JP3433952B2 - シクロスポリン免疫アッセイ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】１．発明の分野 体は、自分と他とを区別する複雑な免疫応答系に頼って
いる。免疫系が正常に機能することは、体の長期にわた
る健康のために肝要である。

【０００２】欠陥ある免疫応答は、自己を他者から護る
体の能力の欠失を招き得る。過大な免疫応答は、他の場
合は無害なものに対する体の過剰な反応を招き得る。時
に応じ、体の免疫系は欠足する応答を増大させるか、あ
るいは過大な応答を抑制するために制御されなければな
らない。例えば、腎臓、心臓、心肺、骨髄および肝臓等
の器官をヒトに移植した場合、時により体は、同種移植
片拒絶と称される工程により移植組織を拒絶する。同種
移植片拒絶の治療において、しばしば免疫系が、薬剤処
置を通して制御された様式で抑制される。免疫抑制薬
は、他者組織の同種移植片拒絶を防止するために、移植
受容者に対して注意深く投与される。

【０００３】米国および他の国々において免疫抑制剤と
しての用途が見出されているシクロスポリン薬の一つ
は、シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）である。ＣｓＡは、一
般構造

【化１１】 を有する環状ウンデカペプチドであり、式中のシクロス
ポリンＡの環状骨格を形成しているすべてのα−アミノ
酸残基は、Ｄ−配置であるα−アミノ酸８を除いてＬ−
配置である。アミノ酸残基１は、通常９個の炭素のアミ
ノ酸である〔２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ，６Ｅ〕−３−ヒドロキ
シ−４−メチル−２−メチルアミノ−６−オクテン酸か
ら誘導される。アミノ酸残基１、３、４、６、９、１
０、および１１は、シクロスポリンＡの環状骨格のアミ
ド窒素原子においてＮ−メチル化されている。シクロス
ポリンＡは、米国特許第４，１１７，１１８号（１９７
８）および４，３９６，５４２号（１９８３）に記述さ
れている。

【０００４】ＣｓＡは、抗菌性、抗関節炎および抗炎症
活性等の他の有用な性質を有し、また糖尿症、マラリア
および自己免疫疾患等の他の症状の治療における用途も
見出されるであろう。ウンデカペプチド環を保持してい
る多数のＣｓＡ代謝産物が同定され、報告されている
（Ｍａｕｒｅｒ，Ｇ．；Ｌｏｏｓｌｉ，Ｈ．Ｒ．；Ｓｃ
ｈｒｅｉｅｒ，Ｅ．；Ｋｅｌｌｅｒ，Ｂ．のＤｒｕｇ
Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏ
ｎ，１９８４，１２（１），１２０−１２６，該代謝産
物の構造、命名および分析データを、ここに参考として
取入れる）。ＣｓＡが同種移植片拒絶の防止のために使
用された場合に、これらの代謝産物が所望の免疫抑制活
性または何らかの望ましからぬ不利益な反応のいずれか
においてどのような役割を演ずるものかは知られていな
い。

【０００５】ＣｓＡは、極めて効果的な免疫抑制剤では
あるが、有効投与量の範囲が狭く、また過剰投与は深刻
な副作用を生じるため、その使用は注意深く管理されな
ければならない。ＣｓＡ治療を受け、過少なＣｓＡが移
植片拒絶を起こすであろう腎臓、心臓または肝臓移植患
者において、腎機能不全、高血圧、心臓血管痙攣、多毛
症、にきび、振せん、痙攣、頭痛、ガム質過形成、下
痢、悪心、嘔吐、肝毒性、腹部不快感、感覚異常、潮
紅、白血球減少、リンパ腫、静脈洞炎、および女性化乳
房等が観察されている。

【０００６】ＣｓＡ投与の管理は、患者内の該薬剤の存
在水準の注意深い制御を含む。ＣｓＡの分布および代謝
は、患者毎に大きく異なり、また逆反応の広い範囲およ
び重篤さゆえに、薬物水準の正確な監視が基本的である
と考えられる。

【０００７】シクロスポリン検出のための実験室的方法
が開発されたきた。これらの技術は、典型的には高速液
体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）、放射免疫アッセイ
（ＲＩＡ）、または螢光偏光性免疫アッセイ（ＦＰＩ
Ａ）に関する。例えば、Ｗｏｌｆ，Ｂ．Ａ．らのＣｌｉ
ｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍ．１９８９，３５（１），１２０
−１２４；Ｖｅｒｎｉｌｌｅｔ，Ｌ．らのＣｌｉｎｉｃ
ａｌ Ｃｈｅｍ．１９８９，３５（４），６０８−６１
１；Ｂａｌｌ，Ｐ．Ｅ．らのＣｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅ
ｍ．１９８８，３４（２）２５７−２６０；Ｓｃｈｒａ
ｎ，Ｈ，Ｆ．らのＣｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍ．１９８
７．３３（１２），２２２５−２２２９；Ｓａｎｇｈｖ
ｉ，Ａ．らのＣｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍ．１９８８，
３４（９），１９０４−１９０６；ＭｃＢｒｉｄｅ，
Ｊ．Ｈ．らのＣｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍ．１９８９，
３５（８），１７２６−１７３０；Ｑｕｓｎｉａｕｘ，
Ｖ．らのＣｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍ．１９８７，３３
（１），３２−３７参照。

【０００８】これらの技術のそれぞれは、手法の安全性
および複雑さ、ならびに興味あるシクロスポリンに対す
る特異性の程度等においてある程度制限がある。例え
ば、ＨＰＬＣは、長い試料調製および／または操作時間
を、高いコストの労力集中的方法を用いながら要求し、
ＲＩＡは、放射性材料の取扱いについて周知の危険性を
与え、またＦＰＩＡは、非特異的モノーまたはポリクロ
ーナル抗体に基づく場合には、しばしばＣｓＡとその代
謝産物との間の区別がつかない。選択されたシクロスポ
リン類に対して特異的な単純な分析方法が、シクロスポ
リン治療の管理に使用するために必要とされる。

【０００９】免疫アッセイは、シクロスポリンを含むと
考えられる試料中のシクロスポリン量の単純な測定方法
の要求には合致した技術である。しかしながら、興味あ
るシクロスポリンを認識し得る利用可能な抗体類のほと
んどは、シクロスポリン代謝産物等の密接に関連する化
合物をも認識し、交差反応を起こす。この交差反応のた
めに、これらの抗体に依存する免疫アッセイは、興味あ
るシクロスポリンに対する特異性が、望まれる程度より
低い。興味あるシクロスポリン以外の化合物と交差反応
を起こす抗体に依存するシクロスポリン免疫アッセイ
は、交差反応性化合物が、興味あるシクロスポリンを認
識する抗体による認識に対して実質的に不活性化された
場合には改善され得るであろう。

【００１０】本発明の方法および組成物は、シクロスポ
リン類についての単純な特異的免疫アッセイに関連す
る。本発明の方法および組成物は、シクロスポリンの免
疫アッセイ方法における交差反応性化合物の不活性化方
法にも関連するものである。

【００１１】２．関連技術の簡単な説明 国際特許出願第８，６０２，０８０（１９８６）は、あ
る種のシクロスポリンに対して選択的なモノクローナル
抗体を記述している。これらの抗体は、抗原性担体に対
して８位の（Ｄ）−リジンまたは２位の（Ｌ）−スレオ
ニン等の修飾アミノ酸残基を介して結合されたシクロス
ポリン類に対する応答において調製される。

【００１２】ヨーロッパ特許出願第２８３，８０１号
（１９８８）は、螢光免疫アッセイ法および抗体産生に
使用するシクロスポリンＡ誘導体を記述している。シク
ロスポリンＡは、第１のアミノ酸残基のアミノ酸側鎖を
介して免疫原性担体に連結されている。Ｃａｃａｌａｎ
ｏ，Ｎ．Ａ．；Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｗ．Ｌ．；Ｅｒｌ
ａｎｇｅｒ，Ｂ．Ｆ．のＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔ
ｈ．１９８９，１１８，２５７−２６３は、確かではな
いが多分、４−ベンゾイル安息香酸上のシクロスポリン
Ａアルキル側鎖の無作為の光化学的結合を記述してい
る。これらの結合は、抗体調製用の免疫原性担体への結
合のために使用される。

【００１３】米国特許第４，７２７，０３５号（１９８
８）は、シクロスポリンの免疫アッセイ方法を記述して
いる。該方法は、放射性ヨウ素または螢光免疫アッセイ
のいずれかに関連する。Ｑｕｅｓｎｉａｕｘ，Ｖ．Ｆ．
Ｊ．；Ｔｅｅｓ，Ｒ．；Ｓｃｈｒｅｉｅｒ，Ｍ．Ｈ．；
Ｗｅｎｇｅｒ，Ｒ．Ｍ．；Ｖａｎ Ｒｅｇｅｎｍｏｒｔ
ｅｌ，Ｍ．Ｈ．Ｖ．らのＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕ
ｎｏｌｏｇｙ １９８７，２４（１１），１１５９−１
１６８は、シクロスポリン−免疫原接合体に対する応答
において生成する抗体を記述している。該接合体は、シ
クロスポリンに対して２または８のアミノ酸上の修飾側
鎖を介して結合されている。

【００１４】米国特許第４，７６４，５０３号（１９８
８）、第４，６３９，４３４号（１９８７）および第
４，３８４，９９６号（１９８３）は、第８のアミノ酸
残基において修飾されたシクロスポリン類を記述してい
る。これらのシクロスポリンは、アミノ酸側鎖において
ヒドロキシル化され、免疫抑制剤として有用である。

【００１５】発明の要約 本発明は一局面において、シクロスポリンを含むと考え
られる試料中のシクロスポリン量の測定に有用な方法に
関する。該方法は、ａ）水性媒質中に、１）シクロスポ
リンを含むと考えられる試料、２）シクロスポリンの環
状骨格の一部であるアラニン窒素原子の一つにおいて、
場合により連結基を介して標識に接合されるシクロスポ
リン、および３）該シクロスポリン標識接合体に結合可
能な抗体類を合し；ならびに、場合によりｂ）該抗体類
に結合する該シクロスポリン標識接合体の量を測定する
工程を含む。

【００１６】本発明の他の局面は、シクロスポリンを含
むと考えられる試料中のシクロスポリン量測定アッセイ
において、妨害交差反応物質を不活性化するために有用
な方法に関する。該方法は、試料を含むアッセイ媒質
を、該妨害交差反応物質を認識可能であってシクロスポ
リン量測定アッセイを実質的に妨害しない抗体と合する
工程を含む。

【００１７】本発明の他の局面は、シクロスポリンの環
状骨格の一部であるアラニン窒素原子の一つにおいて、
場合により連結基を介して標識に接合されるシクロスポ
リンに関するものである。これらの接合体は、本発明の
アッセイ方法において有用である。

【００１８】本発明の他の局面は、シクロスポリンの環
状骨格の一部であるアラニン窒素原子の一つにおいて、
場合により連結基を介して免疫原性担体に接合されるシ
クロスポリンに関する。これらの接合体は、本発明のア
ッセイ方法において使用するための抗体類の生成に有用
である。

【００１９】本発明の他の局面は、場合により連結基を
介して標識に結合されるアチオシクロスポリンに関す
る。

【００２０】本発明の他の局面は、場合により連結基を
介して免疫原性担体に結合されるアチオシクロスポリン
に関する。

【００２１】本発明の他の局面は、シクロスポリンの環
状骨格の一部であるアラニン窒素原子の一つにおいて、
場合により連結基を介して免疫原性担体に接合されるシ
クロスポリンに対する応答により生成される抗体類に関
する。これらの抗体は、本発明のアッセイ方法において
有用である。

【００２２】本発明の他の局面は、場合により連結基を
介して免疫原性担体に接合されるアチオシクロスポリン
に対する応答により生成される抗体類に関する。これら
の抗体は、妨害的交差反応物質の低減において有用であ
る。

【００２３】本発明の他の局面は、シクロスポリンの環
状骨格の一部であるアラニン窒素原子の一つにおいて、
場合により連結基を介して免疫原性担体または標識に接
合されるシクロスポリンの調製方法に関する。

【００２４】本発明の他の局面は、場合により連結基を
介して免疫原性担体または標識に接合されるアチオシク
ロスポリンの調製方法に関する。

【００２５】本発明の他の局面は、本発明のアッセイ方
法の遂行に有用な試薬類に関する。

【００２６】本発明の他の局面は、シクロスポリンのア
ッセイにおける妨害的交差反応物質の不活性化方法の遂
行に有用な試薬類に関する。

【００２７】本発明の他の局面は、本発明のアッセイ方
法を都合良く遂行するために有用なキットに関する。

【００２８】本発明の他の局面は、シクロスポリンのア
ッセイにおける妨害的交差反応物質の不活性化方法を都
合良く遂行するために有用なキットに関する。

【００２９】特定の実施態様の記述 シクロスポリン免疫アッセイにおいて有用な方法、組成
物、試薬およびキットが提供される。特定の実施態様の
記述に先立って、多くの用語を定義しておく。

【００３０】定 義 連結基−連結基は、２つ以上の準構造を連結している構
造中の部位である。連結基は、準構造間に張り渡る水素
（または他の一価原子）以外の原子の少なくとも一つの
連続鎖を有している。連結基の原子および連結基内の鎖
の原子は、それら自体化学結合により結合されている。
連結基内の原子数は、水素以外の原子を計数することに
より決定される。連結基内の鎖の原子数は、連結される
準構造間の最短経路に沿った水素原子以外の原子数を計
数することによって決定される。例えば、ジフェニルメ
タンは、１個の原子の鎖を含む１原子の連結基により連
結された２個のベンゼン環を有し、スチルベンは、２個
の原子の鎖を含む２原子の連結基により連結された２個
のベンゼン環を有し、１，２−ジフェニル−３−エチル
シクロヘキサンは、２個の原子の鎖を含む８原子の連結
基により連結された２個のベンゼン環を有する。

【００３１】カルボキサミド基−カルボキサミド基は、
式：

【化１２】 式中、Ｘは、水素、アルキル（約９個未満の炭素原
子）、またはヒドロキシアルキル（約９個未満の炭素原
子）である、を有する準構造を含んだ構造中の一部であ
る。Ｘは、好ましくは水素または水素原子以外に主とし
て約９個未満の炭素原子、好ましくは約７個未満の炭素
原子、更に好ましくは約５個未満の炭素原子を含む、場
合によりヒドロキシル基で置換されていてもよい直鎖ま
たは分枝状アルキル基である。カルボキサミドは、典型
的にはアルキレン鎖により互いに連結され、ポリ（ペプ
チド類）とも称されるポリ（カルボキサミド）を形成す
る。該アルキレン鎖は、好ましくは水素原子以外に主と
して約１１個未満の炭素原子、好ましくは約９個未満の
炭素原子、更に好ましくは約７個未満の炭素原子を含
む、場合によりヒドロキシル基で置換されていてもよい
直鎖または分枝状アルキル鎖である。

【００３２】非−オキソカルボニル−式：

【化１３】 の一般構造を有するケトンまたはアルデヒド以外の基で
あって、式中、Ｔ_１はカルコゲン（酸素または硫黄）ま
たは置換窒素であり、窒素の置換基は、例えばＨまたは
アルキルであってよい。非−オキソカルボニル基の例
は、カルボン酸（エステル類、アミド類、カルバメート
類、カルボネート類、尿素類等）であり、また、それら
の硫黄および窒素類似体も含む。

【００３３】シクロスポリン−本発明との関連におい
て、シクロスポリン基は、天然または合成シクロスポリ
ンまたは誘導体である。シクロスポリン基は、一般式：

【化１４】

【００３４】式中、Ｒは、水素原子以外に主として約９
個未満の炭素原子、好ましくは約７個未満の炭素を含
む、場合によりヒドロキシル基で置換されていてもよい
直鎖または分枝状アルキル基である、を有する環状のウ
ンデカペプチドである。

【００３５】例えば、シクロスポリンＡにおいてＲは、
−ＣＨ_２ＣＨ_３であり、シクロスポリンＢにおいてＲ
は、−ＣＨ_３であり、シクロスポリンＣにおいてＲは、
−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ_３であり、およびシクロスポリンＤ
においてＲは、−ＣＨ（ＣＨ_３）_２である。好適なシク
ロスポリン類は、シクロスポリンＡ、シクロスポリン
Ｂ、シクロスポリンＣ、シクロスポリンＤ、シクロスポ
リンＥ、シクロスポリンＦ、シクロスポリンＧ、シクロ
スポリンＨ、およびシクロスポリンＩを含む。

【００３６】シクロスポリンの厳密な構造は、例毎に非
主要部分で変わり得る。例えば、アミノ酸残基２−６、
および９−１１の側鎖構造の変化は、本発明の範囲にお
いて熟考される。更に、アミノ酸残基２−６、および９
−１１のアミド窒素原子上の付属置換基の構造変化は、
本発明の範囲において熟考される。また更に、アミノ酸
残基２−１１のα−炭素の立体化学的絶対配置の変化
は、本発明の範囲において、熟考される。

【００３７】本発明の範囲内において、第１のアミノ酸
残基は、実質的に修飾されずに保たれるであろう。更
に、第７および第８のアミノ酸残基の一方または両者
は、ｄ−アラニン、ｌ−アラニンまたはそれらの混合物
であろう。

【００３８】シクロスポリンのアラニン窒素原子−シク
ロスポリン分子の各環状ペプチド単位は、該シクロスポ
リン環の骨格の部分としてアミド窒素原子を含んでい
る。本発明の範囲において、アラニン残基のアミド窒素
原子は、シクロスポリンのアラニン窒素原子である。例
えば、これらはシクロスポリンＡ、ＣおよびＤにおける
第７および第８のアミノ酸残基、ならびにシクロスポリ
ンＤにおける第２、第７および第８のアミノ酸残基の窒
素原子である。

【００３９】シクロスポリン第１アミノ酸残基の第６炭
素原子−シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）の第１のアミノ酸
残基は、遊離のアミノ酸〔２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ，６Ｅ〕−
３−ヒドロキシ−４−メチル−２−メチルアミノ−６−
オクテン酸の縮合形態である。 Ｗｅｎｇｅｒ，Ｒ．の
米国特許第４，３９６，５４２号（１９８３）；Ｗｅｎ
ｇｅｒ，Ｒ．Ｍ．のＨｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍ．Ａ
ｃｔａ．１９８３，６６（７），２３０８−２３２１参
照。この固有なアミノ酸は、Ｎ−メチル−（４Ｒ）−４
−ブト−２Ｅ−エン−１−イル−４−メチル（Ｌ）スレ
オニン（ＭｅＢｍｔ）とも称される。Ｗｅｇｎｅｒ，
Ｒ．らの米国特許第４，６３９，４３４号（１９８７）
参照。ＭｅＢｍｔの縮合および遊離形態の両者の構造お
よび番号付けは、式：

【化１５】 に示される。

【００４０】アチオシクロスポリン−その組成の面の一
つにおいて、本発明は、第１のシクロスポリンアミノ酸
残基を第６および第７の炭素原子を連結している結合で
開裂させ、得られた開裂生成物を、場合により連結基を
介して、標識、免疫原性担体、小有機分子等に接合する
ことにより調製される化合物に関する。第１のアミノ酸
の側鎖が、第６の炭素−第７の炭素結合において開裂さ
れる場合には、第７および第８の炭素原子は除去され、
第６の炭素原子に官能基が導入される。

【００４１】第６の炭素原子上の新たな官能基は、第６
の炭素原子の連結基、標識、免疫原性担体、小有機分子
等への結合を許容するいずれの官能基でもよい。このよ
うな官能基は、複素原子含有基、好ましくはオキソカル
ボニルまたは非−オキソカルボニルを含む。第１のシク
ロスポリンアミノ酸残基の第７および第８の炭素原子が
除去され、第６の炭素原子に官能基が導入されて得られ
たシクロスポリンを、アチオシクロスポリンと称する。

【００４２】アチオシクロスポリンカルボキシアルデヒ
ド−本発明の範囲において、シクロスポリンの第１のア
ミノ酸残基の側鎖が、第６および第７の炭素原子を連結
しているオレフィン性結合において酸化的に開裂され、
第１のアミノ酸残基の側鎖の第７および第８の炭素原子
が除去されて該第１のシクロスポリンアミノ酸残基の第
６の炭素原子においてアルデヒド官能基を形成するよう
に酸素原子により置換されたシクロスポリンを形成する
ことが好ましい。

【００４３】上述の好ましい化合物は、アチオシクロス
ポリンカルボキシアルデヒドと称され、その構造は、
式：

【化１６】 により示される。

【００４４】Ｒ_１Ｒ_２およびＲ_３は、Ｈまたはヒドロキ
シルであり、少なくとも一つがヒドロキシルである。Ｒ
_４は、Ｈまたはメチルである。Ｒ_５は、ヒドロキシル、
トリアルキルシロキシまたはアシロキシであり、Ｒ
_６は、Ｈである。更に好ましくは、Ｒ_１およびＲ_５はヒ
ドロキシルであり、Ｒ_２、Ｒ_３およびＲ_６はＨであり、
Ｒ_４はメチルである。この最も好ましい実施態様は、シ
クロスポリンＡ代謝産物Ｍ−１から形成されるアチオシ
クロスポリンカルボキシアルデヒドである。

【００４５】妨害的交差反応性物質−興味あるシクロス
ポリンを認識し得る抗体類によって認識されるであろう
興味あるシクロスポリン以外の物質は、妨害的交差反応
性物質である。そのような物質は、興味あるシクロスポ
リンに関連する化合物を含み得る。特に、ウンデカペプ
チド環を保存しているシクロスポリンの代謝産物は、共
通する妨害的交差反応性物質である。Ｍａｕｒｅｒらの
前述に取入れた業績は、多くのシクロスポリン代謝産物
を記述している。８種類の共通代謝産物の構造を下記に
示す。これらの８種類の代謝産物は例示的なものであっ
て排他的ではない妨害的交差反応性物質の例である。本
発明は、その最も好ましい面における一つにおいて、妨
害的交差反応性物質としてシクロスポリンＡ代謝産物Ｍ
−１に関連する。

【００４６】

【化１７】

【００４７】

【００４８】有機基−有機基は、大有機分子の残基であ
るか、または小有機分子の残基である。有機基は、好ま
しくは免疫原性担体および標識をいずれかの連結基と共
に含んでなる。有機基は、任意の数の原子を有してもよ
いが、好ましくは水素を含めて少なくとも５個の原子を
含む。

【００４９】小有機分子の残基−小有機分子の残基は、
小有機分子の結合により誘導される基である。小有機分
子は、ビオチン、フルオレセイン、ローダミンおよび他
の染料、テトラサイクリンおよび他の蛋白質結合性分
子、ならびにハプテン類等の分子量が約２０００未満、
好ましくは約１００−１０００、更に好ましくは約３０
０−６００の化合物である。該小有機分子は、シクロス
ポリンのアラニン窒素原子の一つにおいて、場合により
連結基を介してシクロスポリンに結合（接合）可能であ
る。該小有機分子がこのように結合した場合に、これは
小有機分子の残基になる。

