DE10111224B4 - Analoge der Ecstasy-Klasse sowie Verwendung derselben beim Nachweis von Verbindungen der Ecstasy-Klasse - Google Patents

Analoge der Ecstasy-Klasse sowie Verwendung derselben beim Nachweis von Verbindungen der Ecstasy-Klasse Download PDF

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Abstract

Eine Verbindung oder ein Salz dieser Verbindung mit folgender Struktur

Description

  • Hintergrund der Erfindung
  • Diese Erfindung betrifft im allgemeinen das Gebiet der Bestimmung von mißbräuchlichen Drogen in biologischen Proben. Insbesondere stellt diese ein System von Derivaten, Konjugaten und spezifischen Antikörpern wie in den Ansprüchen definiert zur Verfügung, welche in Testsystemen zum Nachweis oder zur Quantifizierung von 3,4-Methylendioxy-methamphetamin (MDMA), ebenfalls bekannt als Ecstasy, und anderen verwandten Verbindungen verwendet werden können.
  • Designerdrogen sind spezifische Derivate von gewöhnlich anzutreffenden mißbräuchlichen Drogen, welche in gewissen geographischen Gebieten und innerhalb bestimmter Bevölkerungsschichten populär sind. Die Verwendung von Designerdrogen bringt all die Risiken mit sich, mit welchen die Verwendung von häufigeren Drogen behaftet ist, wie auch zusätzliche Risiken, in der Hinsicht, daß der Nachweis und die anschließende Behandlung durch die relative Einzigartigkeit der Designerdrogen kompliziert wird. Beispielsweise könnten einige Notfallstationen nicht in der Lage sein, Designerdrogen nachzuweisen, da solchen Einrichtungen die raffinierte und teuere Instrumentation wie z. B. eine Gaschromatographie/Massenspektroskopie (GC/MS)-Ausrüstung fehlt, die zur Bestätigung eines positiven Ergebnisses verwendet wird. Schnelle Screening-Verfahren wie z. B. Immuntests stehen häufiger zur Verfügung, sind leicht zu verwenden und sind ökonomisch, weisen aber gewöhnlich nur eine einzige oder höchstens eine begrenzte Anzahl der am häufigsten angetroffenen Drogen nach. Somit sind sie für eine größere Klasse an Designerdrogen nicht spezifisch.
  • Eine solche Klasse von Designerdrogen ist die Ecstasy-Klasse. Nicht beschränkende Beispiele von Verbindungen in dieser Klasse umfassen 3,4-Methylendioxymethamphetamin (MDMA), ebenfalls bekannt als ”Ecstasy”, 3,4-Methylendioxyamphetamin (MDA), N-Ethyl-3,4-methylendioxyamphetamin (MDE), N-Methyl-1-(3,4-methylendioxyphenyl)-2-butanamin (MBDB), 1-(3,4-Methylendioxyphenyl)-2-butanamin (BDB) und andere Derivate von Amphetamin. Da die Drogendesigner mehr und mehr Varianten von Ecstasy entwickeln, steigt die Anzahl an einzigartigen Verbindungen, welche in die Ecstasy-Klasse fallen, kontinuierlich.
  • Der Nachweis von MDMA, MDA, MDE, MBDB, BDB, einer weiteren Verbindung der Ecstasy-Klasse, oder einem Derivat oder Metaboliten von diesen im Urin hängt derzeit von der Kreuzreaktivität solcher Drogen der Ecstasy-Klasse in Immuntests auf Amphetamin und Methamphetamin ab. Diese Tests können jedoch solche Verbindungen der Ecstasy-Klasse in geringeren Konzentrationen nicht nachweisen. Darüber hinaus sind die bestehenden Immuntests auf Amphetamin und Methamphetamin durch ihre Kreuzreaktivität auf rezeptfreie Allergie- und Erkältungsmedikamente wie z. B. (±)-Ephedrin, (+)-Pseudoephedrin und Phenylpropanolamin und auf verschreibungspflichtige Diätetika wie z. B. Phentermin beschränkt. Dieser Kreuzreaktivitätsfaktor verhindert, daß man den Grenzwert zum Nachweis von Amphetamin und Methamphetamin senkt, was wiederum verhindert, daß Verbindungen der Ecstasy-Klasse bei geringeren Konzentrationen nachgewiesen werden. Daher wird ein Test mit einer erhöhten Spezifität für Verbindungen der Ecstasy-Klasse, entweder als ein Test, um Verbindungen der Ecstasy-Klasse allein nachzuweisen, oder als ein Test, um Verbindungen der Ecstasy-Klasse wie auch Amphetamin und Methamphetamin nachzuweisen, benötigt.