DE69727975T2

DE69727975T2 - 5-hydroxytryptophol (5-htol) derivate, antikörper, immunoassays und detektion von kürzfristigem alkoholkonsum

Info

Publication number: DE69727975T2
Application number: DE69727975T
Authority: DE
Inventors: Ragnhild Brandt; Olof Beck; Anders Helander; Rose-Marie JÖNSSON; Eric Unger; Stefan Borg; Eva Akerblom
Original assignee: Alco Dia AB
Current assignee: Alco Dia AB
Priority date: 1996-12-05
Filing date: 1997-12-05
Publication date: 2005-03-10
Anticipated expiration: 2017-12-06
Also published as: ATE260936T1; JP2001506985A; WO1998024819A1; EP0964875B1; ES2217433T3; SE9604487D0; DE69727975D1; US20060100420A1; US20070276133A1; DK0964875T3; US6608178B1; EP0964875A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen neuen Antikörper, der in Immunoassays von Komponenten verwendet werden kann, die die Konzentrationen von 5-Hydroxytryptophol [5-HTOL = 2-(5-Hydroxy-3-indolyl)ethylalkohol] in Körperflüssigkeiten widerspiegeln. Freies 5-HTOL und Glucuronid- und Sulfatkonjugate davon sind bekannte Marker für kürzliche Alkoholaufnahme beim Menschen. Weitere Aspekte der Erfindung sind solche wie im Titel angegeben.
5-Hydroxytryptophol (5-HTOL) und 5-Hydroxyindol-3-Essigsäure (5-HIAA) sind über das gemeinsame Zwischenprodukt 5-Hydroxyindol-3-Acetaldehyd (5-HIAL) menschliche Serotoninmetabolite (5-Hydroxytryptamin, 5-HT). 5-HTOL wird in den Harn ausgeschieden, wo es hauptsächlich als Konjugat mit einer Glucuronsäure (T-5-G (oder GHTOL), 75–95%) und, im geringerem Maße, als freie Form oder als Konjugat als ein Sulfat auftritt. 5-HIAA wird ebenfalls in den Harn ausgeschieden. Nach Alkoholkonsum steigt die 5-HTOL-Konzentration in verschiedenen Körperflüssigkeiten gegenüber den normalen Werten an, die für Harn im Bereich von 40–650 nmol/l liegen. Gleichtzeitig erhöht sich das Verhältnis 5-HTOL/5-HIAA gegenüber den normalen Werten, die < 0,01 sind (oder < 10, wenn sie als picomolar/nanomolar ausgedrückt werden). Der Anstieg sowohl der 5-HTOL-Konzentration als auch des Verhältnisses 5-HTOL/5-HIAA dauert mehrere Stunden an, nachdem der Alkohol aus dem Körper verschwunden ist. Diese Befunde haben 5-HTOL und das Verhältnis 5-HTOL/5-HIAA zu Markern für kürzlichen Alkoholkonsum bei der Behandlung von Alkoholabhängigkeit und in der Gerichtsmedizin, z. B. bei postmortaler Körperuntersuchung, gemacht. Bevorzugt wurde bisher das Verhältnis gemessen, weil die 5-HTOL-Konzentrationen, nicht dagegen das Verhältnis, nach Aufnahme von Serotonin-reicher Nahrung ebenfalls erhöht sind, und weil sich der Bereich für normale und anormale 5-HTOL-Konzentrationen überlappt, nicht dagegen für die Verhältnisse. Als Alternative wurde auch das Verhältnis zwischen 5-HTOL im Harn und anderen Harnexkretionsprodukten wie beispielsweise Kreatinin verwendet.
Der Begriff „5-HTOL" umfasst, soweit nicht anders angegeben, 5-HTOL-Verbindungen, beispielsweise freies 5-HTOL, dessen Glucuronid (Tryptophol-5-glucuronid, T-5-G) und dessen Sulfat.
Erhöhte Konzentrationen von 5-HTOL-Verbindungen nach Alkoholkonsum wurden bisher im Harn, Plasma und der Cerebrospinalflüssigkeit (CSF) nachgewiesen. Es ist sehr wahrscheinlich, dass man 5-HTOL-Verbindungen auch im Serum, der Tränenflüssigkeit, dem Schweiß, dem Speichel usw. nachweisen kann. Die normale Konzentration von 5-HTOL-Verbindungen und das Gleichgewicht zwischen freiem 5-HTOL und seinen konjugierten Formen kann zwischen verschiedenen Probentypen unterschiedlich sein.
Verglichen mit 5-HIAA ist 5-HTOL schwierig zu messen. Es tritt in niedrigeren Konzentrationen als 5-HIAA auf und die konjugierten Formen liegen im Überschuss vor wobei das Glucuronid stark dominiert. Das gegenwärtig verwendete Verfahren zur Messung von 5-HTOL ist die Gaschromatographie in Kombination mit Massenspektrometrie (GC/MS), ein Verfahren, das teure Instrumente erfordert. Ein Hochdruckflüssigkeitschromatographie-(HPLC)-Verfahren wurde entwickelt, aber es leidet unter dem Nachteil „falscher Peaks", d. h. einem überlappenden R_f für 5-HTOL und andere Verbindungen. Für beide Verfahren ist erforderlich, dass das Glucuronid (T-5-G) vor dem Assay enzymatisch zu freiem 5-HTOL umgewandelt werden muss. Es besteht daher ein Bedarf nach einem billigen, einfachen und zuverlässigen Verfahren zur Messung von 5-HTOL-Verbindungen in verschiedenen Körperflüssigkeiten.
Bezüglich des einschlägigen Standes der Technik wird auf die separate Liste am Ende des Beschreibungsteils verwiesen.
Es sei auch auf Dabadie et al, Synapse 14: 178–183 (1993), lijima et al, Acta histochem 89: 141–156 (1990), US-A-4762781 (Geffard) und EP-A-216162 (A/S de Danske Sukkerfabrikker) verwiesen.
