DE10111224A1 - Analoge der Ecstasy-Klasse sowie Verwendung derselben beim Nachweis von Verbindungen der Ecstasy-Klasse - Google Patents

Analoge der Ecstasy-Klasse sowie Verwendung derselben beim Nachweis von Verbindungen der Ecstasy-Klasse

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Abstract

Die vorliegende Erfindung stellt ein System zum verbesserten Nachweis von Verbindungen der Ecstasy-Klasse in biologischen Proben zur Verfügung, wobei neue Analoge der Ecstasy-Klasse zum Nachweis solcher Drogen zur Verfügung gestellt werden. Diese Analoge sind Verbindungen oder deren Salze, eines 2-Aminomethylendioxyphenyl-(MDP)-Derivats, das an Z befestigt ist, wobei Z eine Komponente ist, die in der Lage ist, entweder direkt oder indirekt an einen immunogenen Träger, eine nachweisbare Markierung oder ein festes Einfangvehikel zu binden. Solche Analogen können verwendet werden, um Immunogene, Enzym- oder Enzymdonor-Konjugate und andere Konjugate zu konstruieren. Die Immunogene erzeugen reproduzierbare Antikörper mit einer ausgezeichneten Fähigkeit, verschiedene Drogen der Ecstasy-Klasse in biologischen Proben von potentiell störenden Substanzen zu unterscheiden. Die spezifischen Antikörper und die Konjugate können verwendet werden, um verschiedene Verbindungen der Ecstasy-Klasse in biologischen Proben wie beispielsweise jenen, die von einer Einzelperson erhalten wurden, welche des Substanzmißbrauchs verdächtigt wird, zu unterscheiden und zu messen.

Description

Hintergrund der Erfindung
Diese Erfindung betrifft im allgemeinen das Gebiet der Bestim­ mung von mißbräuchlichen Drogen in biologischen Proben. Insbe­ sondere stellt diese ein System von Derivaten, Konjugaten und spezifischen Antikörpern zur Verfügung, welche in Testsystemen zum Nachweis oder zur Quantifizierung von 3,4-Methylendioxy­ methamphetamin (MDMA), ebenfalls bekannt als Ecstasy, und anderen verwandten Verbindungen verwendet werden können.
Designerdrogen sind spezifische Derivate von gewöhnlich anzu­ treffenden mißbräuchlichen Drogen, welche in gewissen geogra­ phischen Gebieten und innerhalb bestimmter Bevölkerungsschich­ ten populär sind. Die Verwendung von Designerdrogen bringt all die Risiken mit sich, mit welchen die Verwendung von häufigeren Drogen behaftet ist, wie auch zusätzliche Risiken, in der Hinsicht, daß der Nachweis und die anschließende Behandlung durch die relative Einzigartigkeit der Designerdrogen kompli­ ziert wird. Beispielsweise könnten einige Notfallstationen nicht in der Lage sein, Designerdrogen nachzuweisen, da solchen Einrichtungen die raffinierte und teuere Instrumentation wie z. B. eine Gaschromatographie/Massenspektroskopie (GC/MS)- Ausrüstung fehlt, die zur Bestätigung eines positiven Ergebnis­ ses verwendet wird. Schnelle Screening-Verfahren wie z. B. Immuntests stehen häufiger zur Verfügung, sind leicht zu ver­ wenden und sind ökonomisch, weisen aber gewöhnlich nur eine einzige oder höchstens eine begrenzte Anzahl der am häufigsten angetroffenen Drogen nach. Somit sind sie für eine größere Klasse an Designerdrogen nicht spezifisch.
Eine solche Klasse von Designerdrogen ist die Ecstasy-Klasse. Nicht beschränkende Beispiele von Verbindungen in dieser Klasse umfassen 3,4-Methylendioxymethamphetamin (MDMA), ebenfalls bekannt als "Ecstasy", 3,4-Methylendioxyamphetamin (MDA), N- Ethyl-3,4-methylendioxyamphetamin (MDE), N-Methyl-1-(3,4-methy­ lendioxyphenyl)-2-butanamin (MBDB), 1-(3,4-Methylendioxyphe­ nyl)-2-butanamin (BDB) und andere Derivate von Amphetamin. Da die Drogendesigner mehr und mehr Varianten von Ecstasy entwic­ keln, steigt die Anzahl an einzigartigen Verbindungen, welche in die Ecstasy-Klasse fallen, kontinuierlich.
Der Nachweis von MDMA, MDA, MDE, MBDB, BDB, einer weiteren Verbindung der Ecstasy-Klasse, oder einem Derivat oder Metabo­ liten von diesen im Urin hängt derzeit von der Kreuzreaktivität solcher Drogen der Ecstasy-Klasse in Immuntests auf Amphetamin und Methamphetamin ab. Diese Tests können jedoch solche Verbin­ dungen der Ecstasy-Klasse in geringeren Konzentrationen nicht nachweisen. Darüber hinaus sind die bestehenden Immuntests auf Amphetamin und Methamphetamin durch ihre Kreuzreaktivität auf rezeptfreie Allergie- und Erkältungsmedikamente wie z. B. (±)- Ephedrin, (+)-Pseudoephedrin und Phenylpropanolamin und auf verschreibungspflichtige Diätetika wie z. B. Phentermin be­ schränkt. Dieser Kreuzreaktivitätsfaktor verhindert, daß man den Grenzwert zum Nachweis von Amphetamin und Methamphetamin senkt, was wiederum verhindert, daß Verbindungen der Ecstasy- Klasse bei geringeren Konzentrationen nachgewiesen werden. Daher wird ein Test mit einer erhöhten Spezifität für Verbin­ dungen der Ecstasy-Klasse, entweder als ein Test, um Verbindun­ gen der Ecstasy-Klasse allein nachzuweisen, oder als ein Test, um Verbindungen der Ecstasy-Klasse wie auch Amphetamin und Methamphetamin nachzuweisen, benötigt.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein System zum verbesserten Nachweis von Verbindungen der Ecstasy-Klasse in biologischen Proben zur Verfügung. Hierin werden die Begriffe "aus der Ecstasy-Klasse" und "Ecstasy-Klasse" so verwendet, daß sie sich auf eine Klasse von Verbindungen beziehen, welche, ohne auf diese beschränkt zu sein, 3,4-Methylendioxymeth-amphetamin (MDMA), 3,4-Methylendioxyamphetamin (MDA), N-Ethyl-3,4- methylendioxyamphetamin (MDE), N-Methyl-1-(3,4-methylen­ dioxyphenyl)-2-butanamin (MBDB) und 1-(3,4-Methylendioxy­ phenyl)-2-butanamin (BDB) einschließen. Wie die Durchschnitts­ fachleute erkennen werden, ist die Ecstasy-Klasse eine konstant wachsende Klasse von Drogen, da Drogendesigner fortfahren, neue, einzigartige Verbindungen zu synthetisieren, welche mittels ihrer Struktur und/oder psychedelischen Eigenschaften in die Ecstasy-Klasse fallen. Dementsprechend werden die Be­ griffe "aus der Ecstasy-Klasse" und "Ecstasy-Klasse" hierin so verwendet, daß sie sowohl Verbindungen, die schon synthetisiert wurden, als auch solche, die zukünftig synthetisiert werden, einschließen.
Ein Aspekt der Erfindung richtet sich auf Analoge der Ecstasy- Klasse. Diese Analogen können verwendet werden, um Immunogene, Antikörper, Enzym- oder Enzymdonorkonjugate und andere Konjuga­ te zu konstruieren.
Die Immunogene erzeugen reproduzierbar Antikörper mit einer ausgezeichneten Fähigkeit, verschiedene Drogen der Ecstasy- Klasse in biologischen Proben von potentiell störenden Substan­ zen zu unterscheiden. Die spezifischen Antikörper und Konjugate können verwendet werden, um verschiedene Verbindungen der Ecstasy-Klasse in biologischen Proben wie z. B. jenen von Ein­ zelpersonen, die des Drogenmißbrauchs verdächtigt werden, zu unterscheiden und zu messen. Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft bestimmte Reagenzien, Reagenskombinationen und Kits zur Durchführung von Testverfahren auf Verbindungen der Ecstasy-Klasse in einer biologischen Probe.
In Bezug auf die Analogen der Ecstasy-Klasse richtet sich ein Aspekt der Erfindung auf eine Verbindung, oder ein Salz von dieser, wobei die Verbindung ein 2-Aminomethylendioxyphenyl (MDP)-Derivat ist, das an Z befestigt ist, wobei Z eine Kompo­ nente ist, die in der Lage ist, entweder direkt oder indirekt an einen immunogenen Träger, eine nachweisbare Markierung oder ein festes Einfangvehikel (capture vehicle) zu binden.
Ein anderer Aspekt richtet sich auf eine Verbindung, oder ein Salz von dieser, wobei die Verbindung die folgende Struktur aufweist:
oder ein Salz von dieser, worin X, Q, R1, R2, R3 und R4 unab­ hängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, einer ersten Komponente, einem substituierten Derivat der ersten Komponente und L1 n-Z, unter der Vorausset­ zung, daß wenigstens einer von X, Q, R1, R2, R3 und R4 L1 n-Z ist;
wobei die erste Komponente ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einer geraden Komponente, einer verzweigten Komponente, einer cyclischen Komponente und deren Kombinatio­ nen, und die erste Komponente eine Hauptkette mit m Hauptket­ tenatomen aufweist, wobei m eine ganze Zahl ≧ 1 ist, wobei die m Hauptkettenatome unabhängig voneinander ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus Kohlenstoff, Stickstoff, Sauerstoff, Schwefel, einem nicht substituierbaren Halogenid und deren Kombinationen;
wobei L1 n ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einer zweiten Komponente und einem substituierten Derivat der zweiten Komponente;
wobei die zweite Komponente ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer geraden Komponente, einer verzweigten Komponente, einer cyclischen Komponente und deren Kombinatio­ nen, und die zweite Komponente eine Hauptkette mit n Hauptket­ tenatomen aufweist, wobei n eine ganze Zahl ≧ 0 ist, wobei die n Hauptkettenatome unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Kohlenstoff, Stickstoff, Sauerstoff, Schwefel, einem nicht substituierbaren Halogenid und deren Kombinationen; und
wobei Z eine Komponente ist, welche in der Lage ist, entweder direkt oder indirekt an einen immunogenen Träger, eine nach­ weisbare Markierung oder ein festes Einfangvehikel chemisch zu binden.
Die nachweisbare Markierung der Erfindung kann irgendeine geeignete Markierung sein, wie die Durchschnittsfachleute beim Lesen dieser Beschreibung erkennen werden. Beispielsweise kann die nachweisbare Markierung ein Radioisotop, eine fluoreszie­ rende Gruppe, eine fluoreszenzlöschende Gruppe, eine phospho­ reszierende Gruppe, eine chemilumineszente Gruppe, eine chromo­ phore Gruppe, eine chromogene Substanz, ein Pigment, ein Farb­ stoff, eine elektrochemisch aktive Gruppe, eine elektrochemilu­ mineszente Gruppe, eine Gruppe, die beim Binden eine Änderung bei der Fluoreszenz, Phosphoreszenz, Chemilumineszenz oder einer elektrochemischen Eigenschaft erfährt, ein Peptid, ein Protein, ein Proteinfragment, ein immunogener Träger, ein Enzym, ein Enzyminhibitor, ein Enzymsubstrat, ein Enzymkofak­ tor, eine prosthetische Enzymgruppe, ein Enzymdonor, ein festes Teilchen, ein magnetisches Teilchen, ein unlösliches Teilchen, ein Latexteilchen, ein Goldteilchen, eine feste Oberfläche, ein Antikörper, eine Nukleinsäure oder irgendeine geeignete Kombi­ nation solcher nachweisbaren Markierungen sein.
Der immunogene Träger kann irgendein geeignetes Material sein, welches in der Lage ist, direkt oder indirekt an die Z- Komponente einer Z-haltigen Verbindung (z. B. ein Analoges der Ecstasy-Klasse) der Erfindung zu binden, um ein Immunogen herzustellen, wie die Durchschnittsfachleute erkennen werden. Das feste Einfangvehikel der Erfindung kann ein festes Teil­ chen, eine feste Oberfläche oder eine Kombination von diesen sein. Beispielsweise kann das feste Teilchen ein magnetisches Teilchen, ein unlösliches Teilchen, ein Latexteilchen oder ein Goldteilchen sein. Ebenso kann beispielsweise die feste Ober­ fläche ein Objektträger oder eine Mikrotiterplatte sein.
Die Erfindung umfaßt ebenfalls ein Verfahren zum Erhalten eines Antikörpers, der für Verbindungen der Ecstasy-Klasse spezifisch ist, wobei das Verfahren ein Immunisieren eines Tiers oder ein Inkontaktbringen einer immunkompetenten Zelle oder eines Virus mit einem immunogenen Konjugat eines Analogen der Ecstasy- Klasse gemäß dieser Erfindung umfaßt. Das Tier kann ein Wirbel­ tier, z. B. ein Säugetier sein. Die Antikörper können in lösli­ cher Form vorliegen oder können durch Befestigung an einem festen Einfangvehikel wie z. B. einer festen Oberfläche, einem festen Träger, einem festen Teilchen oder einem unlöslichen Teilchen unlöslich gemacht werden.
Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Antikörper, welcher für Verbindungen der Ecstasy-Klasse spezifisch ist und welcher eine Kreuzreaktivität mit potentiell störenden Substan­ zen unterhalb eines gewissen Grenzwerts aufweist. Beispielswei­ se kann der Antikörper eine Kreuzreaktivität mit sowohl Ephedrin, Pseudoephedrin als auch Phenylpropanolamin von weni­ ger als 10%, bevorzugt weniger als 1% und noch bevorzugter weniger als 0,1% aufweisen. Alternativ oder zusätzlich kann der Antikörper eine Kreuzreaktivität mit jeweils Amphetamin, Methamphetamin und 4-Hydroxy-3-methoxymethamphetamin (HMMA) von weniger als ca. 1% aufweisen. Ebenfalls umfaßt von der Erfin­ dung sind Reagenssätze und Reagenssysteme, welche einen Anti­ körper, der für Verbindungen der Ecstasy-Klasse spezifisch ist, und markierte Analoge der Ecstasy-Klasse oder Konjugate mit Analogen der Ecstasy-Klasse umfassen, die in Kombination ver­ wendet werden können, um einen Immuntest auf Verbindungen der Ecstasy-Klasse durchzuführen. Somit umfaßt die Erfindung eben­ falls Immuntestreagenzien, welche ein Protein- oder Peptidkon­ jugat eines Analogen der Ecstasy-Klasse der Erfindung umfassen, wobei das Protein oder Peptid ein Enzym ist, das beim Binden des Konjugats an einen Antikörper, der für die Verbindungen der Ecstasy-Klasse spezifisch ist, eine Änderung bei der Enzymakti­ vität erfährt; oder das Protein oder Peptid ein Enzymdonor ist, wobei die Fähigkeit des Enzymdonors, sich mit einem Enzymakzep­ tor unter Bildung eines aktiven Enzymkomplexes komplementär zu ergänzen, durch die Bindung des Konjugats an einen Antikörper, welcher für die Verbindungen der Ecstasy-Klasse spezifisch ist, beeinflußt wird.
