JP2001506985A - ５−ヒドロキシトリプトフォール（５−ｈｔｏｌ）誘導体、抗体、イムノアッセイおよび最近のアルコール消費の検出 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 5-HTOL化合物に対して特異的な抗体。5-HTOLの5-ヒドロキシ基とD-グルコピラノシドウロン酸との間にβ-グルクロナイドの構造を包含することを特徴とする5-ヒドロキシトリプトフォール（5-HTOL）とのグルクロナイド。5-HTOL化合物に特異的な抗体の使用により5-ヒドロキシトリプトフォール（5-HTOL）化合物を測定するイムノアッセイおよびそのイムノアッセイを使用する診断方法。

Description

【発明の詳細な説明】 5-ヒドロキシトリプトフォール（5-HTOL）誘導体、抗体、イムノアッセイお よび最近のアルコール消費の検出 技術分野 本発明は、5-ヒドロキシトリプトフォール［5-HTOL＝2-(5-ヒドロキシ-3-イン ドリル)エチルアルコール］の体液レベルを反映する成分のイムノアッセイに使 用できる新規抗体に関する。遊離の5-HTOLおよびそのグルクロナイドおよびスル フェート抱合体（conjugates）は、ヒトの最近のアルコール摂取に関する知られ たマーカーである。本発明の他の観点は表題に示されたとおりである。 背景技術 5-ヒドロキシトリプトフォール（5-HTOL）および5-ヒドロキシインドール-3- 酢酸（5-HIAA）は、共通の中間体5-ヒドロキシインドール-3-アセトアルデヒド （5-HIAL）を経由するセロトニン（5-ヒドロキシトリプタミン、5-HT）のヒト代 謝産物である。5-HTOLは尿中に排泄され、そこではこのものは主にグルクロン酸 と抱合して存在し(T-5-G(またはGHTOL)、75-95%)、より低い度合いで遊離形態で またはスルフェート抱合体で存在する。5-HIAAもまた尿中に排泄される。アルコ ール消費後には、種々の体液中における5-HTOLレベルが、通常の尿中範囲である 40-650nmo1/Lの値から上昇するであろう。同時に5-HTOL/5-HIAAの比率が、＜0.0 1（またはピコモル／ナノモルとして表す場合には＜10）である正常値から高ま るであろう。5-HTOLレベルおよび5-HTOL/5-HIAA比の両方の増大は、アルコール が体内から消失した後も数時間持続する。これらの発見が、5-HTOLおよび5-HTOL /5- HIAA比率をアルコール依存症の治療および法医学、例えば死後の身体検査におけ る最近のアルコール消費のマーカーとなしている。比率でなく、5-HTOLレベルは セロトニンに富んだ食品の摂取後にも増大するので、また、比率でなく、正常お よび異常な5-HTOLレベルの範囲がオーバーラップしているので、比率の測定が優 先されてきた。その代わりに、尿中5-HTOLとクレアチニンのような他の尿中排泄 産物との間の比率も使用されている。 用語"5-HTOL"には、別に記載がなければ、遊離の5-HTOL、そのグルクロナイド （トリプトフォール-5-グルクロナイド、T-5-G）およびそのスルフェートのよう な5-HTOL化合物が包含される。 アルコール消費後の5-HTOL化合物のレベル増大は、これまでに尿、血漿、脳脊 髄液（CSF）中において検出されている。5-HTOL化合物を血清、涙液、汗、唾液 等中においても検出できる可能性は最も高い。5-HTOL化合物の通常のレベルおよ び遊離の5-HTOLとその抱合体形態との間のバランスは、種々の種類のサンプル間 で異なる可能性がある。 5-HIAAと比較して、5-HTOLを測定するのは複雑である。このものは5-HIAAより も低濃度で存在し、そして抱合体形態が過剰にあり、グルクロナイドが強力に優 勢である。5-HTOLの現在使用されている測定方法は、質量分光測定と組み合わせ たガスクロマトグラフィー（GC/MS）であって、これは高価な器具を必要とする 方法である。高圧液体クロマトグラフィー（HPLC）方法が開発されたが、"偽ピ ーク"の欠点、すなわち5-HTOLと他の化合物のR_fがオーバーラップする欠点があ る。