【００５０】大有機分子の残基−大有機分子の残基は、
分子量が２０００を越える分子を有する基であり、ポリ
（アミノ酸）、リポポリサッカライド類、粒状物等を含
む。このような基は、他の物のうちで標識または免疫原
性担体であり得る。

【００５１】ポリ（アミノ酸）−ポリ（アミノ酸）は、
アミノ酸から形成されるポリアミドである。ポリ（アミ
ノ酸）は、ポリペプチドとも称され、一般的には約２，
０００からの分子量範囲にわたり、分子量の上限はない
が通常１０，０００，０００未満、普通には６００，０
００ダルトンを越えない。また、通常は、抗原性担体で
あるか、または酵素が関与するかに依存して、異なる範
囲となるであろう。

【００５２】免疫原性担体一免疫原性担体は、シクロス
ポリンのアラニン窒素原子に対して場合により連結基を
介して接合され、哺乳動物に注射された場合に、免疫応
答を誘発し、シクロスポリンに結合する抗体類の産生を
引起こす基である。免疫原性担体は、抗原性担体とも称
され、またこの技術で一般的な他の同義語により称され
る。

【００５３】抗原性担体の分子量は、典型的には約２，
０００から１０^７の範囲、通常は約２０，０００〜６０
０，０００、より普通には約２５，０００〜２５０，０
００の範囲である。通常、１５０，０００の分子量あた
り少なくとも約１個のシクロスポリン基、更に通常に
は、５０，０００分子量あたり少なくとも約１個、好ま
しくは２５，０００の分子量あたり少なくとも１個が存
在する。

【００５４】ポリ（アミノ酸）抗原性物質として種々の
型の蛋白質が使用されてよい。これらの型は、アルブミ
ン類、グロブリン等の血清蛋白質類、水晶体蛋白質類、
リポ蛋白質等を含む。例示的な蛋白質は、ウシ血清アル
ブミン（ＢＳＡ）、キーホールリンペットヘモシアニン
（ＫＬＨ）、卵アルブミン、ウシガンマークロブリン
（ＢＧＧ）等を含む。別法として、合成ポリ（アミノ
酸）を使用してもよい。

【００５５】該免疫原性担体は、モノサッカライドの反
復する縮合により構築される高分子量ポリマーであるポ
リサッカライドであってもよい。ポリサッカライドの例
は、デンプン、グリコーゲン、セルロース、アラビアゴ
ム等の炭化水素ゴム、寒天等である。ポリサッカライド
は、ポリアミノ酸残基および／または脂質残基を含んで
いてもよい。該免疫原性担体は、単独または上述のポリ
（アミノ酸）もしくはポリサッカライドの一つに接合す
るポリ（核酸）であってもよい。

【００５６】該免疫原性担体は、粒状物であってもよ
い。該粒状物は、少なくとも約０．０２ミクロンである
が約１００ミクロンを越えないものが一般的で、通常は
少なくとも約０・０５ミクロンで約２０ミクロン未満、
好ましくは約０．３〜１０ミクロンの直径である。該粒
状物は、有機性または無機性の、膨潤性または非膨潤
性、多孔性、または非多孔性の、好ましくは水に近似し
た密度を有する一般的には約０．７〜１．５ｇ／ｍＬの
ものであって、透明、半透明または不透明材料からなっ
ている。該粒状物は、例えば、赤血球、白血球、リンパ
球、ハイブリドーマ、ストレプトコッカス、スタフィロ
コッカスアウレウス、Ｅ．コリ、ウイルス等の細胞およ
び微生物等、生物学的材料であってもよい。該粒状物
は、有機または無機のポリマー、リポソーム、ラテック
ス粒子、リン脂質ベシクル、キロミクロン（ｃｈｙｌｏ
ｍｉｃｒｏｎｓ）、リポ蛋白質等であってもよい。

【００５７】ポリマー類は、付加または縮合ポリマーの
いずれであってもよい。これらから誘導される粒状物
は、水性媒質中に容易に分散し、またシクロスポリン基
に直接あるいは連結基を介して間接的に結合（接合）す
るように吸着性または官能性付与可能である。

【００５８】該粒状物は、天然産生材料、合成的に修飾
された天然材料、および合成材料から誘導され得る。有
機ポリマーのうち特に興味あるものは、ポリサッカライ
ド、特にはセファロースとして入手可能なアガロース、
セファデックスおよびセファクリルとして入手可能なデ
キストラン、セルロース、デンプン等の交差結合ポリサ
ッカライド；ポリスチレン、ポリビニルアルコール等の
付加ポリマー類；アクリレートおよびメタクリレート等
の誘導体であるホモポリマー類およびコポリマー類、等
には遊離のヒドロキシル官能基を有するエステル類およ
びアミド類等である。

【００５９】該粒状物は、通常多官能性であり、シクロ
スポリン基に対して場合により連結基を介して結合され
るか、あるいは結合（接合）可能である。多くの官能基
が利用可能、または取込み可能である。官能基は、カル
ボン酸、アルデヒド、アミノ基、シアノ基、エチレン
基、ヒドロキシル基、メルカプト基等を含む。多くの種
類の化合物を粒子に連結する方法は、周知であり、また
文献中に広く例示されている。例えば、Ｃａｕｔｒｅｃ
ａｓａｓのＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９７０，２４
５，３０５７が参考となり、その連結方法をここに参考
として取入れる。

【００６０】標識−標識は、信号を生成するか、あるい
は生成を誘発され得る任意の分子である。該標識は、分
析対象もしくは抗体に対し、または他の分子、例えばレ
セプタ、もしくはレセプタに結合可能なリガンド等、特
にはハプテンに対して接合されてよい。この発明におい
て、標識は、以下に記述されるように信号生成手段を含
む信号生成系の一つであり得る。

【００６１】該標識は、同位体的または非同位体的なも
のであって、好ましくは非同位体である。限定ではな
く、例示のために、標識は、酵素、酵素断片、酵素基
質、酵素阻害剤、補酵素、または触媒等の触媒反応系の
一部；螢光剤、染料、化学発光剤、発光剤、または感応
剤等の発色原系の一部；非磁性または磁性であり得る分
散性粒子、固体担体、リポソーム、リガンド、レセプ
タ、ハプテン、放射性同位体等である。

【００６２】酵素、酵素断片、酵素阻害剤、酵素基質、
および酵素反応系の他の成分を標識として使用し得る。
これらの成分のいずれかを標識として使用する場合、該
成分の一つに関連する化学反応は、信号生成系の一部で
ある。酵素類を使用する場合、分子量は、典型的には約
１０，０００〜６００，０００の範囲、更に普通には約
１０，０００〜３００，０００の範囲であり、また関与
する反応は、多くの場合加水分解または酸化還元反応で
あろう。結合触媒は、非酵素的触媒と共に酵素を含むこ
とができる。該酵素は、該非酵素的触媒による触媒反応
を進行させる反応試剤を生成するか、あるいは該非酵素
的触媒は、該酵素の基質（補酵素を含む）を生成し得
る。使用可能な多様な非酵素的触媒は、米国特許第４，
１６０，６４５号（１９７９）に見出され、その適切な
部分をここに参考として取入れる。

【００６３】使用される該酵素または補酵素は、染料等
の光吸収、まは螢光体等の輻射により光を放射する生成
物の産生により、所望の増幅を与える。別法として、触
媒反応は、例えば化学的発光等、直接的光放射を導き得
る。このような生成物を与える多数の酵素および補酵素
が、米国特許第４，２７５，１４９号の１９〜２３欄お
よび米国特許第４，３１８，９８０号の１０〜１４欄に
示されており、その開示をここに参考として取入れる。
多数の酵素の組合せが、米国特許第４，２７５，１４９
号の２３〜２８欄に示されており、その組合せは、本発
明において用途が見出され得る。この開示をここに参考
として取入れる。

【００６４】特に興味あるものは、過酸化水素の生成に
関与する酵素であり、また過酸化水素の染料前駆体を染
料へと酸化するための用途である。特定の組合せは、例
えば、グルコースおよびガラクトースオキシダーゼ等の
サッカライドオキシダーゼ、またはウリカーゼおよびキ
サンチンオキシダーゼ等の複素環オキシダーゼと組合さ
れる、過酸化水素を染料前駆体の酸化のために使用する
酵素、すなわち西洋ワサビパーオキシダーゼ、ラクトパ
ーオキシダーゼまたはマイクロパーオキシダーゼ等のパ
ーオキシダーゼを含む。他の酵素の組合せは、参考とし
て取入れた主題中に見出されるであろう。

【００６５】単一の酵素を標識として使用する場合、用
途が見出されるであろう酵素は、ハイドロラーゼ、トラ
ンスフェラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼま
たはシンセターゼおよびオキシドリダクターゼであり、
好ましくはハイドロラーゼである。別法として、ホタル
のルシフェラーゼおよび細菌性ルシフェラーゼ等のルシ
フェラーゼも使用することができる。主としてＩ．Ｕ．
Ｂ分類に基づい酵素の選択は：クラス１のオキシドレダ
クターゼおよびクラス３のハイドロラーゼ；特には、ク
ラス１において興味ある酵素はクラス１．１、更に特定
的には１．１．１、１．１．３および１．１．９９のデ
ヒドロゲナーゼ、およびクラス１．１１のパーオキシダ
ーゼである。ハイドロラーゼについては特にクラス３．
１、更に特定的には３．１．３およびクラス３．２、更
に特定的には３．２．１である。

【００６６】例示的なテヒドロゲナーゼとしては、マレ
エートデヒドロゲナーゼ、グルコース−６−リン酸デヒ
ドロゲナーゼ、およびラクテートデヒドロゲナーゼを含
む。オキシダーゼとしては、グルコースオキシダーゼが
例示される。パーオキシダーゼとしては、西洋ワサビパ
ーオキシダーゼが例示的である。ハイドロラーゼとして
は、アルカリホスファターゼ、β−グルコシダーゼおよ
びリゾチームが例示的である。ニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチド（ＮＡＤ）またはそのホスフェート（Ｎ
ＡＤＰ）を補酵素として使用するこれらの酵素は、特に
前者を使用する。一つの好ましい酵素は、グルコース−
６−リン酸デヒドロゲナーゼ、好ましくはＮＡＤ−依存
性グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼである。

【００６７】標識は、直接に、あるいは常法により粒子
または他の分子に結合する螢光性化合物または螢光体に
よって螢光性であってもよい。螢光性標識は、場合によ
り連結基を介して、シクロスポリンまたはシクロスポリ
ンに対する抗体もしくはレセプタに対し、結合される
か、あるいは結合（接合）可能とすべく官能化されるで
あろう。

【００６８】興味ある螢光体は、一般に約３５０ｎｍ以
上、通常約４００ｎｍ以上、好ましくは約４５０ｎｍ以
上の波長の光を放射するであろう。螢光体は、望ましく
は高い量子効率を有し、大きいストークスシフトを有
し、かつそれらの接合および使用条件下で化学的に安定
である。冷光性標識の用語は、電磁的照射、電気化学的
励起または化学的活性化による活性化において光を輻射
する物質を含み、また螢光性およびリン光性物質、シン
チレータ類ならびに化学発光性物質を含むことを意図す
るものである。

【００６９】興味ある螢光体は、ある種の主要な官能基
を有する種々の種類に含まれる。これらの主要な官能基
は、１−および２−アミノナフタレン，ｐ−ｐ−ジアミ
ノスチルベン類、ピレン類、四級フェナントリジン塩
類、９−アミノアクリジン類、ｐ，ｐ′−ジアミノスチ
ルベンイミン類、アントラセン類、オキサカルボキシア
ニン、メロシアニン、３−アミノエキレニン、ペリレ
ン、ビス−ベンゾキサゾール、ビス−ｐ−オキサゾリル
ベンゼン、１，２−ベンゾフェナジン、レチノール、ビ
ス−３−アミノピリジニウム塩類、ベレブリゲニン、テ
トラサイクリン、ステロフェノール、ベンズイミダゾリ
ルフェニルアミン、２−オキソ−３−クロメン、インド
ール、キサンテン、７−ヒドロキシクマリン、４，５−
ヘンズイミダゾール類、フェノキサジン、サリシレー
ト、ストロファンチジン、ポルフィリン類、トリアリル
メタン類、フラビン、および希土類キレートの酸化物お
よび塩類を含む。例示的螢光体は米国特許第４，３１
８，７０７号の７および８欄に列挙され、その開示をこ
こに参考として取入れる。

【００７０】エネルギー吸収体または冷却体が、分離し
て、あるいは相互に組合されて使用され得る。該吸収体
または冷却体は、更に少なくとも約５０ｎｍの直径を有
する固体不溶性粒子に結合され得る。該吸収体および冷
却体の間の距離の特異的結合（抗体−抗原結合等）に由
来する場合、吸収体の螢光が、冷却体により冷却され
る。冷却体は、螢光体と同じまたは異なってよく、通常
異なっている。

【００７１】検出可能な信号としての別の光源は、化学
発光源であり、従って標識は化学発光性化合物であり得
る。該化学発光源は、化学反応により電子的に励起した
状態となり、次いで検出可能な信号として作用するか、
あるいはエネルギーを螢光性受容体に与える光を放射す
る化合物に関連する。

【００７２】種々の条件において、化学発光性を与える
多くの数の化合物群が見出されている。一つの化合物群
は、２，３−ジヒドロ−１，４−フタルアジンである。
最も一般的な化合物は、上記化合物の５−アミノ類似体
であるルミノールである。該群の他の構成員は、５−ア
ミノ−６，７，８−トリメチル−およびジメチルアミン
−〔Ｃａ〕ベンゾ類似体である。これらの化合物は、ア
ルカリ性過酸水素またはカルシウムの次亜塩素酸塩、お
よび塩基により発光性になり得る。他の群の化合物は、
その親化合物について慣用名としてロフィン（ｌｏｐｈ
ｉｎｅ）をもつ２，４，５−トリフェニルイミダゾール
類である。化学発光性類似体は、パラ−ジメチルアミノ
−およびパラ−メトキシ−置換基を含む。化学発光体
は、ゲリジニウムエステル類、ジオキセタン類、および
例えばｐ−ニトロフェニル等の通常はオキサリル活性エ
ステル類であるオキサレート、ならびに塩基性条件下の
過酸化水素等のパーオキシド等により得ることもでき
る。別法として、ルシフェリン類は、ルシフェラーゼま
たはルシゲニンとの組合せにおいて使用されてもよい。

【００７３】接合体−接合体は、２つ以上のサブユニッ
トを場合により連結基を介して互いに結合し、単一の構
造を形成した分子である。結合は、サブユニット間の直
接結合（例えば化学結合）により、または連結基の使用
により形成され得る。例えば、本発明に関連して、シク
ロスポリンのアラニン窒素原子において、場合により連
結基を介して酵素に接合されたシクロスポリンは、シク
ロスポリン−酵素接合体である。場合により連結基を介
してサブユニットＢに接合されたサブユニットＡを含む
ものとして記述される構成物は、サブユニットＡが、場
合により連結基を介してサブユニットＢに結合している
構成物である。

【００７４】接合−接合は、２つのサブユニットを互い
に結合して接合体を形成する任意の方法である。接合工
程は、任意の数の工程を含んでもよい。

【００７５】レセプタ−レセプタは、分子の特定の空間
的および極性的組織を認識し得るいずれかの化合物また
は組成物である。これらの分子の組織化領域は、エピト
ープまたは決定部位と称される。天然に産生する例示的
なレセプタ類は、抗体類、酵素類、ｆａｂ断片、ポリ
（核酸）、補体成分、すなわちチロキシン結合グロブリ
ン、レクチン類、蛋白質Ａ等を含む。レセプタ類は、抗
リガンドとも称される。シクロスポリンを特異的に結合
する天然のレセプタが存在する。

【００７６】リガンド−リガンドは、そのためのレセブ
タが天然に存在するか、あるいは調製可能であるいずれ
かの有機分子である。例えば、本発明との関連において
シクロスポリンはリガンドであり、本発明はシクロスポ
リンのレセプタ抗体を提供する。本発明の他の関連にお
いて、シクロスポリンは、場合により連結基を介してア
ラニン窒素原子において第２のリガンドに接合され得
る。シクロスポリンがこのような様式で第２のリガンド
に連結した場合（シクロスポリン−リガンド接合体）、
該第２のリガンドを認識可能なレセプタ類は、該シクロ
スポリン−リガンド接合体を認識するであろう。

【００７７】ハプテン−ハプテンは、対応する抗体に特
異的に結合し得るが、それら自体は抗体調製のための免
疫原（抗原）としては作用しない。ハプテンを認識する
抗体は、免疫原性（抗原性）担体に結合されたハプテン
を含んでなる化合物に対して調製され得る。ハプテン
は、リガンドの一部分（ｓｕｂｓｅｔ）である。

【００７８】例えば、本発明との関連においてシクロス
ポリンはハプテンである。シクロスポリンがそのアラニ
ン窒素原子の一つにおいて、場合により連結基を介して
抗原性担体に接合された場合に、シクロスポリンを認識
し得る抗体が調製可能である。本発明の別の関連におい
て、シクロスポリンは、そのアラニン窒素原子の一つに
おいて、場合により連結基を介して第２のハプテンに接
合される。シクロスポリンがこのような形で第２のハプ
テンに接合された場合（シクロスポリン−ハプテン接合
体）、第２のハプテンを認識可能な抗体およびシクロス
ポリンを認識可能な抗体は、該シクロスポリン−ハプテ
ン接合体に結合可能であろう。

【００７９】特異的結合対の一員−特異的結合対の一員
（ｓｐｂメンバ）は、他方の分子の特定の空間的および
極性的組織に特異的に結合し、従って補体として定義さ
れる、表面上または空孔内の領域を有する異なった２つ
の分子の一つである。特異的結合対のメンバは、リガン
ドとレセプタ（抗リガンド）と称される。これらは、通
常は、抗原−抗体等の免疫学的対であるが、ビオチン−
アビジン、ホルモン−ホルモンレセプタ、核酸複製物、
ＩｇＧ−蛋白質Ａ、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ等
の他の特異的結合対は、免疫学的対ではない。

【００８０】支持体または表面−支持体または表面は、
多孔性または非多孔性の水不溶性材料である。該支持体
は、親水性または親水性を付与し得るものであって、シ
リカ、硫酸マグネシウム、およびアルミナ等の無機粉
体；例えば、濾紙、クロマトグラフィ用紙等の紙類を含
む繊維等、特にセルロース性またはセルロースから誘導
される材料である天然ポリマー材料；ニトロセルロー
ス、セルロースアセテート、ポリ（ビニルクロライ
ド）、ポリアクリルアミド、交差結合デキストラン、ア
ガロース、ポリアクリレート、ポリエチレン、ポリプロ
ピレン、ポリ（４−メチルブテン）、ポリスチレン、ポ
リメタクリレート、ポリ（エチレンテレフタレート）、
ナイロン、ポリ（ビニルブチレート）等の合成または修
飾された天然産生ポリマー類；それら自体で使用される
か、あるいは他の材料と組合せて使用される、Ｂｉｏｇ
ｌａｓｓとして入手可能なガラス、セラミクス、金属等
を含む。リポソーム、リン脂質胞、および細胞等の天然
または合成組合体も使用可能である。使用可能な他の材
料は、上述の免疫原性担体粒子の定義、および後述の信
号生成系の定義中に記述されている。

【００８１】ｓｂｐメンバの支持体または表面への結合
は、一般に文献中から入手できる周知の技術により行な
うことができ、また上述の免疫原性担体粒子の定義にも
記述されている。表面は、小片、棒、ビーズを含む粒子
等、多くの形状のいずれであってもよい。該表面は、通
常多官能性もしくは多官能性とし得るか、またはｓｂｐ
メンバを、特異的または非特異的な共有または非共有的
相互作用を介して結合し得るものである。連結のための
多くの種類の官能基が免疫原性担体粒子の定義に記述さ
れている。ｓｂｐメンバについて連結基の長さは、連結
される化合物の性質、連結される化合物間の距離、支持
体に連結される化合物間の距離のアッセイに対する効果
等に依存して広く変化し得る。該ｓｂｐメンバは、実質
的には支持体の外部表面に結合されるであろう。

【００８２】信号生成系−信号生成系の機能は、結合お
よび／または非結合標識の量に関連する検出可能な信号
を提供する生成物を生じることである。該信号生成系
は、少なくとも一つが標識である１種以上の成分を有し
ている。該信号生成系は、信号生成のために標識と相互
作用し得る信号生成手段を含め、測定可能な信号を生成
するために要するすべての試薬類を含む。

【００８３】該信号生成系は、外部的手段、通常は電磁
放射、好ましくは目視試験により検出可能な信号を提供
する。そのほとんどにおいて、該信号生成系は、発色性
基質と酵素とを含み、発色性基質が酵素反応的に紫外ま
たは可視領域において光を吸収する染料、リン光物質、
または螢光物質に変換される。

【００８４】該信号生成手段は標識と相互作用して検出
可能な信号を生成する。このような手段は、例えば電磁
放射、熱、化学的試剤等を含む。化学的試剤が使用され
る場合、該化学的試剤のある種のものは展開溶液の部分
として含まれてもよい。該化学的試剤は、基質、補酵
素、増強剤、第２の酵素、活性化剤、共因子、阻害剤、
清浄化剤、金属イオン、信号発生物質の結合に必要な特
異的結合物質等を含んでよい。補酵素、酵素的生成物と
反応する物質、他の酵素および触媒等、該化学的試剤の
あるものは、他の分子または支持体に対して固定されて
もよい。

【００８５】標識を含む信号生成系は、１種以上の粒子
を含んでもよく、粒子は不溶性であって、少なくとも約
５０ｎｍかつ約５０ミクロン以下、通常は少なくとも約
１００ｎｍかつ約２５ミクロン以下、好ましくは約０．
２〜５ミクロンの直径である。該粒子は、有機または無
機、多孔性または非多孔性、好ましくは水に近似する密
度、一般に約０．７から約１．５ｇ／ｍＬであってよ
く、透明、半透明または不透明な材料からなる。一般
に、標識として使用される粒子は、上述の免疫原性担
体、および支持体または表面の定義に記述されるものと
類似した特徴を有するであろう。

【００８６】多くの異なった型の粒子を、光輻射の制御
に使用してもよい。特に興味あるものは、木炭、すす、
グラファイト、コロイド性炭素等の炭素粒子である。炭
素粒子の他に、金属ゾルもまた有用であり、特には金、
銀および白金等の貴金属が有用である。他の金属誘導粒
子は、鉛、銀または銅スルフィド等の金属スルフィド
類、あるいは鉄または銅酸化物等の金属酸化物を含む。

【００８７】螢光化ラテックス粒子は、米国特許第３，
８５３，９８７号中に教示されており、Ｃｏｖａｌｅｎ
ｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐ．からＣｏｖａｓ
ｐｈｅｒｅｓとして商業的に入手可能である。