Das Hauptziel der Erfindung besteht darin, ein Immunoassay-Verfahren für die Messung einer 5-HTOL-Verbindung in Proben bereit zu stellen, die freies 5-HTOL zusammen mit seinen Konjugaten enthalten, ohne zuvor eine Hydrolyse der endogenen 5-HTOL-Konjugate durchzuführen.
Ein zweites Ziel besteht darin, einen Antikörper bereit zu stellen, der einen Immunoassay einer 5-HTOL-Verbindung ermöglicht.
Ein drittes Ziel besteht darin, Derivate von T-5-G bereit zu stellen, die als Immunogene oder als 5-HTOL-Analoga, welche die Struktur der entsprechenden nativen 5-HTOL-Verbindung nachahmen, in verschiedenen Assays verwendet werden können, z. B. kompetitiven Immunoassays für 5-HTOL-Verbindungen.
Die Erfindung basiert auf unserer Entdeckung, dass man Antikörper erhalten kann, die an eine 5-HTOL-Verbindung binden, indem man in den geeigneten Tieren eine humorale Immunantwort unter Verwendung einer immunogenen Form des β-Glucuronids von 5-HTOL und D-Glucopyranosiduronsäure (d. h. einer immunogenen Form von 3-(2-Hydroxyethyl)indol-5-O-β-D-glucopyranosiduronsäure) als dem Immunogen hervorruft.
Die Erfindung stellt somit in einem Aspekt einen Antikörper bereit, der spezifisch für 5-Hydroxytryptophol oder ein Konjugat davon ist.
Der Begriff „spezifisch" bedeutet, dass das Antikörper unter Immunoassay-Bedingungen vorzugsweise an eine 5-HTOL-Verbindung bindet, ohne eine störende Bindungsaktivität gegenüber anderen endogenen Substanzen in Humanproben aufzuweisen, beispielsweise Serotonin (5-HT), 5-HIAA und anderen strukturell verwandten Substanzen, beispielsweise anderen Indolen oder Glucuroniden. In der gegenwärtig bevorzugten Form bindet die erfindungsgemäße Antikörperzubereitung im Vergleich mit anderen endogenen 5-HTOL-Verbindungen vorzugsweise an T-5-G. Die Antikörperzubereitung weist gegenüber potentiell störenden Substanzen, beispielsweise anderen Indolen und Glucuroniden, die in Körperflüssigkeiten vorliegen können, eine akzeptable niedrige Bindungsaktivität auf. Es wird auf den experimentellen Teil verwiesen.
Da die Konzentrationen an freiem 5-HTOL, T-5-G und sulfatiertem 5-HTOL als Folge kürzlicher Alkoholaufnahme alle erhöht sind, können brauchbare Antikörper mit einem, zwei oder allen dieser 5-HTOL-Verbindungen reagieren.
Der Begriff Antikörper umfasst verschiedene Antikörperzubereitungen, welche die oben erwähnte Spezifität aufweisen, beispielsweise den intakten Antikörper und verschiedene aktive Fragmente (Antigen/Hapten-bindende Fragmente), wie beispielsweise Fab, Fab', Fv, F(ab')₂ usw. Er umfasst auch derivatisierte Antikörper, beispielsweise Antikörper, an die Markierungsstoffe kovalent gebunden wurden, beispielsweise Biotin, Hapten, Enzyme, Enzymsubstrate, Kofaktoren, Fluorophore, chemilumineszente Substanzen, Chromophore, radioaktive Isotope, Metalle, Partikel usw., und Trägermoleküle, beispielsweise unlösliche und lösliche Polymere.
Der erfindungsgemäße Antikörper kann eine polyklonale oder monoklonale Zubereitung sein. Er kann eine Mischung einer bestimmten Anzahl von monoklonalen Antikörpern enthalten. Er kann über allgemein bekannte Verfahren erhalten werden, wobei jedoch unsere neuen T-5-G-Derivate (Konjugate) verwendet werden sollten, beispielsweise als Immunogen zur Erzeugung von polyklonalen Antikörpern oder als Antigen für das Screenen einer Immunantwort oder von Zelllinien (z. B. Hybridomen), welche den erfindungsgemäßen Antikörper sekretieren, oder verschiedener Antikörperbibliotheken, aus denen jede individuelle Antikörperkomponente zusammen mit der entsprechenden kodierenden Sequenz isoliert werden kann. Die in Betracht gezogenen Techniken umfassen somit auch Antikörper, die mittels Selektion durch Phagendisplay-Techniken erhalten wurden. Sobald die erfindungsgemäße Antikörperzubereitung einmal erhalten wurde, kann sie über rekombinante Techniken modifiziert werden.
Die zum Prioritätstag am meisten bevorzugte Ausführungsform, die erfindungsgemäße Antikörperzubereitung zu erhalten, ist im experimentellen Teil dargestellt und bedient sich des im Patentbeispiel 3 (Reaktionsschema 2) definierten Konjugats aus dem Hämocyanin der Lochschnecke (KLH) mit T-5-G als Immunogen und der Selektion geeigneter Hybridomklone so wie im experimentellen Abschnitt beschrieben. Die am meisten bevorzugte Form des erfindungsgemäßen Antikörpers bindet somit unter den verschiedenen 5-HTOL-Verbindungen, die in nativen Proben vorhanden sind, vorzugsweise an T-5-G.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein 3-(2-Hydroxyethyl)indol-5-O-β-D-glucopyranosiduronsäure-Derivat bereit, das einen kovalent gebundenen analytisch nachweisbaren Markierungsstoff umfasst.