Weitere Ausführungsformen der Erfindung umfassen Immuntestver­ fahren zum Bestimmen von Verbindungen der Ecstasy-Klasse in einer Probe. Ein solches Verfahren umfaßt die Schritte des Vereinigens der Probe mit einem Antikörper, der für Verbindun­ gen der Ecstasy-Klasse spezifisch ist, unter Bedingungen, welche die Bildung eines stabilen Komplexes aus der Verbindung der Ecstasy-Klasse und dem Antikörper erlauben, und des Nach­ weisens oder Quantifizierens jegliches gebildeten Komplexes aus der Verbindung der Ecstasy-Klasse und dem Antikörper. Zusätzli­ che Schritte können ein Inkontaktbringen des Antikörpers mit einer markierten Verbindung der Ecstasy-Klasse oder einem Analogen der Ecstasy-Klasse unter Bedingungen, welche die Bildung eines stabilen Komplexes zwischen der markierten Ver­ bindung und dem Antikörper erlauben, ein Abtrennen jeglicher markierten Verbindung, die keinen stabilen Komplex bildet, und ein Messen der komplexierten oder abgetrennten Markierung als einem Maß für die Verbindung(en) der Ecstasy-Klasse in der Probe einschließen. Alternativ können die zusätzlichen Schritte einschließen: ein Inkontaktbringen des Antikörpers mit einem Enzym- oder Enzymdonorkonjugat eines Analogen der Ecstasy- Klasse unter Bedingungen, welche die Bildung eines stabilen Komplexes zwischen dem Konjugat und dem Antikörper erlauben; und ein Messen der enzymatischen Aktivität oder der Enzymkom­ plementation als einem Maß für die Verbindung(en) der Ecstasy- Klasse in der Probe. Sowohl Separations- als auch homogene Testverfahren sind von der Erfindung umfaßt.
Die vorstehenden Ausführungsformen dieser Erfindung können als Immuntestverfahren ausgelegt sein, um Verbindungen der Ecstasy- Klasse allein nachzuweisen. Alternativ können der für eine Verbindung der Ecstasy-Klasse spezifische Antikörper und das markierte Analoge der Ecstasy-Klasse mit ähnlichen Reagenzien, die zum Nachweisen von Amphetamin und Methamphetamin entworfen wurden, kombiniert werden, was zu einem Amphetamintest führt, welcher eine größere Nachweisempfindlichkeit für Designeramphe­ tamine der Ecstasy-Klasse (d. h. die Verbindungen der Ecstasy- Klasse) zeigt.
Weitere Ausführungsformen der Immuntestverfahren der Erfindung sind ein Verfahren zum Nachweisen von Verbindungen der Ecstasy- Klasse in einer Probe durch ein Inkubieren einer Reagensmi­ schung, welche die Probe, einen für Verbindungen der Ecstasy- Klasse spezifischen Antikörper und ein markiertes Analoges der Ecstasy-Klasse der Erfindung umfaßt, unter Bedingungen, welche die Bildung eines stabilen Komplexes zwischen dem Antikörper und jeglicher Verbindung(en) der Ecstasy-Klasse in der Probe erlauben, und ein Nachweisen oder Quantifizieren der Fluores­ zenz, Phosphoreszenz, Chemilumineszenz, Elektrochemilumines­ zenz, einer elektrochemischen Eigenschaft, oder irgendeiner Änderung bei diesen Eigenschaften, als einem Maß für die Ver­ bindung(en) der Ecstasy-Klasse in der Probe. Ein Analoges der Ecstasy-Klasse, das mit einem Enzym oder einem Enzymdonor konjugiert ist, kann ebenfalls in diesem Verfahren verwendet werden, wobei die Mischung ebenfalls ein Substrat für das Enzym und, wenn ein Enzymdonorkonjugat verwendet wird, einen Enzymak­ zeptor für den Enzymdonor umfaßt, wobei ein Nachweisen oder Quantifizieren der enzymatischen Umwandlung des Substrats in ein Produkt ein Maß für die Verbindungen der Ecstasy-Klasse in der Probe ist. Ein geeignetes Enzym ist β-Galactosidase; wenn eine Enzymdonor/Enzymakzeptorkombination verwendet wird, ist ein nützlicher Enzymdonor/Enzymakzeptorkomplex ein solcher, der β-Galactosidaseaktivität aufweist.
Die Erfindung umfaßt ebenfalls ein Verfahren zum Anreichern von Verbindungen der Ecstasy-Klasse aus einer biologischen Probe, welches ein Inkubieren der Probe mit einem für Verbindungen der Ecstasy-Klasse spezifischen Antikörper unter Bedingungen, welche erlauben, daß der Antikörper an jegliche Verbindungen der Ecstasy-Klasse in der Probe bindet, um einen Komplex zu bilden, und ein Abtrennen des Komplexes, welcher sich gebildet hat, von anderen Bestandteilen der Probe umfaßt. Der Antikörper kann an ein festes Einfangvehikel (z. B. einen festen Träger, eine feste Oberfläche, ein festes Teilchen oder ein unlösliches Teilchen) gebunden werden, in welchem Fall auf die Abtrennung des unlöslich gemachten Komplexes aus dem Antikörper und der Verbindung der Ecstasy-Klasse ein Waschen des unlöslich gemach­ ten Komplexes und dann eine Elution des an den Antikörper gebundenen Materials folgt. Nachdem die Lösung im Hinblick auf die Verbindung(en) der Ecstasy-Klasse angereichert wurde, kann diese auf jegliche erhaltene(n) Verbindung(en) der Ecstasy- Klasse getestet werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnung
Die Figur ist ein graphische Darstellung einer Standardkurve für eine Verbindung der Ecstasy-Klasse.
Detaillierte Beschreibung von bevorzugten Ausführungsformen
Auf jedes der Dokumente (Patente, Patentanmeldungen, Zeit­ schriftenartikel, Texte, andere Publikationen usw.), die nach­ folgend in dieser detaillierten Beschreibung zitiert werden, wird hiermit vollinhaltlich Bezug genommen.
Die vorliegende Erfindung konzentriert sich zum Teil auf die Gestaltung und Herstellung von Analogen der Ecstasy-Klasse, welche dann zur Herstellung von Immunogenen und Konjugaten verwendet werden können, die in Immuntests zur Bestimmung von Verbindungen der Ecstasy-Klasse nützlich sind. Die Analogen der Ecstasy-Klasse werden durch Verbindungen oder deren Salze dargestellt, wobei die Verbindungen die Kombination aus einem 2-Aminomethylendioxyphenyl (MDP)-Derivat und Z sind, wobei Z eine Komponente ist, die entweder direkt oder indirekt an einen immunogenen Träger, eine nachweisbare Markierung oder ein festes Einfangvehikel binden kann.
Ein solches Analoges der Ecstasy-Klasse kann durch die folgende Struktur dargestellt werden:
oder ein Salz von dieser,
worin X, Q, R1, R2, R3 und R4 unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, einer ersten Komponente, einem substituierten Derivat der ersten Komponente und L1 n-Z, unter der Voraussetzung, daß wenigstens einer von X, Q, R1, R2, R3 und R4 L1 n-Z ist;
wobei die erste Komponente ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einer geraden Komponente, einer verzweigten Komponente, einer cyclischen Komponente und deren Kombinatio­ nen, und die erste Komponente eine Hauptkette mit m Hauptket­ tenatomen aufweist, wobei m eine ganze Zahl ≧ 1 ist, wobei die m Hauptkettenatome unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Kohlenstoff, Stickstoff, Sauerstoff, Schwefel, einem nicht substituierbaren Halogenid und deren Kombinationen;
wobei L1 n ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einer zweiten Komponente und einem substituierten Derivat der zweiten Komponente;
wobei die zweite Komponente ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einer geraden Komponente, einer verzweigten Komponente, einer cyclischen Komponente, und deren Kombinatio­ nen, und die zweite Komponente eine Hauptkette von n Hauptket­ tenatomen aufweist, wobei n eine ganze Zahl ≧ 0 ist, wobei die n Hauptkettenatome unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Kohlenstoff, Stickstoff, Sauerstoff, Schwefel, einem nicht substituierbaren Halogenid und deren Kombinationen; und
wobei Z eine Komponente ist, die entweder direkt oder indirekt chemisch an einen immunogenen Träger, eine nachweisbare Markie­ rung oder ein festes Einfangvehikel binden kann.
Die Analogen der Ecstasy-Klasse (hierin ebenfalls bezeichnet als "Analoge" oder "Analoges") dieser Erfindung können entweder in der gezeigten Form oder z. B. als interner Standard oder kompetitiv bindende Verbindung in einem Testsystem verwendet werden. Sie können ebenfalls weiter angepaßt werden. Beispiels­ weise können sie durch kovalente Befestigung an einer festen Oberfläche oder einem unlöslichen Teilchen unlöslich gemacht werden, wie weiter unten in dieser Anmeldung beschrieben wird. Alternativ können sie zur Verwendung in einem Testsystem ange­ paßt werden, indem daran kovalent eine Markierung, entweder direkt oder über eine kovalente Verknüpfungsgruppe, befestigt wird. Geeignete Markierungen umfassen Radioisotope wie z. B. 125I, eine fluoreszierende Gruppe, eine fluoreszenzlöschende Gruppe, eine phosphoreszierende Gruppe, eine chemilumineszente Gruppe, eine elektrochemisch aktive Gruppe, eine elektrochemi­ lumineszente Gruppe, irgendeine Gruppe, die beim Binden eine Änderung bei der Fluoreszenz, Phosphoreszenz, Chemilumineszenz oder einer elektrochemischen Eigenschaft erfährt, ein Enzym oder einen Enzymdonor, einen Enzyminhibitor, ein Enzymsubstrat, einen Enzymcofaktor und ein prosthetische Enzymgruppe. Die Analogen können zur Verwendung in Agglutinationsreaktionen an Latexteilchen befestigt werden; die Latexteilchen können licht- undurchlässig sein oder einen Fluorophor oder Farbstoff enthal­ ten. Die Analogen können ebenfalls an kolloidalem Gold befe­ stigt werden. Beispiele für diese Tests werden in den US- Patenten Nr. 5 120 643 und 5 334 538 und in Price und Newman, "Light Scattering Immunoassay", Principles and Practice of Immunoassay, (Price und Newmann, Herausgeber), New York: Stock­ ton Press, 1991, Seiten 446 bis 481 beschrieben.
Eine Derivatisierung mit Aminomethylfluorescein wird in dem US- Patent Nr. 4 614 823 gelehrt. Enzym und Enzymdonoren werden in den Testbeschreibungen, die folgen, beschrieben. Die Analogen können ebenfalls als Immunogene ausgelegt werden, indem diese mit einer immunogenen Substanz konjugiert werden, für welche Proteine wie z. B. Napfschneckenhämocyanin (keyhole limpet hemocyanin, KLH) ein Beispiel sind.
"Poly(aminosäuren)", "Proteine", "Peptide" und "Polypeptide" sind Begriffe, die hierin austauschbar verwendet werden, um Polymere von Aminosäuren jeglicher Sequenz, mit typischerweise wenigstens fünf Aminosäuren in der Länge, die durch Peptidbin­ dungen verknüpft sind, zu beschreiben. Einige Beispiele umfas­ sen Proteine, z. B. Enzyme und Enzymdonorpolypeptide, die als immunogene Träger verwendet werden können, und Proteine, die ein nachweisbares Signal für Testzwecke liefern.
Konjugate zwischen Analogen und jeglichem Typ von Protein oder Peptid, wie z. B. einem Enzym, Enzymfragment oder immunogenen Protein, können unter Verwendung irgendeiner geeigneten Ver­ knüpfungschemie hergestellt werden. Der Leser wird im allge­ meinen auf Hermanson, G. T., "Bioconjugate Techniques", Aca­ demic Press: New York, 1996; und "Chemistry of Protein Conjuga­ tion and Cross-linking" von S. S. Wong, CRC Press, 1993 verwie­ sen.
Obwohl die Erfindung nicht darauf beschränkt ist, ist es be­ quem, Proteine und andere Substituenten über den 2- Aminostickstoff in dem Analogen zu befestigen. Ein funktionaler Abstandhalter kann eingeführt werden, welcher die Zugänglich­ keit zu dem Derivat erlaubt, wenn es konjugiert ist.
Der Ausdruck "ein Linker, welcher wenigstens ein Kohlenstoffa­ tom enthält" soll sich auf irgendeine generische Verknüpfungs­ gruppe zwischen zwei anderen Gruppen, z. B. einen Linker zwi­ schen Hapten und Protein oder einen Linker zwischen Hapten und einer funktionellen Gruppe, die zur Befestigung an einem ande­ ren Molekül geeignet ist, beziehen, welche wenigstens ein Koh­ lenstoffatom enthält. Die Linker-Gruppe kann eine C1-C20- Kohlenwasserstoffkette sein, die 0 bis 10 Heteroatome enthält, welche ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus N, O und S, und welche wenigstens soviele Kohlenstoffatome wie Heteroa­ tome enthält. Beispiele für solche generischen Verknüpfungs­ gruppen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, -O- (CH2CH2O)n-, wobei n eine ganze Zahl zwischen 1 und 10 ist (d. h. ein Polyethylenglycollinker); -CH2CH2-Phenyl-CH2CH2- (in ortho-, meta- oder para-Verknüpfung); -CH2CH2-CONH-CH2CH2- (d. h. eine Amidverknüpfung), -C(=O)-CHS-NH- (d. h. ein Aminosäu­ relinker, wobei S eine natürlich oder nicht natürlich auftre­ tende Aminosäureseitenkette ist) oder in der Tat irgendeine geradkettige, verzweigte, cyclische oder Kombination einer geradkettigen, verzweigten oder cyclischen Verknüpfungsgruppe, die als eine kovalente Verknüpfung zwischen den zwei anderen Gruppen dienen kann. Ein weiteres Beispiel sind C1-C20 Alkyl­ gruppen.
Konjugate aus Analogem und Protein werden typischerweiser hergestellt, indem das Analoge mit einer proteinreaktiven Gruppe synthetisiert wird, das modifizierte Derivat mit dem Protein unter Bedingungen inkubiert wird, die erlauben, daß die Konjugationsreaktion auftritt, und dann das Konjugat abgetrennt wird. Beispielsweise kann ein Proteinkonjugat hergestellt werden, indem ein Überschuß eines Maleinimidaddukts mit einem Protein mit freien Thiolgruppen vereinigt wird. Freie Sulfhy­ drylgruppen können in Form von freien Cysteinresten bereitge­ stellt werden oder indem Proteindisulfidbindungen durch ein Reagens wie z. B. Dithiothreitol reduziert werden. Alternativ können Thiolgruppen an ein Protein mit freien primären Amino­ gruppen addiert werden, indem diese mit 2-Iminothiolan (IT) in einem wäßrigen Puffer umgesetzt werden, worauf ein Entfernen von nicht umgesetztem IT folgt. Eine detaillierte Vorschrift für die Thiolierung des Proteins KLH wird in dem US-Patent Nr. 5 439 798 angegeben.