【００８８】シクロスポリン量の測定−シクロスポリン
測定のための、定量的、半定量的および定性的方法、な
らびに他の方法は、シクロスポリン量の測定方法として
考慮される。例えば、シクロスポリンを含むと考えられ
る試料中のシクロスポリンの存在の有無のみを検出する
方法は、本発明の範囲に含まれると考えられる。本発明
の範囲内と考えられる語法“シクロスポリン量の測定”
の同義語は、限定的ではなく、シクロスポリンの検出、
測定、または決定；シクロスポリンの存在の検出、測
定、または決定；およびシクロスポリンの量の検出、測
定、または決定を含む。

【００８９】実質的に結合もしくは認識可能または不可
能−は、特定のアッセイ条件下におけるアッセイ混合物
中の分子間の、結合または認識する量、またはその欠如
を指している。その最も広い面において、ある分子の他
の分子を結合もしくは認識可能であることと、第３の分
子を結合もしくは認識可能であることとの差異は、該分
子の相対濃度を含む特定の組合せのアッセイ条件下で、
意味のあるアッセイの実施を許容するために充分であ
る。他の面において、分子の相対濃度を含む特定組合せ
のアッセイ条件下において第３の分子に対して示される
反応性の２５％未満、好ましくは１０％未満、更に好ま
しくは５％未満であるような反応性を、第１の分子が第
２の分子に対して示す場合、交差反応的な意味である分
子は他の分子を結合または認識できない。

【００９０】シクロスポリンを含むと考えられる試料−
シクロスポリンを含むことが合理的に考えられる任意の
試料は、本発明の方法により分析可能である。このよう
な試料は、ヒト、動物またはヒト生成試料を含む。試料
は、アッセイの妨害とならない任意の都合よい媒質中に
調製され得る。典型的には、該試料は、水性溶液、また
は天然の液体、好ましくは尿、全血、血清、血漿または
唾液、更に好ましくは全血である。

【００９１】試料の前処理−場合により、シクロスポリ
ンを含むと考えられる試料は、前処理を受けてもよい。
前処理は、標的分析対象を１種以上のアッセイ試薬につ
いてより容易に利用できるように設計された工程であ
る。好ましくは、本発明の方法により分析される試料
は、存在するであろう細胞を溶解し、存在するであろう
蛋白質を沈殿させ、存在するであろうシクロスポリンを
可溶化することによって前処理される。このような前処
理は、有機溶媒、好ましくはアルコール、更に好ましく
はメタノールによる試料の処理を含む。

【００９２】特定の実施態様 本発明の一面は、シクロスポリンのアラニン窒素原子に
おいて場合により連結基を介して有機基に接合されたシ
クロスポリンを含む組成物に関する。好ましくは、シク
ロスポリンＡが、その第７および／または８のアミノ酸
残基のアラニン窒素原子において、場合により、水素以
外に約３５個未満、好ましくは２５個未満、更に好まし
くは１５個未満の原子の長さの鎖を有する、水素以外に
約５０個未満、好ましくは約３５個未満、更に好ましく
は約２０個未満の原子を有する連結基を介して接合され
る。該有機基は、分子量が約２，０００を越え、好まし
くは約５，０００を越える基、または、リガンド、ハプ
テンもしくはビオチン等の小有機分子である。好ましく
は、２，０００以上の分子量を有する基は、ポリ（アミ
ノ酸）である。更に好ましくは、該ポリ（アミノ酸）
は、キーホールリンペットのヘモシアニン（ＫＬＨ）、
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、もしくはウシガンマグ
ロブリン（ＢＧＧ）等の免疫原性担体、またはグルコー
ス−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）等の酵
素である。

【００９３】連結基は、存在する場合には、好ましくは
式：−（ＣＨ_２）_ｎＯ−のヒドロキシアルカン鎖を含ん
でなり、ここでシクロスポリンのアラニン窒素原子は、
該ヒドロキシアルカンの炭素原子に接合し、また有機基
は、該酸素原子に接合し、ｎは１〜６、好ましくは２〜
４の範囲の整数、更に好ましくはｎは２である。更に好
ましくはヒドロキシアルカン連結基は、アルキレン鎖に
よって互いに結合された約１〜３個のカルボキサミド基
によって、該酸素原子に延びている。拡張された場合、
有機基は、カルボキサミド拡張基の一端に結合され、ま
た該ヒドロキシアルカン基の酸素原子は、該カルボキサ
ミド拡張基の他端に結合される。

【００９４】別法として、連結基が存在する場合、該基
は式：

【化１８】

【００９５】のカルボキシベンジル基を含んでなり、こ
こにおいてシクロスポリンのアラニン窒素原子は、ベン
ジルの炭素原子に接合され、また有機基はカルボキシル
基の酸素原子に結合される。該カルボキシル基は、ベン
ジルの炭素に対して、好ましくはオルトまたはパラ、更
に好ましくはパラである。更に好ましくは、該カルボキ
シベンジル基は、アルキレン鎖によって互いに結合され
た約１〜約３個のカルボキサミド基によって、該酸素原
子に延びている。拡張された場合、有機基は、カルボキ
サミド拡張基の一端に結合され、また該カルボキシル基
の酸素原子は、該カルボキサミド拡張基の他端に結合さ
れる。

【００９６】更に好ましくは、連結基は：

【００９７】

【化１９】

【００２０】

【化２０】

【００９９】

【化２１】

【０１００】

【化２２】

【０１０１】シクロスポリン類は、環状ウンデカペプチ
ドであるため、アラニン窒素は、アミノ酸残基の一部で
ある。好ましくは、該アラニン窒素は、第７または８番
目のシクロスポリンアミノ酸残基の部分である。更に好
ましくは、該連結基が場合によりカルボキサミド拡張の
ヒドロキシアルカンを含んでなる場合、該アラニン窒素
はシクロスポリンアミノ酸残基第７番の部分であり、ま
た該連結基が場合によりカルボキサミド拡張のカルボキ
シベンジル基を含んでなる場合、該アラニン窒素は第７
番または８番から選択されたシクロスポリンアミノ酸残
基の部分である。

【０１０２】該有機基が免疫原性担体である場合、好適
には、これは抗原性ポリ（アミノ酸）、リポポリサッカ
ライドおよび粒子であってよい。それが、ポリ（アミノ
酸）であることは好ましい。更に好ましくは、それはキ
ーホールリンペットのヘモシアニン（ＫＬＨ）、または
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である。該有機基が免疫
原性担体である場合、連結基がカルボキシベンジル基で
あることは更に好ましい。また更に好ましくは、カルボ
キシベンジル基は、アルキレン鎖により互いに結合され
た約１個〜３個のカルボキサミド基により拡張される。

【０１０３】本発明により考慮される好ましい組成物の
一つは、式（ＸＩＸ）の連結基を介してキーホールリン
ペットヘモシアニンに対して、第７のアミノ酸残基のア
ラニン窒素原子において接合されるシクロスポリンＡお
よび第８のアミノ酸残基のアラニン窒素原子において接
合されるシクロスポリンＡの混合物である。

【０１０４】有機基が標識である場合、標識の型は、行
なわれるアッセイの型に依存する。酵素免疫アッセイの
ためには、該標識は酵素である。好ましくは、均一酵素
免疫アッセイのためには、グルコース−６−リン酸デヒ
ドロゲナーゼである。有機基が標識である場合、連結基
がヒドロキシアルカン基であることが更に好ましい。更
に好ましくは、該ヒドロキシアルカン基は、約１〜３個
のカルボキサミド基により拡張されている。

【０１０５】本発明により考慮されるその他の好ましい
組成物は、基（ＩＩ）の連結基を介して第７のアミノ酸
残基のアラニン窒素原子においてグルコース−６−リン
酸デヒドロゲナーゼに接合されるシクロスポリンＡであ
る。

【０１０６】別の面において本発明は、シクロスポリン
の環状骨格の一部であるアラニン窒素原子の一つにおい
て、場合により連結基を介して有機基に接合されるシク
ロスポリンの調製方法に関する。該方法は： ａ）場合により保護されたシクロスポリンを、２級アミ
ドを脱水素化するために充分な塩基性の塩基と反応さ
せ、 ｂ）ａ）の化合物をアルキリ化剤と反応させてその環状
骨格のアミド窒素原子の一つにおいて連結基に接合する
シクロスポリンを形成し、 ｃ）場合により、ｂ）の化合物の連結基の長さをカルボ
キサミド基の付加により延長してその環状骨格のアミド
窒素原子の一つにおいてカルボキサミド拡張連結基に接
合するシクロスポリンを形成し、 ｄ）ｂ）またはｃ）の化合物からいずれの保護基をも除
去して、その環状骨格のアラニン窒素原子の一つにおい
て、連結基またはカルボキサミド拡張連結基に接合する
シクロスポリン（シクロスポリン−連結基接合体）を形
成し、 ｅ）ｄ）のシクロスポリン−連結基接合体上の官能基を
場合により活性化して、その環状骨格のアラニン窒素原
子の一つにおいて、活性化連結基に接合するシクロスポ
リン（シクロスポリン−活性化連結基接合体）を形成
し、および ｆ）場合により、ｅ）のシクロスポリン−活性化連結基
接合体を、小有機分子または分子量２，０００以上の化
合物と反応させ、場合により連結基を介してアラニン窒
素原子の一つにおいて、有機基に対して接合するシクロ
スポリンを形成し、ここにおいて該有機基は、小有機分
子の残基または分子量２，０００以上の基である、工程
を含んでなる。

【０１０７】好ましくは、ａ）の保護基は、強塩基性条
件下で安定であり、かつ他のおだやかな条件で容易に除
去可能なものであるヒドロキシ保護基であろう。このよ
うな基は当技術分野で周知であり、詳細は示さない。し
かしながら、このような基の詳細、ならびにそれらの調
製および後の除去のために必要な条件は、ここに参考と
して取入れるＧｒｅｅｎｅ，Ｔ．Ｗ．の“Ｐｒｏｔｅｃ
ｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙ
ｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎ
ｃｅ，ＮＹ，１９８１）１頁、第１章、および１０−７
２頁、ならびにここに参考として取入れるＭｃＯｍｉ
ｅ，Ｊ．Ｆ．Ｗ．編“Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕ
ｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ”
（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９７３）９６−
１２０頁に見出すことができる。このような基は、メチ
ル、ｔ−ブチル、アリル、ベンジル、トリアリールメチ
ル、シリル、およびテトラヒドロピラニルエーテル類；
アセタール類、ケタール類、アセテート類、ベンゾエー
ト類、ｐ−ニトロベンゾエート類、ホルメート類；トリ
フルオロ−、クロロ−、メトキシ−およびフェノキシ−
アセテート類；カルボネート類等を含む。更に好ましく
は、保護基はアルキルシランに基づくものである。なお
も好ましくは、トリメチルシリルであろう。

【０１０８】トリメチルシリル（ＴＭＳ）保護ＣｓＡ
（ＴＭＳ−ＣｓＡ）は、式（ＸＸＶ）に示される。

【化２３】

【０１０９】シリル化反応（取入れた参考文献であるＧ
ｒｅｅｎｅの３９−５０頁に詳細に記述される）は、ア
ミン／ハロアルカン混合物等の混合溶媒中において、典
型的に行なわれる。好ましくは、ジクロロメタンと混合
されるトリアルキルアミンまたはピリジン、更に好まし
くは、ピリジン／ジクロロメタンである。該反応は、窒
素、アルゴン、ヘリウム等の不活性雰囲気下に行なわれ
る。典型的には、該反応は、１分間から２４時間を要
し、好ましくは、３０分間から１８時間である。反応温
度は、−１０℃と１００℃との間、好ましくは０℃と５
０℃との間、更に好ましくは２０℃と２５℃との間であ
る。

【０１１０】工程ａ）にて使用される塩基は、好ましく
は、ポリ（アミノ酸）の一部である２級アミド基を脱水
素化するために充分な強度の塩基である。このような塩
基は、当該技術分野で周知であり、詳細は記さない。好
ましくは、該塩基は、メチルリチウム、ブチルリチウ
ム、リチウムハイドライド、カリウムハイドライド、リ
チウムジイソプロピルアミド、リチウムシクロヘキシル
イソプロピルアミド等を含む金属のハイドライド、アル
キル化物またはアミド等、アルカリ金属陰イオン（ハイ
ドライドまたは有機陰イオンの第１Ａ族塩）である。更
に好ましくは、塩基はナトリウム、リチウムまたはカリ
ウムのハイドライド等、金属ハイドライド塩基である。

【０１１１】脱水素化反応は、−７８℃〜１００℃、好
ましくは−１０℃〜４０℃、更に好ましくは０℃〜２０
℃にて行なわれる。このような反応のための溶媒は、例
えばベンゼン、トルエンまたはヘキサン等の脂肪族炭化
水素、および芳香族炭化水素等、不活性有機溶媒であ
る。場合により第１Ａ族の錯形成に好適な金属イオンキ
レート剤、例えばクラウンエーテル、β−ジカルボニル
化合物、またはポリ（アルキレンオキサイド）等が溶媒
に添加される。好ましくは、１８−クラウン−６または
１５−クラウン−５等のクラウンエーテルが、芳香族有
機溶媒において使用され、更に好ましくは、１５−クラ
ウン−５エーテルが、トルエン中で使用される。該反応
は、典型的には不活性雰囲気下で１分間と２４時間との
間、好ましくは１０分間と１２時間との間、更に好まし
くは１０分間と２時間との間で行なわれる。

【０１１２】ｂ）のアルキル化基は、好ましくはα−ハ
ロアルキル安息香酸エステルまたはエポキシドである。
更に好ましくは、調製すべき化合物がカルボキシベンジ
ル連結基を有する場合には、アルキル化基は式（ＸＸＶ
Ｉ）のものであろう。

【０１１３】

【化２４】

【０１１４】式（ＸＸＶＩ）において、Ｒ_１およびＲ_２
は、互いに独立してＨまたは炭素原子数が約７個未満の
アルキルであり、好ましくはＨまたはメチル、更に好ま
しくはＨである。 式（ＸＸＶＩ）において、Ｇ_１は、ハロゲン原子、好ま
しくは臭素、塩素またはヨウ素、更に好ましくは臭素原
子である。

【０１１５】式（ＸＸＶＩ）において、Ｔ_２はＯ、Ｓま
たはＮＲ_３であり、ここでＲ_３は、Ｈまたは炭素数が約
７個未満のアルキルであり、好ましくはＯまたはＳ、更
に好ましくはＯである。 式（ＸＸＶＩ）において、ｋ_１の値は、１から約４ま
で、好ましくは、約２まで、更に好ましくはｋ_１は１で
ある。

【０１１６】式（ＸＸＶＩ）において、Ｇ_２は、ＯＲ_４
またはＳＲ_５であり、ここでＲ_４およびＲ_５は、Ｔ_２お
よびＧ_２の本質に依存して選択される、対応する酸素、
窒素またはサルファカルボニル官能基の保護基である。
これらの官能基のための保護基は、ここに参考として取
入れるＧｒｅｅｎ，Ｔ．Ｗ．の“Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ
Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅ
ｓｉｓ”（Ｗｉｌｅｙ−１ｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ
Ｙ，１９８１）１頁、第１節、１５４−１９２、２０９
−２１０、および２４９−２７８頁；およびＭｃＯｍｉ
ｅ，Ｊ．Ｆ．Ｗ．編“Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕ
ｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”
（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９７３）１８３
−２１０、２８６−２９５、および４０４−４１２頁に
記述されており、ここに詳細は示さない。好ましくは、
Ｇ_２はＯＲ_４であり、Ｒ_４は炭素原子数が約７個未満の
アルキルであり、更に好ましくはＲ_４はメチルである。

【０１１７】更になお好ましくは、調製されるべき化合
物がカルボキシベンジル連結基を有する場合には、アル
キル化剤はオルト−またはパラ−α−ハロメチル安息香
酸のアルキル（約７個未満の炭素原子を有する）エステ
ルであろう。好ましくは、該α−ハロメチル安息香酸ア
ルキルエステルとのアルキル化生成物は、シクロスポリ
ンアミノ酸残基の第７および第８のアラニン窒素原子の
一つにおいて、オルト−またはパラーカルボキシベンジ
ルアルキルエステル基に接合するシクロスポリンであろ
う。

【０１１８】更に好ましくは、調製されるべき化合物が
ヒドロキシアルカン連結基を有する場合には、アルキル
化基は、式（ＸＸＶＩＩ）のものであろう。

【０１１９】

【化２５】

【０１２０】式（ＸＸＶＩＩ）において、Ｒ_６、Ｒ_７、
Ｒ_８およびＲ_９は、れぞれ独立してＨまたは約７個未満
の炭素原子を有するアルキルであり、好ましくはＨまた
はメチル、更に好ましくはＨである。

【０１２１】更になお好ましくは、調製されるべき化合
物がヒドロキシアルカン連結基を有する場合には、アル
キル化剤は、エチレンオキサイド、プロピレンオキサイ
ド等、約７個未満の炭素原子を有するアルキレンエポキ
シドであろう。好ましくは、エチレンエポキシドによる
アルキル化生成物は、第７のシクロスポリンアミノ酸残
基のアラニン窒素原子において、末端がヒドロキシル基
である炭素２個の鎖に接合するシクロスポリンである。

【０１２２】アルキル化剤は、典型的には上述した脱水
素化の後に反応混合物に添加される。該アルキル化剤添
加後、反応は１分間と４８時間との間、好ましくは１時
間と３６時間との間、更に好ましくは１２時間と２４時
間との間継続される。好ましくは、場合により行なわれ
るカルボキサミド鎖拡張工程ｃ）は、ポリ（アミノ酸）
合成の標準的方法である。このような工程は、当技術分
野において常法であり、詳述はしない。しかしながら、
このような工程の要約は、ここに参考として取入れるＷ
ｈｉｔｅ，Ａ，らの、“Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ”（ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌ
ｌ，ＮＹ，１９７８）９２−９５頁に見出される。

【０１２３】一般的に、反応させるべきでない任意のア
ミノ、ヒドロキシル、カルボニルまたはその他の基は保
護される（上記ＧｒｅｅｎｅおよびＭｃＯｍｉｅの参考
文献のとおり）。保護基は、ベンジルオキシカルボニ
ル、トリフェニルメチル、３級ブチルオキシカルボニ
ル、フタロイル、トリフルオロアセチル、ベンジル、ｐ
−トルエンスルホニル、飽和低級アルキル、ベンジルエ
ステル、３級ブチルエステル、アセチル等を含む。反応
すべく保護されていないカルボキシル基は、カップリン
グ剤との反応により活性化され、活性化エステル基を形
成する。このようなカップリング剤は、ジクロロヘキシ
ルカルボジイミド（ＤＣＣ）、イソブチルクロロホルメ
ート、Ｎ，Ｎ′−カルボニルジイミダゾール、ｐ−ニト
ロフェノール／ＤＣＣ等を含む。次いで活性化エステル
は、アミノ化合物との反応に付され、ｃ）のカルボキサ
ミド鎖拡張化合物が形成される。

【００２４】更に好ましくは、カルボキサミド鎖延長工
程は、ｂ）の化合物とイソシアネートまたはチオイソシ
アネートとの反応を含む。典型的には、鎖延長されるべ
き化合物が、アルキル金属アルコキシド等の有機金属触
媒と、脂肪族または芳香族炭化水素溶媒中で反応に付さ
れ、イソシアネートまたはチオイソシアネート、飽和ア
ルキル（炭素数７個未満）エステルが添加される。好ま
しくは、触媒はトリアルキルチン錯体、更に好ましくは
トリブチルチンエポキシドである。好ましい溶媒は、芳
香族炭化水素、更に好ましくはトルエンである。カルボ
キサミド鎖延長試薬は、好ましくはβ−アラニンイソシ
アネート、メチルエステル、メチルグリコネートイソシ
アネート等のイソシアネート、メチルエステルである。

【０１２５】別法として、更に好ましいカルボキサミド
鎖延長工程は、ｂ）の化合物の下記条件下における反応
を接合工程のために含む。好ましくは、鎖延長される化
合物を、下記活性化剤と反応させ、該活性化エステル
を、精製または未精製で、カルボキサミド鎖延長単位、
好ましくはアミノ酸またはポリ（アミノ酸）、更に好ま
しくはグリシン、アラニン、バリン、ロイシンもしくは
イソロイシンまたはこれらの２〜１２残基からなるポリ
（アミノ酸）等の未置換のアミノ酸、更になお好ましく
は、該鎖延長単位は、グリシルグリシンの２個のアミノ
酸単位からなる。

【０１２６】種々の長さのカルボキサミド延長鎖を得る
ために、数種の適当な鎖延長工程を順次行なってもよ
い。

【０１２７】ｄ）の脱保護工程は、上記に詳述した保護
基に基いて選択される。先に引用し、参考とした文献
は、好適な保護基の除去のための条件および試薬を記述
してある。典型的に脱保護は、ｐＨ約２−１２、好まし
くは３−１１、更に好ましくは４−１０における、５−
９５℃、好ましくは１０−４０℃、更に好ましくは２０
−２５℃の水中での水性加水分解を含む。場合により加
水分解触媒は、酸または塩基を含み、好ましくはＨＣ
ｌ、Ｈ_２ＳＯ_４、ＨＦ、ＨＢｒ、ｐ−トルエンスルエン
スルホン酸、ＮａＯＨ、Ｎａ_２ＣＯ_３、ＮａＨＣＯ_３、
Ｋ_２ＣＯ_３、またはＫＨＣＯ_３、更に好ましくはＨＣｌ
またはＫ_２ＣＯ_３を含む。場合により有機共溶媒を使用
することができ、典型的にはプロトン性溶媒、好ましく
はアルコール、更に好ましくはメタノールが使用され
る。

【０１２８】別法として好ましい脱保護反応は、フッ素
イオン供給源との処理を含み、例えば、ＨＦ、または有
機性フッ素塩、好ましくは４級フッ化アンモニウム、更
に好ましくは、テトラアルキルアンモニウムフルオライ
ドを含む。該反応は、上記の温度にて不活性有機溶媒、
好ましくはエーテル、更に好ましくはジエチルエーテル
またはテトラヒドロフラン中にて行なわれる。

【０１２９】上述したカルボキサミド鎖延長方法は、
ｅ）およびｆ）の活性化および接合工程においても有用
である。好ましくは、ｅ）およびｆ）の活性化および接
合工程は、この技術における通常の方法で行なわれる。
例えば、Ｍａｇｉｏ，Ｅ．Ｔ．の“Ｅｎｚｙｍｅ−Ｉｍ
ｍｕｎｏａｓｓｓｙ”（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ
Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，１９８０）、第４章は、このよう
な技術の分類を含み、その８１−８６頁をここに参考と
して取入れる。