両方法は、グルクロナイド（T-5-G）がアッセイ前に遊離の5-HTOLに酵素的 に変換されていることを必要とする。従って、種々の体液中における5-HTOL化合 物の安価で簡単で信頼できる測定方法が必要とされている。 本発明の分野内における以前に刊行された研究論文に関しては、記述の部の最 後にある別掲リストを参照されたい。 本発明の目的 本発明の第１の目的は、内因性の5-HTOL抱合体を予め加水分解することなく、 遊離の5-HTOLをその抱合体と共に含有するサンプル中の5-HTOL化合物を測定する ためのイムノアッセイ法を提供することである。 第２の目的は、5-HTOL化合物のイムノアッセイを可能にする抗体を提供するこ とである。 第３の目的は、免疫原として、または種々のアッセイ例えば5-HTOL化合物の競 合的イムノアッセイにおける相当する天然の5-HTOL化合物の構造を模倣する5-HT OL類似体として使用できるT-5-Gの誘導体を提供することである。 本発明を支持する発見 本発明は、5-HTOLおよびD-グルコピラノシドウロン酸のβ-グルクロナイドの 免疫原性形態（すなわち3-(2-ヒドロキシエチル)インドール-5-O-β-D-グルコピ ラノシドウロン酸の免疫原性形態）を免疫原として使用して、適切な動物におけ る体液性免疫応答を高めることにより、5-HTOL化合物に結合する抗体を取得でき るという本発明者らの発見に基づくものである。 本発明による抗体調製 従って、第１の観点は、5-HTOL化合物に対して特異的な抗体にある。”特異的 な”という用語は、その抗体がイムノアッセイ条件中にヒトサンプル中 の他の内因性物質、例えばセロトニン(5-HT)、5-HIAA、または他のインドールま たはグルクロナイドのような他の構造的に関連する物質に対し何ら妨害性の結合 活性を伴うことなく、5-HTOL化合物に優先的に結合することを意味する。現在の 好ましい様式では、本発明の抗体調製物は、他の内因性5-HTOL化合物に比較して 優先的にT-5-Gに結合する。この抗体調製物は体液中に存在する可能性のある他 のインドールおよびグルクロナイドのようなありうる妨害物質に対して許容でき る程度に低い結合活性しか有しない。実験の部を参照されたい。 遊離の5-HTOL、T-5-Gおよびスルフェート化5-HTOLのレベルはすべて、最近の アルコール摂取の結果として高められるので、有用な抗体はこれら5-HTOL化合物 の１種、２種またはすべてと反応しうる。 抗体という用語は、前記した特異性を有する種々の抗体調製物、例えば完全無 欠な抗体および種々の活性フラグメント(抗原／ハプテン結合性フラグメント)、 例えばFab，Fab'，Fv，F(ab')₂等を包含する。これはまた、誘導体化された抗体 、例えばビオチン、ハプテン、酵素、酵素基質、コファクター、発蛍光団、化学 ルミネサー、発色団、放射性同位体、金属、粒子等、および担体分子、例えば不 溶性および可溶性ポリマーのような標識が共有結合した抗体をも包含する。 本発明の抗体はポリクローナルまたはモノクローナル調製物であることができ る。このものは一定数のモノクローナルの混合物を含有できる。これは、新規T- 5-G誘導体(抱合体)を、例えばポリクローナル抗体を生成させるための免疫原と して使用するか、または免疫応答あるいは細胞系（例えばハイブリドーマ）(こ れは本発明の抗体を分泌するか、または相当するコード配列を伴ってそれぞれ個 々の抗体成分を単離できる種々の抗体ライブラリーを分泌する) をスクリーニングするための抗原として使用すること以外は、一般に知られた方 法により得ることができる。従って、意図される技術はまた、ファージディスプ レー技術による選択を介して得られる抗体をも包含する。ひとたび得られると、 本発明の抗体調製物は組換え技術により改変できる。 本発明の抗体調製物を得るための優先権主張日での最善の様式は、実験セクシ ョンに示されており、そして免疫原として特許実施例３（反応スキーム２）に明 示されるキーホールリンペットヘモシアニン（keyhole limpethemocyanine）(KL H)とT-5-Gとの間のコンジュゲートを使用し、そして実験セクションに記載され るように適切なハイブリドーマクローンを選択する。