Die 3-(2-Hydroxyethyl)indol-5-O-β-D-glucopyranosiduronsäure kann optional an einem oder mehreren OH im Kohlenhydratanteil, d. h. an einer alkoholischen Hydroxylgruppe (Positionen 2, 3 und 4) oder an der Carboxylgruppe (Position 6) oder an dem 3-Hydroxyethylhydroxyl, oder an dem Indol-Stickstoff derivatisiert sein.
Die Derivatisierung der T-5-G-Struktur wird vorgenommen, um eine kovalent gebundene analytisch nachweisbare Gruppe einzuführen, vorzugsweise über die Carboxylgruppe. Die analytisch nachweisbare Gruppe kann von derselben Art sein, wie sie für die erfindungsgemäßen Antikörper besprochen wurde (siehe oben).
Die Derivatisierung einer alkoholischen Hydroxygruppe kann so erreicht werden, wie sie normalerweise für Glucuronid-Derviate durchgeführt wird, z. B. durch selektive Alkylierung oder Acylierung an den Positonen 2, 3 und/oder 4, entweder vor oder nach der Glucuronid-Bildung mit freiem 5-HTOL. Die Derivatisierung an der Carboxylgruppe des Glucuronids oder der freien Glucuronsäure kann zu Amiden und Estern führen, bei denen die Carboxylgruppe weiter derivatisiert ist. Es wird auf den experimentellen Teil verwiesen.
T-5-G kann auch an der Carboxylgruppe derivatisiert werden, so dass es ein kovalent gebundenes Trägermolekül enthält, vorzugsweise ein Trägermolekül polymerer Natur, beispielsweise einen immunogenen Proteinträger, wie beispielsweise menschliches oder bovines Serumalbumin, KLH oder dergleichen, oder ein Trägerpolymer (Unterlage), das unlöslich ist oder unlöslich gemacht werden kann, von der Art, wie es in Trennungsmedien in der Chromatographie und in Immunoassays verwendet wird (z. B. Unterlagen aus synthetischen Polymeren, wie beispielsweise Polystyrol, oder aus Polysacchariden, wie beispielsweise Agarose, Dextran, Zellulose, Stärke und dergleichen).
Die zum Prioritätstag bevorzugten Verfahren zur Synthese der erfindungsgemäßen T-5-G-Verbindungen werden aus dem experimentellen Teil ersichtlich.
In einem noch weiteren Aspekt, stellt die Erfindung einen Immunoassay zur Bestimmung von 5-Hydroxytryptophol oder Konjugaten davon bereit, der dadurch gekennzeichnet ist, dass eine das 5-Hydroxytryptophol oder Konjugate davon enthaltende Probe in einem Immunoassay untersucht wird, der einen erfindungsgemäßen Antikörper verwendet.
Ein solcher Immunoassay kann als diagnostisches Verfahren zur Bestimmung kürzlichen Alkoholkonsums eines Probanden verwendet werden, wobei eine erhöhte Konzentration von 5-HTOL oder Konjugaten davon, falls vorgefunden, als Hinweis auf kürzlichen Alkoholkonsum des Probanden gewertet wird. Der Assay kann auch die Untersuchung einer anderen Verbindung in der gleichen Probe des Probanden, z. B. 5-Hydroxyindolessigsäure (5-HIAA) oder Kreatinin beinhalten, wobei das Verhältnis zwischen den vorgefundenen Konzentrationen der weiteren Verbindung und dem 5-Hydroxytryptophol beziehungsweise Konjugaten davon mit kürzlichem Alkoholkonsum des Probanden korreliert ist.
Bei diesem Aspekt der Erfindung bringt man somit eine Probe, die eine 5-HTOL-Verbindung enthält, mit dem erfindungsgemäßen Antikörper unter Bedingungen in Kontakt, welche die Bildung eines sowohl eine 5-HTOL-Verbindung als auch den erfindungsgemäßen Antikörper umfassenden Immunkomplexes ermöglichen. Die Bedingungen werden dann so gewählt, dass die Menge des gebildeten Komplexes ein Maß für die Menge der 5-HTOL-Verbindung in der Probe sein wird.
Der Nachweis des Komplexes wird nach Verfahren durchgeführt, die dem Fachmann gut bekannt sind, beispielsweise entweder durch Bestimmung des Komplexes als solchem oder der Abnahme der Menge des zugegebenen unkomplexierten erfindungsgemäßen Antikörpers.
Eine allgemeine Art von Immunoassay, der eingesetzt werden kann, verwendet einen markierten Immun-Reaktionspartner, der Immunkomplexe in einer Menge zu bilden vermag, die mit der Menge der in der Probe vorliegenden 5-HTOL-Verbindung in Beziehung steht. Im Prinzip kann der Markierungsstoff von derselben allgemeinen Art sein, wie sie oben für 5-HTOL-Glucuronid Analoga und Antikörper angegeben.
Immunoassays, die Markierungsstoffe verwenden, werden oft in heterogene und homogene Assays unterteilt. Die homogenen Varianten verwenden keinen Schritt der Trennung von Komplex-gebundenem markiertem Reaktionspartner von unkomplexiertem markiertem Reaktionspartner. Aus diesem Grund ist es zwingend erforderlich, einen Markierungsstoff zu verwenden, der sein Signal als Folge der Komplexbildung ändert. In heterogenen Assayvarianten wird der an einen Immunkomplex gebundene markierte Reaktionspartner physikalisch von dem nicht im Komplex gebundenen Reaktionspartner getrennt. Für die heterogenen Varianten besteht somit keine Notwendigkeit für Markierungsstoffe, die ihr Signal auf Grund der Komplexbildung ändern, was bedeutet, dass auch radioaktive Isotop-Markierungsstoffe verwendet werden können.