【０１３０】更に好ましくは、シクロスポリン−連結基
接合体は、ＤＭＦ等の有機溶媒中において、アルキル
（炭素原子数９個未満）クロロホルメート、例えばイソ
ブチルクロロホルメート；ジアルキルカルボジイミド、
例えばジシクロヘキシルカルボジイミド；１−エチル−
３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド
（ＥＤＡＣ）、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホ
リノ−４−エチル）カルボジイミドメチル−ｐ−トルエ
ンスルフォネート（ＣＭＣ）、Ｎ−ヒドロキシスクシン
イミド（ＮＨＳ）／ＥＤＡＣ、Ｎ−ヒドロキシスルホス
クシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）／ＥＤＡＣ等の活性化
剤との反応により活性化される。該活性化反応は、典型
的には−１０〜１００℃、好ましくは０〜３０℃、更に
好ましくは０〜１０℃にて、好ましくは窒素、ヘリウ
ム、アルゴン等の雰囲気下で行なわれる。該活性化反応
は、１分間から１０日間、好ましくは１時間から２日
間、更に好ましくは６−１８時間で行なわれる。該活性
化反応後、活性化化合物は、小有機分子の溶液、または
分子量２０００以上の化合物の溶液に、有機性または水
性／有機性溶媒、例えばＤＭＦまたはＤＭＦ／ボレート
緩衝溶液等の中で添加される。この添加は、ある一定時
間にわたって行なわれてもよく、または、一回に行なわ
れてもよい。添加を一定時間にわたり行なう場合には、
典型的には１分間から１２時間、好ましくは１０分間か
ら８時間、更に好ましくは３０分間から３時間を要す
る。添加後に、該混合物は、１分間から３日間、好まし
くは１０分間から１日間、更に好ましくは１〜１８時
間、攪拌される。

【０１３１】該生成物は、場合により、必要に応じて精
製される。ポリ（アミノ酸）−ハプテン接合体の精製お
よび特徴付けは、ここに参考として取入れるＭａｇｉｏ
らの“Ｅｎｚｙｍｅ−Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ”（ＣＲ
Ｃ Ｐｒｅｓｓ，ＢｏｃａＲａｔｏｎ，ＦＬ，１９８
０）、第４章８６−８８頁に詳細に記述されている。例
えば、該接合体がシクロスポリン−免疫原性担体接合
体、またはシクロスポリン−酵素接合体の場合、精製
は、水性／有機性および水性溶液、例えば水／ＤＭＦま
たは水等に対する透析、あるいはセファデックス等の担
体上のゲル濾過クロマトグラフィにより行なうことがで
きる。

【０１３２】本発明の別の面は、シクロスポリン環状骨
格のアラニン窒素原子において免疫原性担体に接合され
たシクロスポリンを免疫原とする応答において調製され
る抗体類を含む。更に本発明は、このような抗体類およ
び標識の接合体を含む。

【００３３】好ましくは、該抗体類は、免疫原性担体に
接合されるシクロスポリンＡ、場合により水素以外に約
５０個未満の原子、好ましくは水素以外に約３５個未満
の原子、更に好ましくは水素以外に約２０個未満の原子
を有し、かつ約３５個以下、好ましくは約２５個以下、
更に好ましくは約１５個以下の原子の長さを有する鎖を
もった連結基を介して、第７および／または第８のシク
ロスポリンＡアミノ酸残基のアラニン窒素原子において
免疫原性担体に接合されるシクロスポリンＡに対して生
じたものである。

【０１３４】抗体は、他の分子の特定の空間的および極
性組織に特異的に結合し、従って相補的なものとして定
義される免疫グロブリンである。該抗体は、モノクロー
ナルまたはポリクローナルであってよく、この分野で周
知の技術、例えば宿主の免疫および公知技術により免疫
グロブリンが分離される血清の収集（ポリクローナル）
によって、また継続的ハイブリッド細胞系の調製および
分泌蛋白質の収集（モノクローナル）によって、または
天然抗体の特異的結合に要するアミノ酸配列を少なくと
もコードしているヌクレオチド配列またはその変異体の
クローニングおよび発現によって調製され得る。抗体類
は、完全な免疫グロブリンまたはその断片を含み、免疫
グロプリン類は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、
ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよび１ｇＧ３、ＩｇＭ等の種
々のクラスおよびアイソタイプを含む。それらの断片
は、Ｆａｂ、ＦｖおよびＦ（ａｂ′）２、Ｆａｂ′等を
含んでよい。

【０１３５】モノクローナル抗体類は、Ｍｉ１ｓｔｅｉ
ｎおよびＫｏｈｌｅｒにより議論され、Ｎａｔｕｒｅ１
９７５、２５６、４９５−７に報告された方法によって
得ることができる。この方法の詳細は周知であってここ
には反復しない。しかしながら、それは基本的には通常
マウスまたは他の適当な動物である宿主に、免疫原を注
射することを含む。次いで該動物の牌臓から細胞を取出
す。別法として、該宿主は、インビトロにおいて免疫原
に感作された非感作牌臓細胞であってもよい。得られる
細胞は、ミエローマ細胞と融合される。融合細胞が結果
として得られ、“ハイブリドーマ”と称され、インビト
ロにおいて培養可能である。ハイブリドーマの母集団
は、選択され、個々のクローンが単離されるように操作
され、それぞれが抗原に対して単一の抗体を分泌する。

【０１３６】本発明の抗体は、シクロスポリンおよび１
位に非修飾９個の炭素原子のアミノ酸を含む密接に関連
した化合物を特異的に認識することができる（ＣｓＡ番
号付け）。

【０１３７】本発明の抗体と標識との接合体は、ポリ
（アミノ酸）のシクロスポリン基への接合について既に
述べた方法により調製可能である。該シクロスポリン−
連結基接合体の活性化は、前述のようにして行なわれ
る。活性化化合物の抗体への接合は、前述のようにして
行なわれる。

【０１３８】好ましくは、標識接合体試薬のｐＨは、他
の考慮において該標識接合体の活性および安定性を平衡
化するように最適化される。その好ましい実施態様の一
つにおいて、本発明は、シクロスポリン−Ｇ６ＰＤＨ接
合体試薬に関し、ここにおいてｐＨは６−１０、好まし
くは７−９、更に好ましくは７．５−８．５である。好
ましくは、抗体試薬のｐＨは、アッセイ試薬組成物の安
定性および精度を最大とするように最適化される。好ま
しい実施態様の一つにおいて、本発明は、シクロスポリ
ン抗体試薬に関し、ここにおいてｐＨは、４−７、好ま
しくは５−６、更に好ましくは５．２５−５．８５であ
る。

【０１３９】ＢＬＧまたはＰＥＧ等のバルク化剤を含む
表面活性剤；トウィーン−２０、プルラファクスＡ３
８、トライトンＸ−１００、プルロニク２５Ｒ２、ＲＳ
Ａ、ＢＳＡ、モジュサイト（Ｍｏｄ−ｕ−ｃｙｔｅ）、
ゾルプロ（Ｓｏ１−ｕ−ｐｒｏ）等の消胞剤および界面
活性剤；およびこの分野で通常使用されている他の材料
は、抗体および標識接合体試薬の両者に添加することが
できる。表面活性添加剤は、疎水性または低安定性化合
物の溶液中への維持、アッセイ試薬成分の安定化、また
はアッセイ試薬活性の最適化のために添加することがで
きる。

【０１４０】表面活性添加剤は、好ましくは、シクロス
ポリンを含むと考えられる試料に該抗体試薬を加えた際
に、シクロスポリンを溶液中に維持するために添加され
る。その好ましい一つの実施態様において、本発明は、
一種以上のバルク化剤、界面活性剤および／または消泡
剤が添加されたシクロスポリン抗体試薬に関する。

【０１４１】表面活性添加剤は、保存および使用時に、
標識接合体を溶液中に維持するために、標識接合体に添
加される。好ましい実施態様の一つにおいて、本発明
は、一種以上のバルク化剤、界面活性剤、および／また
は消泡剤を含むシクロスポリン−Ｇ６ＰＤＨ接合体試薬
に関する。

【０１４２】試薬の保存寿命を長くするために、抗微生
物剤をアッセイ試薬に添加してもよい。この分野で一般
的な抗微生物剤が有用である。その最も好ましい実施態
様の一つにおいて、本発明は、抗微生物剤を含むシクロ
スポリンアッセイ試薬に関する。

【０１４３】本発明の他の面は、シクロスポリンを含む
と考えられる試料中のシクロスポリン量の測定方法に関
する。本発明の抗体および標識接合体は、シクロスポリ
ンを含むと考えられる試料中のシクロスポリン量の測定
方法において使用される。該アッセイは、場合により試
料の前処理、それに続く試料とシクロスポリンに対する
抗体との接触、および該抗体とシクロスポリンとの免疫
複合体の直接あるいは間接的定量という工程を含んでな
る。本発明のこの面において与えられる改良は、本抗体
のシクロスポリンに対する抗体としての利用である。該
免疫複合体は、例えば使用する抗体が標識に接合してい
る場合、直接に検出される。該免疫複合体は、アッセイ
媒質中の免疫複合体形成の信号生成系に対する効果を試
験することにより、あるいは、本発明の抗体に特異的に
結合する標識レセプタを使用することにより間接的に検
出される。

【０１４４】場合により前処理されるシクロスポリンを
含むと考えられる試料中のシクロスポリン測定アッセイ
の他の構成において、該試料を、シクロスポリンに対す
る抗体、および該抗体により認識される本発明の標識接
合体に接触させる。この方法は、更に、該標識接合体と
抗体との免疫複合体の量を、直接または間接的に測定す
ることを含む。場合により、水素以外に約５０個未満、
好ましくは３５、更に好ましくは２０個未満の原子を有
し、かつ長さにおいて約３５個以下、好ましくは２５、
史に好ましくは１５個以下の原子を有する鎖をもった連
結基を介し、標識に接合されたシクロスポリンを、標識
接合体として使用してもよい。

【０１４５】本発明のアッセイは、シクロスポリンに対
するすべての免疫アッセイに応用される。該アッセイ
は、いずれかのアッセイ成分または生成物の分離を伴わ
ず（均質的）、あるいは分離を伴って（非均質的）行な
われ得る。非均質的アッセイの例は、酵素結合免疫吸着
アッセイ（ＥＬＩＳＡ）等の酵素結合免疫アッセイであ
る。ＥｄＷａｒｄ Ｔ．Ｍａｇｇｉｏによる“Ｅｎｚｙ
ｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ”ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ
Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆ
ｌｏｒｉｄａ，１９８０参照。均質的免疫アッセイは、
酵素多重化免疫アッセイ（ｅｎｚｙｍｅ ｍｕｌｔｉｐ
ｌｉｅｄ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）技術（例えば、米
国特許第３，８１７，８３７号参照）、米国特許第３，
９９３，３４５号に開示されている免疫蛍光法、米国特
許第４，２３３，４０２号に開示されている酵素チャネ
リング（ｅｎｚｙｍｅ ｃｈａｎｎｅｌｉｎｇ）技術、
およびＭａｇｇｉｏの前出文献に議論されている他の酵
素免疫アッセイにより例示される。上記特許の開示を、
前述の特定のアッセイ方法の記述についてその全体を参
考としてここに取入れる。

【０１４６】分析すべき試料は、存在し得る細胞の溶
解、存在し得る蛋白質の沈殿、および／または存在し得
るシクロスポリンの可溶化等のために前処理されてもよ
い。本発明の方法により分析される試料を、有機溶媒、
好ましくはアルコール、更に好ましくはメタノール等の
炭素原子７個未満のアルコールと接触させることにより
前処理することが好ましい。分折対象のアッセイは、通
常は最適なアッセイ感度を与える中程度のｐＨにて、水
性緩衝媒質中で行なわれる。

【０１４７】該水性媒質は、水のみでよく、または０〜
４０体積パーセントの共溶媒を含んでもよい。該媒質に
ついてのｐＨは、通常は約４〜１１の範囲、更に普通に
は約５〜１０の範囲、および、好ましくは約６．５〜
９．５の範囲である。ｐＨは、通常、いずれかの特異的
結合対の結合構成要素の最適結合、および信号生成系の
構成要素等、他のアッセイ試薬について最適なｐＨの間
での妥協点である。

【０１４８】種々の緩衝溶液を、所望のｐＨ値を達成
し、また測定中のｐＨを維持するために使用してもよ
い。例示的な緩衝溶液は、ボレート、ホスフェート、カ
ルボネート、トリス、バルビタール等を含む。この発明
において使用された緩衝溶液は、臨界的ではなく、また
個々のアッセイにおいて一方あるいは他方の緩衝剤が好
ましい。

【０１４９】該アッセイを行なうためには、通常中程度
の温度が使用され、また測定の間、特に速度測定の間は
一定温度が使用される。熟成温度は、通常約５〜４５℃
の範囲、更に普通には約１５°〜４０℃である。測定の
間の温度は、一般には１０゜〜５０℃の範囲、更に普通
には約１５°〜４０℃である。

【０１５０】アッセイされるシクロスポリンの濃度は、
一般には約１０^−５〜１０−^−１３Ｍ、より普通には１
０^−６〜１０^−８Ｍで変化する。アッセイが、定量的、
半定量的、または定性的であること（試料中に存在する
シクロスポリンの量に相対的）等の考慮、特定の検出技
術、およびシクロスポリンの濃度は、一般に種々の試薬
の濃度を決定する。

【０１５１】一方においてアッセイ媒質中の種々の試薬
濃度は、興味あるシクロスポリンの濃度範囲により決定
されるが、各試薬の最終濃度は、範囲にわたるアッセイ
の感度を最適化するように経験的に決定される。すなわ
ち、重要であるシクロスポリン濃度の変化は、正確に測
定可能な信号の差異を与える。

【０１５２】添加量の順序は、広範囲に変化するが、ア
ッセイの性質に依存するある種の選択がある。添加の最
も簡単な順序は、すべての材料を同時に添加し、アッセ
イ媒質が信号に対して有する効果を均質アッセイとして
測定する。別法として、試薬は順次合せられ得る。場合
により、熟成工程は、各添加に引続き、一般に３０秒か
ら６時間、より普通には１分間から１時間の範囲で行わ
れてもよい。

【０１５３】均質系アッセイにおいてすべての試薬が同
時に、または順次合せられた後、信号が測定される。該
信号は、試験試料中のシクロスポリン量に関連する。例
えば酵素多重化アッセイ技術において、その開示をここ
に参考として取入れる米国特許第３，８１７，８３７号
（１９７４）に記述されているように、シクロスポリン
の検出のためにはシクロスポリンを含むと考えられる試
料を、水性媒質中に同時あるいは順次に、本発明の抗体
および本発明のシクロスポリン酵素接合体と合わせる。

【０１５４】一般には酵素に対する基質が添加され、こ
れは酵素触媒反応により発色性または蛍光性生成物を生
じる。好ましくは、該シクロスポリン酵素接合体は、第
７のシクロスポリンアミノ酸残基のアラニン窒素原子に
おいて、場合により水素以外に約５０個未満の原子、好
ましくは水素以外に約３５個未満の原子、更に好ましく
は水素以外に約２０個未満の原子を有し、かつ長さにお
いて約３５個以下、好ましくは２５個以下、更に好まし
くは１５個以下の原子からなる鎖を有する連結基を介し
て、酵素に接合されるシクロスポリンＡである。特に好
ましい酵素は、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナー
ゼである。試料中のシクロスポリンと該シクロスポリン
酵素接合体とは、抗体上の部位について競合する。

【０１５５】次いで、媒質中の酵素活性が、通常分光学
的手段により測定され、シクロスポリンの存在量が既知
の標準または参照試料を試験した場合に測定される酵素
活性と比較される。典型的には、標準または参照試料
は、シクロスポリンが含まれると考えられる試料と実質
的に同じ方法で試験される。一般的に、比較は、未知試
料からの結果と、数種の標準試料のアッセイ操作の結果
とについてなされる。該標準試料は、測定すべきシクロ
スポリン分析対象物を、既知であるが異なった濃度で含
む。好ましくは、標準試料中に存在する濃度範囲は、未
知試料中の考えられる分析対象物濃度の範囲におよぶも
のである。

【０１５６】非均質系アッセイは、通常は１以上の分離
工程を含む。該非均質系アッセイは、競合的または非競
合的であり得る。競合的アッセイにおいて、本発明の抗
体は、支持体に結合され、次いで試料およびシクロスポ
リンの環状骨格のアラニン原子において酵素等の検出可
能な標識に接合されたシクロスポリンを含有する媒質に
接触させられる。試料中のシクロスポリンは、支持体に
結合された抗体上の部位について該接合体と競合する。
支持体と媒質とを分離した後、支持体または媒質の標識
活性を、常法により測定し、試料中のシクロスポリン量
と関連付ける。

【０１５７】別の競合的非均質系手段において、本発明
の抗体が支持体に結合される。媒質は、シクロスポリン
を含むと考えられる試料、およびシクロスポリンの環状
骨格のアラニン窒素原子において、ビオチン等の小有機
分子（分子量２，０００未満）に接合されたシクロスポ
リンを含有して調製される。好ましくは、シクロスポリ
ンＡは、第７および／または第８のシクロスポリンＡア
ミノ酸残基のアラニン窒素原子において、場合により水
素以外に約５０個未満の原子、好ましくは水素以外に約
３５個未満の原子、更に好ましくは水素以外に約２０個
未満の原子を有し、長さにおいて約３５個以下、好まし
くは２５個以下、更に好ましくは１５個以下の原子から
なる鎖を有する連結基を介して接合される。

【０１５８】シクロスポリンおよび該接合体は、抗体部
位について競合する。一定時間後、該支持体は媒質から
分離され、洗浄され、レセプタまたは酵素等、標識に結
合された小有機分子の結合相手を含有する第２の媒質に
接触させられる。該小有機分子がビオチンである場合
に、該支持体は、酵素に結合するアビジンと接触させら
れる。該支持体が第２の媒質から分離され、支持体また
は第２の媒質のいずれかの酵素活性が、常法により測定
される。該酵素活性は、試料中のシクロスポリン量に関
連する。

【０１５９】非競合的方法の例は、２種の抗休を含むサ
ンドイッチアッセイであり、抗体の一方は、標識され、
他方は支持体に固定されるか、または支持体への固定化
が図られる。

【０１６０】別の面において、試料中のシクロスポリン
の存在または量を測定するために、凝集を利用すること
ができる。シクロスポリンの環状骨格のアラニン窒素原
子において免疫原性担体に接合されたシクロスポリンに
対する応答において生じた抗体は、粒子に接合すること
ができる。好ましくは該抗体は、第７および／または第
８のシクロスポリンＡアミノ酸残基のアラニン窒素原子
において、場合により水素以外に約５０個未満の原子、
好ましくは水素以外に約３５個未満の原子、更に好まし
くは水素以外に約２０個未満の原子を有し、長さにおい
て約３５個以下、好ましくは２５個以下、更に好ましく
は１５個以下の原子からなる鎖を有する連結基を介して
免疫原性担体に接合されるシクロスポリンＡに対する応
答において生じるものである。好ましい免疫原性担体
は、ＫＬＨおよびＢＳＡを含み、更に好ましくはＫＬＨ
である。

【０１６１】凝集という点で利用できる他の接合体は、
シクロスポリンの環状骨格のアラニン窒素原子において
粒子に接合されたシクロスポリンである。好ましくはシ
クロスポリンＡは、第７および／または第８のシクロス
ポリンＡアミノ酸残基のアラニン窒素原子において、場
合により水素以外に約５０個未満の原子、好ましくは水
素以外に約３５個未満の原子、更に好ましくは水素以外
に約２０個未満の原子を有し、長さにおいて約３５個以
下、好ましくは２５個以下、更に好ましくは１５個以下
の原子からなる鎖を有する連結基を介して免疫原性担体
に接合される。

【０１６２】この凝集という面における一方法として、
シクロスポリンを含むと思われる試料は、上述の抗体粒
子接合体に合されてもよい。適当な熟成の後、シクロス
ポリンの存在による粒子の凝集の程度が直接的に測定さ
れ得る。他方において、該粒子は媒質から分離され得、
かつ上述の方法で粒子に接合されたシクロスポリンと合
することができる。凝集は、試料中のシクロスポリン量
の指標として測定される。上の記述は、本発明の化合物
を使用して行なうことができる多くの凝集プロトコール
のうちの２種類を例示するにとどまる。

【０１６３】本発明の他の局面は、シクロスポリンを含
むと思われる試料中のシクロスポリン量測定のための本
発明のアッセイ方法を都合よく実施するに有用なキット
に関するものである。この発明の応用性を増強するため
に、試薬類は、その割合が該方法およびアッセイの実質
的な最適化を与えるように、同じまたは分離された容器
中において包装された組合せとして提供される。試薬類
は、その交差反応性および安定性に依存して、それぞれ
分離された容器とするか、あるいは種々の試薬を１個以
上の容器に合せることができる。該キットは、試薬の一
つとして、シクロスポリンの環状骨格のアラニン窒素原
子において免疫原性担体に接合されたシクロスポリンに
対する応答において生ずる抗体を含む。好ましくは、該
抗体は、第７および／または第８のシクロスポリンＡア
ミノ酸残基のアラニン窒素原子において、場合により水
素以外に約５０個未満の原子、好ましくは約３５個未満
の原子、更に好ましくは水素以外に約２０個未満の原子
を有し、長さにおいて約３５個以下、好ましくは２５個
以下、更に好ましくは１５個以下の原子からなる鎖を有
する連結基を介して接合されるシクロスポリンＡに対す
る応答において生じたものである。好ましい免疫原性担
体は、ＫＬＨおよびＢＳＡを含み、更に好ましくはＫＬ
Ｈである。この抗体は、標識されてもされなくてもよ
い。

【０１６４】このキットは、シクロスポリンの環状骨格
のアラニン窒素原子において標識に接合されるシクロス
ポリンを含んでもよい。好ましくは、シクロスポリンＡ
は、第７および／または第８のシクロスポリンＡアミノ
酸残基のアラニン窒素原子において、場合により水素以
外に約５０個未満の原子、好ましくは水素以外に約３５
個未満の原子、更に好ましくは水素以外に約２０個未満
の原子を有し、長さにおいて約３５個以下、好ましくは
２５個以下、更に好ましくは１５個以下の原子からなる
鎖を介して接合される。該キットは、更に信号生成系の
構成要素、支持体、補助試薬等を含む、アッセイの実施
のための他の包装試薬を包むことができる。

【０１６５】上記定義に記述したように、支持体は、多
孔性または非多孔性の水不溶性材料である。該支持体
は、親水性または親水性を付与し得るものであって、シ
リカ、硫酸マグネシウム、およびアルミナ等の無機粉
体；例えば濾紙、クロマトグラフィ用紙等の紙類を含む
繊維等、特にセルロース性またはセルロースから誘導さ
れる材料である天然ポリマー材料；ニトロセルロース、
セルロースアセテート、ポリ（ビニルクロライド）、ポ
リアクリルアミド、交差結合デキストラン、アガロー
ス、ポリアクリレート、ポリエチレン、ポリプロピレ
ン、ポリ（４−メチルブテン）、ポリスチレン、ポリメ
タクリレート、ポリ（エチレンテレフタレート）、ナイ
ロン、ポリ（ビニルブチレート）等の合成または修飾さ
れた天然産生ポリマー類；それら自体で使用されるか、
あるいは他の材料と組合せて使用される、Ｂｉｏｇ１ａ
ｓｓとして入手可能なガラス、セラミクス、金属等を含
む。