Um spezifische Antikörper gegen Analoge der Ecstasy-Klasse zu erhalten, kann ein Konjugat aus Analogem und Protein dieser Erfindung eine Mehrzahl von Analogen kovalent gebunden an einen immunogenen Proteinträger umfassen, welcher im Hinblick auf seine Fähigkeit ausgewählt wurde, eine allgemein immunstimula­ torische Wirkung zu liefern. Verschieden Proteinträger können eingesetzt werden, einschließlich Serumalbumin, Serumglobuli­ nen, Okularlinsenproteinen, Lipoproteinen, Ovalbumin, throxin­ bindendem Globulin und synthetischen Polypeptiden. Auf Wunsch kann KLH verwendet werden.
Der Begriff "Antikörper", wie er in dieser Offenbarung verwen­ det wird, bezieht sich sowohl auf polyklonale als auch monoklo­ nale Antikörper und verwandte Antigenerkennungseinheiten. Der Umfang dieses Begriffs umfaßt bewußt nicht nur intakte Immun­ globulinmolküle, sondern ebenfalls solche Fragmente und Deriva­ te von Immunglobulinmolekülen, wie sie durch Techniken herge­ stellt werden können, die im Stand der Technik bekannt sind, und welche die Antikörperaktivität eines intakten Immunglobu­ lins beibehalten. In diesem Zusammenhang bezieht sich "Antikör­ peraktivität" auf die Fähigkeit eines Antikörpers, ein spezifi­ sches Antigen bevorzugt gegenüber anderen potentiellen Antige­ nen über die Antigenkombinationsstelle, die innerhalb eines variablen Bereichs eines Immunglobulins lokalisiert ist, zu binden. Fragmente und andere Derivate von Immunglobulinen können durch Verfahren der Standardproteinchemie, wie z. B. ein Unterwerfen des Antikörpers unter eine Spaltung mit einem proteolytischen Enzym wie Pepsin, Papain oder Trypsin, und ein Reduzieren der Disulfidbindungen mit solchen Reagenzien wie Dithiothreitol, hergestellt werden. Gentechnisch veränderte Varianten des intakten Immunglobulins können hergestellt wer­ den, indem ein Polynukleotid erhalten wird, welches den Anti­ körper codiert, und die allgemeinen Verfahren der Molkularbio­ logie angewendet werden, um codierende Sequenzen zu spleißen oder Mutationen einzuführen und die Variante zu translatieren. Beispiele für gentechnisch hergestellte Antikörpervarianten umfassen chimäre und humanisierte Antikörper, Fab-ähnliche Fragmente, Einzelkettenfragmente des variablen Bereichs (scFv), und Diabodies.
Im Hinblick auf die allgemeinen Techniken, die beim Hervorru­ fen, Reinigen und Modifizieren von Antikörpern und der Planung und Ausführung von Immuntests verwendet werden, wird der Leser auf das Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir & C. C. Blackwell, Herausgeber); CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY (J. E. Coligan et al., Herausgeber, 1991); David Wild, Herausgeber, The Immunoassay Handbook (Stockton Press NY, 1994); und R. Masseyeff, W. H. Albert und N. A. Staines, Herausgeber, Methods of Immunological Analysis (Weinheim: VHC Verlagsgesellschaft mbH, 1993) verwiesen.
Die polyklonalen Antikörper dieser Erfindung werden durch Verabreichung der immunogenen Analog-Protein-Konjugate an einen tierischen Wirt, gewöhnlich gemischt mit einem Adjuvans, her­ vorgerufen. Jeder tierische Wirt, welcher Antikörper produ­ ziert, kann verwendet werden, wobei ein Beispiel ein Wirbeltier wie z. B. ein Säugetier ist. Das Immunogen wird geeigneterweise zur Injektion vorbereitet, indem lyophilisiertes Immunogen rehydratisiert wird, um eine Lösung oder Suspension zu bilden. Beispielhafte Adjuvanzien sind Wasser-in-Öl-Immersionen, z. B. Freund's vollständiges Adjuvans zur ersten Verabreichung und Freund's unvollständiges Adjuvans für Verstärkungsdosen. Die Präparation wird typischerweise an einer Vielzahl von Stellen und typischerweise in zwei oder mehr Dosen über einen Zeitraum von wenigstens vier Wochen verabreicht. Das Serum wird geerntet und auf das Vorliegen eines Antikörpers gegen eine Verbindung der Ecstasy-Klasse getestet, wobei in einem Standardimmuntest oder einer Präzipitationsreaktion ein Konjugat aus der Verbin­ dung der Ecstasy-Klasse und einem Protein oder ein Analoges verwendet wird.
Polyklonale Antiseren werden typischerweise Antikörper enthal­ ten, welche nicht mit einer Verbindung der Ecstasy-Klasse reagieren können, als auch Antikörper gegen eine Verbindung der Ecstasy-Klasse, die mit anderen Substanzen einschließlich Amphetamin, Methamphetamin und HMMA kreuzreaktiv sind. Verfah­ ren zur Reinigung spezifischer Antikörper aus einem polyklona­ lem Antiserum sind im Stand der Technik bekannt. Ein solches Verfahren ist eine Affinitätsreinigung unter Verwendung einer Säule einer Verbindung der Ecstasy-Klasse, die mit einer festen Phase konjugiert ist. Eine Art der Herstellung einer Säule mit einer Verbindung der Ecstasy-Klasse ist es, eine Verbindung der Ecstasy-Klasse oder ein Analoges dieser Erfindung mit einem Protein zu konjugieren, das von dem Protein, das in dem Immuno­ gen verwendet wird, verschieden ist, und dann das Konjugat an einem kommerziell erhältlichen aktivierten Harz wie z. B. CNBr- aktivierter SEPHAROSE™ zu befestigen. Der Antikörper gegen die Verbindung der Ecstasy-Klasse wird über die Säule geleitet, die Säule wird gewaschen, und der Antikörper wird mit einem milden denaturierenden Puffer wie z. B. 0,1 M Glycin, 0,2 M NaCl, pH 2,5 eluiert.
Die monoklonalen Antikörper dieser Erfindung können durch eine Anzahl verschiedener Techniken hergestellt werden, die im Stand der Technik bekannt sind. Im Hinblick auf die Hybridomtechnolo­ gie wird der Leser im allgemeinen auf Harrow & Iane (1988), die US-Patente Nr. 4 491 632, 4 472 500 und 4 444 887 und auf Methods in Enzymology, 73B: 3 (1981) verwiesen. Der häufigste Weg, monoklonale Antikörper zu produzieren, ist es, eine Milz­ zelle oder eine andere Antikörper-produzierende Zelle, die aus einem Tier gewonnen wurde, das wie vorher beschrieben mit einer Verbindung der Ecstasy-Klasse immunisiert wurde, zu immortali­ sieren und zu klonieren. Der Klon wird durch ein Verfahren wie z. B. eine Fusion mit einem nicht produzierenden Myelom, durch ein Transfizieren mit Epstein-Barr-Virus oder ein Transformie­ ren mit onkogener DNA immortalisiert. Die behandelten Zellen werden kloniert und kultiviert, und Klone werden ausgewählt, welche einen Antikörper mit der gewünschten Spezifität produ­ zieren. Tests auf die Spezifität werden durch eine Anzahl von Techniken mit Kulturüberständen durchgeführt, beispielsweise indem das immunisierende Antigen in einem Immuntest als das Nachweisreagens verwendet wird. Ein Vorrat des monoklonalen Antikörpers aus dem ausgewählten Klon kann dann aus einem großen Volumen des Kulturüberstands oder aus der Ascitesflüs­ sigkeit von geeignet präparierten Wirtstieren, denen der Klon injiziert wurde, gereinigt werden. Der Antikörper kann im rohen Überstand oder im Ascites auf Aktivität hin getestet werden, und er wird ggf. unter Verwendung von standardmäßigen biochemi­ schen Präparationstechniken wie z. B. Ammoniumsulfatfällung, Ionenaustauschchromatographie und Gelfiltrationschromatograpie gereinigt.
Alternative Verfahren zum Erhalten von Antikörpern beinhalten ein Inkontaktbringen einer immunkompetenten Zelle oder eines viralen Teilchens mit einem Analog-Protein-Komplex dieser Erfindung in vitro. In diesem Zusammenhang bedeutet "immunkom­ petent", daß die Zelle oder das Teilchen in der Lage ist, einen Antikörper zu exprimieren, der für das Antigen spezifisch ist, ohne daß eine weitere genetische Umordnung nötig ist, und daß dieser aus einer Zellmischung durch Präsentation des Antigens selektioniert werden kann. Immunkompetente eukaryotische Zellen können aus einem immunisierten Säugetierdonor geerntet werden, oder sie können aus einem nicht immunisierten Donor geerntet werden und in vitro prästimuliert werden, indem diese in Gegen­ wart von Immunogen und immunstimulatorischen Wachstumsfaktoren kultiviert werden. Zellen der gewünschten Spezifität können durch ein Inkontaktbringen mit dem Immunogen unter Kulturbedin­ gungen, die zu der Proliferation der spezifischen Klone, nicht aber der unspezifischen Klone führen, selektioniert werden. Immunkompetente Phagen können konstruiert werden, um die Im­ munglobulinabschnitte des variablen Bereichs auf ihrer Oberflä­ che zu exprimieren. Siehe Marks et al., New Engl. J. Med. 335: 730, 1996; WO Patentschriften 94/13804, 92/01047 und 90/02809; und McGuinness et al., Nature Biotechnol. 14: 1149, 1996. Ein Phage mit der gewünschten Spezifität kann beispiels­ weise durch ein Haften an einem Komplex aus einer Verbindung der Ecstasy-Klasse und einem Protein, welcher an einer festen Phase befestigt ist, selektioniert werden und dann in E. coli amplifiziert werden.
Antikörper, die unter Verwendung irgendeiner der oben erwähnten Techniken erhalten wurden, werden nicht nur im Hinblick auf ihre Fähigkeit, mit einer Verbindung der Ecstasy-Klasse zu reagieren, sondern ebenfalls im Hinblick auf eine geringe Kreuzreaktivität mit potentiell störenden Substanzen hin ge­ screened oder gereinigt. Die "Kreuzreaktivität" wird in einem quantitativen Immuntest bestimmt, indem unter Verwendung be­ kannter Verdünnungen des Zielanalyten, z. B. MDMA, eine Stan­ dardkurve aufgenommen wird. Die Standardkurve wird dann verwen­ det, um die apparente Konzentration der störenden Substanz zu berechnen, die in verschiedenen bekannten Mengen in Proben vorlag, die unter ähnlichen Bedingungen getestet wurden. Die Kreuzreaktivität ist die apparente Konzentration, geteilt durch die tatsächliche Konzentration, multipliziert mit 100. Ein Immuntest zum Bestimmen der Kreuzreaktivität ist ein Test vom Typ CEDIA®, welcher ein ED28-(MD-MDA)2-Donorpolypeptid verwen­ det, wie im Detail in Beispiel 10 beschrieben wird. Alternativ kann die Kreuzreaktivität in demselben Typ von Immuntests bestimmt werden, in welchem der Antikörper schließlich verwen­ det wird.
Es lohnt sich im allgemeinen, Antikörper auf eine Kreuzreakti­ vität mit anderen pharmazeutischen Verbindungen zu screenen, die Patienten begleitend einnehmen können, insbesondere jene, die im Urin ausgeschieden werden und eine Struktur aufweisen, die eine gewisse Ähnlichkeit mit Verbindungen der Ecstasy- Klasse aufweist. Von besonderem Interesse sind die rezeptfreien Allergie- und Erkältungsmedikamente wie z. B. (±)-Ephedrin, (+)-Pseudoephedrin und Phenylpropanolamin. Wenn die für die Ecstasy-Klasse spezifischen Reagenzien in Kombination mit Reagenzien zum Nachweis von Amphetamin und Methamphetamin verwendet werden sollen, ist zusätzlich eine geringe Kreuzreak­ tivität gegenüber diesen rezeptfreien Allergie- und Erkältungs­ medikamenten erwünscht, um die Wechselwirkung zwischen den verschiedenen Reagenzien zu verringern und somit die Testpla­ nung und Formulierung zu vereinfachen.
Antikörper gegen Verbindungen der Ecstasy-Klasse gemäß dieser Erfindung sind nützlich zum Nachweis von Verbindungen der Ecstasy-Klasse und zum Reinigen von Verbindungen der Ecstasy- Klasse aus einer Mischung. Eine Reinigung von Verbindungen der Ecstasy-Klasse unter Verwendung eines Antikörpers in Immunaffi­ nitätstechniken ist nützlich bei der Isolierung präparativer Mengen von Verbindungen der Ecstasy-Klasse aus Verunreinigun­ gen, die durch andere Techniken mitgereinigt werden. Eine Reinigung von Verbindungen der Ecstasy-Klasse in Spurenmengen aus klinischen Proben ist wünschenswert, wenn die Proben poten­ tiell eine Substanz enthalten, die keine Verbindung der Ecstasy-Klasse ist, aber die Ablesung in dem Nachweissystem komplizieren kann. Beispielsweise erfordern die GC/MS-Tests im allgemeinen eine Extraktion des Analyten aus der wäßrigen Probe. Eine gängige Extraktion aus der flüssigen oder festen Phase kann hohe Hintergrundsignale und eine schlechte Nach­ weisempfindlichkeit ergeben. Eine Analyten-spezifische Immun­ adsorption verbessert das Ausmaß der Selektion und konzen­ triert ebenfalls den Analyten in einem kleineren Volumen als dem der ursprünglichen Probe.
Mögliche Verfahren der Immunaffinitätsreinigung umfassen eine Präzipitation mit doppeltem Antikörper, eine Präzipitation mit Protein A und die Bildung anderer Typen von Antikörper- Konjugaten. Ein solches Verfahren ist die Festphasenadsorption. Der Antikörper wird an irgendeinem geeigneten Harz befestigt, die ursprüngliche Probe wird mit dem Harz in Kontakt gebracht, das Harz wird gewaschen und die Probe wird eluiert. Bevorzugte Harze umfassen: Sepharose® (Pharmacia), Poros®-Harze (Roche Molcular Biochemicals, Indianapolis), Actigel Superflow™-Harze (Sterogene Bioseparations Inc., Carlsbad CA) und Dynabeads™ (Dynal Inc., Lake Success, NY).
