50㎕의 피코빌리좀-GAM을 0.5 내지 10㎍/웰로 가한다. 플레이트를 실온에서 진탕시키면서 1시간 동안 항온처리하고, 가만히 따라 버린 후, 검정 완충액으로 3회 세척하기 전 및 후에 관찰한다. 고정화된 MIgG에 결합하는 피코빌리좀-GAM 결합은 하기 조건하에 웰의 바닥 및 내부 아래상에 적핑크색 피복물로서 플레이트를 세척하기 전 및 후에 모두 가시적으로 구별될 수 있다.
1. MIgG 피복 농도 > 0.5㎍/웰;
2. 피코빌리좀-GAM 접합체 > 1㎍/웰 및
3. 경쟁적 [가용성 MIgG] < 10ng/웰.
현저한 비특이적 결합(1㎍/웰의 가용성 MIgG에서 결합된 색상)은 피코빌리좀-GAM의 최고 농도에서조차 세척 플레이트내에서 가시적으로 명백하지 않다. 가시적으로 검출가능한 특이적인 결합(색상 차이 +/- 1㎍/웰 MIgG)은 최고 피복물 및 접합체 농도(10 내지 20㎍/웰 피복 x 5 내지 10㎍/웰 피코빌리좀-GAM)로 처리한 웰내에서 가장 크게 명백하다. 이러한 조건하에서, MIgG에 대한 가시적 검출 한계는 10 내지 100ng/시험이며, 이는 10-12 내지 10-13몰/시험(약 10-9M MIgG)에 상응한다.
샌드위치 검정: 백색 폴리스티렌 마이크로라이트 2㎕ 미세역가 플레이트(Dynatech)를 2 내지 8℃에서 15시간 동안 10mM 나트륨 포스페이트(pH 7.35) 중 2 내지 20㎍/ml의 친화-정제된 RAM(H+L) 항체로 피복한다. 상층액을 흡인시키고 웰을 200㎕의 차단 완충액(경쟁 검정당)과 함께 1시간 동안 실온에서 항온처리한 후 250㎕의 세척 완충액(1mg/ml BSA를 함유하는 PBS)으로 6회 세척한다. 최종 세척후, 플레이트를 뒤집어서 격렬히 블롯팅하면서 종이 타월상에서 배수시킨다. 100㎕의 검정 완충액 또는 MIgG(10 내지 1000ng/웰의 검정 완충액)를 각각의 웰에 가하고, 실온에서 1시간 동안 항온처리하여 흡인시킨다. 웰을 250㎕의 세척 완충액으로 3회 세척한다. 피코빌리좀-GAM 접합체를 100㎕의 검정 완충액중에서 0.5 내지 10㎍/웰로 가하고, 실온에서 진탕시키면서 2시간 동안 항온처리하고, 따라 버린 후, 검정 완충액으로 3회 세척하기 전 및 후에 관찰한다. 세척하거나 세척하지 않은, 결합된 피코빌리좀-GAM은 하기 조건하에서 MIgG에 노출된 웰중에서 가시적으로 구별될 수 있다:
1. > 0.2㎍/웰에서 RAM 피복;
2. [MIgG] > 10ng/웰 및
3. RAM 및 MIgG 농도에 따라, 1.5 내지 10㎍/웰에서 [피코빌리좀-GAM].
세척전에, 검정 완충액과 비교하여 10ng/ml MIgG에 노출된 웰의 가시적 차이는 최저이다. 세척은 분해에 있어서 단지 약간의 증진만을 제공한다. 고체상 결합력 또는 접합체 농도를 증가시키고, 고 친화성 트레이서 항체를 선택하며, 검정 프로토콜 또는 완충액 조성을 변형시키거나 UV 조사하에 결합된 상의 관측을 위한 바람직한 조건을 조사함에 의해서 면역계적 미세역가 검정의 가시적 검출 한계를 최적화하기 위한 어떠한 노력도 이루어지지 않았다.