こうして、最善の様式をし た本発明の抗体は、天然のサンプル中に存在する種々の5-HTOL化合物の中からT- 5-Gに優先的に結合する。 本発明の5-HTOL類似体 T-5-G（すなわち、3-(2-ヒドロキシエチル)インドール-5-O-β-D-グルコピラ ノシドウロン酸）およびその誘導体は、それらが以前に全く単離されていないと いう意味で新規である。従って、本発明のこの観点の最も広い概念は、3-(2-ヒ ドロキシエチル)インドール-5-O-β-D-グルコピラノシドウロン酸の構造を示す ことを特徴とする5-HTOL化合物であり、これは場合により炭水化物部分中の一つ またはそれ以上のOHで、すなわちアルコール性ヒドロキシ基（２、３および４位 ）で、またはカルボキシ基（６位）で、または3-ヒドロキシエチルのヒドロキシ ルで、またはインドール窒素で誘導体化されていることができる。 アルコール性ヒドロキシ基での誘導体化は、グルクロナイド誘導体に関して通 常行われるようにして、例えば遊離の5-HTOLとのグルクロナイド形成前 または後のいずれかでの２、３および／または４位での選択的アルキル化または アシル化によって達成できる。グルクロナイドまたは遊離のグルクロン酸のカル ボキシ基での誘導体化によりアミドおよびエステルを生成することができ、その カルボキシ基はさらに誘導体化される。実験の部を参照されたい。 T-5-Gは、好ましくはポリマー性質を有する共有結合された担体分子、例えば ヒトまたはウシ血清アルブミン、KLH等のような免疫原性タンパク質担体、また はクロマトグラフィーおよびイムノアッセイにおいて分離媒体として使用される 種類の不溶性または不溶化可能な担体ポリマー（支持体）(例えば、ポリスチレ ンのような合成ポリマーから作られた支持体、またはアガロース、デキストラン 、セルロース、スターチ等のようなポリサッカライドから作られた支持体)を含 有するように、カルボキシ基で誘導体化されることが好ましい。 T-5-G構造物の誘導体化はまた、好ましくはカルボキシ基を介して共有結合さ れた分析的に検出可能な基を導入するために行ってもよい。分析的に検出可能な 基は、前記本発明の抗体について議論したと同じ種類のものであることができる 。 優先権主張日における本発明のT-5-G化合物の好ましい合成法は、実験の部か ら明白である。 本発明のイムノアッセイ観点 本発明のこの観点は、5-HTOL化合物を含有するサンプルを、本発明の抗体と、 5-HTOL化合物および本発明の抗体の両方を含む免疫複合体の形成を可能にする条 件下に接触させることを包含する。従って、形成された複合体の量がそのサンプ ル中の5-HTOL化合物の量の尺度であるように条件を選択する。 複合体の測定は当業上良く知られた方法に従い、例えば複合体そのままとし て、あるいは添加された本発明抗体の複合体形成しなかったものの量の減少とし て実施される。 使用しうるイムノアッセイの一般的な種類の一つは、サンプル中に存在する5- HTOL化合物の量に関連する量にて免疫複合体を形成できる標識された免疫反応体 を利用するものである。原則として、標識は、5-HTOLグルクロナイド類似体およ び抗体に関して前記したと同じ一般的種類のものであることができる。 標識を用いるイムノアッセイは、しばしばヘテロジニアスアッセイとホモジニ アスアッセイとに分けられる。ホモジニアス方法は、複合体と結合した標識反応 体を複合体形成しなかった標識反応体から分離する工程を用いない。これは、複 合体形成の結果としてそのシグナルを変化させる標識を使用することを不可避な ものとなしている。へテロジニアスアッセイ方法においては、免疫複合体中に結 合された標識反応体が、複合体中に結合されなかった標識反応体から物理的に分 離される。従って、ヘテロジニアス方法は、標識が複合体形成ゆえにそのシグナ ルを変化させることを必要とせず、このことは放射性同位体標識も使用できるこ とを意味する。 イムノアッセイを分けるもう一つのやり方は、競合的および非競合的（サンド イッチ）方法である。