Ein Kopplungsverfahren ist wie folgt: Die benötigte Menge an aktivierter Sepharose® wird gewogen, wobei das gewünschte Kopplungsverhältnis und die Tatsache berücksichtigt werden, daß 1 g gefriergetrocknetes Material zu einem Gelvolumen von 3,5 ml aufquillt. Das Gel wird rekonstituiert und in einem Waschpuffer (1 mM HCl) (3 ml und dann 200 ml pro Gramm) gewaschen, und dann in einem Kopplungspuffer (0,1 M NaHCO3, 0,5 M NaCl, pH 8,3) (50 ml pro Gramm) gewaschen, wobei ein Buchner-Trichter verwendet wird. Der Antikörper wird in dem Kopplungspuffer gelöst oder dorthinein ausgetauscht, und 5-10 mg werden pro ml gekoppelt. Der Gelkuchen wird in einen Behälter mit geeigneter Größe überführt, der Antikörper wird zugegeben, und das Volumen wird so eingestellt, daß sich eine 50%-ige Aufschlämmung ergibt. Die Suspension wird für 2 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 2 bis 8°C End-über-End gemischt. (Ein Rühren wird vermieden, um ein Scheren der Kügelchen zu verhindern.) Der Anteil des Anti­ körpers, welcher erfolgreich gekoppelt wurde, wird bestimmt, indem A280 vor und nach dem Koppeln gemessen wird. Dann wird ein Blockierpuffer zugegeben (1 M Ethanolamin, pH 8,0, oder 0,2 M Trispuffer, pH 8,0), und die Suspension wird für weitere 2 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 2 bis 8°C End-über-End gemischt. Das Gel wird in einem Buchner-Trichter mit Kopplungs­ puffer, einem zweiten Waschpuffer (0,1 M Acetat, 0,5 M NaCl, pH 4,0) und dann Kopplungspuffer (jeweils 100 ml pro Gramm) gewa­ schen. Das Affinitätsharz kann dann mit präparierter inakti­ vierter Sepharose® 4B verdünnt werden, um die gewünschte Bin­ dungskapazität zu ergeben.
Harze dieser Art werden typischerweise unter gekühlten Bedin­ gungen oder in Gegenwart eines Konservierungsmittels wie z. B. 0,1% Natriumazid konserviert. Eine Trennung kann durch Säulen­ chromatographie oder eine chargenweise Elution durchgeführt werden. Bei einem typischen Trennverfahren werden 10 ml einer Probe, die auf das Vorliegen einer Verbindung der Ecstasy- Klasse hin getestet wird (wie z. B. eine Urinprobe von einem menschlichen Patienten), mit 200 µl einer 50%-igen Aufschläm­ mung des Harzes gegen eine Verbindung der Ecstasy-Klasse verei­ nigt. Die Reaktion und Extraktion kann bequem in einem koni­ schen Probenbehälter mit einem durch eine Kappe abgedeckten 10 ml Vorrat, der am Boden mit einer Fritte und einer zugestopften Spitze ausgerüstet ist, durchgeführt werden. Eine kleine Menge an Puffer kann ebenfalls zu der Probe zugegeben werden, wenn der Antikörper gegenüber einer pH-Änderung zwischen den Proben empfindlich ist. Die Mischung wird dann mit der Kappe abge­ deckt, und das Harz wird für ca. 30 bis 120 min auf einem Plattform-Schüttler oder Rotator in Suspension gehalten. Das Harz wird von der Probe getrennt (z. B. durch Filtration oder Zentrifugation) und mit 10 ml phosphatgepufferter Salzlösung und dann zweimal mit Wasser gewaschen. Nach der letzten Wäsche wird das Harz trockengesaugt, indem für 2-5 s ein Vakuum ange­ legt wird. 1 ml Methanol wird dann zugegeben, das Harz wird für ~2-5 min inkubiert, und das Methanol wird zurückgewonnen. Das Methanoleluat kann dann auf das Vorliegen von Verbindungen der Ecstasy-Klasse hin charakterisiert werden, was mit dem Vorlie­ gen von Verbindungen der Ecstasy-Klasse in der ursprünglichen Probe korreliert. Eine erfolgreiche Elution kann bestätigt werden, indem parallel Extraktionen mit Proben laufengelassen werden, welche Standardmengen einer Verbindung der Ecstasy- Klasse enthalten, oder indem ein interner Standard, wie z. B. eine kreuzreaktive Substanz oder ein stabiler Isotop-markierter interner Standard, in die Probe eingeschlossen wird. Analoge der Ecstasy-Klasse, welche zu diesem Zweck geeignet sind, wurden vorher in dieser Anmeldung beschrieben.
Umfaßt von dieser Erfindung sind Immuntestverfahren auf das Vorliegen von Verbindungen der Ecstasy-Klasse in einer interes­ sierenden Probe, einschließlich, aber nicht begrenzt auf Kör­ perflüssigkeiten von Patienten, die in dem Verdacht stehen, MDMA ("Ecstasy") oder eine verwandte Droge genommen zu haben, z. B. Körperflüssigkeiten von Menschen. Geeignete Proben umfas­ sen biologische Proben, die von Patienten entnommen wurden, welche gegebenenfalls verdünnt oder modifiziert wurden, um den Test zu erleichtern, experimentelle Proben, die durch irgendein chemisches oder biologisches Verfahren erzeugt wurden, und Standards, die bekannte Konzentrationen einer bestimmten Ver­ bindung der Ecstasy-Klasse oder einer anderen Substanz(en) enthalten, die zur Eichung des Tests verwendet werden.
Nach Wunsch können die flüssigen biologischen Proben Urin, Serum, Plasma und Flüssigkeiten, die während einer Autopsie entnommen werden (wie z. B. Cerebrospinalflüssigkeit), ein­ schließen. Gewebeproben können für einen Immuntest in ein flüssiges Medium extrahiert werden. Haarproben können ebenfalls getestet werden, indem diese in ein flüssiges Medium extrahiert werden. Beispielsweise kann das Haar in der Luft und Aceton gewaschen werden, um Öle zu entfernen, getrocknet werden und dann in einer Kugelmühle pulverisiert werden. 20-30 mg pulveri­ siertes Haar werden dann für ca. 5 h bei 40°C in einem neutra­ len Puffer inkubiert. Ebenso geeignet sind postmortale Cere­ brospinalflüssigkeit oder Glaskörperflüssigkeit. Schweißproben können erhalten werden, indem beispielsweise ein PharmChek- Schweißpflaster (Sudormed, Santa Ana, CA) verwendet wird, welches einen Semi-Okklusivverband umfaßt, der aus einem Cellu­ lose-Löschpapier-Sammelkissen für medizinische Zwecke besteht, das von einer dünnen Schicht Polyurethan und Acrylat- Klebstoffen bedeckt ist. Am Ende der Tragdauer wird das Kissen mit einem geeigneten Puffer, wie z. B. 2,5 ml 0,2 M Acetatpuffer mit Methanol bei pH 5,0 (25: 75), Fogerson et al., J. Anal. Toxicol. 21: 451, 1997, oder mit Acetonitril eluiert.
In den meisten Fällen beinhalten die Tests die Verwendung eines Antikörpers, welcher gegen ein Analog-Protein-Konjugat dieser Erfindung hervorgerufen wurde oder welcher die charakteristi­ schen Eigenschaften eines solchen Antikörpers aufweist.
Das Verfahren erfordert ein Vereinigen der Probe mit dem Anti­ körper unter Bedingungen, welche die Bildung eines stabilen Komplexes zwischen der Substanz, die getestet werden soll (hierin beschrieben als der "Analyt" und typischerweise eine bestimmte Verbindung der Ecstasy-Klasse), und dem Antikörper erlauben. Darauf folgt ein Nachweisen jegliches gebildeten Komplexes aus einer Verbindung der Ecstasy-Klasse und einem Antikörper. Ein "stabiler Komplex" ist ein Komplex zwischen Antikörper und Analyten (typischerweise nicht kovalent assozi­ iert), welcher wenigstens so lange bestehen bleibt, wie es dauert, das Vorliegen des Komplexes durch das geplante Verfah­ ren zu messen.
Tests dieser Erfindung umfassen sowohl qualitative als auch quantitative Tests. Typische quantitative Verfahren beinhalten ein Mischen des Analyten mit einer vorbestimmten Menge des Reagensantikörpers und ein Korrelieren der Menge des gebildeten Komplexes mit der Menge des Analyten in der ursprünglichen Probe, indem eine Beziehung verwendet wird, die unter Verwen­ dung von Standardproben festgestellt wurde, die bekannte Mengen des Analyten in dem Bereich enthielten, der für die zu testende Probe erwartet wurde. Bei einem qualitativen Test macht eine hinreichende Menge an Komplex ober- oder unterhalb eines Grenz­ wertes, der durch Proben aufgestellt wurde, von denen bekannt war, daß sie den Analyten enthielten oder davon frei waren, das Testergebnis aus. Wenn nichts anderes angegeben ist, bezieht sich der Vorgang des "Messens" oder "Bestimmens", wie in dieser Anmeldung verwendet, sowohl auf die qualitative als auch die quantitative Bestimmung.
Die Tests dieser Erfindung umfassen sowohl auf einer Trennung basierende als auch homogene Tests. Bei den auf einer Trennung basierenden Tests beinhaltet das Nachweisen des Komplexes ein Verfahren, worin der gebildete Komplex physisch von entweder dem nicht umgesetzten Analyten, dem nicht umgesetzten Antikör­ per oder beiden abgetrennt wird. Siehe z. B. US-Patent Nr. 3 646 346. Der Komplex kann zuerst in der Flüssigkeitsphase gebildet werden und dann anschließend durch ein Festphasenreagens einge­ fangen werden oder auf der Grundlage einer veränderten physika­ lischen oder chemischen Eigenschaft, wie beispielsweise durch Gelfiltration oder Präzipitation, abgetrennt werden. Alternativ kann eines der Reagenzien an einer festen Phase befestigt werden, bevor es mit anderen Reagenzien in Kontakt gebracht wird, und dann kann der Komplex gewonnen werden, indem die feste Phase von nicht umgesetzten Reagenzien freigewaschen wird. Auf einer Trennung basierende Tests beinhalten typischer­ weise die Verwendung eines markierten Analogen oder eines Antikörpers, um den Nachweis oder die Quantifizierung des Komplexes zu erleichtern. Geeignete Markierungen sind Radioiso­ tope wie z. B. 125I, Enzyme wie z. B. Peroxidase und β- Galactosidase und fluoreszierende Markierungen wie z. B.) Fluo­ resceinisothiocyanat. Der Trennungsschritt beinhaltet ein Entfernen des markierten Reagenzes, das in Komplexform vor­ liegt, von dem nicht umgesetzten markierten Reagens. Die Menge der Markierung in dem Komplex kann direkt gemessen werden oder aus der Menge, die nicht umgesetzt zurückbleibt, abgeleitet werden.
Bei homogenen Tests wird der Komplex typischerweise nicht von nicht umgesetzten Reaktionskomponenten abgetrennt, sondern stattdessen wird das Vorliegen des Komplexes durch eine Eigen­ schaft nachgewiesen, welche wenigstens einer der Reaktanden als eine Folge des Einbaus in den Komplex erwirbt oder verliert. Homogene Tests, die im Stand der Technik bekannt sind, umfassen Systeme, die Paare aus Fluorochrom und Fluorochrom-Löscher auf unterschiedlichen Reagenzien (US-Patente Nr. 3 996 345, 4 161 515, 4 256 834 und 4 261 968); Paare aus Enzym und Enzyminhibi­ tor auf unterschiedlichen Reagenzien (US-Patente Nr. 4 208 479, 4 233 401, 3 817 837 und das Europäische Patent EP 165 716) Latex-Trübungsinhibitionstests (Price und Newman "Light Scatte­ ring Immunoassay", Principles and Practice of Immunoassay (Price und Newman, Herausgeber), New York: Stockton Press, 1991, Seiten 446-481); Paare aus Chromophor und Chromophor- Modifikator auf unterschiedlichen Reagenzien (US-Patent Nr. 4 208 479); und Immuntests mit kloniertem Enzymdonor einschlie­ ßen.
Nützliche Markierungen zur Verwendung bei den Analogen dieser Erfindung für Immuntesttechniken umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Radioisotope, eine fluoreszierende Gruppe, eine Fluoreszenz-löschende Gruppe, eine phosphoreszierende Gruppe, eine chemilumineszente Gruppe, eine elektrochemisch aktive Gruppe, eine elektrochemilumineszente Gruppe, irgendeine Grup­ pe, die beim Binden eine Änderung bei der Fluoreszenz, Phospho­ reszenz, Chemilumineszenz oder einer elektrochemischen Eigen­ schaft erfährt, ein Enzym, einen Enzymdonor, einen Enzyminhibi­ tor, ein Enzymsubstrat, einen Enzymcofaktor und eine prostheti­ sche Enzymgruppe.
Die Tests dieser Erfindung umfassen sowohl Sandwich- als auch Kompetitionstests. Sandwichtests beinhalten typischerweise die Bildung eines Komplexes, bei welchem der zu messende Analyt sandwichartig zwischen einem Reagens, wie z. B. einem ersten Antikörper, der schließlich für die Abtrennung des Komplexes verwendet wird, und einem anderen Reagens, wie z. B. einem zweiten Antikörper, welcher als eine Markierung für den abge­ trennten Komplex verwendet wird, liegt. Kompetitionstests beinhalten ein System, bei welchem der zu messende Analyt mit einem Analogen des Analyten um die Bindung an ein anderes Reagens, wie z. B. einen Antikörper, konkurriert. CEDIA® ist ein Beispiel für einen Kompetitionstest. Umfaßt von der Erfindung sind ebenfalls Tests, die weder Sandwich- noch Kompetition­ stests sind, wie gewisse Tests, die eine Immunpräzipitation beinhalten.
Für Verbindungen der Ecstasy-Klasse spezifische Immuntests, die Antikörper gegen eine Verbindung der Ecstasy-Klasse dieser Erfindung verwenden, werden mit Hilfe der Spezifität des Anti­ körpers spezifisch gemacht. Für Tests, die weiterhin Protein­ konjugate einsetzen, wie z. B. in dem Fall, wo ein Hapten (d. h. eine Verbindung der Ecstasy-Klasse oder ein Analoges) mit einem Enzympolypeptid markiert wird, kann das Hapten durch irgendein geeignetes Verfahren an dem Proteinkonjugat befestigt werden. Bei gewissen Ausführungsformen wird die Chemie, die hierin zur Bildung von immunogenen Proteinkonjugaten von Analogen be­ schrieben wird, ebenfalls verwendet, um das Proteinkonjugat herzustellen, das als ein Testreagens verwendet wird. Auf diese Weise wird der Haptenkern dem Antikörper in ungefähr derselben Orientierung wie während des Immunisierungsereignisses präsen­ tiert, als der Antikörper erzeugt wurde.
Die Testverfahren dieser Erfindung umfassen homogene Enzym­ tests, in welchen eine Verbindung der Ecstasy-Klasse oder ein Analoges mit einem aktiven Enzym konjugiert werden. Die Konju­ gation wird so eingerichtet, daß die Bindung eines Antikörpers gegen eine Verbindung der Ecstasy-Klasse an das Analoge die enzymatische Aktivität auf eine quantitative Weise beeinflußt. Wenn eine Probe, die eine Verbindung der Ecstasy-Klasse ent­ hält, mit dem Antikörper vorgemischt wird, komplexiert der Antikörper mit der Verbindung der Ecstasy-Klasse und wird an einer Bindung an das Enzymkonjugat gehindert. Auf diese Weise kann die Aktivität des Enzyms mit der Menge einer Verbindung der Ecstasy-Klasse, die in der Probe vorliegt, korreliert werden. Von Enzymamplifikationstests wird in dem US-Patent Nr. 3 852 157 berichtet.