【０１６６】本発明によるアッセイにおいては、種々の
補助材料がしばしば使用される。緩衝剤は、アッセイ媒
質およびアッセイ成分のための安定化剤と共に、通常ア
ッセイ媒質中に存在する。これらの添加物に加え、アル
ブミン等の付加的な蛋白質、または界面活性剤、特に非
イオン性界面活性剤、結合増強剤、例えばポリエチレン
グリコール等がしばしば含まれるであろう。

【０１６７】別の局面において、本発明は、場合により
連結基を介して標識または免疫原性担体に接合されたア
チオシクロスポリンに関する。該アチオシクロスポリン
は、好ましくはシクロスポリン代謝産物、更に好ましく
はシクロスポリンＡ代謝産物、更になお好ましくはシク
ロスポリンＡ代謝産物Ｍ１から形成される。

【０１６８】好ましくは、連結基は、結合または水素以
外に１〜６０個の原子を有し、かつ長さにおいて３０個
以下の原子からなる鎖を有する基である。更に好ましく
は、連結基は、水素以外に１〜１０個の原子を有し、か
つ長さにおいて５個以下の原子からなる鎖を有する基で
ある。

【０１６９】標識および免疫原性担体は、シクロスポリ
ン接合体について上述した標識および免疫原性担体と同
じ群から選択される。酵素アッセイについては、標識は
酵素である。均質系酵素免疫アッセイについては、好ま
しくは標識はデヒドロゲナーゼ、更に好ましくはグルコ
ース−６−リン酸デヒドロゲナーゼである。免疫原性担
体は、好ましくは抗原性ポリ（アミノ酸）、更に好まし
くは、キーホールリンペットヘモシアニンである。

【０１７０】本発明の好ましい実施態様の一つは、式：

【化２６】

【０１７１】の組成物に関し、式中Ｒは、式：

【化２７】

【０１７２】であり、Ｚは、蛋白質、ポリサッカライ
ド、リポ蛋白質、糖蛋白質等、好ましくは分子量２，０
００以上のポリペプチド等の免疫原性担体であり、更に
好ましくはＺは、キーホールリンペットヘモシアニンま
たはグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼであり、
またｎは、１から、Ｚの分子量を５０００で割った値ま
での数である。

【０１７３】別の局面において、本発明は、シクロスポ
リンのアッセイにおいて交差反応性物質を認識できる抗
体に関するものである。該アッセイは、好ましくは上述
のアッセイの一つである。上述したように、妨害的交差
反応性物質は、シクロスポリン代謝産物、更に好ましく
はシクロスポリンＡ代謝産物、更になお好ましくは、シ
クロスポリンＡ代謝産物Ｍ１である。

【０１７４】本発明のこの局面における抗体類は、シク
ロスポリン量測定のためのアッセイにおいて妨害しな
い。従って、該抗体類は、妨害的交差反応性物質に結合
するが、アッセイ条件下においてシクロスポリンまたは
シクロスポリン−標識接合体には実質的に結合できな
い。好ましくは、該抗体は、ウンデカペブチド環をなお
も含んでいるシクロスポリンＡ代謝産物に結合し、シク
ロスポリンＡには実質的に結合せず、またシクロスポリ
ン−酵素接合体の酵素活性を実質的に阻害しない。

【０１７５】本発明の好ましい実施態様の一つは、式：

【化２８】

【０１７６】の組成物に対する応答により生ずる抗体に
関するものであり、式中Ｒは、式：

【化２９】

【０１７７】であり、Ｚは、蛋白質、ポリサッカライ
ド、リポ蛋白質、糖蛋白質等、好ましくは分子量２，０
００以上のポリペプチド等の免疫原性担体であり、更に
好ましくはＺは、キーホールリンペットヘモシアニンで
あり、またｎは、１から、Ｚの分子量を５０００で割っ
た値までの数である。これらの抗体は、シクロスポリン
Ａ代謝産物Ｍ１に結合可能であり、シクロスポリンＡを
実質的に認識せず、かつ第７のシクロスポリンＡアミノ
酸残基のアラニン窒素原子において、場合により連結基
を介してグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼに接
合されるシクロスポリンＡの酵素活性を実質的に阻害し
ない。

【０１７８】妨害的交差反応性物質を認識可能な抗体類
は、前述のシクロスポリンを認識する抗体に関する方法
によって調製され得る。

【０１７９】他の面において、本発明は、場合により連
結基を介して免疫原性担体または標識に接合されるアチ
オシクロスポリンの調製方法に関するものである。

【０１８０】これらの接合体の調製方法は、次の工程を
含む： （ａ） シクロスポリン代謝産物を、第１のアミノ酸残
基のオレフィン性側鎖において酸化的に開裂させる； （ｂ） 場合により、ａ）の生成物を延長し、アチオシ
クロスポリン−連結基接合体を形成する； （ｃ） ｂ）の生成物を、接合のために活性化する；お
よび （ｄ） ｃ）の活性化生成物を、標識または免疫原性担
体と反応させることにより、接合体を形成させる。

【０１８１】工程ａ）の酸化的開裂反応は、シクロスポ
リン代謝産物の第１のアミノ酸残基の第６および第７の
炭素原子を結合する１個以上の結合を開裂することが好
ましい。該開裂反応は、第６の炭素原子に官能基を生成
する。この官能基は、ヒドロキシ、ケト、アルデヒド、
カルボン酸、アミノ、イミド、スルフィド、ジスルフィ
ド等のいずれかであり、これは、アチオシクロスポリン
−連結基接合体を形成するために側鎖を延長するか、あ
るいは該アチオシクロスポリンを直接に結合を介して免
疫原性担体または標識に接合するために使用され得る。

【０１８２】更に好ましくは、酸化的開裂反応は、アチ
オシクロスポリンカルボキシアルデヒドを生成する。こ
の型の２種類の開裂反応の例は、オゾン分解および過ヨ
ウ素酸分解である。エポキシ化／二重結合の開環により
調製される１，２−ジオール類の過ヨウ素酸分解は、詳
述されている（Ｄｒｙｈｕｒｓｔ，Ｇ．の“ジオールお
よび他の官能基の過ヨウ素酸酸化”（Ｐｒｅｇａｍｏｎ
Ｐｒｅｓｓ，ＮｅＷＹｏｒｋ，１９７０））。二重結
合のオゾン分解は、やはり詳述されている（“Ｏｚｏｎ
ｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ”（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉ
ｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．１９５９）；
Ｍａｙ Ｄ，Ｆ．Ｒ．“有機化合物の酸化”（Ａｍｅｒ
ｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓ
ｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．１９６７）；Ａｕｇｕｓｔｄ
ｉｎｅ，Ｒ．Ｌ．らの“酸化”（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋ
ｋｅｒ，ＮｅＷ Ｙｏｒｋ，１９７１））。

【０１８３】更になお好ましくは、酸化的開裂反応は、
溶液相オゾン分解と引続く還元的仕上げである。該反応
のための好ましい溶媒は、ジクロロメタン等のハロアル
カンを含む。反応温度は、−１００℃〜１０℃、好まし
くは−７８℃〜−５０℃である。オゾンは、反応内に気
体流、好ましくは酸素または空気、更に好ましくは酸素
中にて導入される。該反応は、オゾンの特徴的な青色を
溶液が示すまで継続される。次いで、過剰のオゾンを溶
液から好ましくは不活性気体流により除去する。反応混
合物の温度を３０℃以下まで、好ましくは０℃以下ま
で、更に好ましくは−１０℃以下まで昇温させる。次い
で還元剤を加え、最終アルデヒド生成物を生成させる。
好ましくは、還元剤は、ジアルキルスルフィド、更に好
ましくはジメチルスルフィドである。

【０１８４】鎖延長反応ｂ）は、シクロスポリン分子の
連結基を延長するための上述したいずれの反応であって
もよい。好ましくは、該反応ｂ）はアルデヒド延長反応
である。更に好ましくは、延長は、アチオシクロスポリ
ンカルボキシアルデヒドをアミノオキサルアルカン酸と
反応させることにより達成される。

【０１８５】好ましくは、該アミノオキサルアルカン酸
は、アミノオキシ酢酸ＨＣｌ塩である。該反応は、アル
カノール溶媒、好ましくは低級アルカノール溶媒、更に
好ましくはメタノール中で行なわれる。この反応は、０
℃と１００℃との間、好ましくは２０℃と５０℃との
間、更に好ましくは室温にて行なわれる。この反応は、
不活性雰囲気下で、１分間と２０時間との間、好ましく
は１０分間と１０時間との間、更に好ましくは１時間と
２時間との間で行なわれる。

【０１８６】ｃ）の活性化反応は、上述したシクロスポ
リン−連結基接合体の活性化と同様にして行なわれ、該
活性化反応は、スルホ−ＮＨＳによる処理を含む。 ｄ）の接合反応は、上述したシクロスポリン−連結基接
合体の接合反応と同様にして行なわれ、好ましくは、該
接合反応は、工程ｃ）の活性化エステル生成物をポリ
（アミノ酸）と共に処理することを含む。

【０１８７】その好ましい実施態様の一つにおいて、本
発明は、スキームＩの化合物（４）の調製方法に関する
ものである。スキームＩの工程ａ）は、シクロスポリン
Ａ代謝産物Ｍ１（化合物（１）、スキームＩ）のオゾン
による分解であり、ジメチルスルフィドによる仕上げが
引続く。スキームＩの工程ｂ）は、化合物（２）のアミ
ノオキシ酢酸ＨＣｌ塩を用いた処理による鎖延長であ
り、化合物（３）が形成される。スキームＩの工程ｃ）
は、スルホーＮＨＳを用いた化合物（３）の活性化であ
り、活性化エステルが形成される。スキームＩの工程
ｄ）は、工程ｃ）の活性化エステル生成物と、キーホー
ルリンペットヘモシアニンまたはグルコース−６−リン
酸とのカップリングであり、好ましい化合物（４）が形
成される。

【０１８８】

【化３０】 ＫＬＨ＝キーホールリンペットヘモシアニン

【０１８９】

【化３１】

【０１９０】別の局面において、本発明は、シクロスポ
リンを含むと考えられる試料中のシクロスポリン量測定
のためのアッセイにおいて、妨害的交差反応性物質を不
活性化する方法に関する。好ましくは、該アッセイは上
述したシクロスポリンアッセイの一つである。該不活性
化方法は、シクロスポリンを含むと考えられる試料を含
有する媒質を、妨害的交差反応性物質に結合可能な抗体
と合せることを含む。好ましくは、該アッセイ媒質は、
上述したアッセイ媒質である。

【０１９１】使用される抗体は、シクロスポリン量測定
のためのアッセイにおいて妨害しない。好ましくは、該
抗体類はアッセイ条件下で、シクロスポリンに実質的に
結合しない。更になお好ましくは、抗体は妨害的交差反
応性物質に結合し、シクロスポリンに実質的に結合せ
ず、またアッセイ条件下でシクロスポリン−標識接合体
に実質的に結合しない。

【０１９２】好ましい実施態様の一つにおいて、本発明
は、シクロスポリンＡ代謝産物Ｍ１に結合し、シクロス
ポリンＡに実質的に結合せず、かつ第７のシクロスポリ
ンアミノ酸残基のアラニン窒素原子において、場合によ
り連結基を介してグルコース−６−リン酸デヒドロゲナ
ーゼに接合されるシクロスポリンＡを実質的に阻害（す
なわち実質的に認識）しない抗体を合せることを含む。

【０１９３】妨害的交差反応性物質を不活性化するため
に必要とされる抗体の量は、シクロスポリンを含むと考
えられる試料中に存在する物質の量、および該物質がア
ッセイを妨害する程度に依存する。より多くの妨害物質
が存在し、かつ交差反応の程度が大きいほど、より多く
の抗体が要求され、アッセイの性能を犠牲にせずに交差
反応を最小とすべく充分な抗体が添加される。

【０１９４】血清中に存在するＭ１の量は、検出される
全ＣｓＡ（代謝産物を含む）の下限９．６％および上限
２３％であることが報告されている。Ｍ１の濃度は、心
臓移植患者の群において３０〜９０ｎｇ／ｍＬ、および
肝臓移植患者の群において２２６〜５４４ｎｇ／ｍＬで
あることが報告されている（ＴｒａｎｓｐｌａｎｔＰｒ
ｏｃｅｅｄｉｎｇ １９８８、ＶＸＸ、１７３−１７５
および６１４−６２２参照）。代謝産物Ｍ１の妨害の程
度は、シクロスポリンに結合する抗体の選択性に依存す
る。選択性がより低いシクロスポリン抗体を用いるほ
ど、Ｍ１による妨害の程度は大きい。

【０１９５】別の局面において、本発明は、シクロスポ
リンのアッセイにおける妨害的交差反応性物質の不活性
化方法を都合よく行なうために有用なキットに関する。
このようなキットについての好ましい考察は前述されて
おり、また該キットは、本発明のこの局面に従って抗体
を含んでいる。

【実施例】

【０１９６】下記の実施例は、本発明の特定の実施態様
を更に記述するものである。これらは典型的な例示的実
施例であり、また本発明の範囲を記述するが限定するこ
とを意図するものではない。

【０１９７】例 １ 保護シクロスポリン 乾燥ピリジン（６ｍＬ）および乾燥ジクロロメタン（６
ｍＬ）中のシクロスポリンＡ（１８００ｍｇ、１．５ｍ
ｍｏｌ）の攪拌されている溶液に、クロロトリメチルシ
ランを、室温にてアルゴン雰囲気下に滴々加えた。添加
完了後、該混合物を一夜攪拌した。次いで、該混合物を
真空下に乾燥まで蒸発させ、固体残渣をジクロロメタン
に再溶解させ、エチルアセテート／ヘキサン（８０：２
０）により溶出するシリカゲルカラム上で精製し、ＴＭ
Ｓ保護シクロスポリンＡを得た（式（ＸＸＶ）、ＴＭＳ
−ＣｓＡ、１７００ｍｇ、８９％）；白色固体。Ｍ．
Ｐ．：１５２−１５６℃。Ｉ．Ｒ．（ＣＨＣ１_３）：３
６５０ｗ、３３００ｓ、２９５０ｓ、２９４５ｓ、２８
５０ｓ、１６５０ｓ、１４１５ｓ、および１４００ｃｍ
^１。Ｍ．Ｓ．：ｍ／ｅ１２７５（Ｍ^＋）。^１Ｈおよび
^１３Ｃ ＮＭＲスペクトルは、与えられた構造に一致し
た。

【０１９８】例 ２ ｐ−カルボキシベンジルシクロスポリンのキーホールリ
ンペットヘモシアニン接合体 Ａ．保護ｐ−カルボキシベンジルシクロスポリン 乾燥トルエン（２０ｍＬ）中の例１の生成物（９００ｍ
ｇ、０．７１ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、１５−クラウン
−５エーテル（０．３ｍＬ）を加えた。次いで、ナトリ
ウムハイドライド（３５０ｍｇ、鉱油中の５０％懸濁
液、乾燥トルエンにて洗浄）を、氷浴温度にてアルゴン
雰囲気下で加えた。該混合物を攪拌し、３０分間にて室
温まで加温されることを許容した。メチルｐ−ブロモメ
チルベンゾエート（４００ｍｇ、２．５×０．７１ｍｍ
ｏｌ）を添加し、該混合物を室温にて２４時間攪拌し
た。

【０１９９】エチルアセテート（１５０ｍＬ）を加え、
続けて水（５０ｍＬ）を徐々に注意深く加え、次いで塩
酸（１Ｎ）を、該混合物が酸性（ｐＨ≒３．０）となる
まで加えた。有機層を分離し、水（２×５０ｍＬ）、食
塩水（１００ｍＬ）により洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ_４）
させた。溶媒を減圧下で除去して青白色泡状物（１．３
ｇ）を得、これをシリカゲル薄層プレート上にてエチル
アセテート／ヘキサン（６５：３５；Ｒ、約０．６）で
溶離して、第７および第８のシクロスポリンＡアミノ酸
残基のアラニン窒素原子において式（ＸＩＩＩ）の連結
基を介してメトキシ基に結合するＴＭＳ保護シクロスポ
リンＡ混合物（約５０：５０）を得た；白色固体（６７
０ｍｇ、６７％）。Ｍ．Ｓ．：ｍ／ｅ１，４２３
（Ｍ^＋）。^１Ｈおよび^１３Ｃ ＮＭＲスペクトルは、与
えられた構造式に一致した。

【０２００】Ｂ．ｐ−カルボキシベンジルシクロスポリ
ン メタノール（５ｍＬ）中の例２Ａの生成物（２８０ｍ
ｇ、０．１９７ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に水を加えた（滴
々、約１．５ｍＬまたは溶液がわずかに白濁するま
で）。炭酸カリウム（無水、２３０ｍｇ）を加え、該混
合物を１２時間攪拌し、追加的に水を、溶液がわずかに
白濁するまで滴々加えた。該混合物を更に１２時間、室
温にて攪拌した。この混合物に、塩酸（１Ｎ）を溶液が
酸性（ｐＨ≒２．０）になるまで注意深く入れた。水
（５０ｍＬ）を加え、該混合物をジクロロメタン（３×
５０ｍＬ）で抽出した。有機抽出分を合せ、食塩水（２
×５０ｍＬ）にて洗浄し、乾燥させた（ＭｇＳＯ_４）。
溶媒を減圧下に除去して粗製の生成物（２７０ｍｇ）を
得、これをジクロロメタン（１０ｍＬ）に再溶解し、シ
リカゲルカラム上で、出発物質を除去するまでエチルア
セテートで溶出させ、次いでエチルアセテート／酢酸
（９９．９９：０１）で溶離して、第７および第８のシ
クロスポリンＡアミノ酸残基のアラニン窒素原子におい
て式（ＸＩＩＩ）の連結基を介してヒドロキシ基に結合
するシクロスポリンＡ混合物（約５０：５０）を得た
（１６０ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ、６３％）；白色固
体。Ｍ．Ｐ．：１７１−１７７℃。Ｉ，Ｒ．（ＣＨＣｌ
_３）：３７００ｗ、３３００ｗ、３０００ｍ、２９５０
ｓ、２９２０ｍ、２８７５ｍおよび１６４０ｃｍ^−１。
Ｕ．Ｖ．：（エタノール）２３０ＮＭ（ε＝２．４×１
０^４）。Ｍ．Ｓ．：ｍ／ｅ１３３４（Ｍ１，２４）。元
素分析Ｃ_７０Ｈ_１１７Ｎ_１１Ｏ_１４についての理論値：
Ｃ，６２．９０；Ｈ，８．８２；Ｎ，１１．０６。実験
値：Ｃ，６２．１０；Ｈ，８，８３；Ｎ，１０．０８。
^１Ｈおよび^１３Ｃ ＮＭＲスペクトルは与えられた構造
に一致した。

【０２０１】Ｃ．キーホールリンペットヘモシアニン免
疫原 乾燥ＤＭＦ（１．３ｍＬ）中の例２Ｂの生成物（１００
ｍｇ、０．０７４ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、氷浴温度に
てアルゴン雰囲気下で、１−エチル−３−（３−ジメチ
ルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ）（２１
ｍｇ、１．５×０．０７４ｍｍｏｌ）およびＮ−ヒドロ
キシスルホスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）（２５ｍ
ｇ、１．５×０．０７４ｍｍｏｌ）を加えた。該混合物
を、一夜またはＴＬＣ分析（エチルアセテート／酢酸、
９９：１）により出発物質が無くなるまで攪拌した。こ
の溶液を、ボレート緩衝溶液（６ｍＬ、１００ｍＭ、
（ｐＨ≒９．１）およびＤＭＦ（０．５ｍＬ）中のキー
ホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）（１５０ｍ
ｇ、６６％蛋白質、９２％純度）の溶液を、氷浴温度で
１．５時間で加えた。添加完了後、該混合物を、４℃の
冷室（以下“冷室”と称す）中で一夜攪拌した。該乳様
混合物を、水／ＤＭＦ（８０：２０）、水／ＤＭＦ（９
０：１０）、最後に水のみに対して透析した。透析袋内
容物を凍結乾燥して、第７および第８のシクロスポリン
Ａアミノ酸残基のアラニン窒素原子において式（ＸＩＩ
Ｉ）の連結基を介してキーホールリンペットヘモシアニ
ンに結合するシクロスポリンＡ（１５０ｍｇ）を得た。

【０２０２】Ｄ．ハプテン数の測定 ボレート緩衝溶液（ｐＨ≒９．１、１００ｍＭ）中の例
２Ｃの生成物の溶液（０．５９ｍｇ／ｍＬ、１ｍＬ）
に、２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮ
Ｂ）（０．１％、１ｍＬ）溶液を加え、該混合物を４０
℃にて２時間攪拌した。該混合物を室温まで冷却後、ド
デシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の溶液（１０％、１ｍ
Ｌ）および塩酸（１Ｎ、１ｍ）を加えた。ボレート緩衝
溶液（ｐＨ≒９．１、１００ｍＭ）中のＫＬＨ（精製、
１．０９ｍｇ／ｍＬ）の標準溶液を調製し、ＴＮＢＳ溶
液（１ｍＬ、０．１％）により４０℃にて２時間処理し
た。この標準溶液を、ＳＤＳ溶液（１０％、１ｍＬ）お
よび塩酸（１Ｎ、１ｍＬ）と反応させた。試料および標
準溶液の３４０ｎｍにおける吸光度を測定し、Ｈａｂｅ
ｅｂ，Ａ．Ｆ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．１９６６，１４，３２８（ここに参考として加え
る）の方法に従ってハプテン数を計算し、１，１００を
得た。

【０２０３】例 ３ ｏ−カルボキシベンジルシクロスポリンのキーホールリ
ンペットヘモシアニン接合体 Ａ．保護ｏ−カルボキシベンジルシクロスポリン 乾燥トルエン中のナトリウムハイドライド（３５０ｍ
ｇ、鉱油中の５０％懸濁物、乾燥トルエンにより３×１
０ｍＬで洗浄）の攪拌懸濁物に、例１の生成物（９００
ｍｇ、０．７１ｍｍｏｌ）を室温で加え、続けて１５−
クラウン−５エーテル（０．３５ｍＬ）を加えた。該混
合物を室温にてアルゴン雰囲気下で３０分間攪拌した。
メチルｏ−ブロモメチルベンゾエートを４分割して加え
た（０、１２時間、２４時間、３６時間の時点；各時点
で５０８ｍｇを加え、全体として４×５０８ｍｇ、４×
２ｍｍｏｌ）。該混合物を、室温にて３６時間攪拌した
後、エチルアセテート（１５０ｍＬ）を加え、次いで水
（２０ｍＬ）を注意深く加えた。該混合物を、塩酸（１
Ｎ）により酸性化した。