Noch eine weitere Art der Unterteilung von Immunoassays ist die der Unterteilung in kompetitive und nicht-kompetitive (Sandwich-) Varianten. Im ersten Fall lässt man die 5-HTOL-Verbindung, die an den erfindungsgemäßen Antikörper bindet und in der Probe vorliegt, mit einem T-5-G-Analogon um eine begrenzte Menge der erfindungsgemäßen Antikörper konkurrieren (die 5-HTOL-Verbindung, die mit dem Antikörper plus dem T-5-G-Analogon reagiert), worauf die Menge an Komplex zwischen dem T-5-G-Analogon und dem erfindungsgemäßen Antikörper nachgewiesen und mit der Menge der 5-HTOL-Verbindung in der Probe in Beziehung gesetzt wird. Das T-5-G-Analogon ist in diesem Fall vorzugsweise ein markiertes oder Träger-gebundenes T-5-G-Derivat wie oben definiert. Für den Fall, dass das T-5-G-Analogon der markierte Reaktionspartner ist, kann der erfindungsgemäße Anti-5-HTOL-Antikörper in ungelöster Form (beispielsweise an eine Unterlage gebunden) oder gelöster Form verwendet werden. Eine Alternative besteht in einer Variante, bei der ein unlösliches T-5-G-Analogon mit einer 5-HTOL-Verbindung der Probe um eine begrenzte Menge des löslichen erfindungsgemäßen Anti-5-HTOL-Antikörpers konkurriert.
Die zum Prioritätstag bevorzugten Immunoassayvarianten umfassen heterogene kompetitive Immunoassays wie oben beschrieben. Es wird auch auf den experimentellen Teil verwiesen.
Von Assayvarianten, die keinen markierten Reaktionspartner verwenden, können Biosensor-Techniken erwähnt werden, bei denen die Bindung zwischen Antigen/Hapten und Antikörpern an einer Oberfläche stattfindet.
Die Probe kann Serum, Plasma, Harn, CSF oder jede andere Probe sein, die eine oder mehrere 5-HTOL-Verbindungen enthalten kann.
Es sind solche Temperatur- und pH-Bedingungen anwendbar, die für Immunoassays normal sind, d. h. 0–40°C, vorzugsweise 15–35°C, und pH 4–9, vorzugsweise pH 5–8.
Das Ergebnis des erfindungsgemäßen Immunoassays kann in diagnostischen Verfahren zur Bestimmung kürzlichen Alkoholkonsums eines Probanden auf dieselbe Weise verwendet werden, wie sie früher für 5-HTOL-Verbindungen erfolgte (siehe den Einleitungsteil). Dies bedeutet, dass in den bevorzugten Varianten der erfindungsgemäßen diagnostischen Verfahren vorgefundene Konzentrationen von 5-HTOL-Verbindungen in Beziehung mit einigen anderen Verbindungen gesetzt werden können, z. B. den Konzentrationen von 5-HIAA oder Kreatinin. Für Immunoassays kann die Menge an gebildetem Immunkomplex oder jeder andere Messwert der Menge an 5-HTOL-Verbindungen in der Probe natürlich ebenso gut direkt mit der kürzlichen Alkoholaufnahme in Beziehung gesetzt werden wie die Konzentration einer 5-HTOL-Verbindung als solche. Das diagnostische Verfahren ist besonders gut auf menschliche Probanden abgestimmt.
EXPERIMENTELLER TEIL
Synthese
Beispiel 1. Synthese und Aufreinigung von 3-(2-Hydroxyethyl)indol-5-yl-O-β-D-Glucopyranosiduronsäure (I)
(Schema 1): 2-(5-Hydroxy-3-indolyl)ethylalkohol (151 mg), MgCl₂ (50 mg), Uridin-5'-diphosphoglucuronsäure Triammoniumsalz (490 mg), Uridin-5'-diphosphoglucuronyltransferase (182 mg) (Typ III aus Rinderleber, Sigma) und 40 ml 0,1 M pH 7,4 Tris-Puffer wurden in einen 200 ml E-Kolben gegeben. Der Kolben wurde mit Parafilm versiegelt und in einem Schüttler-Inkubator bei 37°C und 150 Upm inkubiert. Kleine Proben wurden zu verschiedenen Zeitpunkten aus der Inkubation entnommen und nach Abkühlung, Zentrifugation, Filtration und Ansäuerung durch analytische PepPRC auf einem FPLC-System analysiert, um die Reaktion zu verfolgen. Die Konzentration von 3-(2-Hydroxyethyl)indol-5-yl-O-β-D-glucopyranosiduronsäure (I) erreichte nach 20 h Plateau-Konzentrationen und blieb für mehr als 7 h bei diesen Konzentrationen.
Man stoppte die Inkubation 15 min lang auf Eis, worauf man bei 10.000 Upm bei 5°C für 30 min unter Verwendung eines JA-10 Rotors in einer J2-21 M/E Beckman-Zentrifuge zentrifugierte. Der Überstand wurde dann über Watte filtriert, und durch Zugabe von HCl auf unter pH 3 angesäuert. Man gab Methanol auf eine Endkonzentration von 2,5% ab. Von dieser Mischung wurde jeweils 1/3 auf einer Pep RPC HR 16/10 Säule in einem Wasser-Methanol-System aufgereinigt. Die Säule wurde zuerst ausgiebig in Wasser äquilibriert. Man trug die Probe in 2,5% Methanol auf, stellte einen Gradient von 2,5–5,5% Methanol über 85 min, dann isokratische Bedingungen über 60 min und danach einen Gradient von 5,5–50% Methanol über 100 min ein. Die Flussgeschwindigkeit betrug zu jeder Zeit 3,5 ml/min. 3-(2-Hydroxyethyl)indol-5-yl-O-β-D-glucopyranosiduronsäure (I) wurde bei 5,5 Methanol eluiert. Das Vereinigen von Fraktionen und die Reinheit der Präparationen wurde mittels TLC (n-Butanol : Essigsäure : Ethylacetat : Wasser, 1 : 1 : 1 : 1) überwacht. Die Ausbeute nach der Aufreinigung betrug 65 mg. ¹NMR (D₂O) δ 3.5 (t 2H), 3.7–3.79 (m 3H), 3.93 (t 2H), 4.16 (d 1H), 5.19 (d 1H), 7.12 (q 1H), 7.33 (s 1H), 7.44 (d 1H), 7.45 (d 1H). J_1,2 für H in Glucopyranosiduronsäure betrug 7,8 cps, was auf eine β-Form hinwies. ¹³CNMR (D₂O) 27, 61, 71, 72, 74, 75, 102, 106, 111, 112, 113, 125, 127, 133, 150, 172. Das Muster der Kohlenstoff-Peaks der Glucopyranosiduronsäure ist in Übereinstimmung mit der β-Form.