前者の場合、本発明抗体と結合性でかつサンプル中に存在 する5-HTOL化合物を、本発明抗体の限定された量に対してT-5-G類似体と競合さ せ(抗体と反応性の5-HTOL化合物プラスT-5-G類似体)、その後T-5-G類似体と本発 明抗体との間の複合体の量を測定し、サンプル中の5-HTOL化合物の量と関連させ る。この場合のT-5-G類似体は、好ましくは前記した標識されたかまたは担体と 結合したT-5-G誘導体である。T-5-G類似体が標識された反応体である場合、使用 される本発明の抗-5-HTOL抗体 は不溶化された形態（例えば支持体に連結）または可溶性形態であることができ る。代替方法は、不溶性T-5-G類似体がサンプル中の5-HTOL化合物と、限定され た量の可溶性の本発明の抗-5-HTOL抗体に関して競合するものである。 優先権主張日において好ましいイムノアッセイ方法には、前記したヘテロジニ アス競合イムノアッセイが包含される。 標識反応体を何ら使用しないアッセイ方法の中では、抗原／ハプテンと抗体と の間の結合が表面で起こるバイオセンサー技術が挙げられる。 サンプルは、血清、血漿、尿、CSFまたは１種またはそれ以上の5-HTOL化合物 を含有する可能性のある任意の他のサンプルであることができる。 イムノアッセイに通常である温度およびpH条件、すなわち0-40℃好ましくは15 -35℃、およびpH4-9好ましくはpH5-8を適用できる。 本発明によるイムノアッセイの結果は、これまで5-HTOL化合物についてなされ てきたのと同じやり方で、個体の最近のアルコール消費を測定するための診断方 法に使用できる(導入部を参照されたい)。このことは、本発明の診断方法の好ま しい方法においては、5-HTOL化合物の見出されたレベルを、何か他の化合物、例 えば5-HIAAまたはクレアチニンのレベルと関連づけることができることを意味す る。イムノアッセイに関しては、形成された免疫複合体の量またはサンプル中の 5-HTOL化合物の量の任意の他の尺度は、もちろん5-HTOL化合物そのままのレベル と同様に、最近のアルコール消費と直接関連づけることができる。この診断方法 はヒト個体に特に良く適合される。 実験の部 合成実施例１ ：3-(2-ヒドロキシエチル)インドール-5-イル-O-β-D-グルコピラノシ ドウロン酸（I）の合成および精製（スキーム1） 2-(5-ヒドロキシ-3-インドリル)エチルアルコール(151mg)、MqCl₂(50mg)、ウ リジン5'-ジホスホグルクロン酸トリアンモニウム塩(490mg)、ウリジン5'-ジホ スホグルクロニルトランスフェラーゼ（182mg)(ウシ肝臓からのIII型、Sigma)お よび0.1M pH7.4トリス緩衝液40mlを、200mlのE-フラスコに加えた。このフラス コをパラフィルム（parafilm）で密封し、シェーカーインキュベーター中で37℃ および150rpmにてインキュベートした。反応を追跡するために、種々の時点でイ ンキュベート物から小サンプルを抽出し、冷却し、遠心分離し、濾過し、酸性化 した後にFPLCシステム上で分析用Pep RPCにより分析した。3-(2-ヒドロキシエチ ル)インドール-5-イル-O-β-D-グルコピラノシドウロン酸（I）の濃度は、20時 間後にプラトーレベルに到達し、そのレベルで７時間以上とどまった。 インキュベーションを氷上で15分間停止させ、続いてJ2-21 M/E Beckman遠心 機中でJA-10ローターを用いて10000rpmで５℃にて30分間遠心した。次に上清を 詰綿で濾過し、HClの添加によりpH３以下に酸性化した。最終濃度2.5%となるま でメタノールを加えた。この混合物のうち1/3を水／メタノール系中でPep RPC H R 16/10カラム上で一度に精製した。このカラムは初めに水中で広範に平衡化し た。サンプルは2.5%メタノール中にて適用し、2.5から5.5%メタノールのグラジ エントを85分間操作し、次に60分間イソクラチック操作し、そののち5.5から50% メタノールのグラジエントを100分間操作した。流速は終始毎分3.5mlであっ た。