Enzymkomplementationstests werden allgemein in dem US-Patent Nr. 4 708 929 beschrieben. Verwandte Reagenzien und Methoden werden in den US-Patenten Nr. 5 254 577, 5 444 161, 5 464 747 und 5 514 560 gelehrt. Immuntests mit einem klonierten Enzymdo­ nor für Procainamid und N-Acetylprocainamid (NAPA) werden in den US-Patenten Nr. 5 439 798 und 5 525 474 beschrieben. Zu Zwecken der Weiterverfolgung von Patenten in den USA wird auf die oben aufgelisteten Patente hiermit vollständig Bezug genom­ men. Enzymkomplementationstests, die auf dem Enzym β-Galacto­ sidase basieren, sind unter der eingetragenen Marke CEDIA® leicht kommerziell erhältlich. Der Leser wird für weitere Informationen auf die CEDIA®-Produktblätter und technische Handbücher verwiesen.
Typischerweise beinhaltet ein Enzymkomplementationsimmuntest dieser Erfindung ein Vereinigen der Probe mit: einem für eine Verbindung der Ecstasy-Klasse spezifischen Antikörper; einem Enzymdonorpolypeptid-Konjugat; einem Enzymakzeptorpolypeptid (worin das Enzymakzeptorpolypeptid in der Lage ist, mit dem Enzymdonorpolypeptid-Konjugat in Abwesenheit eines Antikörpers gegen Verbindungen der Ecstasy-Klasse einen aktiven Enzymkom­ plex zu bilden); und einem Substrat, das in der Lage ist, durch den aktiven Enzymkomplex in ein Produkt umgewandelt zu werden. Die Menge des Produkts wird dann gewöhnlich als eine Funktion der Zeit gemessen.
Für die Zwecke von Komplementationstests ist der für eine Verbindung der Ecstasy-Klasse spezifische Antikörper vorzugs­ weise ein Antikörper, der gegen ein Analog/Protein-Konjugat dieser Erfindung hervorgerufen wurde oder der die charakteri­ stischen Eigenschaften eines solchen Antikörpers aufweist. Außer, daß diese auf eine Kreuzreaktivität hin gescreent wur­ den, weisen wünschenswerte Antikörper drei andere Merkmale auf. Eines, welches als "Inhibition" bezeichnet wird, bezieht sich darauf, wie gut der Antikörper das Enzymdonor-Konjugat bindet und die Bildung aktiver β-Galactosidase blockiert (inhibiert). Eine ausreichende Inhibition (vorzugsweise wenigstens ca. 70%) wird benötigt, um ein angemessenes Signal zu liefern. Ein zweites Kriterium ist der Titer des Antikörpers, welcher benö­ tigt wird, um das gewünschte Inhibitionsniveau zu erhalten, wobei eine Inhibition bei niedrigeren Antikörperniveaus wün­ schenswert ist. Ein drittes Kriterium, welches als "Modulation" bezeichnet wird, bezieht sich darauf, wie gut der Analyt der Probe in der Lage ist, mit dem Konjugat um die Enzymbindung zu konkurrieren. Die Modulation wird als der Unterschied bei der Enzymgeschwindigkeit zwischen einer Probe, die eine vorgegebene Konzentration des Analyten aufweist, und einer Probe, die keinen Analyten enthält, geteilt durch die Geschwindigkeit bei der vorgegebenen Konzentration des Analyten, berechnet. Eine bessere Modulation bei der Zielkonzentration für den Entschei­ dungspunkt positiv/negativ (d. h. "den Grenzwert" des Tests) korreliert bei Konzentrationen in der Nähe des Grenzwerts mit einer besseren Testempfindlichkeit und -genauigkeit.
Das Enzymdonor-Enzymakzeptor-Paar ist ein Paar von Poly­ peptiden, welche sich spontan im Reagenspuffer unter Bildung eines aktiven Enzymkomplexes zusammenfügen. Der aktive Enzym­ komplex ist in der Lage, ein Substrat enzymatisch in ein Pro­ dukt umzuwandeln, das unterschiedlich nachgewiesen wird. Typi­ scherweise hat das Produkt eine andere Farbe als das Substrat und kann in einem Spektrophotometer quantifiziert werden. Das Paar aus Donor und Akzeptor sind typischerweise zwei funktiona­ le Untereinheiten eines gemeinsamen Enzyms. Die Untereinheiten können in dem nativen Enzym nicht kovalent assoziiert sein oder sie können Defektversionen eines gemeinsamen Polypeptids sein, die einander ergänzen, wenn sie zusammen vorliegen.
Nach Wunsch können Enzymdonor- und Enzymakzeptorpolypeptide auf dem Enzym β-Galactosidasepolypeptid basieren. Ein "β- Galactosidasepolypeptid" ist ein Polypeptid, das auf der Grund­ lage seiner Aminosäuresequenz oder der enzymatischen Aktivität dahingehend identifizierbar ist, daß es sich aus einem Enzym mit β-Galactosidaseaktivität entwickelt hat. Die Definition umfaßt nicht nur natürlich auftretende β-Galactosidase, sondern ebenfalls Fragmente, Deletionsmutanten, Fusionsproteine, Mutan­ ten und andere darauf basierende Varianten, welche durch solche Verfahren wie enzymatische Fragmentierung und Gentechnologie mit den relevanten codierenden Sequenzen erhalten wurden. Besondere β-Galactosidasepolypeptide werden in den oben aufge­ listeten US-Patentanmeldungen beschrieben, welche sich auf Immuntests mit kloniertem Enzymdonor beziehen.
β-Galactosidase-Enzymakzeptoren können über eine Deletions­ mutante des β-Galactosidasegens produziert werden. EA22 weist z. B. eine Deletion der Aminosäurereste 13-40 auf. Andere Enzy­ makzeptorfragmente von β-Galactosidase, welche die natürliche Sequenz enthalten, welche die Aminosäureposition 602 ein­ schließt, können ebenfalls verwendet werden. Andere Beispiele umfassen EA5, 3A11, EA14, EA17, EA18, EA20, EA23 und EA24. Das distale Ende des deletierten Segments liegt normalerweise zwischen den Aminosäurepositionen 26 und 54 der β- Galactosidasesequenz. Bei EA22 ist das distale Ende des Deleti­ onssegments die Aminosäure 40. Ein anderer β-Galactosidase- Enzymdonor ist ED28. ED28 ist ein Peptid mit 90 Aminosäuren, welches die Reste 6-45 von β-Galactosidase enthält, wobei Cysteine an den Positionen 1 und 46 (in Bezug auf die Nummerie­ rung des ursprünglichen β-Galactosidasefragments) vorliegen. Die Sequenz von ED28 ist (SEQ ID NR. 1) Met-Asp-Pro-Ser-Gly- Asn-Pro-Tyr-Gly-Ile-Asp-Pro-Thr-Gln-Ser-Ser-Pro-Gly-Asn-Ile- Asp-Pro-Cys-Ala-Ser-Ser-Asn-Ser-Leu-Ala-Val-Val-Leu-Gln-Arg- Arg-Asp-Trp-Glu-Asn-Pro-Gly-Val-Thr-Gln-Leu-Asn-Arg-Leu-Ala- Ala-His-Pro-Pro-Phe-Ala-Ser-Trp-Arg-Asn-Ser-Glu-Glu-Ala-Arg- Thr-Asp-Cys-Pro-Ser-Gln-Gln-Leu-Ala-Gln-Pro-Glu-Trp-Gly-Leu- Glu-Ser-Arg-Ser-Ala-Gly-Met-Pro-Leu-Glu; siehe ebenfalls die Europäische Patentanmeldung Nr. 90 308 937.3 und die US-Patente Nr. 4 708 929, 5 444 161 und 5 763 196. Die zwei Cysteinreste können zur genauen und reproduzierbaren Plazierung von Sulfhy­ dryl-reaktiven Addukten einer Verbindung der Ecstasy-Klasse oder eines Analogen verwendet werden, wie vorher beschrieben wurde. Vor der Konjugation mit dem Hapten wird das reduzierende Reagens, welches normalerweise bei der Lagerung von ED28 ver­ wendet wird, durch eine geeignete Entsalzungstechnik, wie z. B. auf einer Pharmacia NAP5™-Säule, wie in dem US-Patent Nr. 5 439 798 beschrieben wird, entfernt. Die Verbindung der Ecstasy- Klasse oder das Analoge wird dann mit Maleinimid-Addukten konjugiert, wie an anderer Stelle in dieser Anmeldung beschrie­ ben wird. Eine Anpassung der Verknüpfung kann durchgeführt werden, indem die Enzyminhibition durch einen für eine Verbin­ dung der Ecstasy-Klasse spezifischen Antikörper überwacht wird. Typische verwendete Linkergruppen sind Maleinimid-Addukte, wobei der Maleinimidstickstoff und der Stickstoff der Verbin­ dung der Ecstasy-Klasse oder der Stickstoff des Analogen durch -(CH2CH2)- verknüpft sind.
Beispielhafte Substrate zur Verwendung in Immuntests, die auf β-Galactosidase basieren, umfassen jene, die in den US-Patenten Nr. 5 032 503, 5 254 677, 5 444 161 und 5 514 560 beschrieben werden. Ein solches Substrat ist Chlorphenolrot-β-D- galactopyranosid. Eine Optimierung der Merkmale und Bedingungen der Tests, welche von dieser Erfindung umfaßt sind, ist eine Sache von Routineversuchen, die ein Durchschnittsfachmann kennt.
Reagenzien und Puffer, die in den Tests dieser Erfindung ver­ wendet werden, können getrennt oder in Kombination in Form von Kits verpackt werden, um den Vertrieb zu erleichtern. Die Reagenzien werden in geeigneten Behältern zur Verfügung ge­ stellt und werden typischerweise in einer Verpackung, zusammen mit schriftlichen Anleitungen, die sich auf die Testverfahren beziehen, zur Verfügung gestellt.
Die Analogen und die spezifischen Antikörper dieser Erfindung können durch Befestigung an einem festen Einfangvehikel unlös­ lich gemacht werden. Dieses kann beispielweise an der Wand eines Gefäßes sein, an einem Feststoffteilchen oder an einem Träger mit großem Molekulargewicht, der in Suspension gehalten werden kann, aber durch physikochemische Mittel wie z. B. durch Zentrifugation oder Mikrofiltration entfernt werden kann. Die Befestigung muß nicht kovalent sein, ist aber zumindest von ausreichender Beständigkeit, um jegliche Trenntechniken (ein­ schließlich Wäschen) auszuhalten, die Teil der Testverfahren sind. Geeignete partikuläre Materialien umfassen Agarose, Polystyrol, Cellulose, Polyacrylamid, Latexteilchen, magneti­ sche Teilchen und fixierte rote Zellen. Geeignete, kommerziell erhältliche Matrizes umfassen Sepharose® (Pharmacia), Poros®- Harze (Roche Molcular Biochemicals, Indianapolis), Actigel Superflow™-Harze (Sterogene Bioseparations Inc., Carlsbad CA) und Dynabeads™ (Dynal Inc., Lake Success, NY). Die Wahl ist nicht kritisch und hängt im allgemeinen von solchen Merkmalen wie Stabilität, Kapazität, Zugänglichkeit des gekoppelten Antikörpers, Flussgeschwindigkeit, der Fähigkeit, das Harz in der Reaktionsmischung zu dispergieren, und der Leichtigkeit der Trennung ab.
Geeignete Ansätze zur Befestigung der Substanz auf der festen Oberfläche hängen von dem Wesen des Analogen oder des Antikör­ pers und der festen Phase ab. Befestigungssysteme umfassen jene, die in der folgenden Tabelle gezeigt sind:
Tabelle 1
Konjugationschemie
Beispielsweise können Antikörper, die durch Chromatographie über eine Protein A-Affinitätschromatographie gereinigt wurden, wie von dem Hersteller empfohlen an mit Cyanbromid aktivierter Sepharose® CL-4B (Pharmacia, Piscataway, NJ) befestigt werden. Das Harz wird so präpariert, daß es ungefähr 0,8 mg gebundenen Antikörper pro ml Harzbettvolumen enthält. Das Verfahren kann wie folgt durchgeführt werden: Die benötigte Menge an aktivier­ ter Sepharose® wird gewogen, wobei berücksichtigt wird, daß 1 g gefriergetrocknetes Material zu einem Gelvolumen von 3,5 ml aufquillt. Das Gel wird rekonstituiert und im Waschpuffer (1 mM HCl) (3 Zyklen einer Harzwäsche, bei 200 ml pro Gramm) gewa­ schen und dann dreimal mit Kopplungspuffer (0,1 M NaHCO3, 0,5 M NaCl, pH 8,3) (50 ml pro Gramm) gewaschen, indem ein Buchner- Trichter verwendet wird. Der Antikörper wird in Kopplungspuffer gelöst oder ausgetauscht, und es werden 5-10 mg pro ml gekop­ pelt. Der Gelkuchen wird in einen Behälter mit geeigneter Größe überführt, der Antikörper wird zugegeben, und das Volumen wird so eingestellt, daß eine 50%-ige Aufschlämmung erzeugt wird. Die Suspension wird für 2 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 2 bis 8°C End-über-End gemischt. (Ein Rühren wird vermie­ den, um ein Scheren der Kügelchen zu verhindern). Der Anteil des Antikörpers, der erfolgreich gekoppelt wurde, kann durch ein Messen von A280 vor und nach der Kopplung bestimmt werden. Dann wird Blockierungspuffer zugegeben (1 M Ethanolamin, pH 8,0, oder 0,2 M Trispuffer, pH 8,0), und die Suspension wird für weitere 2 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 2 bis 8°C End-über-End gemischt. Das Gel wird in einem Buchner- Trichter mit Kopplungspuffer, einem zweiten Waschpuffer (0,1 M Acetat, 0,5 M NaCl, pH 4,0) und dann Kopplungspuffer (jeweils 100 ml pro Gramm) gewaschen. Nach der letzten Wäsche mit Kopp­ lungspuffer wird das Harz mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS, pH 7,4, 0,09% Natriumazid) in eine 50%-ige (v/v) Auf­ schlämmung überführt. Das präparierte Affinitätsharz kann gegebenenfalls mit einer 50%-igen (v/v) Aufschlämmung inakti­ vierter Sepharose® 4B verdünnt werden, um die gewünschte Bin­ dungskapazität zu ergeben.
Natürlich können Antikörper, die zu einer Unlöslichkeit führen sollen, nach anderen Kriterien ausgewählt werden als die, die zu Testzwecken verwendet werden. Eine Modulation ist nicht, aber eine hohe Kapazität (oder Affinität) und eine geringe Kreuzreaktivität mit potentiell störenden Substanzen, wie z. B. Amphetamin und Methamphetamin, ist für einen Festphasenantikör­ per wünschenswert. Ein Antikörper, welcher für Verbindungen der Ecstasy-Klasse spezifisch ist und zur Verwendung als ein unlös­ lich gemachter Antikörper geeignet ist, wurde erhalten und weist die Laborbezeichnung 1A9 auf.