Beispiel 2: Synthese von N-(2-Pyridyldithioethyl)-(2-Hydroxyethyl)indol-5-yl-O-β-D-glucopyranosiduronsäure (II)
Schema 2. 3-(2-Hydroxyethyl)indol-5-yl-O-β-D-glucopyranosiduronsäure (I) (52 mg, 0,153 mmol) wurde in einem 5 ml Reacti-Gefäß in 1 ml DMF (mit Molekularsieben getrocknet) gelöst. Danach wurden O-(N-Succinimidyl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium-tetrafluorborat (TSTU) (73 mg, 0.243 mmol) und Diisopropylethylamin (84 μl, 0,456 mmol) zugegeben. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur für 35 min durchgeführt.
Cysteamin-2-pyridyldisulfid-hydrochlorid (72 mg, 0,324 mmol) wurde in ein anderes Reacti-Gefäß gegeben, gefolgt von DMF (0,5 ml) und Diisopropylethylamin (56 μl, 0,324 mmol). Zu dieser Lösung wurde die Hydroxysuccinimidyl-aktivierte Säure (I) gegeben. Nach einstündiger Umsetzung engte man im Vakuum bei geringem Druck ein, wodurch ein Öl erhalten wurde. Die TLC (n-Butanol : Ethylacetat : Essigsäure : Wasser = 1 : 1 : 1 : 1) zeigte, dass fast das gesamte (I) reagiert hatte. Das Öl wurde in 3 ml 27% Methanol gelöst, in drei Teile aufgeteilt und unter Verwendung eines Gradienten von 25–60% Methanol, das 0,2% Essigsäure enthielt, mit einer Flussrate von 3,5 ml/min auf einer PepRPC Säule HR 16/10 fraktioniert. Das gewünschte Produkt (II) wurde bei einem Gradienten von 43% Methanol, das 0,2% Essigsäure enthielt, eluiert. Fraktionen mit (II) wurden vereinigt und durch Verdampfen im Vakuum konzentriert und schließlich gefriergetrocknet, wobei 26 mg (II) als weißes Pulver anfielen. ¹HNMR (D₂O) δ 2,98 (t 2H), 3,01–3,12 (m 2H), 3,54–3,63 (m 2H), 3,71–3,77 (m 3H), 3,87 (t 2H), 3,97–4,01 (m 1H), 5.22 (d 1H), 7,14–7,17 (m 2H), 7,24 (s 1H), 7,42 (t 1H), 7,47 (t 1H), 7,48 (s 2H), 8,3 (d 1H).
Beispiel 3. Synthese des KLH-Konjugats (III) (Schema 2)
Lochschnecken-Hämocyanin (KLH) (73,5 mg) wurde in 6,5 ml 0,1 M Borat-Puffer bei einem pH von 9,5 gelöst. Ungelöste Substanz wurde durch Filtration entfernt und der Proteingehalt der Lösung durch Aminosäureanalyse mit 37 mg/ml Protein bestimmt. Zu dieser eiskalten Lösung von KLH wurden 0,8 ml einer Lösung eines gemischten Anhydrids aus 3-(2-Hydroxyethyl)indol-5-yl-O-β-D-glucopyranosiduronsäure (0,025 mmol) zugegeben. Letztere Verbindung wurde durch Auflösen von 3-(2-Hydroxyethyl)indol-5-yl-O-β-D-glucopyranosiduronsäure (I) (10,6 mg, 0,0312 mmol) in 1 ml Tetrahydrofuran in einem 5 ml Reacti-Gefäß zubereitet. Man blies Stickstoffgas in das Gefäß ein und stellte letzteres in ein Eisbad. Nach 15 min wurden Isobutylchlorformiat (4,1 μl, 0,0312 mmol) und Triethylamin (4,3 μl, 0,0312) zugegeben, und die Reaktion der Säure (I) und des Isobutylchlorformiats war bei 0°C innerhalb von 30 min abgeschlossen. Man setzte das KLH mit dem Anhydrid 20 min bei 0°C um und stellte den Reaktionsansatz dann über Nacht in einen Kühlschrank. Das Tetrahydrofuran wurde in einem Vakuumverdampfer entfernt und die Reaktionslösung (4,8 ml) wurde auf zwei Sephadex G25 M PD-10 Säulen abgetrennt, die mit 2 mM Phosphatpuffer pH 7,5 äquilibriert waren. Das Konjugat wurde mit 3,2 ml Puffer eluiert. Das Gesamtvolumen betrug 6,4 ml. Der Proteingehalt wurde über Aminosäureanalyse als 3,04 mg/ml bestimmt. Der Grad der Substitution wurde durch UV-Spektroskopie als 270 Verbindung I pro KLH bestimmt (berechnet auf der Basis eines Mw von 3 000 000.)