3-(2-ヒドロキシエチル)インドール-5-イル-O-β-D-グルコピラノシドウロ ン酸（I）は、5.5%メタノールで溶離された。フラクションをプールし、調製物 の純度をTLC（n-ブタノール：酢酸：酢酸エチル：水，1:1:1:1）により監視した 。精製後の収量は65mgであった。 グルコピラノシドウロン酸中のHのJ_1,2は7.8cpsであり、このことはβ型を示し た。¹³CNMR(D₂O)27，61，71，72，74，75，102，106，111，112，113，125，127 ，133，150，172。グルコピラノシドウロン酸の炭素ピークパターンはβ型と一 致する。実施例２ ：N-(2-ピリジルジチオエチル)-(2-ヒドロキシエチル)インドール-5-イ ル-O-β-D-グルコピラノシドウロン酸（II）の合成（スキーム2） 3-(2-ヒドロキシエチル)インドール-5-イル-O-β-D-グルコピラノシドウロン 酸（I）(52mg，0.153ミリモル)を、５mlの反応バイアル中の１mlのDMF（モレキ ュラーシーブで乾燥）中に溶解した。次に0-(N-スクシンイミジル)-N,N,N',N'- テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（TSTU）(73mg，0.243ミリモル )およびジイソプロピルエチルアミン(84μl，0.456ミリモル）を加えた。反応を 室温で35分間行った。 システアミン-2-ピリジルジスルフィッド塩酸塩（72mg，0.324ミリモル）を、 もう一つの反応バイアル中に加え、続いてDMF（0.5ml）およびジイソプロピルエ チルアミン（56μl，0.324ミリモル）を加えた。この溶液中にヒドロキシスクシ ンイミジル活性化した酸（I）を添加した。反応を１時間行い、次に低圧真空中 で蒸発させると、油状物が得られた。TLC（n-ブタ ノール：酢酸エチル：酢酸：水，1:1:1:1）では、殆どすべての（I）が反応した ことが示された。この油状物を27%メタノール３ml中に溶解させ、３つに分け、0 .2%酢酸を含有する25-60%メタノールのグラジエントを用い、Pep RPCカラムHR 1 6/10上で毎分3.5mlの流速で分別した。所望の産物（II）は、0.2%酢酸を含有す る43%メタノールのグラジエントで溶離された。（II）を含有するフラクション をプールし、真空中蒸発により濃縮し、最後に凍結乾燥すると、26mgの（II）が 白色粉末として得られた。 実施例３：KLHコンジュゲート（III）の合成（スキーム2） キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）(73.5mg)を、pH9.5に保持された0. 1Mボレート緩衝液6.5ml中に溶解させた。未溶解物質を濾過して除去し、溶液の タンパク質含量をアミノ酸分析により分析すると、タンパク質が37mg/mlであっ た。氷冷したこのKLHの溶液に、3-(2-ヒドロキシエチル)インドール-5-イル-O- β-D-グルコピラノシドウロン酸の混合無水物（0.025ミリモル）の溶液0.8mlを 加えた。後者の化合物は、3-(2-ヒドロキシエチル)インドール-5-イル-O-β-D- グルコピラノシドウロン酸（I）(10.6mg，0.0312ミリモル)を５mlの反応バイア ル中の１mlのテトラヒドロフラン中に溶解させることにより調製した。窒素ガス をバイアル中に導入し、後者を氷浴中に置いた。15分後にイソブチルクロロホル ミエート(4.1μl，0.0312ミリモル）およびトリエチルアミン（4.3μl， 0.0312）を加え、酸（I）とイソブチルクロロホルミエートとの反応を０℃で30 分に完結した。KLHと無水物との間の反応を０℃で20分間行い、次に冷蔵庫中に 一晩置いた。テトラヒドロフランを真空蒸発器中で除去し、反応溶液（4.8ml） をpH7.5の２mMホスフェート緩衝液を用いて平衡化した２個のセファデックスG25 M PD-10カラム上で分離した。コンジュゲートを3.2ml緩衝液で溶離した。合計 容量は6.4mlであった。タンパク質含量をアミノ酸分折で測定すると、3.04mg/ml であった。