Ein unlöslich gemachtes Antigen kann in Tests für den Antikör­ per verwendet werden, und ein unlöslich gemachter Antikörper kann in Tests für das Immunogen Verwendet werden. Markierungs­ verfahren und Prinzipien verschiedener Typen von Immuntests wurden vorher in dieser Offenbarung angegeben. Bei einem Fest­ phasentest wird die Testprobe typischerweise mit der festen Phase gemischt, um ein Binden jeglicher Testsubstanz zu erlau­ ben. Dann wird die feste Phase von der Probe und von jeglichem nicht-gebundenem Material abgetrennt, und die feste Phase wird gewaschen. Der nächste Schritt ist es, jegliche Substanz an der festen Phase zu bestimmen, die aus der Probe gebunden hat. Dieses kann durchgeführt werden, indem in die Reaktionsmischung ein markiertes Äquivalent des Analyten oder des Antikörpers, auf welchen getestet wird, eingeschlossen wird und die Menge des Analyten oder Antikörpers durch Kompetition bestimmt wird. Ein solches Verfahren wird in dem US-Patent Nr. 4 551 426 beschrieben. Alternativ kann die feste Phase in einem Sandwich­ format verwendet werden, indem das gewaschene Harz mit einem Nachweismittel umgesetzt wird, das in der Lage ist, jegliche Substanz zu bestimmen, die das Harz spezifisch gebunden hat.
Unlöslich gemachtes Antigen und Antikörper können ebenfalls zu Zwecken der Reinigung oder Anreicherung von Substanzen, welche diese binden, als Affinitätsharze verwendet werden. Das Verfah­ ren umfaßt ein Inkubieren des unlöslich gemachten Antigens oder Antikörpers mit dem Ausgangsmaterial unter Bedingungen, welche eine Bindung der Substanz erlauben, ein Entfernen des Ausgangs­ materials, gegebenenfalls ein Waschen der festen Phase und dann ein Gewinnen der gebundenen Substanz. Materialien, die mittels Antigen-Antikörper-Reaktivität binden, können im allgemeinen unter Verwendung organischer Lösungsmittel, Puffer mit hohem oder niedrigem pH (wie z. B. verdünnter Essigsäure oder Glycin­ puffer, pH 2,4), hohem Salzgehalt (wie z. B. einer gepufferten Lösung von 1 M KSCN) oder organischen Lösungsmitteln (wie z. B. Methanol) eluiert werden.
Bei einer Abwandlung hiervon können ein unlöslich gemachtes Antigen oder ein Antikörper verwendet werden, um eine Probe vor einem Testen in einem Testsystem vorzubehandeln. Wenn bei­ spielsweise eine Probe im Test auf eine Verbindung der Ecstasy- Klasse positiv ist, kann diese mit einer geeigneten Menge des Harzes gegen eine Verbindung der Ecstasy-Klasse behandelt werden und dann erneut getestet werden. Das Testergebnis wird als positiv bestätigt, wenn das Harz darin erfolgreich ist, den nachweisbaren Analyten aus dem Harz zu entfernen. Eine Weiter­ entwicklung des Adsorptionsverfahrens zur Durchführung eines bestätigenden Tests wird in der Internationalen Patentanmeldung WO 98/26644 beschrieben.
Bei einer anderen Variation wird das Harz nicht verwendet, um den Analyten aus der Probe zu eliminieren, sondern um diese damit anzureichern. Ein System besteht aus einem Probenextrak­ tionskit aus der ImmunElute™-Produktserie von Microgenics. Ein Antikörper gegen Verbindungen der Ecstasy-Klasse mit den ge­ wünschten Spezifitätscharakteristika wird, wie schon beschrie­ ben, an Agarose gekoppelt. Das Harz wird als eine Suspension von 5 ml (50% Vol/Vol) in einem geeigneten Puffer, welcher 0,1% Natriumazid als Konservierungsmittel enthält, zur Verfügung gestellt. Der Kit enthält ebenfalls Polyprepsäulen mit jeweils 10 ml, die jeweils oben Kappen und an dem Ausfluß am Boden unterhalb der Fritte oder des Filters, welche das Harz an Ort und Stelle halten, entfernbare Stopfen aufweisen.
Um die Affinitätsanreicherung durchzuführen, wird die biologi­ sche Probe, wenn nötig, durch Zentrifugation oder Filtration aufgeklart, um eine Trübung zu entfernen. Eine negative Kon­ trolle und Standards werden hergestellt, indem von Analyten freies Urin zur Verfügung gestellt wird, in verschiedene Teströhrchen aufgeteilt wird und bekannte Mengen des Analyten über den erwarteten Bereich hinweg zugegeben werden. Die Kon­ trolle, die Standards und die Testproben (Volumina bis zu ~10 ml) werden dann auf eine entsprechende Extraktionssäule ge­ schichtet. Wenn dieses passend ist und gewünscht wird, kann eine interne Kontrolle in jede Probe eingeschlossen werden, solange die Kontrollsubstanz ebenfalls von dem Antikörper erkannt wird und weder die Extraktion noch den Test stört. Gewisse Analoge gemäß dieser Erfindung sind für diesen Zweck geeignet. Das Harz wird gemischt, um eine gleichmäßige Suspen­ sion zur Verfügung zu stellen, und 200 µl Suspension werden zu jeder Probensäule zugegeben. Die Säulen werden dann mit Kappen verschlossen und für 30 bis 120 min auf einem Schüttler ge­ mischt und anschließend mit dem dünnen Ende nach unten in ein geeignetes Gestell gestellt. Der Stopfen wird entfernt, und die Säule wird trockenlaufen gelassen. Das Harz wird gewaschen (z. B. 10 ml phosphatgepufferte Salzlösung, gefolgt von zweimal 10 ml deionisiertem und destilliertem Wasser). Nach einem Trocknen des Harzes unter einem schwachen Vakuum wird die Probe dann eluiert. Um dieses zu erreichen, wird die Säule erneut verstopft. 10 ml eines geeigneten Elutionslösungsmittels, wie z. B. Methanol, werden auf die Säule pipettiert, und diese wird 2-5 min stehen gelassen. Dann wird der Stopfen entfernt und das Methanol wird am Boden der Säule eluiert. Der Methanolextrakt kann dann durch ein geeignetes Verfahren, wie z. B. GC/MS, getestet werden. Alternativ kann ein Aliquot in einem wäßrigen Puffer verdünnt und durch einen Immuntest getestet werden.
Eine zusätzliche Erläuterung der Entwicklung und der Verwendung der Reagenzien und Tests gemäß dieser Erfindung wird in dem nachstehenden Abschnitt der Beispiele angegeben. Die Beispiele werden als ein weiterer Leitfaden für den Praktiker mit durch­ schnittlichem Fachwissen angegeben und sollen in keiner Weise als beschränkend aufgefaßt werden.
Beispiele Beispiel 1 Herstellung von 3,4-Methylendioxyphenylaceton (3,4-MDPA)
Wasserstoffperoxid (70 ml, 30%) wurde vorsichtig zu einer Lösung von Ameisensäure (350 ml, 88%) in einem Dreihalskolben (1 l) zugegeben, welcher mit laufendem Wasser gekühlt wurde. Isosafrol (72 ml) wurde tropfenweise über einen Tropftrichter zu der Reaktionsmischung bei einer solchen Geschwindigkeit zugegeben, daß die Temperatur der Reaktionsmischung unterhalb von 35°C gehalten wurde. Nach Abschluß der Zugabe von Isosafrol wurde eine nicht-homogene Lösung erhalten. An diesem Punkt wurde Aceton (200 ml) zu der Reaktionsmischung bei einer sol­ chen Geschwindigkeit zugegeben, daß die Temperatur unterhalb von 35°C gehalten wurde. Die Reaktion wurde über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen. Das Lösungsmittel wurde durch einen Rotationsverdampfer entfernt, welcher mit einer Trocken­ eis-Aceton-Kältefalle, einer Hochvakuumpumpe und einem Wasser­ bad ausgestattet war, dessen Temperatur 30°C nicht überschritt. Ethyläther (500 ml) wurde zu dem Rückstand zugegeben. Die Lösung wurde in einen Scheidetrichter überführt. Die organische Phase wurde mit Natriumbicarbonat (0,1 N, 2 × 500 ml) und Wasser (3 × 300 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde in einen Rundkolben überführt. Das Lösungsmittel wurde durch Rotationsverdampfung entfernt. Konzentriert Schwefelsäure (75 ml) wurde tropfenweise in Wasser (425 ml) verdünnt. Methanol (160 ml) wurde zu dem öligen Rückstand zugegeben und gemischt, um eine homogene Lösung zu erhalten. Die Schwefelsäurelösung wurde zu der methanolischen Reaktionsmischung zugegeben. Der Kolben wurde mit einem wassergekühlten Rückflußkühler und einem Heizmantel ausgerüstet. Die Reaktionsmischung wurde für vier Stunden unter Rückfluß erhitzt. Der Heizmantel wurde entfernt, und gestoßenes Eis (150 g) wurde zu der Reaktionsmischung zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde in einen Scheidetrichter überführt und mit Ethylether (1 × 350 ml, 1 × 150 ml und 1 × 100 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit Wasser (3 × 150 ml) gewaschen. Natriumhydroxid (40 ml, 0,1 N) wurde in Wasser (360 ml) verdünnt. Die organische Phase wurde mit verdünntem Natriumhydroxid (2 × 200 ml, 10 mM) und gesättigter Natriumchloridlösung (100 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde mit wasserfreiem Natriumsulfat (20 g) über Nacht getrocknet. Das Trockenmittel wurde abfiltriert und der Kuchen wurde mit Ethylether (2 × 10 ml) gewaschen. Das Lösungsmittel wurde durch Rotationsverdampfung entfernt. Das Produkt wurde bei verringertem Druck (2-0,5 mmHg) destil­ liert. Die zweite Fraktion, welche bei 90-100°C (~ 1 mmHg) destilliert wurde, enthielt das Produkt. Das Produkt wurde durch EI/MS mit einem m/z von 182 identifiziert. Das Infra­ rotspektrum (cm-1) zeigte Streckungen bei 1714 (C=O) und 2898 (C-H), welche dem Produkt entsprachen.
Beispiel 2 Herstellung von 1-N-tert-Butoxycarbonyl-1,4- diaminobutan (N-boc-DAB)
Dichlormethan (75 ml) wurde zu einem 250 ml-Rundkolben zugege­ ben. Ein trockener und sauberer Magnetrührer wurde in den Reaktionskolben zugegeben. 1,4-Diaminobutan (4,7 g) wurde in den Reaktionskolben zugegeben. Der Reaktionskolben wurde in Eis für 15 Minuten gekühlt. Di-tert-butyldicarbonat (2,75 g) wurde in Dichlormethan (25 ml) gelöst, und dann in einen Flüssig­ keitszugabetrichter überführt. Die Di-tert-butyldicarbonat­ lösung wurde tropfenweise über einen Zeitraum von einer Stunde zu der Reaktion zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht rühren gelassen. Die Reaktionsmischung wurde mit Natrium­ hydroxid (3 × 50 ml, 0,1 N), Wasser (2 × 50 ml) und gesättigter Natriumchloridlösung (2 × 25 ml) gewaschen. Das Produkt wurde durch Blitzsäulenchromatographie auf Kieselgel (Lösungsmittel: Dichlormethan/Methanol/Ammoniumhydroxid; 60/40/3 v/v/v) gerei­ nigt. Der Hauptfleck mit einem Rf = 0,3 und mit positiver Reaktion auf Ninhydrin-Spray entsprach dem Produkt. Die Frak­ tionen, welche das Produkt enthielten, wurden zusammengefaßt, und das Lösungsmittel wurde entfernt. 1,9 g Produkt wurden nach Trocknen unter Hochvakuum über Nacht erhalten.
Beispiel 3 Herstellung von N-(4'-tert-Butoxycarbonyl­ aminobutyl)-3,4-methylendioxyamphetamin (N-boc- AB-PWA)
3,4-MDPA (1,3 g) wurde in Isopropylalkohol (1 ml) in einem 10 ml- Rundkolben gelöst. N-boc-DAB (1,5 g) wurde in Isopropylalko­ hol gelöst und zu der Reaktionsmischung zugegeben. HgCl2 (50 mg) wurde in einem separaten Behälter in absolutem Ethanol (2 ­ ml) gelöst. Isopropylalkohol (7 ml) wurde zu der HgCl2-Lösung zugegeben. Die HgCl2-Lösung wurde zu der Reaktionsmischung zugegeben. Aluminiumfolie (0,9 g) wurde in kleinen Stücken zu der Reaktionsmischung zugegeben. Die Reaktion wurde durch Erwärmen gestartet, wobei ein Wärmebrenner (heat gun) verwendet wurde. Der Beginn der Reaktion fiel mit der Erzeugung kleiner Wasserstoffbläschen zusammen. Nach einem vollständigen Ver­ schwinden der Aluminiumfolie wurde die Reaktion für 30 min stehen gelassen. An diesem Punkt wies die Reaktionsmischung ein Erscheinungsbild einer grauen Aufschlämmung auf. Methanol (25 ml) wurde zu der Reaktionsmischung zugegeben. Die Reaktionsmi­ schung wurde zuerst durch ein rauhes Filterpapier, dann über einen Celitkuchen filtriert. Das Lösungsmittel wurde durch Rotationsverdampfung entfernt. Ein klarer öliger Rückstand wurde erhalten. Eine Analyse durch Dünnschichtchromatographie (DSC) auf Kieselgelplatten mit einem fluoreszierenden Indikator zeigt ein Produkt bei einem Rf = 0,3 (Lösungsmitel: Dichlor­ methan/Methanol/Triethylamin; 93/7/1; v/v/v). Das Produkt wurde durch Blitzchromatographie gereinigt. Geeignete Fraktionen wurden zusammengefaßt, und das Produkt wurde durch DSC als ein einzelner Fleck isoliert. Das Produkt wog nach Trocknen 1,2 g.
Beispiel 4 Herstellung von N-(4'-Aminobutyl)-3,4-methylen­ dioxyamphetamin (AB-MDA)
N-boc-AB-MDA (300 mg) wurde in Trifluoressigsäure (2 ml) in einem bernsteinfarbigen Glasfläschchen gelöst. Ein Magnetrührer wurde zu der Reaktionsmischung zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde für eine Stunde gerührt. TFA wurde unter vermindertem Druck entfernt. Das fast weiße feste Produkt wurde bis zur weiteren Verwendung beim -80°C gelagert.
Beispiel 5 Herstellung von 4'-Maleinimidobutyl-3,4-methy­ lendioxyamphetamin (MB-MDA)
AB-MDA (51 mg) wurde in Tetrahydrofuran (2,5 ml) gelöst. Gesät­ tigte Natriumbicarbonatlösung (1,5 ml) wurde zu der Reaktions­ mischung zugegeben. Methoxycarbonylmaleinimid (17 mg) wurde zu der Reaktionsmischung zugegeben. Ein Magnetrührer mit geeigne­ ter Größe wurde zu der Reaktionsmischung zugegeben. Die Reakti­ onsmischung wurde für zwei Stunden gerührt. An diesem Punkt war die Reaktion vollständig. Wasser (15 ml) und Ethylacetat (25 ml) wurden zu der Reaktionsmischung zugegeben. Die Mischung wurde in einen Scheidetrichter überführt. Die organische Phase wurde mit Wasser (10 ml) und einer gesättigten Natriumchlorid­ lösung (15 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat (2 g) getrocknet. Das Lösungsmittel wurde durch Rotationsverdampfung entfernt. Das Produkt wurde durch HPLC gereinigt, wobei Wasser und Acetonitril (beide enthielten 0,1% TFA) als mobile Phase verwendet wurden. Eine semipräparative C4-Säule wurde als stationäre Phase verwendet. Der Hauptpeak (Rt = 14 min) wurde gesammelt und lyophilisiert. Dieses ergab 18,4 mg des Produkts.