실시예 11
가시적 검출에 의한 면역크로마토그래피 딥스틱(immunochromatographic dipstick)
경쟁적 검정 형태: MIgG를 하기와 같이 알데하이드-처리된 변형된 폴리설폰막상의 국부 영역에 공유결합적으로 고정화시킨다. 유효 공극 크기가 0.8μ M인 UltrabindTM US 800 비지지된 막(Gelman Sciences)을 20cm x 6cm 단편으로 절단한다. MIgG(0.1% 나트륨 아지드를 포함하는 10mM 포스페이트-완충된 등장성 염수(PBS), pH 7.2 중 2 내지 10mg/ml)를 각각의 단편(가장자리로부터 3cm)의 중간을 가로질러 연필로 그려진 장선을 따라 4㎕/선형 cm에서 점진적인 모세 피펫(Drummond Scientific)으로 수동 스폿팅한다. 30분 동안 공기 건조한 후, 막을 10mM PBS(pH 7.4) 중 1% BSA로 이루어진 50ml의 차단 완충액중 실온에서 1시간 온화하게 진탕시키면서 항온처리하고 0.1% BSA를 함유하는 100ml의 PBS(pH 7.2) 중에서 2회 세척하고 3시간 동안 공기 건조시킨다. 다음 세척된 건조 막을 0.2% 트윈 20을 함유하는 PBS(pH 7.2) 중에서 1시간 동안 진탕시키면서 세척하고 밤새 실온에서 건조되도록 한다.
피코빌리좀-GAM 접합체를 하기와 같이 MIgG-변형 막에 적용시킨다. 건조되고, 세척된 막 단편을 1 x 6cm 스트립으로 너비를 절단한다. 0.1M 슈크로즈를 함유하는 0.5M KPi(pH 7.35) 중 10㎍/ml의 면역학적으로 활성인 GAM 및 약 0.5mg/ml의 안정화된 피. 크루엔툼 피코빌리좀을 포함하는 피코빌리좀-GAM 복합체(2.5 AU545/ml) 10㎕를 고정화된 MIgG의 중심 횡선 및 한쪽 말단 사이에 각각 1 x 6cm 스트립 중간의 약 1㎠ 위에 적용한다. 접합체 처리된 스트립을 사용전 30분간 공기-건조시킨다.
건조된 스트립의 접합체-처리된 말단을 완충액[1mg/ml BSA를 함유하는 PBS(pH 7.4)] 또는 MIgG(완충액 중 1㎍/ml)에 접촉시키고 모세 작용에 의해 샘플이 스트립에 삽입되도록 함으로써 면역크로마토그래피적 MIgG 딥스틱을 평가한다. 전면 유액이 완충액-처리된 스트립위로 3.5cm 이주하는 경우(약 10분), 자핑크색 밴드가 고정화된 MIgG 라인(3cm)에 나타나며 스트립이 완충액으로 완전히 포화되면서(약 20분) 점진적으로 강도가 진해진다. MIgG-함유 완충액에 노출된 스트립내에서 어떠한 밴드도 명백하지 않으며, 이는 고정화된 MIgG에 대한 피코빌리좀-GAM 결합이 가용성 MIgG에 의해 실질적으로 억제됨을 나타낸다.
장파장(365nm) 자외선 조사시 암실에서 스트립의 관찰은 MIgG-처리된 딥스틱내 국부화된 피코빌리좀-CAM 형광성을 나타내지 못한다. 완충액-처리된 딥스틱에서 고정화된 MIgG에 결합된 피코빌리좀-GAM은 암청색 기저치에 대한 강렬하고, 형광성인 적색 밴드로서 나타난다. 이 형광성 밴드는 스트립을 공기-건조시킨 후 사라진다. 물을 건조된, 완충액-처리한 스트립상의 가시 밴드에 적용시키는 경우, 강렬한 국부화된 적색(피코빌리좀) 및 이동성 오렌지색(B-PE) 형광성 상이 관측되며, 이는 건조되고 재-습윤된 GA-처리된 피코빌리좀의 부분 분해를 나타낸다. 유사한 결과를 동결-건조전 및 후에 피코빌리좀-GAM 접합체를 형광계적으로 평가하여 수득한다. 545nm 여기를 갖는 666/573 방사 비는 건조 및 재구성되면서 현저하게 감소되고, 이는 접합체를 슈크로즈 또는 기타 보호제로 예비처리하지 않는 한, 형광성 에너지 전달의 현저한 비커플링을 나타낸다. 분리된 B-PE가 APC(피. 크루엔툼 피코빌리좀의 말단 수용체) 보다 더욱 강렬한 형광단일 경우, 접합체 결합 및 검출 단계 사이의 피코빌리좀의 분해는 형광성 시그날 및 증가된 검정 감도를 증폭시키기 위한 수단을 제공한다.