Beispiel 4. Synthese von HSA-Konjugat (IV) (Schema 3)
Menschliches Serumalbumin (HSA) (28,5 mg, 0,425 μmol) wurde in 1,73 ml 0,2 M Phosphatpuffer bei einem pH von 8,5 gelöst. Dieser Lösung wurde N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)proprionat (SPDP) (2,0 mg, 6,38 μmol) in 0,178 ml Ethanol zugegeben. Die Reaktion wurde für 15 min durchgeführt und der pH dann mit konzentrierter und 2 M Essigsäure auf 4,35 eingestellt. Dithiotreitol (5,7 mg) wurde zugegeben, um die Disulfidbindung zu reduzieren. Nach zehnminütiger Umsetzung entsalzte man die Reaktionslösung dann auf einer Sephadex G25 M PD-10 Säule. Das Protein wurde mit 2,4 ml eines 5 mM Phosphatpuffers eluiert, der einen pH von 4,5 beihielt und 0,3 M Natriumchlorid enthielt. Die Analyse des HSA-Konjugats ergab einen Gehalt von 6,7 SH/HSA, und der Proteingehalt betrug 10,34 mg/ml.
Zu dieser HSA-Konjugatlösung (2,48 μmol SH-Gruppen) gab man in 0,216 ml Acetonitril gelöstes N-2-Pyridyldithioethyl)-3-(2-hydroxyethyl)indol-5-yl-O-β-D-glucopyranosiduronamid (II) (1,9 mg, 3,72 μmol). Der pH wurde auf 8,45 eingestellt. Die Reaktion wurde für 24 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt und der Reaktionsansatz dann auf zwei Sephadex G25 M PD-10 Säulen fraktioniert, die mit 50 mM Phosphatpuffer pH 7,4 äquilibriert waren. Das Konjugat wurde mit 3,9 ml Puffer eluiert.
Beispiel 5. I¹²⁵-Markierung des HSA-Konjugats IV
Markierung mit I¹²⁵ wurde nach der Chloramin T-Methode durchgeführt (Greenwood F. C. et al., Biochem. J. 89 (1963) 114–123).
Antikörper
Immunogene
Typ 1: Erhalten durch Reduktion der Verbindung II mit NaHB₄ und anschließende Umsetzung des reduzierten Derivats mit [17-((Jodacetyl)amino)-3,6,9,12,12-pentaoxaheptadacanoyl]amino-KLH oder [17-((Jodacetyl)amino)-3,6,9,12,12-pentaoxaheptadacanoyl]amino-HSA (Akerblom et al., Bioconjugate Chemistry 4 (1993) 455–466), wobei Konjugat A beziehungsweise Konjugat B erhalten wurden.
Typ 2: Konjugat C ist das HSA-Konjugat IV.
Typ 3: Konjugat D und Konjugat E entsprechen Konjugat III mit KLH (270 T-5-G pro Mol KLH) beziehungsweise HSA (2,5 Gruppen T-5-G pro Mol HSA).
Immunisierungen
Typ 1: Fünf Balb/c Mäuse wurden mit 50 μg Immunogen (Konjugat A) in Freund's komplettem Adjuvans (FCA) geprimt. Nachfolgende Injektionen wurden alle vier Wochen ohne Adjuvans verabreicht (4 × 50 μg).
Typ 2: Zwei Balb/c Mäuse wurden mit 25 μg Immunogen (Konjugat C) in Freund's komplettem Adjuvans (FCA) geprimt und alle vier Wochen ohne Adjuvans geboostet (4 × 50 μg).
Typ 3: Drei Gruppen mit drei Balb/c Mäusen in jeder Gruppe wurden mit 50 μg Immunogen (Konjugat D) in FCA geprimt und nach vier Wochen ohne Adjuvans mit 50 μg und nach vier weiteren Wochen mit 50 μg Konjugat D geboostet.
Immunantwort: Diese wurde durch ELISA (siehe unten) und Inhibitions-ELISA (siehe unten, Spezifität) getestet. Alle der sechzehn Mäuse wiesen einen hohen Titer im ELISA auf, aber es war nur möglich, die Bindung an das an die Wände der Mikrotiter-Wells beschichtete T-5-G Derivat mit T-5-G bei vier Mäusen (alle nach Typ 3 immunisiert) zu inhibieren. Diese vier Mäuse wurden geboostet (3 × 25 μg) an Tag eins, Tag zwei und Tag drei und am Tag vier für Fusionierung verwendet.
Fusionierungen
Die Fusionierungen wurden mit Hilfe von Polyethylenglykol (PEG) und SP2/0 Myelomzellen als Fusionspartner durchgeführt. Die Zellsuspension wurde in 96 Well-Mikrotiterplatten ausgesät und in Dubecco's Modifiziertem Eagles Medium (DMEM), das mit 15% fötalem Kälberserum supplementiert war, kultiviert und mit HAT (Hypoxanthin-Aminopterin-Thymidin) selektiert. Peritoneale Makrophagen wurden als Nährzellen verwendet. Die Überstände wurden über ELISA gescreent (siehe unten). Positive Hybridome wurden über Inhibitions-ELISA (siehe unten) mit T-5-G als Inhibitor gescreent. Die vier Fusionen führten zu 37 Hybridomen, und auf der Grundlage der Ergebnisse des Inhibitions-ELISA wurden zwölf von ihnen für eine Klonierung ausgewählt.
Klonierung und Screening
Klonierung: 0,8 Zellen/Well wurden in 96-Well-Platten mit peritonealen Makrophagen als Nährzellen ausgesät. Wells mit einer Zelle wurden am Tag fünf beobachtet und auf dieselbe Weise wie die Hybridome und in einem Inhibitions-ELISA an Tag sieben getestet.