Massenspektrum (EI), m/z 329 (M-1), 315 (M-15), 195 (M-135) 1H-NMR(CD3OD), δ (ppm), 6,83 (s,2H, =CH-), 6,69-6,79 (m, 3H, Ar- H), 5,9 (s, 2H, O-CH 2-O-), 3,55 (t, 3H, Ar-CH 2-), 3,41 (m, 1H, N-CH-), 3,06 (m, 4H, N-CH 2-), 1,67 (m, 4H, -CH 2-), 1,21 (d, 3H, -CH 3).
Beispiel 6 Herstellung des ED28-(MB-MDA)2-Konjugats
Eine Lösung von MB-MDA (0,2 mg) in Acetonitril (HPLC-Grad, 0,2 ml) wurde zu einer Lösung von entsalztem ED28 (1 mg) in Natri­ umphosphatpuffer (2,0 ml, 100 mM, pH 7,0) zugegeben. Die Reak­ tion wurde für eine Stunde bei Raumtemperatur stehen gelassen. Das Konjugat wurde durch HPLC unter Verwendung von Wasser und Acetonitril (beide enthielten 0,1% TFA) als mobile Phase gereinigt. Eine halbpräparative C4-Säule wurde als stationäre Phase verwendet. Das Konjugat eluierte bei Rt = 20,4 min, wobei ein linearer Stufengradient von 20 bis 40% Acetonitril in 20 min bei einer Laufzeit von 25 min verwendet wurde. Die Flußge­ schwindigkeit betrug 4 ml pro min. Die Reinigung wurde bei 280 nm überwacht. Das Produkt wurde unter Verwendung von OD280 und ε280 = 22.600 cm-1M-1 auf 0,9 mg quantifiziert.
Beispiel 7 Herstellung eines Immunogens der Ecstasy-Klasse
Napfschneckenhämocyanin (KLH, 20 mg, Pierce chemicals) wurde in Natriumphosphatpuffer (2 ml, 100 mM, pH = 8,00) rekonstituiert. 2-Iminothiolan (2-IT, 3,1 mg) wurde in Wasser vom HPLC-Grad (0,5 ml) gelöst. Die Lösung von 2-IT wurde in einem Teil zu der KLH-Lösung zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde für 1 min gemischt, wobei eine fast klare graue Lösung erhalten wurde. Die Reaktion wurde für 60 min stehen gelassen. Das aktivierte KLH-(SH)n wurde auf einer Sephadex PD-10-Säule entsalzt, welche mit Natriumphosphatpuffer (100 mM, pH 7,0) voräquilibriert worden war. Die SH-Beladung wurde auf 1390 pro KLH-Molekül (MG 5.000.000) bestimmt. DMSO (0,6 ml) wurde zu der KLH-(SH)1390- Lösung zugegeben. Das MB-MDA (2,67 mg) wurde in Acetonitril (0,15 ml) gelöst. Die Lösung von MB-MDA wurde zu der KLH- (SH)1390-Lösung zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei 4°C gerührt. Das Immunogen wurde zweimal mit PBS- Lösung (150 mM NaCl, 10 mM Natriumphosphat, pH = 7,0-7,1), welche DMF (20% V/V) enthielt, und zweimal mit PBS-Lösung dialysiert. Die dialysierte Lösung des Immunogens (~ 34 ml, ~0,5 mg/ml) wurde zur Immunisierung von Mäusen verwendet.
Beispiel 8 Entwicklung von polyklonalen anti-MDA-Anti­ körpern
Mäuse wurden durch Verabreichung von MDA-MB-2IT-KLH in einer Serie von Injektionen immunisiert. Den Mäusen wurde 10 Tage nach der dritten Immunisierung Blut entnommen. Die Seren wurden in einem β-Galaktosidase-Enzymkomplementationstest auf einer Platte mit 96 Vertiefungen wie folgt getestet:
  • a) Das Enzymakzeptor (EA)-Reagens wurde hergestellt, indem EA- Protein mit CEDIA-Puffer verdünnt wurde. Wenn auf eine Reak­ tion auf den Analyten getestet wurde, wurde MDMA zu dem EA- Reagens zugegeben. Die verwendeten Bestandteile und Konzen­ trationen sind nachfolgend aufgelistet:
Tabelle 2
CEDIA-Puffer
Tabelle 3
EA-Reagens
  • a) Das Enzymdonor (ED)-Reagens wurde ebenfalls in CEDIA- Puffer mit den nachstehenden Bestandteilen hergestellt:
Tabelle 4
ED-Reagens
  • a) Das Testprotokoll war wie folgt: 50 µl verdünnter Antikör­ per wurden zu einer Vertiefung einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen zugegeben. 75 µl EA-Reagens mit oder ohne MDMA (27,5 nM; entspricht einer Konzentration von 1.000 ng/ml in einer Urinprobe) wurden zu jeder Vertiefung zuge­ geben und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurden 75 µl ED-Reagens zugegeben und für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Extinktion wurde bei 540 nm bei einer Referenzwellenlänge von 690 nm abgelesen.
  • b) Die Analyse der Daten wurde wie folgt durchgeführt: Die prozentuale Inhibition wurde als die Extinktion in Gegen­ wart des Antikörpers, geteilt durch die Extinktion in Ab­ wesenheit des Antikörpers, mal 100% berechnet. Die pro­ zentuale Modulation wurde wie folgt berechnet: (Extinktion in Gegenwart des Antikörpers und MDMA minus Extinktion in Gegenwart des Antikörpers und in Abwesenheit von MDMA) ge­ teilt durch die Extinktion in Gegenwart des Antikörpers und MDMA, mal 100%.
Nach 11 Wochen wurde den Mäusen Blut entnommen, und das Serum wurde unter Verwendung von MDMA auf anti-MDA-Antikörper hin getestet. Die Ergebnisse, welche in Tabelle A gezeigt sind, zeigen die Bindung des Enzymdonor-MDA-Konjugats; die maximale Inhibition betrug für alle 13 Mäuse < 80%, und die maximale Modulation von 22 bis 55% wurde bei Titern von 1 : 400 bis 1 : 1600 erreicht. Die Maus 3C wurde aufgrund des Befunds der maximalen Reaktion auf MDMA in dem Test zur Hybridom-Produktion ausgewählt.
Tabelle 5
Testen von polyklonalen anti-MDA-Antiserien, unter Verwendung von MDMA
Beispiel 9 Entwicklung und Selektion von monoklonalen anti-MDA-Antikörpern, unter Verwendung von MDMA
Die Milz aus der Maus 3C wurde entnommen, und die Milzzellen wurden mit Myelomzellen unter Verwendung von Polyethylenglykol als Fusionsmittel fusioniert. Das Parentalmyelom, welches für alle Fusionen verwendet wurde, war P2X63-Ag8.653, das über die Americ 08914 00070 552 001000280000000200012000285910880300040 0002010111224 00004 08795an Type Culture Collection (ATCC) gekauft wurde. Die Chronologie der Ereignisse zur Entwicklung monoklonaler Anti­ körper, die unter Verwendung von KLH-2IT-MB-MDA hervorgerufen wurden, war wie folgt
Erste Immunisierung Zeit 0
Zweite Immunisierung 4 Wochen
Dritte Immunisierung 8 Wochen
Den Mäusen Blut entnommen 9 Wochen
Seren aus der ersten Blutentnahme titriert 11 Wochen
Vierte Immunisierung 22 Wochen
Erste Fusion durchgeführt 25 Wochen
Die erste Fusion erzeugte 20 Klone, welche einen Antikörper produzierten, der die Enzymbildung durch das ED-MDA-Konjugat in einem Enzymkomplementationstest vom Typ CEDIA® in einer Platte mit 96 Vertiefungen inhibierte. Wie in Tabelle 6 gezeigt ist, ergaben fünf dieser Antikörper eine Modulation mit MDMA von < 20%; der Rest ergab eine Modulation von ≦ 15%. Wie in Tabelle 6 gezeigt ist, ergaben fünf dieser Antikörper eine merkliche Kreuzreaktivität mit den Hauptdrogen der MDMA-Klasse MDMA, MDA, MDEA, BDB und MBDB, aber eine geringe oder keine Kreuz­ reaktivität mit HMMA (ein pharmakologisch inaktives Analoges von MDMA), Amphetamin oder Methamphetamin. Die fünf Klone, welche in Tabelle 6 aufgelistet sind, wurden zur weiteren Auswertung zurückbehalten, und Kulturflüssigkeitsüberstände, welche das exprimierte Immunglobulin enthielten, wurden zur Analyse in einem automatisierten CEDIA®-Test hergestellt.
Beispiel 10 Beispiel eines Cedia®-Tests auf Verbindungen der Ecstasy-Klasse, der unter Verwendung eines Hitachi-Analysegeräts für klinische Chemie durchgeführt wurde
  • a) Herstellung der Reagenzien
Tabelle 8
Lyophilisiertes Enzymakzeptor-Reagens
Tabelle 9
Enzymakzeptor-Rekonstitutionspuffer
Das Arbeitsenzymakzeptor-(EA)-Reagens wurde durch Rekonstitu­ tion des lyophilisierten EA-Reagenzes mit EA-Rekonstitutions­ puffer, entsprechend den oben gezeigten Konzentrationen, herge­ stellt. (*) zeigt die Endkonzentration nach der Rekonstitution an.
Das Enzymdonor-(ED)-Reagens wurde als ein flüssiges Reagens mit den nachstehenden Bestandteilen hergestellt.
Tabelle 10
Enzymdonor-Reagens
Beide Reagenzien wiesen einen pH von 6,9 auf.
  • a) Testprotokoll: Der Test wurde auf einem Hitachi- Analysator für klinische Chemie wie folgt durchgeführt: Die Probe wurde in eine Reaktionsküvette pipettiert. EA- Reagens, welches den Antikörper enthielt, wurde zugege­ ben. Die Mischung wurde für ungefähr 5 min bei 37°C inkubiert. Das ED-Reagens, welches monoklonales anti- MDA-Substrat enthielt, wurde anschließend zugegeben, und die Inkubation wurde für 4 min bei 37°C fortgesetzt. Die Geschwindigkeit der Substrathydrolyse wurde photome­ trisch bei 570 nm (unter Subtraktion eines Hintergrunds bei 660 nm) von vier bis fünf Minuten nach der ED-Zugabe gemessen. Die folgende Tabelle faßt das Testprotokoll zusammen:
Tabelle 11
Automatisiertes Testprotokoll
  • a) Ergebnisse
Die Figur zeigt eine Standardkurve für eine Verbindung der Ecstasy-Klasse, die auf der Grundlage von Daten, die unter Verwendung des 1A9-Antikörpers, wie oben beschrieben, abgelei­ tet wurden, aufgestellt wurde. Tabelle 12 zeigt die Kreuzreak­ tivität mehrerer Drogen der Ecstasy-Klasse, wie auch von HMMA, Amphetamin und Methamphetamin. Wie man in der Tabelle sieht, ist der Antikörper 1A9 in der Lage, zahlreiche Verbindungen der Ecstasy-Klasse in einem homogenen Immuntest nachzuweisen, welcher auf der CEDIA®-Technologie basiert. Die Nachweisemp­ findlichkeit (d. h. die prozentuale Modulation) ist akzeptabel, wobei bei einer Analytenkonzentration von 300 ng/ml eine ausge­ zeichnete Dosiswirkung besteht. Die nachgewiesenen Verbindungen der Ecstasy-Klasse zeigen Kreuzreaktivitäten, wie sie nachste­ hend zusammengefaßt sind:
Verbindung
Kreuzreaktivität
MDMA 100%
MDA 55%
MDEA 155%
MBDB 23%
BDB 33%
In vorteilhafter Weise wies der CEDIA®-MDMA-Test auf Verbindun­ gen der Ecstasy-Klasse weder die pharmakologisch inaktive Verbindung HMMA, noch die aktiven Verbindungen Amphetamin und Methamphetamin nach.
Tabelle 12
Spezifität des MDMA-Antikörpers
Beispiel 11 Verstärkung der Kreuzreaktivität gegenüber Drogen der Ecstasy-Klasse in dem CEDIA® DAU-Test auf Amphetamine, durch die Zugabe des anti-Ecstasy- Antikörpers 1A9 und von ED-MDA-Konjugat
Der CEDIA® DAU-Test auf Amphetamine wurde im Hinblick auf seine Kreuzreaktivität mit den Ecstasy-Drogen MDA, MDMA, MDEA, BDB und MBDB durch die Zugabe des anti-Ecstasy-Antikörpers 1A9 und von ED28-(MB-MDA)2-Konjugat verstärkt. CEDIA® DAU-Amphetamin­ testkits wurden von der Microgenics Corporation, Fremont, CA, erhalten. Die Kits wurden rekonstituiert, und die Tests wurden gemäß den Anleitungen für einen Test mit einem Grenzwert von 500 ng/ml auf einem Hitachi 911-Analysator laufen gelassen. Methamphetamine wurden zur Grenzwert-Kalibrierung verwendet.
Ein direkter Vergleich des CEDIA® DAU-Amphetamintests und der verstärkten Version wurde durchgeführt. Die verwendeten Reagen­ zien waren wie folgt:
Standard CEDIA® DAU-Test auf Amphetamine
  • - R1: CEDIA® DAU-Amphetamin-EA-Reagens wurde in CEDIA® DAU- Amphetamin-EA-Rekonstitutionspuffer rekonstituiert
  • - R2: CEDIA® DAU-Amphetamin-EA-Reagens wurde in CEDIA® DAU- Amphetamin-ED-Rekonstitutionspuffer rekonstituiert
Verstärkter CEDIA® DAU-Test auf Amphetamine
  • - R1: CEDIA® DAU-Amphetamin-EA-Reagens wurde in CEDIA® DAU- Amphetamin-ED-Rekonstitutionspuffer rekonstituiert, und dann wurde Ascitesflüssigkeit mit dem MAK 1A9 bei einer Endverdünnung von 1 : 1200 zugegeben.
  • - R2: CEDIA® DAU-Amphetamin-ED-Reagens wurde in CEDIA® DAU- Amphetamin-ED-Rekonstitutionspuffer rekonstituiert, und dann wurde ED28-(MB-MDA)2 bis zu einer Endkonzentration von 1 nM zugegeben.
Das Testprotokoll für beide Reagenziensätze ist in Tabelle 13 gezeigt:
Tabelle 13
Automatisiertes Testprotokoll
Ergebnisse
Die Mengen des monoklonalen Antikörpers 1A9 und des ED-MDA- Konjugats, die zu dem verstärkten CEDIA® DAU-Test auf Ampheta­ mine zugegeben wurden, wurden optimiert, so daß diese ungefähr dieselbe Reaktion auf 500 ng/ml MDA wie auf 500 ng/ml Metham­ phetamin ergaben. Die Standardkurven für MDA und Methamphet­ amin in dem regulären und dem verstärkten Test sind in Tabelle 14 gezeigt.