置換度をUV分光法により測定すると、KLH当たり270の化合物であった (Mw 3 000 000について計算)。実施例４ ：HSAコンジュゲート（IV）の合成（スキーム3） ヒト血清アルブミン（HSA）(28.5mg，0.425μモル)をpH8.5に保持した0.2Mホ スフェート緩衝液1.73ml中に溶解させた。この溶液中に、0.178mlのエタノール 中のN-スクシンイミジル3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート(SPDP)(2.0mg，6. 38μモル)を加えた。15分間反応を行い、次に濃酢酸および2M酢酸を用いてpHを4 .35に調整した。ジチオトレイトール（5.7mg）を添加してジスルフィッド結合を 還元した。反応を10分間行い、次に反応溶液をセファデックスG25 M PD-10カラ ム上で脱塩した。タンパク質を、pH4.5に保持し0.3Mの塩化ナトリウムを含有す る５mMホスフェート緩衝液2.4mlを用いて溶離した。HSAコンジュゲートを分析し たところ、6.7SH/HSAを含有しており、タンパク質含量は10.34mg/mlであった。 このHSAコンジュゲート溶液（2.48μモルSH基）に、0.216mlのアセトニトリル 中に溶解したN-(2-ピリジルジチオエチル)-3-(2-ヒドロキシ エチル)インドール-5-イル-O-β-D-グルコピラノシドウロンアミド（II）(1.9mg ，3.72μモル)を加えた。PHを8.45に調整した。反応を室温で24時間行い、次にp H7.4の50mMホスフェート緩衝液を用いて平衡化した２個のセファデックスG25 M PD-10カラム上で分別した。コンジュゲートは、緩衝液3.9mlを用いて溶離した。実施例５ ：HSAコンジュゲートIVのI¹²⁵標識化 I¹²⁵を用いる標識化は、クロラミンT法で実施した(Greenwood F.C.ら、Bioche m．J．89（1963）114-123)。 抗体免疫原 ：タイプ１ ：化合物IIをNaBH₄を用いて還元し、次にこの還元された誘導体を、［1 7−((ヨードアセチル)アミノ)-3,6,9,12,12-ペンタオキサヘプタデカノイル］ア ミノ-KLHと、または［17-((ヨードアセチル)アミノ)-3,6,9,12,12-ペンタオキサ ヘプタデカノイル］アミノ-HSAと反応させて(Akerblomら、Bioconjugate Chemis try４（1993）455-466)、それぞれコンジュゲートAおよびBにすることにより得 られた。タイプ２ ：コンジュゲートCはHSAコンジュゲートIVである。タイプ３ ：コンジュゲートDおよびコンジュゲートEは、それぞれKLHとのコンジ ュゲートIII（KLHのモル当たりT-5-G 270）およびHSAとのコンジュゲートIII(HS Aのモル当たりT-5-G 2.5基)に相当する。 免疫化：タイプ１ ：5匹のBalb/cマウスをフロインド完全アジュバント（FCA）中の50μg の免疫原（コンジュゲートA）で初回免疫した。後続の注射は、アジュバントな しで４週間毎に与えられた(4×50μg)。タイプ２ ：2匹のBalb/cマウスをフロインド完全アジュバント（FCA）中の25μg の免疫原（コンジュゲートC）で初回免疫し、アジュバントなしで4週間毎にブー スター投与した(4×50μg)。タイプ３ ：1群当たり３匹のBalb/cマウスの３群をFCA中の50μgの免疫原（コン ジュゲートD）で初回免疫し、4週間後にアジュバントなしで50μgのコンジュゲ ートDを、さらに４週間後に50μgのコンジュゲートDをブースター投与した。免疫応答 ：これはELISA(下記参照)および阻害ELISA(下記参照、特異性)により試 験した。16匹のマウスすべてがELISAで高い力価を生じたが、マイクロタイター ウエルの壁に被覆されたT-5-G誘導体（4匹のマウスにはT-5-G）への結合を阻害 しうるのみであった(すべてタイプ３により免疫された)。これら４匹のマウスは １日目、２日目および３日目にブースター投与（3×25μg）され、４日目に融合 された。 