ELISA: Die Wells der 96-Well ELISA-Mikrotiter-Platten wurden für Typ 1 Immunisierungen mit Konjugat B, und für Typ 2 und 3 Immunisierungen mit Konjugat E in 0,1 M Na-Carbonat pH 9,5 bei Raumtemperatur über Nacht beschichtet, dann 3 mal mit 0,9% NaCl gewaschen, das 0,02% Tween^® 20 enthielt. 1 : 5 in Ca²⁺/Mg²⁺-freiem, 0,05% Tween 20 enthaltendem PBS verdünnte Kulturüberstände wurden dann zugegeben und die Platten für 2 h bei 37°C inkubiert. Die Platten wurden erneut wie oben beschrieben gewaschen. Antikörperbindung wurde mit Hase-Fab'-Anti-Maus IgFc-β-Galaktosidase-Konjugat und o-Nitro-phenyl-β-Galaktosid als Enzymsubstrat mit 30 min Subtratinkubation nachgewiesen.
Inhibitions-ELISA: Dieser wurde wie für ELISA beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, dass die Kulturüberstände mit T-5-G (1 μg/Well) inkubiert wurden, bevor sie den Wells zugegeben wurden.
Ergebnisse: Sechs Klone erzeugten Antikörper, die sich in Inhibitionsexperimenten als gegen T-5-G reaktiv zeigten. Einer davon wurde weiter auf Kreuzreaktivität untersucht.
Kreuzreaktivitäten
Kreuzreaktivität für verschiedene Substanzen wurde in dem unten beschriebenen Immunoassay-Verfahren mit Verdünnungen der getesteten Substanz (in dem Verdünnungsmittel) an Stelle von Harn oder Standard gemessen. Der Konzentrationsbereich, der für jede Substanz getestet wurde, deckte drei Größenordnungen ab und erreichte den höchsten in der Literatur beschriebenen Wert oder überstieg diesen um eine Größenordnung.
Die Toleranzgrenze für störende Bindungsaktivitäten anderer Substanzen wird als Inhibition der Reaktion zwischen dem Proteinkonjugat IV und dem erfindungsgemäßen Antikörper gemessen (Kreuzreaktivität) und wird relativ zur Konzentration von T-5-G an der Nachweisgrenze angegeben. Akzeptable Inhibierungsgrenzen für verschiedene Substanzen im Harn werden für eine 50 nM Nachweisgrenze von T-5-G aus Tabelle 1 ersichtlich.
TABELLE 1. Harn. Potentiell störende Substanzen, deren höchste Konzentrationen und zulässige maximale Kreuzreaktivität
Der auf Kreuzreaktivität getestete Antikörper erfüllte die in Tabelle 1 aufgestellten Kriterien.
Immunoassay
Materialien: 3-(2-Hydroxyethyl)indol-5-O-β-D-glucopyranosiduronsäure, ¹²⁵I-markiertes T-5-G-HSA-Konjugat (Konjugat IV, Schema 3) und gegen ein T-5-G-KLH-Konjugat (Konjugat III, Schema 2) erzeugter Maus-monoklonaler Anti-5-HTOL-Antikörper waren alle wie oben beschrieben. Das Verdünnungsmittel war 0,05 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, der 0,01 M EDTA, 0,1% Tween^® und 1% BSA enthielt. Die Dekantierungslösung war Pharmacia Dekantierungssuspension ohne zugegebene Antikörpersuspension (Pharmacia Diagnostics AB). μ-Agarosepartikel trugen kovalent gebundenen Schaf-Anti-Maus-Antikörper.
Assay-Prinzip: Konkurrenz zwischen T-5-G der Probe und markiertem Konjugat IV um eine begrenzte Menge Maus-Anti-5-HTOL-Antikörper mit nachfolgender Fällung durch Zugabe von an Agarose μ-Partikel gebundenem Schaf-Anti-Maus-Antikörper.
Assay-Verfahren: In ein Teströhrchen werden 50 μl Harn oder Standard pipettiert, 50 μl Tracer-Lösung, 50 μl Antikörper-Lösung (einer der oben erwähnten sechs ausgewählten Klone, 5 μg/ml), auf einem Schüttler bei ~600 Upm für ~1 min gemischt, bei Raumtemperatur für 1,5 h stehen gelassen, 50 μl der Suspension aus Schaf-Anti-Maus-Mikro-Agarose (~100 mg/ml) werden wie oben gemischt und für weitere 0,5 h stehen gelassen, dann werden 2 ml Dekantierungslösung zugegeben, es wird für 10 min bei 3000 Upm in dem JR-3.2 Rack Rotor in einer Beckman J-6B Zentrifuge zentrifugiert, wobei die Röhrchen sich in Pharmacia Dekantierungsständern befinden. Innerhalb von 5 min nach beendigter Zentrifugation wird der Überstand dekantiert und die Röhrchenständer umgedreht auf absorbierendem Gewebe für 2 min stehen gelassen. Schließlich wird die in den Röhrchen verbleibende Radioaktivität in einem Gammazähler gemessen. Eine Standardkurve wird mit T-5-G bei 10, 100, 1000 und 10000 nmol/l in dem Verdünnungsmittel erstellt.
Als Beispiel werden Ergebnisse eines Tests des Harn am Morgen danach mit freiwilligen Berichten der Probanden über den Alkoholkonsum in Tabelle 2A gezeigt. Harnproben wurden bis zur Verwendung bei –70°C gefroren gehalten. Nach dem Auftauen wurden die Proben vor der Analyse kurz zentrifugiert, alle Proben wurden in Duplikaten analysiert. Die Kreatininanalyse wurde nach Jaffe durchgeführt.
Tabelle 2A. Alkoholaufnahme gegen das Verhältnis nm GHTO/nm Kreatinin im Harn. Männer
Literaturnachweise
Veröffentlichungen der Erfinder

1. Beck et al., Levels of 5-hydroxytryptophol in cerebrospinal fluid from alcoholics determined by gas chromatography-mass spectrometry. Biochem. Pharmacol. 29 (1980) 693–696.
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3. Beck et al., 5-hydroxytryptophol in the cerebrospinal fluid and urine of alcoholics and healthy subjects. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology 321 (1982) 293–297.