샌드위치 검정 형태: 친화-정제된 RAM 항체[(H+L 쇄)-특이적인; OEM Concept]을 MIgG 대신에 UltrabindTM US800막에 고정화시키는 것외에는, 면역계적 MIgG 딥스틱을 경쟁적 딥스틱에서와 실질적으로 동등한 방법으로 제조한다. 직선상 cm당 RAM(2mg/ml) 10㎕를 10 x 6cm 막 단편에 너비를 가로질러 스폿팅하고, 차단한 후, 세정 및 세척하고 MIgG-고정화된 막당 1 x 6cm 스트립으로 절단한다. 0.2M 슈크로즈를 함유하는 0.5M KPi(pH 7.35) 중 대략 1mg/ml의 안정화된 피. 크루엔툼 피코빌리좀 및 20㎍/ml의 면역학적으로 활성인 GAM을 포함하는 10㎕의 피코빌리좀-GAM 접합체(5.1AU545/ml)를 경쟁적 딥스틱당 고정화된 RAM 라인 및 한쪽 말단 사이 중간에 적용시키고 스트립을 사용전에 공기-건조시킨다.
샌드위치 MIgG 딥스틱은 접합체-처리된 말단을 PBS-BSA 완충액에 MIgG(1㎍/ml)가 있거나 없이 접촉시키고 모세 작용에 의해 샘플이 스트립을 포화하도록(약 20분)함으로써 평가한다. 뚜렷한 자주-핑크색 밴드가 MIgG-처리된 딥스틱내 고정화된 RAM 라인에서 형성되나 완충액-처리된 대조군에서는 형성되지 않는다. 이 결과는 6 x 10-9M 이하의 검출 한계를 갖는 면역계적 검정에 있어 가용성의 피코빌리좀 접합체의 특이적인 결합을 입증한다.

Claims (66)

  1. 24시간내에 1 xg에서 침강되지 않고 1,000xg에서 5분간 원심분리시 55% 이상이 상층액중에 존재하는, 가용성의, 분리되고 안정화된 피코빌리좀의 제제.
  2. 리간드, 수용체 및 시그날-생성 분자로 이루어진 그룹중에서 선택된 제2종 물질에 상호 부착된 피코빌리좀의 제1종 물질을 포함하는, 피코빌리좀 이종접합체의 제제.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 피코빌리좀이 고형 지지체에 고정된 제제.
  4. 고형 지지체에 고정된, 기능상의 손상이 없는(intact) 분리된 피코빌리좀의 제제.
  5. 제2항 또는 제4항에 있어서, 피코빌리좀이 안정화된 제제.
  6. 제3항에 있어서, 피코빌리좀이 안정화된 제제.
  7. 제3항에 있어서, 피코빌리좀이 고형 지지체상에 규정된 배향으로 고정화된 제제.
  8. 제4항에 있어서, 피코빌리좀이 고형 지지체상에 규정된 배향으로 고정화된 제제.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 피코빌리좀이 하나 이상의 로드(rod)를 포함하는 제제.
  10. 제3항에 있어서, 피코빌리좀이 하나 이상의 로드(rod)를 포함하는 제제.
  11. 제4항에 있어서, 피코빌리좀이 하나 이상의 로드(rcd)를 포함하는 제제.
  12. 제1항 또는 제2항에 있어서, 피코빌리좀이 바람직한 화학 성분(moiety)에 의해 공유부착되어 변형된 제제.
  13. 제3항에 있어서, 피코빌리좀이 바람직한 화학 성분(moiety)에 의해 공유부착되어 변형된 제제.
  14. 제4항에 있어서, 피코빌리좀이 바람직한 화학 성분(moiety)에 의해 공유부착되어 변형된 제제.
  15. 제12항에 있어서, 화학성분이 피코빌리좀에 대하여 특정 분율로 부착되어 있는 제제.
  16. 제13항에 있어서, 화학성분이 피코빌리좀에 대하여 특정 분율로 부착되어 있는 제제.
  17. 제14항에 있어서, 화학성분이 피코빌리좀에 대하여 특정 분율로 부착되어 있는 제제.
  18. 제4항에 있어서, 피코빌리좀이 리간드, 수용체 및 시그날-생성 분자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 분자종에 부착된 제제.
  19. 제18항에 있어서, 분자종이 한가지 유형의 피코빌리좀 구성성분 단백질에 부착된 제제.
  20. 제5항에 있어서, 분자종이 한가지 유형의 피코빌리좀 구성성분 단백질에 부착된 제제.
  21. 제18항에 있어서, 분자종이 피코빌리좀에 공유부착된 제제.
  22. 제19항 또는 제20항에 있어서, 분자종이 피코빌리좀에 공유부착된 제제.
  23. 제1항, 제2항, 제4항, 제8항, 제11항, 제14항 및 제17항중 어느 한 항에 있어서, 피코빌리좀이, 피코빌리좀에 특이적으로 결합하는 다중특이적 리간드 또는 다중특이적 수용체에 비공유결합된 제제.