融合： 融合は、ポリエチレングリコール（PEG）の助けにより、融合相手としてSP2/O ミエローマ細胞を用いて行われた。細胞懸濁物を96ウエルのマイクロタイタープ レート中に播種し、15%ウシ胎児血清を補添しHAT（ヒポキサンチン-アミノプテ リン-チミジン）で選択したダルベッコ改良イーグル培地（DMEM）中で培養した 。支持細胞として腹腔マクロファージを使用した。上清をELISAによりスクリー ニングした(下記参照)。陽性ハイブリドーマを、 インヒビターとしてT-5-Gを用いて阻害ELISAで試験した(下記参照)。４種の融合 物から37のハイブリドーマが生じ、そして阻害ELISAの結果に基づきそれらの12 がクローニングのために選択された。 クローニングおよびスクリーニング：クローニング ：支持細胞として腹腔マクロファージを用い、96ウエルプレート中 に0.8細胞／ウエルを播いた。細胞１個のウエルを５日目に観察し、７日目にハ イブリドーマと同じ方法および阻害ELISAで試験した。ELISA : 96ウエルのELISAマイクロタイタープレートのウエルを、pH9.5の0.1M Na-カー ボネート中で、タイプ１の免疫化にはコンジュゲートBで、タイプ２および３の 免疫化にはコンジュゲートEで室温にて一夜被覆し、次に 0.05%Tween20を含有するCa²⁺/Mg²⁺を含有しないPBS中に１:５に希釈した培養上 清を加え、プレートを37℃で２時間インキュベートした。プレートを再び前記し たようにして洗浄した。抗体結合は、O-ニトロ-フェニル-β-ガラクトシドを酵 素基質とし、ウサギFab’抗-マウスIgFc-β-ガラクトシダーゼコンジュゲートを 用いて30分間の基質インキュベーションで検出した。阻害ELISA : これは、培養上清をウエルに添加する前にT-5-G（1μg/ウエル）とともにイン キュベートする以外は、ELISAに関して記載したのと同様にして行った。結果 ： ６つのクローンが、阻害実験でT-5-Gに対して反応性であることを示した抗体 を生産した。次にこれらの一つを交差反応性においてさらに研究した。 交差反応性： 種々の物質に関する交差反応性を、尿または標準物の代わりに使用される供試 物質を（希釈剤中に）希釈して以下に記載するイムノアッセイ法で測定した。各 物質について試験された濃度範囲は３種の大きさを包含し、一つの大きさは顕著 な文献最高値までまたはそれ以上であった。 他の物質の結合活性を妨害する寛容限界は、タンパク質コンジュゲートIVと本 発明の抗体との間の反応の阻害として測定され(交差反応性)、検出限界でのT-5- Gの濃度に関連して示される。尿中における種々の物質についての受容できる阻 害限界は、T-5-Gの50nM検出限界に関する表1から明らかである。 表 １．尿、妨害可能物質、それらの最高濃度および許容できる最大交差反 応性 交差反応性について試験した抗体は、表1に示される基準に従った。 イムノアッセイ：材料 ：3-(2-ヒドロキシエチル)インドール-5-O-β-D-グルコピラノシドウロン酸 、¹²⁵I-標識T-5-G-HSAコンジュゲート（コンジュゲートIV、スキーム3）およびT -5-G-KLHコンジュゲート(コンジュゲートIII、スキーム2)に対して生成されたマ ウスモノクローナル抗-5-HTOL抗体は、すべて前を含有するpH7.0の0.05M燐酸ナトリウム緩衝液であった。デカント溶液は、抗体 懸濁物を添加されてないPharmaciaデカンティング懸濁液であった(Pharmacia Di agnostics AB)。μ-アガロース粒子は、共有結合されたヒッジ-抗-マウス抗体を 担持していた。アッセイ原理 ： 限定された量のマウス抗-5-HTOL抗体についてサンプルT-5-Gと標識されたコン ジュゲートIVとの間での競合、それに続くアガロースμ-粒子に結合されたヒツ ジ-抗-マウス抗体の添加による沈殿。