4. Beck et al., 5-hydroxyindoleacetic acid and 5-hydroxytryptophol levels in rat brain: effects of ethanol, pyrazole, cyanamide and disulfiram treatment. Drug and Alcohol Dependence 16 (1986) 303–308.
5. Helander et al., Effects of ethanol, acetaldehyde and disulfiram on the metabolism of biogenic aldehydes in isolated human blood cells and platelets. Biochem. Pharmacol. 36 (1987) 3981–3985
6. Helander et al., Determination of urinary 5-hydroxyindole-3-acetic acid by high-performance liquid chromatography with electro detection and direct sample injection. Anal. Biochem. 196 (1991) 170–173.
7. Borg et al., Carbohydrate deficient transferrin and 5-hydroxytryptophol: two new markers of high alcohol consumption. In: Measuring Alcohol Consumption (Hrsg. Litten et al.) 149–159 (1992) Humana Press Inc, Clifton, NJ.
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13. Voltaire-Carlsson et al., Detection of relapses in alcohol-dependent patients: comparison of carbohydrate-deficient transferrin in serum, 5-hydroxytryptophol in urine, and self-reports. Alcoholism: Clin. Exp. Res. 17 (1993) 703–708.
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19. Helander et al., Distinguishing ingested ethanol from microbial formation by analyzing urinary 5-hydroxytryptophol and 5-hydroxyindole acetic acid. J. For. Sci. 40 (1995) 95–98.
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21. Helander et al., Determination of 5-hydroxytryptophol in urine by high-performance liquid chromatography: application of a new post-column dervatization method with fluorometric detection. J. Pharmaceut. Biomed. Anal. 13 (1995) 651–654.
22. Helander et al., Longitudinal comparison of carboxyhydrate-deficient transferrin and γ-glutamyltransferase: complementary markers of excessive alcohol consumption. Alcohol and Alcoholism 31 (1996) 101–107.
23. Jones et al., Disclosing recent drinking after alcohol has been cleared from the body (Letter). J. Anal. Toxicol. 20 (1996) 141–142.
24. Helander et al., Laboratory testing for recent alcohol consumption: comparison of ethanol, methanol, and 5-hydroxytryptophol. Clin. Chem. 42 (1996) im Druck.

Veröffentlichungen von möglichem Interesse

25. Feldstein et al., Biogenic amines, biogenic aldehydes, and alcohol. Quarterly Journal of Studies on Alcohol. 25 (1964) 218–225.
26. Davies et al., The alteration of serotonin metabolism to 5-hydroxytryptophol by ethanol ingestion in man. J. Lab. Clin. Med. 69 (1967) 132–140.
27. Feldstein et al., 5-hydroxytryptamine metabolism in rat brain and liver homogenates. Br. J. Pharmacol. 34 (1968) 38–42.
28. Yoshimoto et al., Occurence in vivo of 5-hydroxytryptophol in the brain of rats treated with ethanol. Alcohol & Alcoholism 27 (1992) 131–136.

Review-Artikel

29. Rosman et al., Diagnostic utility of laboratory tests in alcoholic liver disease. Clin. Chem. 40 (1994) 1641–1651.
30. Conigrave et al., Diagnostic tests of alcohol consumption. Alcohol & Alcoholism 30 (1995) 13–26.
31. O'Neal et al., Postmortem production of ethanol and factors that influence interpretation. Am. J. For. Med. Path. 17 (1996) 8–20.

Claims

Antikörper mit Spezifität für 5-Hydroxytryptophol oder ein Konjugat davon.
Antikörper nach Anspruch 1 mit Spezifität für ein Glucuronid- oder Sulfat-Konjugat von 5-Hydroxytryptophol.
Antikörper nach Anspruch 1, der gegenüber freiem 5-Hydroxytryptophol oder anderen im Harn vorliegenden 5-Hydroxytryptophol-Konjugaten bevorzugt an ein Glucuronid-Konjugat von 5-Hydroxytryptophol bindet.
Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 3, der keine wesentliche Bindungsaktivität gegenüber anderen Indolen oder Glucuroniden aufweist, die in Humanproben vorliegen.
Derivat von 3-(2-Hydroxyethyl)-indol-5-O-β-D-glucopyranosiduronsäure mit einem kovalent gebundenen analytisch nachweisbaren Markierungsstoff.
Derivat nach Anspruch 5, worin der Markierungsstoff an der Carboxylgruppe gebunden ist.
Immunoassay zum Nachweis von 5-Hydroxytryptophol oder Konjugaten davon, dadurch gekennzeichnet, dass man eine das 5-Hydroxytryptophol oder die Konjugate davon enthaltende Probe mit einem Immunoassay untersucht und einen Antikörper gemäß Definition in einem der Ansprüche 1 bis 4 verwendet.
Immunoassay nach Anspruch 7, wobei es sich bei der Probe um Harn handelt.
Immunoassay nach Anspruch 7 oder 8, wobei es sich um einen kompetitiven Assay handelt.
Immunoassay nach einem der Ansprüche 7 bis 9, den man an einer von einem Probanden stammenden Probe durchführt und wobei man eine erhöhte Konzentration des 5-Hydroxytryptophols oder der untersuchten Konjugate davon, falls vorgefunden, als Hinweis auf kürzlichen Alkoholkonsum des Probanden wertet.
Immunoassay nach einem der Ansprüche 7 bis 9, den man an einer von einem Probanden stammenden Probe durchführt, wobei man eine weitere Verbindung in der gleichen Probe nachweist und wobei man das Verhältnis zwischen den vorgefundenen Konzentrationen der weiteren Verbindung und des 5-Hydroxytryptophols bzw. der Konjugate davon mit kürzlichem Alkoholkonsum des Probanden korreliert.
Immunoassay nach Anspruch 11, wobei die weitere Verbindung unter 5-Hydroxyindolessigsäure (5-HIAA) und Kreatinin ausgewählt ist.