【０２０４】有機層を分離し、水（３×３０ｍＬ）、食
塩水（５０ｍＬ）により洗浄し、乾燥させた（ＭｇＳＯ
_４）。有機溶媒を除去し、油状残渣をエチルアセテート
に再溶解させ、エチルアセテート／ヘキサン（６５：３
５、ＲＦ≒０．６）で溶離するシリカゲル薄層プレート
にて精製し、第７および第８のシクロスポリンＡアミノ
酸残基のアラニン窒素原子において、式（ＸＩＶ）の連
結基を介してメトキシル基に結合するＴＭＳ保護シクロ
スポリンＡ混合物（約５０：５０）を得た（６００ｍ
ｇ、６０％）。白色固体。Ｍ．Ｓ．：ｍ／ｅ １，４２
３（Ｍ^＋）。^１Ｈおよび^１３Ｃ ＮＭＲスペクトルは、
与えられた構造に一致した。

【０２０５】Ｂ．ｏ−カルボキシベンジルシクロスポリ
ン メタノール（１０ｍＬ）中の例３Ａの生成物（５００ｍ
ｇ、０．３５７ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、水を添加した
（≒３．０ｍＬまたはわずかに白濁するまで）。炭酸カ
リウム（無水、１０００ｍｇ）を加えた（混合物の白濁
が残っている場合には、透明な溶液が得られるまでメタ
ノールを数滴加える）。該混合物を室温で、アルゴン雰
囲気下で２７時間攪拌した。ジクロロメタン（１５０ｍ
Ｌ）および水（５０ｍＬ）を加えた。該有機層を分離
し、水性層をジクロロメタン（２×５０ｍＬ）で抽出し
た。合せた有機層を、水／食塩水（１：１、２×５０ｍ
Ｌにより洗浄し、乾燥させた（ＭｇＳＯ_４）。溶媒を蒸
発させて乾燥させ、粗生成物（４０ｍｇ）を得、これを
シリカゲルカラム上で、出発物質および非酸性物質が除
去されるまでエチルアセテートで溶出し、次いでエチル
アセテート／酢酸（９９．５：０．５）の混合物により
溶出させて、第７および第８のシクロスポリンＡアミノ
酸残基のアラニン窒素原子において式（ＸＩＶ）の連結
基を介してヒドロキシル基に結合するシクロスポリンＡ
の混合物（約５０：５０）を得た（３５０ｍｇ、０．２
６ｍｍｏｌ、７５％）。白色固体。Ｍ．Ｐ．：１６２−
１７１℃。Ｉ．Ｒ．（ＣＨＣｌ_３）：３５００ｗ、３４
５０ｗ、３４００ｍ、３３００ｓ、２９５０ｍ、２８５
０ｍ、および１６２０ｓ、１４２０ｍ、１４００および
１２００ｂｃｍ^−１。Ｍ．Ｓ．：ｍ／ｅ １３３４（Ｍ
−１、６０）。元素分析Ｃ_７０Ｈ_１１７Ｎ_１１Ｏ_１４に
ついての理論値：Ｃ，６２．９０；Ｈ，８．８２；Ｎ，
１１．０６。実験値：Ｃ，６２．２３；Ｈ，８．４８；
Ｎ，１１．７９。^１Ｈおよび^１３Ｃ ＮＭＲスペクトル
は、与えられた構造に一致した。

【０２０６】Ｃ．キーホールリンペットヘモシアニン免
疫原 例３Ｂの生成物および例２Ｃの方法を使用して、第７お
よび第８のシクロスポリンＡアミノ酸残基のアラニン窒
素原子において、式（ＸＩＶ）の連結基を介してキーホ
ールリンペットヘモシアニンに結合するシクロスポリン
Ａの混合物（約５０：５０）を、同様な収率をもって調
製した。

【０２０７】Ｄ．ハプテン数の測定 例３Ｃの生成物および例２Ｄの方法を使用して、ハプテ
ン数５００を得た。

【０２０８】例 ４ ｏ−カルボキシベンジルシクロスポリンのウシ血清アル
ブミン接合体 Ａ．ウシ血清アルブミンシクロスポリン ウシ血清アルブミンをＫＬＨに代えて用いた点を除き、
例３Ｂの生成物および例２Ｃの方法を使用して、第７お
よび第８のシクロスポリンＡアミノ酸残基のアラニン窒
素原子において、式（ＸＩＶ）の連結基を介してウシ血
清アルブミンに結合するシクロスポリンＡ（Ｃｓ−ＢＳ
Ａ）の混合物（約５０：５０）を、同様な収率をもって
得た。

【０２０９】Ｂ．ハプテン数の測定 ＢＳＡをＫＬＨに代えて使用した点を除き例２Ｄの方法
を使用して、例４Ａで形成したＣｓ−ＢＳＡ接合体のハ
プテン数として５５が見出された。

【０２１０】例 ５ 保護ヒドロキシメチルシクロスポリン 乾燥トルエン（３０ｍＬ）中の例１の化合物（１０００
ｍｇ、０．７８ｍｍｏｌ）および１５−クラウン−５エ
ーテル（０．２ｍＬ）の攪拌溶液に、ナトリウムハイド
ライド（４５０ｍｇ、鉱油中の５０％懸濁物、乾燥トル
エンにて洗浄）を、室温にてアルゴン雰囲気下に加え
た。３０分後に該反応混合物を４℃に冷却し、エチレン
オキシド（６ｍＬ）をシリンジにより加えた。反応フラ
スコを密栓し（ストッパーおよびパラフィンにより封止
した）、室温にて２４時間攪拌した。該反応混合物を水
（１００ｍＬ）により注意深く処理し、塩酸（１Ｎ）に
より酸性化し、ジクロロメタン（２００ｍＬ）を添加し
た。有機層を分離し、水（１００ｍＬ）にて洗浄し、乾
燥させた（ＭｇＳＯ_４）。溶媒を減圧下で除去して粗生
成物を白色固体として得、これをシリカゲルカラム上で
エチルアセテートを用いて溶離して精製し、第７のシク
ロスポリンアミノ酸残基のアラニン窒素原子において式
（Ｉ）の連結基を介してヒドロキシル基に結合するＴＭ
Ｓ保護シクロスポリンＡを得た；白色固体（３５０ｍ
ｇ、３４％）。Ｍ．Ｐ．：１２４−１３２℃。Ｉ．Ｒ．
（ＣＨＣｌ_３）：３６５０Ｗ、３４００ｗ、３３００
ｍ、２９５０ｍ、１６２０ｓ、１４６０ｗ、および１４
００ｗならびに１２００ｂｃｍ^−１。Ｍ．Ｓ．：ｍ／ｅ
１３１７（Ｍ^＋，１００）、１２１７（Ｍ−ＣＨ_２Ｃ
Ｈ_２ＯＨ、１０）。^１Ｈおよび^１３Ｃ ＮＭＲスペクト
ルは、与えられた構造に一致した。

【０２１１】例 ６ モノカルボキシアミド延長ヒドロキシエチルシクロスポ
リンのキーホールリンペットヘモシアニン接合体 Ａ．保護モノカルボキシアミド延長ヒドロキシエチルシ
クロスポリン 乾燥トルエン（２ｍＬ）中の例５の生成物（３００ｍ
ｇ、０．２３ｍｍｏｌ）およびトリ−ｎ一ブチルチンエ
トキシド（１５４ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）の攪拌溶液
に、メチルグリシネートイソシアネートを室温にてアル
ゴン雰囲気下で加えた。該反応混合物を２時間攪拌し
た。エチルアセテート（５０ｍＬ）および水（５０ｍ
Ｌ）を加えた。有機層を分離し、食塩水／水（１：１，
２×５０ｍＬ）により洗浄し、乾燥させた（ＭｇＳ
Ｏ_４）。溶媒を減圧下で除去し、粗生成物をエチルアセ
テートで溶離するシリカゲルカラムで精製して、第７の
シクロスポリンＡアミノ酸残基のアラニン窒素原子にお
いて式（ＩＩ）の連結基を介してメトキシ基に結合する
ＴＭＳ保護シクロスポリンＡを得た（２８０ｍｇ、０．
２ｍｍｏｌ、８５％）。Ｍ．Ｓ．：ｍ／ｅ １４３３
（Ｍ＋１，１００）。^１Ｈおよび^１３Ｃ ＮＭＲスペク
トルは、与えられた構造に一致した。

【０２１２】Ｂ．モノカルボキシアミド延長ヒドロキシ
エチルシクロスポリン メタノール（１０ｍＬ）中の例６Ａの生成物（２５０ｍ
ｇ、０．１７ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、水を該混合物が
わずかに白濁するまで加えた。炭酸カリウム（２００ｍ
ｇ、無水）を加え、該混合物を室温にてアルゴン雰囲気
下で一夜攪拌した。該混合物を塩酸（１Ｎ）により酸性
化し、水（２０ｍＬ）を加えた。該混合物をジクロロメ
タン（３×７５ｍＬ）により抽出した。合せた有機抽出
物を、食塩水（１０ｍＬ）で洗浄し、乾燥させた（Ｍｇ
ＳＯ_４）。溶媒を減圧下で除去し、第７のシクロスポリ
ンＡアミノ酸残基のアラニン窒素原子において式（Ｉ
Ｉ）の連結基を介してヒドロキシル基に結合されたシク
ロスポリンＡを得た；白色固体（２２０ｍｇ、０．１６
ｍｍｏｌ、９６％）。Ｍ．Ｐ．１５６−１６６℃。この
物質は約９５％の純度であったが、エチルアセテート／
メタノール／酢酸（９８：１．９：１，Ｒ．＝０．１
５）により溶離されるシリカゲルカラムによって更に精
製され得る。Ｉ．Ｒ （ＣＨＣｌ_３）：３６５０ｗ、３
４００ｗ、３３００ｗ、２９５０ｍ、１７００ｗ、１６
２０ｓ、１４６０ｍ、１４００ｍおよび１０９０ｗｃｍ
^−１。Ｍ．Ｓ． ｅ／ｍ １３６９（Ｍ^＋＋Ｎａ，６
０）、１３４７ （Ｍ＋Ｈ，５０）。^１Ｈおよび^１３Ｃ
ＮＭＲスペクトルは、与えられた構造に一致した。

【０２１３】Ｃ．キーホールリンペットへモシアニン接
合体 乾燥ＤＭＦ（１ｍＬ）中の例６Ｂの生成物（３０ｍｇ、
２．２×１０^−２ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、ＥＤＡＣ
（５．２ｍｇ、１．２×２．２×１０^−２ｍｍｏｌおよ
びスルホーＮＨＳ（５．２ｍｇ、１．２×２．２×１０
^−２ｍｍｏｌ）を、４℃にてアルゴン雰囲気下で加え
た。次いで該混合物を冷室内で一夜攪拌した。該溶液
を、ボレート緩衝溶液（ｐＨ≒９．１、３．５ｍＬ、１
００ｍＬ）およびＤＭＦ（０．５ｍＬ）中のＫＬＨ溶液
に２時間で添加した。添加完了後、該混合物を冷室内に
て一夜攪拌した。該混合物を、Ｈ_２Ｏ／ＤＭＦ（７５
％：２５％）に対し、次いで水に対して透析し、第７の
シクロスポリンＡアミノ酸残基のアラニン窒素原子にお
いて式（ＩＩ）の連結基を介してキーホールリンペット
ヘモシアニンに結合するシクロスポリンＡを得た（７４
ｍｇ）。

【０２１４】Ｄ．ハプテン数測定 例６Ｃの生成物および例２Ｄの方法を使用してハプテン
数５００が測定された。

【０２１５】例 ７ トリカルボキシアミド延長ヒドロキシエチルシクロスポ
リンのキーホールリンペットヘモシアニン接合体 Ａ．ジカルボキシアミド−アミノ延長ヒドロキシエチル
シクロスポリン 乾燥ＴＨＦ（１ｍＬ）中の例６Ｂの生成物（８０ｍｇ、
６×１０^−２ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、Ｎ−ヒドロキシ
スクシンイミド（ＮＨＳ）（９．０ｍｇ、１．３×６×
１０^−２ｍｍｏｌ）およびジシクロヘキシルカルボジイ
ミド（ＤＣＣ）（１６．１ｍｇ、１．３×６×１０^−２
ｍｍｏｌ）を、４℃にてアルゴン雰囲気下で加えた。該
混合物を冷室内で一夜攪拌し、ＴＨＦ（５ｍＬ）中のエ
チレンジアミン（６００ｍｇ、１０ｍｍｏｌ）溶液にゆ
っくり加えた。該混合物を室温にて４時間攪拌し、水
（２０ｍＬ）を加えた。該混合物をジクロロメタン（３
×５０ｍＬ）により抽出し、乾燥させた（Ｎａ_２Ｓ
Ｏ_４）。溶媒を減圧下で除去して、第７のシクロスポリ
ンＡアミノ酸残基のアラニン窒素原子において、式（Ｘ
Ｉ）の連結基を介してアミノ基に結合するシクロスポリ
ンを得（８０ｍｇ、５．６×１０^−２ｍｍｏｌ、９４
％）、これを更に精製することなく使用した。

【０２１６】Ｂ．トリカルボキシアミド延長ヒドロキシ
エチルシクロスポリン 乾燥ＴＨＦ（１ｍＬ）中の例７Ａの生成物（８０ｍｇ、
５・６×１０^−２ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、無水ジグリ
コール酸（９７％、２４ｍｇ、３×５．６×１０^−２ｍ
ｍｏｌ）およびトリエチルアミン（２６ｍｇ、０．２６
ｍｍｏｌ）を室温にてアルゴン雰囲気下で加えた。該反
応物を一夜攪拌した。水（１０ｍＬ）およびジクロロメ
タン（５０ｍＬ）を加え、該混合物を塩酸（１Ｎ）によ
り酸性化した。有機相を分離し、水性相をジクロロメタ
ン（２×２５ｍＬ）により抽出した。合せた有機層を食
塩水（５０ｍＬ）により洗浄し、乾燥させた（ＭｇＳＯ
_４）。溶媒を減圧下にて除去し、第７のシクロスポリン
Ａアミノ酸残基のアラニン窒素原子において式（ＸＩ
Ｉ）の連結基を介してヒドロキシル基に結合するシクロ
スポリンＡを得た（７０ｍｇ、８３％）；ガラス様固
体。Ｍ．Ｓ．：ｍ／ｅ１５０５（Ｍ＋Ｈ，３０％）。^１
Ｈ ＮＭＲスペクトルは、与えられた構造に一致した。

【０２１７】Ｃ．キーホールリンペットヘモシアニン接
合体 ＤＭＦ（１ｍＬ）中の例７Ｂの生成物（６０ｍｇ、４×
１０^−２ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、ＮＨＳ（５．５ｍ
ｇ、１．２×４×１０^−２ｍｍｏｌ）およびＤＣＣ
（９．８ｍｇ、１．２×４×１０^−２ｍｍｏｌ）を４℃
にてアルゴン雰囲気下で加えた。該混合物を一夜攪拌し
た。該溶液を、リン酸緩衝溶液（６ｍＬ、ｐＨ≒８．
３、１００ｍＭ）中のＫＬＨ（１２０ｍｇ、６６％蛋白
質、９２％の純度）の溶液およびＤＭＦ（０．８ｍＬ）
に４℃にて３時間で加えた。添加完了後、該溶液を冷室
内で一夜攪拌した。該混合物をＨ_２Ｏ／ＤＭＦ（９０：
１０）および水に対して透析した。次いで接合体を凍結
乾燥して、第７のシクロスポリンＡアミノ酸残基のアラ
ニン窒素原子において、式（ＸＩＩ）の連結基を介して
キーホールリンペットヘモシアニンに結合するシクロス
ポリンＡを得た（１２０ｍｇ）。

【０２１８】Ｄ．ハプテン数測定 例７Ｃの生成物および例２Ｄの方法を使用して、ハプテ
ン数７００が測定された。

【０２１９】例 ８ モノカルボキシアミド延長ヒドロキシエチルシクロスポ
リン同族体 Ａ．保護カルボキシアミド延長ヒドロキシエチルシクロ
スポリン同族体 乾燥トルエン（１ｍＬ）中の例５の生成物（６０ｍｇ、
４．５×１０^−２ｍｍｏｌ）およびトリ−ｎ−ブチルチ
ンエトキシド（３０ｍｇ、８．９×１０^−２ｍｍｏｌ）
の攪拌溶液に、β−アラニンイソシアネートメチルエス
テルを加えた。該混合物を２時間攪拌した。エチルアセ
テート（５０ｍＬ）および水（５０ｍＬ）を加え、有機
層を分離し、食塩水／水（１：１、２×５０ｍＬ）によ
り洗浄し、乾燥させた（ＭｇＳＯ_４）。減圧下で有機相
を除去し、泡状固体を、エチルアセテートで溶離するシ
リカゲルカラムで精製し、第７のシクロスポリンＡアミ
ノ酸残基のアラニン窒素原子において、式（ＩＸ）の連
結基を介してメトキシ基に結合するＴＭＳ保護シクロス
ポリンＡを得た（５９ｍｇ、４．１×１０^−２ｍｍｏ
ｌ、９１％）。

【０２２０】Ｂ．モノカルカキシアミド延長ヒドロキシ
エチルシクロスポリン同族体 メタノール（１ｍＬ）中の例８Ａの生成物の攪拌溶液
に、水および炭酸カリウム（３０ｍｇ、無水）を加え、
該混合物を２０時間攪拌した。該混合物を塩酸（１Ｎ）
により酸性化し、水（２０ｍＬ）を加え、該混合物をジ
クロロメタン（２×２０ｍＬ）により抽出し、乾燥させ
た（ＭｇＳＯ_４）。この物質をシリカゲルカラム上にて
エチルアセテート／メタノール／酢酸（９８：２：０．
１）により溶離させて精製し、第７のシクロスポリンＡ
アミノ酸残基のアラニン窒素原子において、式（ＩＸ）
の連結基を介してヒドロキシル基に結合されるシクロス
ポリンＡを得た（２５ｍｇ、９０％）。Ｍ．Ｓ．：ｍ／
ｅ １３１８（Ｍ＋Ｈ，１００）。

【０２２１】例 ９ モノカルボキシアミド延長ヒドロキシエチルシクロスポ
リンチオ類似体 Ａ．保護モノカルボキシアミド延長ヒドロキシエチルシ
クロスポリンチオ類似体 乾燥トルエン（１ｍＬ）中の例５の生成物（６０ｍｇ、
４．５×１０^−２ｍｍｏｌ）およびトリ−ｎ−ブチルチ
ンエトキシド（７０ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）の攪拌溶液
に、酢酸イソチオシアネートメチルエステル（９０ｍ
ｇ）を加えた。該混合物を２時間攪拌した。エチルアセ
テート（５０ｍＬ）および水（５０ｍＬ）を加えた。有
機層を分離し、食塩水／水（１：１、２×５０ｍＬ）に
より洗浄し、乾燥させた（ＭｇＳＯ_４）。減圧下で有機
層を分離し、泡状固体を、シリカゲルカラム上にてエチ
ルアセテートにより溶離させて精製し、第７のシクロス
ポリンＡアミノ酸残基のアラニン窒素原子において、式
（Ｘ）の連結基を介してメトキシ基に結合されるＴＭＳ
保護シクロスポリンＡを得た（５５ｍｇ、３．８×１０
^−２ｍｍｏｌ）。

【０２２２】Ｂ．モノカルボキシアミド延長ヒドロキシ
エチルシクロスポリンチオ類似体 メタノール（１０ｍＬ）中の例９Ａの生成物（５５ｍ
ｇ、３．４×１０^−２ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、水およ
び炭酸カリウム（３０ｍｇ、無水）を加え、該混合物を
２０時間攪拌した。該混合物を塩酸（１Ｎ）により酸性
化し、水（２０ｍＬ）を加え、該混合物をジクロロメタ
ン（２×２０ｍＬ）によって抽出し、乾燥させた（Ｍｇ
ＳＯ_４）。この材料を、シリカゲルカラム上にてエチル
アセテート／メタノール／酢酸（９８：２：０．１）に
より溶離させて精製し、第７のシクロスポリンＡアミノ
酸残基のアラニン窒素原子において、式（Ｘ）の連結基
を介してヒドロキシル基に結合するシクロスポリンＡを
得た（５０ｍｇ、３．４×１０^−２ｍｍｏｌ、８９
％）。Ｍ．Ｓ．：ｍ／ｅ １４９６（７０％），１３６
３（８０％）。

【０２２３】例１０ モノカルボキシアミド延長ヒドロキシエチルシクロスポ
リンアルキル類似体 Ａ．保護モノカルボキシアミド延長ヒドロキシエチルシ
クロスポリンアルキル類似体 例５の生成物および例８Ａの方法を使用して（β−アラ
ニンイソシアネートメチルエステルに代えてα−アラニ
ンイソシアネートメチルエステルを使用した点を除
く）、第７のシクロスポリンＡアミノ酸残基のアラニン
窒素原子において式（ＶＩ）の連結基を介してメトキシ
基に結合するＴＭＳ保護シクロスポリンＡを、同様な収
率をもって調製した。

【０２２４】Ｂ．モノカルボキシアミド延長ヒドロキシ
エチルシクロスポリンアルキル類似体 例１０Ａの生成物および例８Ｂの方法を使用して、第７
のシクロスポリンＡアミノ酸残基のアラニン窒素原子に
おいて式（ＶＩ）の連結基を介してヒドロキシル基に結
合するシクロスポリンＡを、９０％の収率をもって調製
した。Ｍ．Ｓ．：ｍ／ｅ １３９９（Ｍ＋Ｋ、１００
％）、１３８３（Ｍ＋Ｎａ、７０％）、１３６２（Ｍ＋
Ｈ、３０％）。

【０２２５】例１１ モノカルボキシアミド延長ヒドロキシエチルシクロスポ
リン芳香族類似体 Ａ．保護モノカルボキシアミド延長ヒドロキシエチルシ
クロスポリン芳香族類似体 例５の生成物および例８Ａの方法を使用して（α−アラ
ニンイソシアネートメチルエステルに代えてα−フェニ
ルα−アラニンイソシアネートメチルエステルを使用し
た点を除く）、第７のシクロスポリンＡアミノ酸残基の
アラニン窒素原子において、式（Ｖ）の連結基を介して
メトキシ基に結合するＴＭＳ保護シクロスポリンＡを同
様な収率をもって得た。

【０２２６】Ｂ．モノカルボキシアミド延長ヒドロキシ
エチルシクロスポリン芳香族類似体 例１０Ａの生成物および例８Ｂの方法を使用して、第７
のシクロスポリンＡアミノ酸残基のアラニン窒素原子に
おいて、式（Ｖ）の連結基を介してヒドロキシル基に結
合するＴＭＳ保護シクロスポリンＡを同様な収率をもっ
て得た。Ｍ．Ｓ．：ｍ／ｅ １４２２（Ｍ−Ｈ，３０
％）。