  24. 제3항에 있어서, 피코빌리좀이, 피코빌리좀에 특이적으로 결합하는 다중특이적 리간드 또는 다중특이적 수용체에 비공유결합된 제제.
  25. 제7항에 있어서, 피코빌리좀이, 피코빌리좀에 특이적으로 결합하는 다중특이적 리간드 또는 다중특이적 수용체에 비공유결합된 제제.
  26. 제9항에 있어서, 피코빌리좀이, 피코빌리좀에 특이적으로 결합하는 다중특이적 리간드 또는 다중특이적 수용체에 비공유결합된 제제.
  27. 제12항에 있어서, 피코빌리좀이, 피코빌리좀에 특이적으로 결합하는 다중특이적 리간드 또는 다중특이적 수용체에 비공유결합된 제제.
  28. 제13항에 있어서, 피코빌리좀이, 피코빌리좀에 특이적으로 결합하는 다중특이적 리간드 또는 다중특이적 수용체에 비공유결합된 제제.
  29. 제15항에 있어서, 피코빌리좀이, 피코빌리좀에 특이적으로 결합하는 다중특이적 리간드 또는 다중특이적 수용체에 비공유결합된 제제.
  30. 제16항에 있어서, 피코빌리좀이, 피코빌리좀에 특이적으로 결합하는 다중특이적 리간드 또는 다중특이적 수용체에 비공유결합된 제제.
  31. 제1항 또는 제2항에 있어서, 피코빌리좀이, 글리세롤의 존재하, 동결 및 탈수 중에서 선택된 하나, 둘 또는 세가지 조건에 대해 안정적인 것인 제제.
  32. 제3항에 있어서, 피코빌리좀이, 글리세롤의 존재하, 동결 및 탈수 중에서 선택된 조건중 하나, 둘 또는 세가지 조건에 대해 안정적인 것인 제제.
  33. 제4항에 있어서, 피코빌리좀이, 글리세롤의 존재하, 동결 및 탈수 중에서 선택된 조건중 하나, 둘 또는 세가지 조건에 대해 안정적인 것인 제제.
  34. 제1항 또는 제2항에 있어서, 피코빌리좀이 분리된 피코빌리단백질, 분리된 링커 단백질 또는 이들의 혼합물을 포함하는 혼합물로부터 재구성된 것인 제제.
  35. 제3항에 있어서, 피코빌리좀이 분리된 피코빌리단백질, 분리된 링커 단백질 또는 이들의 혼합물을 포함하는 혼합물로부터 재구성된 것인 제제.
  36. 제4항, 제11항 또는 제14항에 있어서, 피코빌리좀이 분리된 피코빌리단백질, 분리된 링커 단백질 또는 이들의 혼합물을 포함하는 혼합물로부터 재구성된 것인 제제.
  37. 제9항에 있어서, 피코빌리좀이 분리된 피코빌리단백질, 분리된 링커 단백질 또는 이들의 혼합물을 포함하는 혼합물로부터 재구성된 것인 제제.
  38. 제10항에 있어서, 피코빌리좀이 분리된 피코빌리단백질, 분리된 링커 단백질 또는 이들의 혼합물을 포함하는 혼합물로부터 재구성된 것인 제제.
  39. 제12항에 있어서, 피코빌리좀이 분리된 피코빌리단백질, 분리된 링커 단백질 또는 이들의 혼합물을 포함하는 혼합물로부터 재구성된 것인 제제.
  40. 제13항에 있어서, 피코빌리좀이 분리된 피코빌리단백질, 분리된 링커 단백질 또는 이들의 혼합물을 포함하는 혼합물로부터 재구성된 것인 제제.
  41. 제1항 또는 제2항에 있어서, 피코빌리좀이 시그날-생성 시스템에 대한 에너지 공여체 또는 에너지 수용체인 제제.
  42. 제3항에 있어서, 피코빌리좀이 시그날-생성 시스템에 대한 에너지 공여체 또는 에너지 수용체인 제제.
  43. 제4항에 있어서, 피코빌리좀이 시그날-생성 시스템에 대한 에너지 공여체 또는 에너지 수용체인 제제.
  44. 제1항 또는 제2항에 있어서, 피코빌리좀이 피코빌리좀 구성성분을 발현할 수 있는 유전자 재조합체, 하이브리드 및 돌연변이체로 이루어진 그룹중에서 선택된 유기체로부터 수득된 하나 이상의 단백질을 포함하는 것인 제제.