アッセイ操作 ： 50μlの尿または標準物、50μlのトレーサー溶液、50μlの抗体溶液 （前記６種の選択されたクローン一つ、５μg/ml）を試験管にピペットで加え、 シェーカーで600rpmで１分間混合し、室温で1.5時間放置し、50μlのヒツジ-抗- マウスミクロアガロース懸濁液（100mg/ml）を加え、前記のようにして混合し、 さらに0.5時間放置し、次に２mlのデカンティング溶液を加え、Beckman J-6B遠 心器中のJR-3.2 Rack Rotor中で管をPharmaciaデカンティングラック中に入れて 、3000rpmで10分間遠心する。遠心完結後５分以内に上清をデカンテーションし 、管ラックを吸収性組織上に２分間倒置する。最後に、管中の残留放射能をガン マカウンターで測定する。標準曲線は、希釈剤中のT-5-Gを10、100、1000および 10000nmol/Lで用いて作成される。 一例として、朝排尿後のアルコール消費の自己報告した志願者での試験の結果 を表２Ａに示す。尿サンプルを使用時まで-70℃で凍結保存し、解凍後サンプル を短時間遠心し、次に分析し、全サンプルを２重に分析した。クレア 表 ２Ａ アルコール摂取対尿中のnm GHTO/nmクレアチニン比率、男性

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ヘランダー，アンダース スウェーデン エス―752 24 ウプッサ ラ，ブレッドマンスガタン 10エー (72)発明者 ジョンソン，ローズ−マリー スウェーデン エス―752 32 ウプッサ ラ，ラックアルベルグスガタン １ (72)発明者 アンガー，エリック スウェーデン エス―753 24 ウプッサ ラ，バルビーガタン ９ (72)発明者 ボルグ，ステファン スウェーデン エス―182 74 ストック スンド，フォーレニングスバーゲン 29 (72)発明者 エケルブロム，エバ スウェーデン エス―756 52 ウプッサ ラ，タルゴクスバーゲン 15

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 5-HTOL化合物に対して特異的な抗体。 ２． 尿中に存在する他の5-HTOL化合物に比較して、優先的にT-5-G（GHTOL）に 結合することを特徴とする、請求項１に記載の抗体。 ３． ヒトサンプル中に存在する他のインドールまたはグルクロナイドに対して 何ら有意な結合活性を有しないことを特徴とする、請求項１-２のいずれかに記 載の抗体。 ４． 5-HTOLの5-ヒドロキシ基とD-グルコピラノシドウロン酸との間にβ-グル クロナイドの構造を包含することを特徴とする、5-ヒドロキシトリプトフォール （5-HTOL）とのグルクロナイド。 ５． 免疫原性担体、または水性媒体中に不溶性のポリマー性固形支持体または 分析的に検出可能な基を含有するように誘導体化されていることを特徴とする、 請求項４に記載のグルクロナイド。 ６． カルボキシ基において誘導体化されていることを特徴とする、請求項４- ５のいずれかに記載のグルクロナイド。 ７． 5-HTOL化合物を含有するサンプルを、請求項１-３のいずれかに定義され た抗体を用いるイムノアッセイでアッセイすることを特徴とする、5-ヒド ロキシトリプトフォール（5-HTOL）化合物を測定するためのイムノアッセイ。 ８． 前記サンプルが尿であることを特徴とする、請求項７に記載のイムノアッ セイ。 ９． 前記アッセイが、請求項４-６のいずれかに定義されたT-5-G誘導体を用い る競合性のものであることを特徴とする、請求項７-８のいずれかに記載のイム ノアッセイ。 10． 請求項７-９のいずれかに従って個体に由来するサンプルについてイムノ アッセイを実施し、次いでアッセイされた5-HTOL化合物の高められた測定レベル を、前記個体の最近のアルコール消費の指標とすることを特徴とする、個体の最 近のアルコール消費を測定するための診断方法。 11． 請求項７-９のいずれかに従って個体に由来するサンプルについてイムノ アッセイを実施し、前記個体からの同じサンプル中の5-ヒドロキシインドール酢 酸（5-HIAA）またはクレアチニンのような何らかの他の化合物をもアッセイし、 それぞれ前記他の化合物とアッセイされた5-HTOL化合物との測定レベル間の関連 を、前記個体の最近のアルコール消費と相関させることを特徴とする、個体の最 近のアルコール消費を測定するための診断方法。