【０２２７】例１２ カルボキシメチル延長ヒドロキシエチルシクロスポリン Ａ．保護カルボキシメチル延長ヒドロキシエチルシクロ
スポリン 乾燥ＴＨＦ（１．５ｍＬ）中の例５の生成物（１３０ｍ
ｇ、９．８×１０^−２ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、ナトリ
ウムハイドライド（２０ｍｇ、鉱油中の５０％懸濁物、
乾燥ＴＨＦにて洗浄）および１５−クラウン−５エーテ
ル（≒２０ｍｇ）を、室温にてアルゴン雰囲気下で加え
た。該混合物を１時間攪拌し、乾燥ＴＨＦ（０．５ｍ
Ｌ）中のα−ブロモ酢酸メチルエステル（８０ｍｇ）を
加えた。

【０２２８】該反応物を更に２時間攪拌し、追加分のα
−ブロモ酢酸メチルエステル（８０ｍｇ）を添加し、該
反応物を２時間攪拌した。エチルアセテート（５０ｍ
Ｌ）および（２０ｍＬ）を加え、該混合物を塩酸（１
Ｎ）により酸性化した（ｐＨ≒３．０）。有機相を分離
し、水（２×５０ｍＬ）により洗浄し、乾燥させた（Ｍ
ｇＳＯ_４）。溶媒を減圧下で除去し、残渣をシリカゲル
薄層プレート上でエチルアセテートにより溶離して精製
し、第７のシクロスポリンＡアミノ酸残基のアラニン窒
素原子において、式（ＶＩＩ）の連結基を介してメトキ
シ基に結合するＴＭＳ保護シクロスポリンＡを得た（８
０ｍｇ、６０％）；白色固体。Ｍ．Ｓ．：ｍ／ｅ １３
５８（Ｍ−Ｈ，１００）。^１Ｈ ＮＭＲスペクトルは、
与えられた構造に一致した。

【０２２９】Ｂ．カルボキシメチル延長ヒドロキシエチ
ルシクロスポリン メタノール（４ｍＬ）中の例１２Ａの生成物（７９ｍ
ｇ、５．８×１０^−２ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、水を該
混合物が白濁するまで（約１．５ｍＬ）加えた。炭酸カ
リウム（無水、４０ｍｇ）を加え、該混合物を２０時間
攪拌した。該混合物を塩酸（１Ｎ）により酸性化し、水
（２０ｍＬ）を加え、該混合物をジクロロメタン（２×
２０ｍＬ）により抽出し、乾燥させた（ＭｇＳＯ_４）。
該粗生成物を、シリカゲルカラム上でエチルアセテート
／メタノール／酢酸（９８：２：０．１）により溶離し
て精製し、第７のシクロスポリンＡアミノ酸残基のアラ
ニン窒素原子において、式（ＶＩＩ）の連結基を介して
ヒドロキシル基に結合するシクロスポリンＡを得た（６
５ｍｇ、８０％）；白色固体。Ｍ．Ｓ．：ｍ／ｅ １３
２６（Ｍ＋Ｎａ）、１３０４（Ｍ＋Ｈ）。^１Ｈ ＮＭＲ
スペクトルは、与えられた構造式に一致した。

【０２３０】例１３ ジカルボキシアミド延長ｐ−カルボキシベンジルシクロ
スポリンキーホールリンペットヘモシアニン接合体 Ａ．ジカルボキシアミド延長ｐ−カルボキシベンジルシ
クロスポリン ＤＭＦ（０．６９ｍＬ）中の例２Ｂの生成物（６０ｍ
ｇ）の攪拌溶液に、Ｎ−ヒドロキシスルフォスクシンイ
ミド（スルホ−ＮＨＳ、１２．８ｍｇ）および（１−エ
チル−３（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミ
ド（ＥＤＡＣ、１３．９ｍｇ）を４℃にてアルゴン雰囲
気下で加えた。該反応混合物を４℃にて一夜攪拌した。
スルホ−ＮＨＳエステルの完全な形成は、１８時間後に
ＴＬＣ（シリカゲル、溶離剤０．１５：２：８の酢酸／
メタノール／ジクロロメタン）により観察した。得られ
たスルホ−ＮＨＳエステルを、ボレート緩衝液（１ｍ
Ｌ、ｐＨ９、０．０５Ｍ）およびＤＭＦ（２ｍＬ）の混
合物中のグリシルグリシン（１２．１ｍｇ）の溶液に、
ｐＨを８．５〜９に調節しながら４℃にて３０分間でゆ
っくり加えた。淡黄色溶液を４℃にて更に３０分間攪拌
し、室温で２時間攪拌した。得られた生成物に、１Ｎ
ＨＣｌを加え（混合物がｐＨ４となるまで）、沈殿を収
集し、真空下で乾燥させて白色生成物を得た（４９ｍ
ｇ）。濾液をエチルアセテートで抽出し、該有機抽出物
を乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、溶媒を蒸発させて生成物
の第２の量を得た。合せた生成物を調製用層クロマトグ
ラフィ（シリカゲル、溶離液３：４０：１６０の酢酸／
メタノール／ジクロロメタン）により精製し、第７およ
び第８のシクロスポリンアミノ酸残基のアラニン窒素原
子において、式（ＸＩＸ）の連結基を介してヒドロキシ
ル基に結合するシクロスポリンＡの混合物（約５０：５
０）を得た（２９ｍｇ）。Ｍ．Ｓ．：ｍ／ｅ １４５０
（Ｍ＋Ｈ）、１４８８（Ｍ＋Ｋ）。

【０２３１】Ｂ．キーホールリンペットヘモシアニン接
合体 ＤＭＦ（３００μＬ）中の例１３Ａの生成物（２０ｍ
ｇ）に、ＤＭＦ（３００μＬ）中のＥＤＡＣ（３．１ｍ
ｇ）およびＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（３．
５８ｍｇ）を加えた。該反応混合物を４℃にて一夜攪拌
した。スルホ−ＮＨＳエステルの不完全形成は、ＴＬＣ
（シリカゲル、溶離液３：４０：１６０の酢酸／メタノ
ール／ジクロロメタン）により観察された。追加的にＥ
ＤＡＣ（３．１ｍｇ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイ
ミド（３．５８ｍｇ）を添加した。該反応混合物を、室
温にて４時間攪拌した。完全反応をＴＬＣ（シリカゲ
ル、溶離液３：４０：１６０の酢酸／メタノール／ジク
ロロメタン）により観察した。

【０２３２】ボレート緩衝溶液（３．０ｍＬ、ｐＨ９、
０．０５Ｍ）およびＤＭＦ（０．７ｍＬ）の混合物中の
ＫＬＨ（４０ｍｇ）の溶液に、上記で調製されたスルホ
−ＮＨＳエステル反応混合物を、ｐＨ８．５の一定ｐＨ
調節を行ないつつ室温にて４時間で添加した。追加量の
ＤＭＦ（０．２５ｍＬ）を４時間で加えた。得られた反
応混合物を４℃にて一夜攪拌した。該白濁混合物を、１
０％ＤＭＦ／水（ＮＨ_４ＯＨによりｐＨ８、３×４Ｌ）
および水（ＮＨ_４ＯＨによりｐＨ８、５×４Ｌ）に対し
て透析した。得られた生成物を凍結乾燥し、第７および
第８のシクロスポリンＡアミノ酸残基のアラニン窒素原
子において、式（ＸＩＸ）の連結基を介してキーホール
リンペットヘモシアニンに結合するシクロスポリンＡを
得た（３２ｍｇ）

【０２３３】Ｃ．ハプテン数測定 例１３Ｂの生成物および例２Ｄの方法を使用して、ハプ
テン数９４８が測定された。

【０２３４】例１４ シクロスポリン，グルコース−６−リン酸デヒドロゲナ
ーゼ接合体 Ａ．シクロスポリンハプテンの活性化 炎中で乾燥させたフラスコに、３５ｍｇのシクロスポリ
ンハプテン、特に例６Ｂの生成物、６．２ｍｇのスルホ
−ＮＨＳ、５．５ｍｇのＥＤＡＣ、および０．３５ｍＬ
のＤＭＦを容れた。該混合物を４℃にて一夜攪拌した。

【０２３５】Ｂ．グルコース−６−リン酸デヒドロゲナ
ーゼへの接合 例１４Ａの生成物を、ｐＨ８．８の炭酸ナトリウム緩衝
液／ＤＭＦ（０．２ｍＬ／ｍＬの緩衝液）中のグルコー
ス−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ、炭酸ナ
トリウム緩衝液中で０．０５５ｍ）、グルコース−６−
リン酸（Ｇ６Ｐ、４．５ｍｇ／ｍｇＧ６ＰＤＨ）、およ
びＮＡＤＨ（９ｍｇ／ｍｇＧ６ＰＤＨ）の溶液に対し
て、氷浴温度にて小分けして加えた。反応を、監視し、
抗−ＣｓＡ抗体不在時の酵素活性に相対的な、抗−Ｃｓ
Ａ抗体存在時の酵素活性の２９−３５％阻害において停
止させた。

【０２３６】Ｃ．接合体の単離 この例１４Ｂの接合体である、第７のシクロスポリンＡ
アミノ酸残基のアラニン窒素原子において式（ＩＩ）の
連結基を介してグルコース−６−デヒドロゲナーゼに結
合するシクロスポリンＡを、Ｇ１００セファデックス上
のクロマトグラフィ的分離により、０．０５％のナトリ
ウムアジドおよび０．００５％のチメロサールを含む
０．０５５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を用い
て単離した。約３５％未満の不活性化において、５−１
０のハプテン数を得た。例２Ｂ、３Ｂ、７Ｂ、８Ｂ、９
Ｂ、１０Ｂ、１１Ｂまたは１２Ｂも、例１４と同様な方
法で対応するＧ６ＰＤＨ接合体に変換された。

【０２３７】例１５ モノクローナル抗体の調製、シクロスポリン Ａ．一般的方法 使用した標準的ハイブリドーマ技術は、詳述されている
（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．；Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．Ｎａｔ
ｕｒｅ１９７５，２５６，４９５−７；Ｈｕｒｒｅｌ
ｌ，Ｊ．Ｇ．Ｒ．“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｈｙｂｒｉ
ｄｏｍａ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ
ｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，ＣＲＣ Ｐ
ｒｅｓｓ，１９８２，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ３３
４３１）。

【０２３８】Ｂ．免疫 ＢＡＬＢ／Ｃマウスを、完全フロイントアジュバンド
（ＣＦＡ）中のイムノゲン（特には例１３ＢのＫＬＨ接
合体）の５０〜２００μｇを用いて、腹腔内的（ＩＰ）
または皮下的（ＳＣ）注射により免役した。イムノゲン
（不完全フロイントアジュバンド（ＩＦＡ）、ＩＰまた
はＳＣ）を用いてブーストを月毎に行なった。最終のＩ
Ｐ、ＳＣ、または静脈内（ＩＶ）注射を生理食塩水中の
１００−５００μｇにて融合に先立って実施した。

【０２３９】Ｃ．免疫の監視 マウスの監視のために、血清抗体に向いたＥＬＩＳＡ試
験を２〜３回の免疫後に使用した。血清抗体力価は、ア
ッセイに先立って倍々希釈した。

【０２４０】マイクロタイターＥＩＡプレート（Ｃｏｓ
ｔｅｒ ＃３５９０）を、イムノゲンと同じハプテンに
より標識したＧ６ＰＤＨ酵素−接合体の５０μＬ／ウェ
ルにより被覆し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、０．０１
Ｍリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、およ
び０．０２％ナトリウムアジド、ｐＨ７．２）に１：１
００に希釈し、３７℃にて１時間熟成させ、次いでＰＢ
Ｓ中の１％正常ヒツジ血清（ＮＳＳ）を、非特異的結合
を防ぐために３００ｕＬ／ウェル添加した。３０分間放
置した後、プレートの内容物を傾けて排出した。一連の
希釈を行なった血清を５０ｕＬ／ウェル加え、３７℃に
て３０分間熟成した。該プレートを、ＥＬＩＳＡ洗浄緩
衝液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０〔Ｆｉｓｈｅｒ Ｓ
ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏ．＃ＣＳ−２７９−３〕、Ｐ
ＢＳ中、ｐＨ７．２）を用いて３回洗浄した。ＰＢＳ中
に１：１０００に希釈されたアルカリホスファターゼ
（ＩｇＧ＋ＩｇＭ＋軽鎖特異的、Ｔａｇｏ＃６５４３、
８８７Ｍｉｔｔｅｎ Ｒｏａｄ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍ
ｅ，ＣＡ９４０１１，ＵＳＡ）にて標識されたヤギの抗
−マウス血清を５０ｕＬ／ウェルでプレートに加え、更
に３０分間３７℃で熟成した。該プレートを前述と同様
に洗浄し、次いで１００ｕＬ／ウェルの基質（１５ｍｇ
のｐ−ニトロフェニルホスフェート・２ナトリウム〔Ｐ
ＮＰＰ、Ｓｉｇｍａ＃Ｓ１０４−１０５〕２５ｍＬの１
０％ジエタノールアミン〔Ｅａｓｔｍａｎ−Ｋｏｄａｋ
＃１５９８〕あたり、ｐＨ９．８、０．５ｍＭ ＭｇＣ
ｌ_２〔Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ＃５９５８〕を含む）
を添加した。プレートを震盪機上に室温で３０分間、ま
たは可視的な発色があるまで置いた。該プレートを、次
いでＴｉｔｅｒｔｅｋ Ｍｕｌｔｉｓｃａｎにより４０
５ｎｍで測定した。ＯＤ値を、血清試料の希釈度に対し
てプロットした。血清抗体力価は、滴定曲線の最大ＯＤ
から７０％低減する希釈度と定義した。

【０２４１】Ｄ．細胞融合 免疫マウスから脾臓細胞を取出し、ＰＧＥを用いてＰ３
Ｘ６３−ＡＧ８．６５３ミエローマ細胞と融合させ
た。該細胞をＨＡＴ添加媒質中に懸濁し、９６−ウェル
のマイクロタイタープレートに分配した。４日後に、細
胞に半量のＨＡＴ添加媒質を置換することにより養分を
与えた。

【０２４２】Ｅ．ハイブリトーマの選択 細胞融合から約１週間後、ハイブリトーマを特異的抗体
について選択した。抗体産生に対する選択のために、逆
ＥＬＩＳＡアッセイを使用した。マイクロタイターＥＩ
Ａプレートを、ＰＢＳ中に１：１００に希釈したＩｇＧ
＋ＩｇＡ＋ＩｇＭ，Ｈ＋Ｌ鎖に対するウサギの抗−マウ
ス特異的抗体（Ｚｙｍｅｄ＃６１−６４００ＳＹ）、ｐ
Ｈ７．２により５０ｕＬ／ウェルを用いて被覆し、使用
まで４℃にて１週間を限度として保存した。該プレート
に、非特異的結合を防ぐために１％ＮＳＳ／ＰＢＳを３
００ｕＬ／ウェル用いて充填し、３０分間静置した後、
傾けて排出した。次いで用いた媒質５０ｕＬ／ウェルを
加え、３７℃にて３０〜６０分間熟成させた。イムノゲ
ンと同じハプテンにより標識したＧ６ＰＤＨ酵素を、Ｐ
ＢＳ中に１：１００〜１：７００に希釈し、５０ｕＬ／
ウェルを加え、次いで３７℃にて３０〜６０分間熟成し
た。プレートを前述と同様に洗浄し、最終的に１００ｕ
Ｌ／ウェルの基質（０．０５３Ｍ ｔｒｉｚｍａ塩基
〔Ｓｉｇｍａ＃Ｔ１５０３〕、０．０２Ｍ ＮＡＤ、
０．０３３Ｍ Ｇ−６−Ｐ、０．０２５％ＮａＮ〔ナト
リウムアジド、Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ＃７−ＶＯ１５〕、
ＨＣｌにてｐＨ６．２に調節、０．６３ｍＭ ｐ−ヨウ
化ニトロテトラゾリウムバイオレット〔ＩＮＴ、Ｓｉｇ
ｍａ＃Ｉ８３７７〕、１％ＮＳＳおよび６単位／ｍＬの
ジアホラーゼ（ｄｉａｐｈｏｒａｓｅ）〔Ｓｉｇｍａ＃
２３８１〕）を添加した。該プレートを室温にて約１時
間、震盪機上に置き、４９２ｎｍにてＴｉｔｅｒｔｅｃ
Ｍｕｌｔｉｓｃａｎにより測定した。背景より少なく
とも２倍高い読取値を与えるウェルをＥＬＩＳＡ＋とし
た。

【０２４３】Ｆ．腹水中における抗体産生 腹水中においてモノクローナル抗体産生の規模を拡大す
るために、細胞の移植の２〜７日前に０．３〜０．５ｍ
Ｌ／マウスのＩＦＡのＩＰ注射によりマウスをプライム
して腫瘍細胞の生育を誘発した。細胞をＴ−７５フラス
コ中で対数相にて約１８×１０^６細胞に生育させ、遠心
分離し、次いで２ｍＬのＳ−ＤＭＥＭ中に再懸濁させ
た。各マウスに、約４−５×１０^６細胞の０．５ｍＬ
ＩＰ注射を行なった。腹水腫瘍は、通常１または２週間
で発達する。次いで高濃度の抗体を含む腹水を１８−ゲ
ージの針を用いて流出させた。該液体を室温で凝結さ
せ、次いで、１５００ｒｐｍにて３０分間遠心分離を行
なった。抗体を含む液体を注出し、−２０℃に冷凍して
保存した。この例１５の方法により、例２Ｃ、３Ｃ、６
Ｃ、７Ｃおよび４Ａの生成物に対しても抗体を生成させ
た。

【０２４４】例１６ 抗体および酵素接合体の選択 Ａ．一般的因子 シクロスポリンに対するＥＭＩＴ（登録商標）アッセイ
に使用する最適なモノクローナル抗体および酵素接合体
の選択は、多くの相互関連因子に依存する。主には、抗
体は酵素接合体を認識し、効果的でなければならない。
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ
Ｈ）は、好適な酵素であるため、抗体は、グルコース−
６−リン酸接合体の活性を阻害する能力に基づいて選択
されるであろう。更には、抗体は、興味あるシクロスポ
リンを認識する能力に基いて選択される。例えば、シク
ロスポリンＡを検出し、その代謝産物は検出しないアッ
セイが望まれる場合、抗体はこの特異性をもつものが選
択されるであろう。別法として、シクロスポリンＡとそ
の主要な代謝産物を検出し得るアッセイが望まれる場合
には、この特異性を有する抗体が選択されるであろう。

【０２４５】他の選択因子は、安定性、調製の容易さ、
ならびに抗体および酵素接合体の溶解性を含む。行なわ
れるアッセイの詳細も、抗体および酵素接合体の選択に
影響を与える。例えば、試料は全血、血清、尿等であり
得る。アッセイ希釈剤、安定化用添加剤、緩衝剤成分、
消泡剤、および前処理も、抗体および酵素接合体の選択
に影響を与える。上述の因子は、一般的であり、かつ相
互関連性のものである。最適抗体および酵素接合体の選
択は、上述の因子のいくつかの注意深い平衡に加えて、
興味ある特定のアッセイにおいて重要な他の因子に関連
する。

【０２４６】Ｂ．酵素接合体スクリーニング 例１４において調製されたシクロスポリンＡ、グルコー
ス−６−リン酸デヒドロゲナーゼ接合体を、例１５の２
種類の抗体（クローン５Ｅ１０および２Ｇ４）を用いて
処理した場合の阻害百分率について選択を行なった。主
要な選択因子は、接合阻害能および安定性を最大にする
ことを含む。

【０２４７】

【表１】 ａ．接合反応混合物中の酵素に対するハプテンの最終モ
ル比 ｂ．不活性化百分率 ｃ．酵素阻害百分率

【０２４８】Ｃ．抗体スクリーニング 例１５の抗体を例１４のグルコース−６−リン酸接合体
に対する阻害割合について選択した。主要な選択因子
は、酵素接合体の阻害およびＣｓＡ添加による阻害低下
を最大にすることを含む。

【０２４９】

【表２】

【０２５０】

【表３】

【０２５１】

【表４】

【０２５２】Ｄ．抗体交差反応スクリーニング 例１５の抗体を、Ｇ６ＤＰＨ接合体、連結基ＩＩを使用
してシクロスポリン代謝産物に対する交差反応性の選択
を行なった。主要な選択因子は、交差反応性の最小化を
含む。

【０２５３】

【表５】

【０２５４】

【表６】

【０２５５】Ｄ．結論 上記スクリーニングに基づくと、第７のシクロスポリン
Ａアミノ酸残基のアラニン窒素原子において、式ＩＩの
連結基を介してグルコース−６−リン酸デヒドロゲナー
ゼに接合するシクロスポリンが、例示的な酵素接合体と
して選択される。抗体クローン番号２Ｇ４が、例示的な
抗体として選択される。

【０２５６】例１７ ＥＭＩＴ（登録商標）アッセイ性能 ＥＭＩＴアッセイプロトコールの詳細は、米国特許第
３，５１７，８３７号（１９７４）に記述されている。
例１３ＢのＫＬＨ接合体を使用する例１５の方法により
調製された抗体を使用し、これを、この例においては抗
−ＣｓＡモノクローナル抗体と称する。Ｇ６ＤＰＨ接合
体は例６Ｂの化合物を使用して例１４の方法により調製
され、この例においてはＣｓＡ−Ｇ６ＤＰＨ接合体と称
する。該アッセイは、ＣＯＢＡＳ ＭｉＲＡ分析装置で
行なわれた。

【０２５７】１００マイクロリットルの全血試料および
６種の基準を、別々に２００μＬのメタノールと回転攪
拌した。メタノールは、細胞を溶解させ、シクロスポリ
ンを可溶化し、また血液蛋白質を沈殿させた。１分間の
熟成後、混合物を遠心分離にかけた。上澄を前処理希釈
剤で１〜３に希釈した。分析機において、得られた前処
理試料３６μＬを、基質および補体を含むモノクローナ
ル抗−ＣｓＡ−抗体試薬の１５５μＬと共に７５秒間熟
成した。次いで、７５μＬのＣｓＡ−Ｇ６ＰＤＨ接合体
試薬を加えた。１７５秒間熟成後、酵素活性、（薬剤濃
度の機能）をＮＡＤＨ生成を追って、３４０ｎｍにて分
光測定的に１００秒間監視した。

【０２５８】該モノクローナル抗−ＣｓＡ抗体試薬は、
モノクローナル抗−ＣｓＡ抗体、ニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチド、グルコース−６−リン酸、塩化ナト
リウム、バルク剤、界面活性剤および保存剤を含んでい
た。該ＣｓＡ−Ｇ６ＰＤＨ接合体試薬は、酵素接合体、
トリス緩衝剤、バルク剤、安定剤および保存剤を含んで
いた。希釈剤は、トリス緩衝剤、界面活性剤および保存
剤を含んでいた。