Tabelle 14
Standardkurven für den normalen und den ver­ stärkten CEDIA® DAU-Test auf Amphetamine
Die Kreuzreaktivität für Methamphetamin und die Drogen der Ecstasy-Klasse bei dem Standard- und dem verstärkten CEDIA® DAU-Test auf Amphetamine sind in Tabelle 15 gezeigt. In allen Fällen gibt es eine Verbesserung bei der Erkennung der Drogen der Ecstasy-Klasse bei dem verstärkten Testsystem. Somit ver­ besserte die Zugabe des Antikörpers gegen das MDP-Derivat und das markierte MDP-Analoge die Fähigkeit eines herkömmlichen Tests für die Amphetamin-Klasse, einen breiten Bereich von Designer-Amphetaminen nachzuweisen.
Tabelle 15
Kreuzreaktivitäten des Standard- und des ver­ stärkten CEDIA® DAU-Tests auf Amphetamine
Verschiedene Änderungen, Modifikationen oder Variationen können im Hinblick auf die Erfindung, welche oben im Detail beschrie­ ben wurde, durchgeführt werden, ohne den Umfang der vorliegen­ den Erfindung zu verlassen, welcher nur durch die folgenden Ansprüche definiert wird.

Claims (50)

1. Verbindung oder ein Salz von dieser, wobei die Verbindung ein 2-Aminomethylendioxyphenyl-(MDP)-Derivat ist, das an Z befestigt ist, wobei Z eine Komponente ist, die in der Lage ist, entweder direkt oder indirekt an einen immunogenen Trä­ ger, eine nachweisbare Markierung oder ein festes Einfangvehi­ kel zu binden.
2. Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung die fol­ gende Struktur aufweist:
oder ein Salz von dieser,
wobei X, Q, R1, R2, R3 und R4 unabhängig voneinander ausge­ wählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, einer ersten Komponente, einem substituierten Derivat der ersten Komponente und L1 n-Z, unter der Voraussetzung, daß wenigstens einer von X, Q, R1, R2, R3 und R4 L1 n-Z ist;
wobei die erste Komponente ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einer geraden Komponente, einer verzweigten Kom­ ponente, einer cyclischen Komponente und deren Kombinationen, und die erste Komponente eine Hauptkette mit m Hauptkettenato­ men aufweist, wobei m eine ganze Zahl 1 ist, wobei die m Hauptkettenatome unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Kohlenstoff, Stickstoff, Sauerstoff, Schwefel, einem nicht substituierbaren Halogenid und deren Kombinationen;
wobei L1 n ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einer zweiten Komponente und einem substituierten Derivat der zweiten Komponente;
wobei die zweite Komponente ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einer geraden Komponente, einer verzweigten Kom­ ponente, einer cyclischen Komponente und deren Kombinationen, und die zweite Komponente eine Hauptkette mit n Hauptketten­ atomen aufweist, wobei n eine ganze Zahl ≧ 0 ist, wobei die n Hauptkettenatome unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Kohlenstoff, Stickstoff, Sauerstoff, Schwefel, einem nicht substituierbaren Halogenid und deren Kombinationen; und
wobei Z eine Komponente ist, welche in der Lage ist, ent­ weder direkt oder indirekt chemisch an einen immunogenen Trä­ ger, eine nachweisbare Markierung oder ein festes Einfangvehi­ kel zu binden.
3. Verbindung nach Anspruch 2, worin Z ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Maleinimido-, Amino-, Carboxyl-, Thiol-, Hydroxyl-, Aldehyd-, Halogenid-, Sulfon-, Triazin- sowie Imi­ dogruppen und deren Kombinationen.
4. Verbindung nach Anspruch 2, worin Z -NH-C(=O)-L2-M ist, wobei L2 eine Alkylengruppe ist und M ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Halogenid- und Maleinimidogruppen.
5. Verbindung nach Anspruch 2, worin Z ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus:
worin J ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Sauer­ stoff, Schwefel, Amino- und Alkylengruppe.
6. Verbindung nach Anspruch 2, worin das nichtsubstituierbare Halogenid der ersten oder zweiten Komponente Fluor ist.
7. Verbindung nach Anspruch 2, worin das substituierte Deri­ vat der ersten oder zweiten Komponente Fluor umfaßt.
8. Verbindung nach Anspruch 2, worin, wenn X, Q, R1, R2, R3 oder R4 die gerade Komponente der ersten Komponente oder das substituierte Derivat der ersten Komponente ist, m eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis 4 ist.
9. Verbindung nach Anspruch 8, worin das substituierte Deri­ vat der ersten Komponente Fluor umfaßt.
10. Verbindung nach Anspruch 2, worin R2, R3 und R4 unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Was­ serstoff, der geraden Komponente der ersten Komponente und dem substituierten Derivat der ersten Komponente; unter der Vor­ aussetzung, daß m eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis 2 ist.
11. Verbindung nach Anspruch 10, worin das substituierte Deri­ vat der ersten Komponente Fluor umfaßt.
12. Verbindung nach Anspruch 2, worin R1 und R2 unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Was­ serstoff, einer Alkylgruppe und einem substituierten Derivat der Alkylgruppe.
13. Verbindung nach Anspruch 12, worin das substituierte Deri­ vat der Alkylgruppe Fluor umfaßt.
14. Verbindung nach Anspruch 2, worin n in dem Bereich von 1 bis 20 liegt.
15. Verbindung nach Anspruch 2, worin n in dem Bereich von 1 bis 10 liegt.
16. Verbindung nach Anspruch 2, worin die zweite Komponente oder das substituierte Derivat der zweiten Komponente eine kürzeste Hauptkette in dem Bereich von 1 bis 12 Hauptketten­ atomen aufweist.
17. Immunogenes Reaktionsprodukt der Verbindung nach Anspruch 2, die mit einem immunogenen Träger umgesetzt wurde.
18. Antikörper, der gegen das immunogene Reaktionsprodukt nach Anspruch 17 hervorgerufen wurde.
19. Synthetisches Hapten, umfassend:
ein 2-Aminomethylendioxyphenyl-(MDP)-Derivat, welches in der Lage ist, mit einem immunogenen Träger zu reagieren, um einen MDP-Antikörper zu produzieren, der in der Lage ist, bevorzugt an eine Verbindung der Ecstasy-Klasse zu binden.
20. Synthetisches Hapten nach Anspruch 19, worin der MDP-Anti­ körper eine Kreuzreaktivität von weniger als 10% mit jeweils Ephedrin, Pseudoephedrin und Phenylpropanolamin aufweist.
21. Synthetisches Hapten nach Anspruch 19, worin der MDP-Anti­ körper eine Kreuzreaktivität von weniger als 1% mit jeweils Ephedrin, Pseudoephedrin und Phenylpropanolamin aufweist.
22. Synthetisches Hapten nach Anspruch 19, worin der MDP-Anti­ körper eine Kreuzreaktivität von weniger als 0,1% mit jeweils Ephedrin, Pseudoephedrin und Phenylpropanolamin aufweist.
23. Synthetisches Hapten nach Anspruch 19, worin der MDP-Anti­ körper eine Kreuzreaktivität von weniger als 1% mit jeweils Amphetamin, Methamphetamin und 4-Hydroxy-3-methoxy-methamphe­ tamin (HMMA) aufweist.
24. Immunogenes Reaktionsprodukt des MDP-Derivats nach Anspruch 19, das mit einem immunogenen Träger umgesetzt wurde.
25. Antikörper, der gegen das immunogene Reaktionsprodukt nach Anspruch 24 hervorgerufen wurde.
26. Antikörper, welcher in der Lage ist, bevorzugt an eine Verbindung der Ecstasy-Klasse zu binden.
27. Antikörper nach Anspruch 26, wobei der Antikörper eine Kreuzreaktivität von weniger als 10% mit jeweils Ephedrin, Pseudoephedrin und Phenylpropanolamin aufweist.
28. Antikörper nach Anspruch 26, wobei der Antikörper eine Kreuzreaktivität von weniger als 1% mit jeweils Ephedrin, Pseudoephedrin und Phenylpropanolamin aufweist.
29. Antikörper nach Anspruch 26, wobei der Antikörper eine Kreuzreaktivität von weniger als 0,1% mit jeweils Ephedrin, Pseudoephedrin und Phenylpropanolamin aufweist.
30. Antikörper nach Anspruch 26, wobei der Antikörper eine Kreuzreaktivität von weniger als 1% mit jeweils Amphetamin, Methamphetamin und 4-Hydroxy-3-methoxymethamphetamin (HMMA) aufweist.
31. Antikörper nach Anspruch 26, wobei die Verbindung der Ecstasy-Klasse ein Molkulargewicht von 170 Daltons bis 220 Daltons aufweist.
32. Immuntestkit, welches die Verbindung nach Anspruch 2 und eine nachweisbare Markierung umfaßt.
33. Immuntestkit nach Anspruch 32, wobei die Verbindung und die Markierung in Form eines Konjugats vorliegen.
34. Immuntestkit nach Anspruch 32, welches weiterhin den Anti­ körper nach Anspruch 18 umfaßt.
35. Immuntestkit nach Anspruch 32, welches weiterhin den Anti­ körper nach Anspruch 25 umfaßt.
36. Immuntestkit nach Anspruch 32, welches weiterhin den Anti­ körper nach Anspruch 26 umfaßt.
37. Immuntestkit, welches den Antikörper nach Anspruch 18 und eine nachweisbare Markierung umfaßt.
38. Immuntestkit, welches den Antikörper nach Anspruch 25 und eine nachweisbare Markierung umfaßt.
39. Immuntestkit, welches den Antikörper nach Anspruch 26 und eine nachweisbare Markierung umfaßt.
40. Verfahren zum Nachweisen eines Analyten, welches die folgenden Schritte umfaßt:
Inkontaktbringen des Antikörpers nach Anspruch 18 mit einer Verbindung der Ecstasy-Klasse ("Analyt") sowie einer nachweisbaren Markierung unter Bedingungen, welche die Bindung des Analyten und der Markierung an den Antikörper erlauben und welche eine Konkurrenz zwischen dem Analyten und der Markie­ rung um die Bindung an den Antikörper erlauben; und
Nachweisen des Analyten.
41. Verfahren zum Nachweisen eines Analyten, welches die folgenden Schritte umfaßt:
Inkontaktbringen des Antikörpers nach Anspruch 25 mit einer Verbindung der Ecstasy-Klasse ("Analyt") sowie einer nachweisbaren Markierung unter Bedingungen, welche die Bindung des Analyten und der Markierung an den Antikörper erlauben und welche eine Konkurrenz zwischen dem Analyten und der Markie­ rung um die Bindung an den Antikörper erlauben; und
Nachweisen des Analyten.
42. Verfahren zum Nachweisen eines Analyten, welches die folgenden Schritte umfaßt:
Inkontaktbringen des Antikörpers nach Anspruch 26 mit einer Verbindung der Ecstasy-Klasse ("Analyt") sowie einer nachweisbaren Markierung unter Bedingungen, welche die Bindung des Analyten und der Markierung an den Antikörper erlauben und welche eine Konkurrenz zwischen dem Analyten und der Markie­ rung um die Bindung an den Antikörper erlauben; und
Nachweisen des Analyten.
43. Immuntestkit, umfassend:
einen Antikörper, der in der Lage ist, eine Verbindung, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Amphetamin, Methamphetamin und deren Kombinationen, zu binden; und
einen Kit-Bestandteil, der ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus der Verbindung nach Anspruch 2 und einer nach­ weisbaren Markierung, dem Antikörper nach Anspruch 18 und deren Kombinationen.
44. Immuntestkit, umfassend:
einen Antikörper, der in der Lage ist, eine Verbindung, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Amphetamin, Methamphetamin und deren Kombinationen, zu binden; und
einen Kit-Bestandteil, der ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus der Verbindung nach Anspruch 2 und einer nach­ weisbaren Markierung, dem Antikörper nach Anspruch 25 und deren Kombinationen.
45. Immuntestkit, umfassend:
einen Antikörper, der in der Lage ist, eine Verbindung, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Amphetamin, Methamphetamin und deren Kombinationen, zu binden; und
einen Kit-Bestandteil, der ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus der Verbindung nach Anspruch 2 und einer nach­ weisbaren Markierung, dem Antikörper nach Anspruch 26 und deren Kombinationen.
46. Verfahren zum Nachweisen eines Analyten, welches die folgenden Schritte umfaßt:
Inkontaktbringen: eines Antikörpers, der in der Lage ist, eine Verbindung zu binden, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Amphetamin, Methamphetamin und deren Kombinatio­ nen ("Antikörper der Amphetamin-Klasse"); einer Komponente, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus der Verbin­ dung nach Anspruch 2 und einer nachweisbaren Markierung, dem Antikörper nach Anspruch 18 und deren Kombinationen; und einer Verbindung der Ecstasy-Klasse ("Analyt") unter Bedingungen, welche erlauben, daß der Analyt an eine Komponente bindet, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: dem Antikörper der Amphetamin-Klasse; der Verbindung nach Anspruch 2 und der nachweisbaren Markierung; dem Antikörper nach Anspruch 18; und deren Kombinationen; und
Nachweisen des Analyten.
47. Verfahren zum Nachweisen eines Analyten, welches die folgenden Schritte umfaßt:
Inkontaktbringen: eines Antikörpers, der in der Lage ist, eine Verbindung zu binden, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Amphetamin, Methamphetamin und deren Kombinatio­ nen ("Antikörper der Amphetamin-Klasse"); einer Komponente, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus der Verbin­ dung nach Anspruch 2 und einer nachweisbaren Markierung, dem Antikörper nach Anspruch 25 und deren Kombinationen; und einer Verbindung der Ecstasy-Klasse ("Analyt") unter Bedingungen, welche erlauben, daß der Analyt an eine Komponente bindet, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: dem Antikörper der Amphetamin-Klasse; der Verbindung nach Anspruch 2 und der nachweisbaren Markierung; dem Antikörper nach Anspruch 25; und deren Kombinationen; und
Nachweisen des Analyten.
48. Verfahren zum Nachweisen eines Analyten, welches die folgenden Schritte umfaßt:
Inkontaktbringen: eines Antikörpers, der in der Lage ist, eine Verbindung zu binden, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Amphetamin, Methamphetamin und deren Kombinatio­ nen ("Antikörper der Amphetamin-Klasse"); einer Komponente, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus der Verbin­ dung nach Anspruch 2 und einer nachweisbaren Markierung, dem Antikörper nach Anspruch 26 und deren Kombinationen; und einer Verbindung der Ecstasy-Klasse ("Analyt") unter Bedingungen, welche erlauben, daß der Analyt an eine Komponente bindet, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: dem Antikörper der Amphetamin-Klasse; der Verbindung nach Anspruch 2 und der nachweisbaren Markierung; dem Antikörper nach Anspruch 26; und deren Kombinationen; und
Nachweisen des Analyten.
49. Immuntestkit, welches die Verbindung nach Anspruch 2 und ein festes Einfangvehikel umfaßt.
50. Kit nach Anspruch 49, worin das feste Einfangvehikel ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem festen Teilchen, einer festen Oberfläche und deren Kombinationen.
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