  45. 제3항에 있어서, 피코빌리좀이 피코빌리좀 구성성분을 발현할 수 있는 유전자 재조합체, 하이브리드 및 돌연변이체로 이루어진 그룹중에서 선택된 유기체로부터 수득된 하나 이상의 단백질을 포함하는 것인 제제.
  46. 제4항, 제11항 또는 제14항에 있어서, 피코빌리좀이 피코빌리좀 구성성분을 발현할 수 있는 유전자 재조합체, 하이브리드 및 돌연변이체로 이루어진 그룹중에서 선택된 유기체로부터 수득된 하나 이상의 단백질을 포함하는 것인 제제.
  47. 제9항에 있어서, 피코빌리좀이 피코빌리좀 구성성분을 발현할 수 있는 유전자 재조합체, 하이브리드 및 돌연변이체로 이루어진 그룹중에서 선택된 유기체로부터 수득된 하나 이상의 단백질을 포함하는 것인 제제.
  48. 제10항에 있어서, 피코빌리좀이 피코빌리좀 구성성분을 발현할 수 있는 유전자 재조합체, 하이브리드 및 돌연변이체로 이루어진 그룹중에서 선택된 유기체로부터 수득된 하나 이상의 단백질을 포함하는 것인 제제.
  49. 제12항에 있어서, 피코빌리좀이 피코빌리좀 구성성분을 발현할 수 있는 유전자 재조합체, 하이브리드 및 돌연변이체로 이루어진 그룹중에서 선택된 유기체로부터 수득된 하나 이상의 단백질을 포함하는 것인 제제.
  50. 제13항에 있어서, 피코빌리좀이 피코빌리좀 구성성분을 발현할 수 있는 유전자 재조합체, 하이브리드 및 돌연변이체로 이루어진 그룹중에서 선택된 유기체로부터 수득된 하나 이상의 단백질을 포함하는 것인 제제.
  51. 분석물과 동일한 결합 특이성을 갖는 시약 분자 또는 특이적 결합 파트너를 제1항, 제2항, 제4항 및 제8항 중 어느 한 항에 따른 피코빌리좀으로 검출가능하도록 표지하는 것을 특징으로 하여, 분석물과 당해 분석물의 특이적 결합 파트너간의 결합을 검출하는 것을 포함하여, 샘플내 분석물의 존재 또는 양을 검정하는 방법.
  52. 제51항에 있어서, 피코빌리좀이 특이적 결합 파트너에 부착된 방법.
  53. 제51항에 있어서, 피코빌리좀이, 검정 성분에 특이적으로 결합하는 리간드 또는 수용체에 부착된 방법.
  54. 제51항에 있어서, 피코빌리좀이 검정 성분에 비공유적 수단에 의해 부착된 방법.
  55. 제51항에 있어서, 피코빌리좀이 검정 성분에 공유결합에 의해 부착된 방법.
  56. 제51항에 있어서, 특이적 결합 파트너에 대한 분석물의 결합이, 비결합된 특이적 결합 파트너로부터 결합된 특이적 결합 파트너를 분리하지 않고 측정되는 균질한 검정인 방법.
  57. 제51항에 있어서, 피코빌리좀이 에너지 공여체 또는 수용체인 형광 에너지 전달단계를 추가로 포함하는 방법.
  58. 제51항에 있어서, 피코빌리좀이 동결 또는 탈수방법에 의해 제조되어 사용되는 방법.
  59. 제51항에 있어서, 분석물이 핵산, 약물, 리간드, 항원, 햅텐, 항체 및 탄수화물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 방법.
  60. 제19항에 있어서, 분자종이 다가 리간드 또는 다가 수용체를 통해 피코빌리좀 구성성분 단백질에 부착되는 것인 제제.
  61. 제20항에 있어서, 분자종이 다가 리간드 또는 다가 수용체를 통해 피코빌리좀 구성성분 단백질에 부착되는 것인 제제.
  62. 제41항에 있어서, 하나 이상의 피코빌리좀을 포함하는 시그날 생성 시스템을 추가로 포함하는 제제.
  63. 제42항에 있어서, 하나 이상의 피코빌리좀을 포함하는 시그날 생성 시스템을 추가로 포함하는 제제.
  64. 제43항에 있어서, 하나 이상의 피코빌리좀을 포함하는 시그날 생성 시스템을 추가로 포함하는 제제.
  65. 제51항에 있어서, 피코빌리좀이 고형 지지체 상에 고정화된 것인 방법.
  66. 제65항에 있어서, 고형 지지체 상이 합성막, 중합체, 중합체성 비드, 중합체성 매트릭스, 미세입자 및 유리로 이루어진 그룹으로부터 선택된 것인 방법.
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