【０２５９】各試薬は、標準的ＥＭＩＴ技術に適合する
ように調剤される。該試薬は凍結乾燥されておらず、従
って液体である。バルク剤、界面活性剤および保存剤
は、使い易さおよび試薬の保存のために選択された。Ｃ
ｓＡ−Ｇ６ＤＰＨ接合体試薬のために好ましい安定剤
は、酵素活性部位以外の部位においてグルコース−６−
リン酸デヒドロゲナーゼに結合する抗体である。このよ
うな抗体は、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ
をイムノゲンに用いて例１５に記述した標準的なハイブ
リドーマ技術により調製される。抗−Ｇ６ＰＤＨ抗体
は、ＣｓＡ−Ｇ６ＰＤＨ接合試薬の安定化剤として使用
された。

【０２６０】２０の試料および６種の基準を、このプロ
トコールのもとに２時間以内で前処理し、アッセイし
た。アッセイの標準曲線の範囲は、５００ｎｇ／ｍＬま
で拡がっている。曲線の範囲内の分析的回復は、９５−
１０４％変化した。３種の水準の対照を用いた操作精度
は、５．０〜７．１％ＣＶの範囲であった。同じ対照間
の操作精度は４．９〜７．４％ＣＶであった。シクロス
ポリン代謝産物Ｍ１を用いて交差反応性が観察された
が、他の主な代謝産物Ｍ８、Ｍ１７およびＭ２１につい
ては観察されなかった。５７種類の可能的に同時投与さ
れている薬剤、血球数の変化、ビリルビンまたはトリグ
リセリドの高い水準は、アッセイにおいて妨害しなかっ
た。

【０２６１】

【表７】 ＣＯＢＡＳ ＭＩＲＡ分析機上のアッセイパラメータ アッセイ温度 ３７℃ 波長 ３４０ｎｍ 前処理試料の体積 ３６μＬ 希釈体積（水） ５９μＬ 抗体試薬体積 １５５μＬ 熟成時間（試料＋抗体試薬） ７５ｓｅｃ 酵素試薬体積 ７５μＬ 遅延時間（試料＋抗体および酵素試薬） １７５ｓｅｃ 読取時間 １００ｓｅｃ

【０２６２】３種の水準のシクロスポリンＡを、１０種
の新鮮なシクロスポリンＡ−負の全血試料に入れた。該
試料を２つ一組でアッセイした。

【０２６３】

【表８】

【０２６４】５種の水準のシクロスポリンＡを２種類の
分離した新鮮なシクロスポリン−負の全血試料に入れ
た。アッセイを２つ一組で行なった。

【０２６５】

【表９】

【０２６６】操作内の精度決定を、それぞれ３種の水準
にある２０の別個の試料抽出物について行なった。操作
間の精度決定を、２台の分析機において合計２０回の操
作における各々３種の水準について行なった。個々の試
料抽出物は、各操作においてアッセイされ、また、定量
化は同一の標準曲線から行なった。

【０２６７】

【表１０】

【０２６８】Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏ
ｎ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔ／Ｃｏｌ
ｌｅｇｅ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇ
ｉｓｔｓ（ＡＡＣＣ／ＣＡＰ）のＷｈｏｌｅ Ｂｌｏｏ
ｄ ＣｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎＡ Ｓｕｒｖｅｙの試料、
およびｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ Ｑｕａ
ｌｉｔｙ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ Ｓｃｈｅｍ（ＵＫＱ
ＡＳ）からの試料をＥＭＩＴシクロスポリンＡアッセイ
により測定した。結果は、ＨＰＬＣおよびＣＹＣＬＯ−
Ｔｒａｃ ＳＰ ＲＩＡ（ＩＮＣＳＴＡＲ）のものと良
好に一致した。

【０２６９】

【表１１】

【０２７０】４種の主要なシクロスポリンＡ代謝産物に
よる交差反応性を、２００ｎｇ／ｍＬのシクロスポリン
Ａの存在下で評価した。これらの代謝産物中、Ｍ１（Ａ
Ｍ９）のみが有意な交差反応性を示した。

【０２７１】

【表１２】

【０２７２】下記の５７種の化合物は、アッセイにおい
て交差反応を起こさなかった。それらは、以下の濃度に
おいて２００ｎｇ／ｍＬのシクロスポリンＡの存在下で
試験された。実質的な交差反応性は、シクロスポリンＡ
濃度において、２５％を越える上昇として定義した。

【０２７３】

【表１３】

【０２７４】３０ｍｇ／ｄＬのビリルビンまたは１００
０ｍｇ／ｄＬのトリグリセリドの存在下において、ＥＭ
ＩＴ（登録商標）シクロスポリンＡアッセイでは何らの
有意な妨害を生じないことが見出された。

【０２７５】

【表１４】

【０２７６】１８％〜６６％の範囲のヘマトクリット値
を有する試料は、シクロスポリンＡの濃度７５、２５０
および４００ｎｇ／ｍＬにおける回収率について、何ら
臨床的に有意な変位を示さなかった。

【０２７７】

【表１５】

【０２７８】例１８ オキシ酢酸イミノ延長アチオシクロスポリン 無水メタノール（１ｍｌ）中のシクロスポリンＡ代謝産
物Ｍ−１（化合物（１）、スキームＩ、６ｍｇ、４．９
×１０^−３ｍｍｏｌ、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓ，Ｕ．らの
Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍ．１９８８，３４（１），
３４−３９の方法により、Ｒｏｅｒｉｇ，Ｄ．Ｌ．らの
Ｓ．Ｃｈｅｍａｔｏｇ．１９７５，１１０，３４９の方
法に従ってＢｉｏ−Ｂｅａｄｓを使用して、イヌ尿から
得た）の攪拌溶液に、−７８℃にてオゾンを含む酸素気
流（Ｗｅｌｂａｃｈオゾン発生装置、０．５ｍＬ／分、
制御圧６ｐｓｉ、オゾン発生器圧４ｐｓｉ、オゾン発生
器を８０ボルトで運転）を１０分間（溶液が青色に変わ
るまで）通し、オゾン含有酸素気流を停止した。該溶液
にアルゴンを１０−１５分間通気した（溶液温度が−２
０℃となるまで）。ジメチルスルフィド（０．２ｍｌ）
を加えた。該混合物を、室温まで温め、メタノールのほ
とんどが蒸発するまでアチオシクロスポリンカルボキシ
アルデヒド生成物（化合物（２）、スキームＩ）は単
離、精製、分析されなかった。オゾン分解生成物を含む
反応混合物を、無水メタノール（１ｍｌ）中に再溶解
し、アミノオキシ酢酸（ＨＣｌ塩、１２ｍｇ、０．１ｍ
ｍｏｌ）を加えた。該混合物を、室温にて２時間攪拌し
た。ジクロロメタン（３０ｍｌ）、食塩水／水混合物
（１：１、２０ｍｌ）および２滴のＨＣｌ（１Ｎ）を加
えた。ジクロロメタン層を分離し、乾燥させ（ＭｇＳＯ
_４）、蒸発させてオキシ酢酸イミノ延長アチオシクロス
ポリン（化合物（３）、スキームＩ、６ｍｇ、４．７×
１０^−３ｍｍｏｌ、９６％）。Ｍ．Ｓ．，ｍ／ｅ１２７
９．９（Ｍ＋Ｈ）^＋。該生成物を、精製なしで使用した
が、更に、調製用薄層クロマトグラフィ（シリカゲル、
エチルアセテート／ＭｅＯＨ／ＡｃＯＨ，９０：１０：
０．１）によって精製することもできる。

【０２７９】例１９ オキシ酢酸イミノ延長アチオシクロスポリンキーホール
リンペットヘモシアニン接合体 乾燥ＤＭＦ（０．２ｍｌ）中の例１８の生成物（化合物
（３）、スキームＩ、５ｍｇ、３．９×１０^−３ｍｍｏ
ｌ）およびＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（スル
ホ−ＮＨＳ、１１ｍｇ、１．２×３．９×１０^−３ｍｍ
ｏｌ）の攪拌溶液に、１−エチル−３−（３−ジメチル
アミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ、１．１ｍ
ｇ、１．６×３．９×１０^−３ｍｍｏｌ）を添加した。
該混合物を室温にてアルゴン雰囲気下に５時間攪拌し
た。該反応の監視に薄層クロマトグラフィ（シリカゲ
ル、エチルアセテート／ＭｅＯＨ／ＡｃＯＨ，８５：１
５：０．４）を使用した。この技術により、すべての出
発物質が消費された。該活性化エステル生成物は、単
離、精製、分析を行なわなかった。リン酸緩衝液（ｐＨ
≒８．１、１００ｍＭ、２ｍｌ）およびＤＭＦ（０．２
ｍｌ）中のキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬ
Ｈ、６４％純度、１７ｍｇ、２×１０^−５ｍｍｏｌ）の
攪拌溶液に、４℃において活性化エステル生成物を、１
時間で添加した。該混合物を４℃にて一夜攪拌した。該
混合物を、Ｈ_２Ｏ／ＤＭＦ（８０：２０、５００ｍｌ）
および水に対して透析した。透析生成物を凍結乾燥し
て、オキシ酢酸イミノ延長アチオシクロスポリンのキー
ホールリンペットヘモシアニン接合体（式（４）、スキ
ームＩ、１５ｍｇ）を得た。この接合体は、Ｍ１−ＫＬ
Ｈ接合体とも称される。

【０２８０】例２０ オキシ酢酸イミノ延長アチオシクロスポリンのグルコー
ス−６−リン酸デヒドロゲナーゼ接合体 例１４の方法および例１８のアチオシクロスポリンハプ
テンを使用して、オキシ酢酸イミノ延長連結基を介して
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼに接合するア
チオシクロスポリン（化合物（４）、スキームＩ、ＫＬ
Ｈに代えて接合はＧ６ＰＤＨに対して）を調製した。こ
の接合体は、Ｍ１−Ｇ６ＰＤＨ接合体とも称される。

【０２８１】例２１ 抗Ｍ１モノクローナル抗体の調製 Ａ．一般的方法 例１５の方法、および例１９のオキシ酢酸イミノ延長ア
チオシクロスポリンのキーホールリンペットヘモシアニ
ン接合体生成物を使用して、モノクローナル抗体を調製
した。例２０のオキシ酢酸イミノ延長アチオシクロスポ
リンのグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ接合体
生成物をＥＬＩＳＡスクリーニングに使用した。

【０２８２】Ｂ．抗−Ｍ１抗体の選択 Ｂａｌｂ／ｃマウスを免役した。３回の免疫（１００μ
ｇ／注射／マウス、月毎）後、マウスから尾部静脈にて
採血し、血清抗体力価を測定した。Ｆｏｒｗａｒｄ Ｅ
ＬＩＳＡプロトコールにより、血清の一連の希釈物をＣ
ｓＡ−Ｇ６ＰＤＨおよびＭ１−Ｇ６ＰＤＨの両者に対し
て選択した。初期の力価は、ＣｓＡ−Ｇ６ＰＤＨに比べ
てＭ１−Ｇ６ＰＤＨに対して約３倍高いものであった。
力価は、Ｍ１−Ｇ６ＰＤＨに対して選択した場合、１：
３０，０００であったが、一方ＣｓＡ−Ｇ６ＰＤＨに対
しては、わずか１：１０，０００であった。

【０２８３】４回の融合を行なった。融合の際、脾臓
は、免疫応答の上昇を示してわずかに拡大した。脾臓の
大きさは、置換により測定して０．２５〜０．５ｍＬの
範囲であった。初期の選択は、逆ＥＬＩＳＡにより、ウ
サギα−マウスＩｇＧ＋ＩｇＡ＋ＩｇＭ鎖（Ｚｙｍｅ
ｄ、４５８、Ｃａｒｌｔｏｎ Ｃｏｕｒｔ、Ｓ．Ｓａｎ
Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ ９４０８０、ＵＳＡ、＃
６１−６４００ＳＹ）で被覆した複写プレート上で行な
われた。初期選択の応答は、融合あたり３〜３６ＥＬＩ
ＳＡ−正ウェルの範囲の変化があった。第２の選択は、
ＥＭＩＴにより行なった。抗体類を、ＣｓＡ−Ｇ６ＰＤ
Ｈを阻害する能力について試験した。抗体は、抗−Ｃｓ
Ａ−抗体の存在下で、ＣｓＡの存在において阻害の逆転
を示すが、Ｍ１の存在において阻害の逆転を示さず、か
つＭ１−Ｇ６ＰＤＨを阻害するが、ＣｓＡには実質的に
結合せず、またＣｓＡ−Ｇ６ＰＤＨを阻害しないものと
して選択された。一つの抗体（クローン２Ｂ１０）が、
抗−Ｍ１モノクローナル抗体として選択された。

【０２８４】Ｃ．抗−Ｍ１抗体の調製および精製 抗−Ｍ１モノクローナル抗体（クローン２Ｂ１０）を産
生可能な細胞をスピナーフラスコ中で、３７℃および７
％ＣＯ_２において生育させた。培養物を、新鮮培地の供
給および培養の追加またはより大型の容器に分割するこ
とにより維持した。Ｔｒｙｐａｎ Ｂｌｕｅを用いた細
胞の計数および生存性測定は、細胞生育を監視するため
に常法どおり行なった。使用媒質の５Ｘ〜１０Ｘ濃縮物
のＰａｒａｇｏｎゲル電気泳動を、抗体産生を監視する
ために常法どおり行なった。１０日後、培養物をＢｅｃ
ｋｍａｎ ＲＣ２Ｂ遠心分離機により５０００ｒｐｍで
１５分間、４℃にて遠心分離し、抗体から細胞を除去し
た。

【０２８５】１５Ｌの培養液中の抗体を５倍に濃縮し、
１０ｍＭ ＭＥＳ緩衝溶液にて透析した。該抗体を、Ｂ
ａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢｘ（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ Ｉｎ
ｃ．＃７２６９−００）上のカラムクロマトグラフィに
より精製した。高さ５０ｃｍ、直径２．６ｃｍのカラム
に、約１００グラムのＡＢｘを１０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液
で平衡化して充填した。抗体を５ｍＬ／分にて負荷し、
次いで、１０ｍＭ ＭＥＳｐＨ５．６から２００ｍＭ
ＮａＣｌ／１００ｍＭトリスｐＨ７．４までの１Ｌの勾
配により溶出した。試料は、カラムから１０ｍＬの分画
で収集され、蛋白質濃度について２８０ｎｍにおいて吸
光度の監視が行なわれた。抗体を含む分画を集めた。

【０２８６】例２２ 抗−Ｍ１抗体を用いたＥＭＩＴアッセイの性能 例１７のアッセイを、例Ａに特定した成分に加えて例２
１の抗−Ｍ１抗体を含むモノクローナル抗−ＣｓＡ抗体
試薬を使用して行なった。４種の主要なシクロスポリン
Ａ代謝産物の交差反応性を、２００ｎｇ／ｍＬのシクロ
スポリンＡの存在下で評価した。代謝産物Ｍ１、Ｍ８、
Ｍ１７またはＭ２１について、臨床的に有意な交差反応
性（臨床的に有意な交差反応性は、ＣｓＡ定量値を≧２
０％で増大させる交差反応性である）は観察されなかっ
た。アッセイ性能の他の局面は、実質的に影響を受けな
かった。

【０２８７】

【表１６】

【０２８８】前述の本発明は、例示のためにある程度詳
細に記述されているが、ある種の変更や修飾が、添付す
る請求の範囲の内で行なわれ得るであろうことは自明で
あろう。特には、本発明の化合物の連結基の構造の重要
でない変更が行なわれ得る。本発明の化合物または抗体
の性質を顕著に変えるものではないこのような修飾は、
自明のものと考えられる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/535 Ｇ０１Ｎ 33/535 // Ａ６１Ｋ 38/00 Ａ６１Ｋ 39/385 39/385 39/395 Ｎ 39/395 Ｕ 37/02 (72)発明者 スベットラナ アレクサンダー アメリカ合衆国カリフォルニア州サニイ ベイル，ホレンベック アベニュー 913 (72)発明者 マエ ダブリュ．フ アメリカ合衆国カリフォルニア州ロス アルトス ヒルズ，セント フランシス 26705 (72)発明者 エドウィン エフ．ウルマン アメリカ合衆国カリフォルニア州アサー トン，セルビィ レーン 135 (56)参考文献 特表 昭62−500383（ＪＰ，Ａ) 国際公開90／006763（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07K 1/06 C07K 7/64 C07K 16/00 C12Q 1/32 G01N 33/53 G01N 33/535 A61K 38/00 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims (25)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 シクロスポリンを含むと考えられる試料
   中のシクロスポリン量の測定方法であって、 ａ）水性媒体中において １）シクロスポリンを含むと考えられる前記試料、 ２）シクロスポリンのアラニン窒素原子の一つにおいて
   標識に接合されたシクロスポリン（シクロスポリン標識
   接合体）、および ３）前記シクロスポリン標識接合体に結合可能な抗体、
   を混合し、ｂ）前記抗体と前記シクロスポリン標識接合体との間に
   形成される検出可能な複合体の存在を測定し、そして、 ｃ）前記検出可能な複合体を前記試料中のシクロスポリ
   ンの存在と相互に関連させる ことからなる方法。
2. 【請求項２】 前記シクロスポリンがシクロスポリンの
   アラニン残基７または８の窒素原子において前記標識に
   接合された、請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 請求項１に記載の、シクロスポリンを含
   むと考えられる試料中のシクロスポリン量の測定方法で
   あって、 ａ） 水性媒体中において １）シクロスポリンを含むと考えられる前記試料、 ２）シクロスポリンのアラニン窒素原子の一つにおいて
   グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼに接合された
   シクロスポリン（シクロスポリンＧ６ＰＤＨ接合体）、 ３）前記シクロスポリンＧ６ＰＤＨ接合体に結合可能な
   抗体、および ４）グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの基質、 を混合し、 ｂ） 該グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性
   を測定することにより前記抗体と前記シクロスポリンＧ
   ６ＰＤＨ接合体との間に形成される検出可能な複合体の
   存在を測定し、そして ｃ） 前記グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活
   性を前記試料中のシクロスポリンの存在と相互に関連さ
   せることからなる方法。
4. 【請求項４】 前記シクロスポリンがシクロスポリンの
   アラニン残基７または８の窒素原子においてグルコース
   −６−リン酸デヒドロゲナーゼに接合された請求項３に
   記載の方法。
5. 【請求項５】 シクロスポリンの環状骨格のアラニン窒
   素原子において有機基に接合されたシクロスポリンから
   なる化合物であって、前記シクロスポリンは以下の群か
   ら選ばれる連結基を通して前記有機基に接合された化合
   物： （Ｉ）式 ―（ＣＨ₂）_nＯ― のヒドロキシアルカン
   鎖、ここで、ｎは約１−６の整数であり、そしてシクロ
   スポリンのアラニン窒素原子はヒドロキシアルカンの炭
   素原子に接合され、前記有機基は酸素原子に接合され
   る； （ＩＩ）式 のカルボキシベンジル基、ここで、シクロスポリンのア
   ラニン窒素原子はベンジル炭素原子に接合され、前記有
   機基はカルボキシ基の酸素原子に接合される； および （ＩＩＩ）式 の基。
6. 【請求項６】 ヒドロキシアルカン連結基が、酸素原子
   においてアルキレン鎖により一緒に連結された１〜３の
   カルボキシアミド基により延長された、請求項５に記載
   の化合物。
7. 【請求項７】 カルボキシベンジル連結基が、カルボキ
   シ基の酸素原子においてアルキレン鎖により一緒に連結
   された１〜３のカルボキシアミド基により延長された、
   請求項５に記載の化合物。
8. 【請求項８】 前記シクロスポリンがシクロスポリンの
   アラニン残基７または８の窒素原子において前記有機基
   に接合された、請求項５、６または７のいずれか一つに
   記載の化合物。
9. 【請求項９】 前記有機基は標識、リガンド、ハプテ
   ン、ビオチンまたはポリ（アミノ酸）を含む、請求項
   ５，６，７または８のいずれか一つに記載の化合物。
10. 【請求項１０】 ポリ（アミノ酸）が免疫原性担体であ
    る、請求項９に記載の化合物。
11. 【請求項１１】 免疫原性担体がキーホールリムペット
    （ｋｅｙｈｏｌｅｌｉｍｐｅｔ）ヘモシアニン、ウシ血
    清アルブミンまたはウシガンマグロブリンである、請求
    項１０に記載の化合物。
12. 【請求項１２】 ポリ（アミノ酸）が酵素である、請求
    項９に記載の化合物。
13. 【請求項１３】 酵素がグルコース−６−リン酸デヒド
    ロゲナーゼである、請求項１２に記載の化合物。
14. 【請求項１４】 請求項１０または１１に記載の化合物
    に応答して調製された抗体。
15. 【請求項１５】 抗体がシクロスポリンを認識すること
    ができる、請求項１４に記載の抗体。
16. 【請求項１６】 前記シクロスポリンがシクロスポリン
    Ａ代謝産物Ｍ１である、請求項１４に記載の抗体。
17. 【請求項１７】 標識に接合された請求項１４に記載の
    抗体からなる化合物。
18. 【請求項１８】 式 の化合物： （式中、基β₁およびβ₂の一つは水素であり、他方は以
    下の基から選ばれる； ここで、β₃はポリ（アミノ酸）である）。
19. 【請求項１９】 ポリ（アミノ酸）がグルコース−６―
    リン酸デヒドロゲナーゼである、請求項１８に記載の化
    合物。
20. 【請求項２０】 ポリ（アミノ酸）が免疫原性担体であ
    る、請求項１９に記載の化合物。
21. 【請求項２１】 請求項１８に記載の化合物に応答して
    調製された抗体。
22. 【請求項２２】 請求項１８に記載の化合物の製造方法
    であって、 ａ）シクロスポリンを、第二アミドの脱プロトン化に充
    分な塩基性を有する塩基と反応させ、 ｂ）脱プロトン化されたａ）の化合物をエポキシドと反
    応させ、そして ｃ）前記シクロスポリンから保護基を除去することから
    なり； ここで、前記有機基はヒドロキシ基を末端とする２個の
    炭素の鎖を含む、製造方法。
23. 【請求項２３】 請求項１８に記載の化合物の製造方法
    であって、 ａ）シクロスポリンを、第二アミドの脱プロトン化に充
    分な塩基性を有する塩基と反応させ、 ｂ）脱プロトン化されたａ）の化合物をα−ハロメチル
    安息香酸、低級アルキルエステルと反応させ、そして ｃ）前記シクロスポリンから保護基を除去することから
    なり； ここで、前記有機基はカルボキシベンジル基を含む、製
    造方法。
24. 【請求項２４】 請求項１８に記載の化合物の製造方法
    であって、 ａ）前記有機基がカルボキシル基に結合する約２〜１４
    個の原子を水素以外に有する鎖を含む場合の請求項１０
    に記載の化合物の活性エステルを調製し、そして ｂ）前記活性エステルを酵素に添加することからなり、 ここで、前記有機基は酵素標識である、製造方法。
25. 【請求項２５】 グルコース−６−リン酸デヒドロゲナ
    ーゼ−シクロスポリン接合体（Ｇ６ＰＤＨ接合体）およ
    びシクロスポリンに対する抗体の免疫複合体から構成さ
    れる、請求項１に記載の方法で用いる組成物。