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein System zum verbesserten Nachweis von Verbindungen der Ecstasy-Klasse in biologischen Proben zur Verfügung. Hierin werden die Begriffe ”aus der Ecstasy-Klasse” und ”Ecstasy-Klasse” so verwendet, daß sie sich auf eine Klasse von Verbindungen beziehen, welche, ohne auf diese beschränkt zu sein, 3,4-Methylendioxymeth-amphetamin (MDMA), 3,4-Methylendioxyamphetamin (MDA), N-Ethyl-3,4-methylendioxyamphetamin (MDE), N-Methyl-1-(3,4-methylendioxyphenyl)-2-butanamin (MBDB) und 1-(3,4-Methylendioxyphenyl)-2-butanamin (BDB) einschließen. Wie die Durchschnittsfachleute erkennen werden, ist die Ecstasy-Klasse eine konstant wachsende Klasse von Drogen, da Drogendesigner fortfahren, neue, einzigartige Verbindungen zu synthetisieren, welche mittels ihrer Struktur und/oder psychedelischen Eigenschaften in die Ecstasy-Klasse fallen. Dementsprechend werden die Begriffe ”aus der Ecstasy-Klasse” und ”Ecstasy-Klasse” hierin so verwendet, daß sie sowohl Verbindungen, die schon synthetisiert wurden, als auch solche, die zukünftig synthetisiert werden, einschließen.
  • Ein Aspekt der Erfindung richtet sich auf Analoge der Ecstasy-Klasse wie in Anspruch 1 definiert. Diese Analogen können verwendet werden, um Immunogene, Antikörper, Enzym- oder Enzymdonorkonjugate und andere Konjugate zu konstruieren.
  • Die Immunogene erzeugen reproduzierbar Antikörper mit einer ausgezeichneten Fähigkeit, verschiedene Drogen der Ecstasy-Klasse in biologischen Proben von potentiell störenden Substanzen zu unterscheiden. Die spezifischen Antikörper und Konjugate können verwendet werden, um verschiedene Verbindungen der Ecstasy-Klasse in biologischen Proben wie z. B. jenen von Einzelpersonen, die des Drogenmißbrauchs verdächtigt werden, zu unterscheiden und zu messen. Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft bestimmte Reagenzien, Reagenskombinationen und Kits zur Durchführung von Testverfahren auf Verbindungen der Ecstasy-Klasse in einer biologischen Probe.
  • In Bezug auf die Analogen der Ecstasy-Klasse richtet sich ein Aspekt der Erfindung auf eine Verbindung wie in Anspruch 1 definiert, oder ein Salz von dieser.
  • Die Verbindung weist die folgende Struktur auf:
    Figure DE000010111224B4_0003
  • Die nachweisbare Markierung der Erfindung kann irgendeine geeignete Markierung sein, wie die Durchschnittsfachleute beim Lesen dieser Beschreibung erkennen werden. Beispielsweise kann die nachweisbare Markierung ein Radioisotop, eine fluoreszierende Gruppe, eine fluoreszenzlöschende Gruppe, eine phosphoreszierende Gruppe, eine chemilumineszente Gruppe, eine chromophore Gruppe, eine chromogene Substanz, ein Pigment, ein Farbstoff, eine elektrochemisch aktive Gruppe, eine elektrochemilumineszente Gruppe, eine Gruppe, die beim Binden eine Änderung bei der Fluoreszenz, Phosphoreszenz, Chemilumineszenz oder einer elektrochemischen Eigenschaft erfährt, ein Peptid, ein Protein, ein Proteinfragment, ein immunogener Träger, ein Enzym, ein Enzyminhibitor, ein Enzymsubstrat, ein Enzymkofaktor, eine prosthetische Enzymgruppe, ein Enzymdonor, ein festes Teilchen, ein magnetisches Teilchen, ein unlösliches Teilchen, ein Latexteilchen, ein Goldteilchen, eine feste Oberfläche, ein Antikörper, eine Nukleinsäure oder irgendeine geeignete Kombination solcher nachweisbaren Markierungen sein.
  • Der immunogene Träger kann irgendein geeignetes Material sein, welches in der Lage ist, direkt oder indirekt an die Verbindung der Erfindung zu binden, um ein Immunogen herzustellen, wie die Durchschnittsfachleute erkennen werden. Das feste Einfangvehikel der Erfindung kann ein festes Teilchen, eine feste Oberfläche oder eine Kombination von diesen sein. Beispielsweise kann das feste Teilchen ein magnetisches Teilchen, ein unlösliches Teilchen, ein Latexteilchen oder ein Goldteilchen sein. Ebenso kann beispielsweise die feste Oberfläche ein Objektträger oder eine Mikrotiterplatte sein.
  • Die Erfindung beschreibt ebenfalls ein Verfahren zum Erhalten eines Antikörpers, der für Verbindungen der Ecstasy-Klasse spezifisch ist, wobei das Verfahren ein Immunisieren eines Tiers oder ein Inkontaktbringen einer immunkompetenten Zelle oder eines Virus mit einem immunogenen Konjugat eines Analogen der Ecstasy-Klasse gemäß dieser Erfindung umfaßt. Das Tier kann ein Wirbeltier, z. B. ein Säugetier sein. Die Antikörper können in löslicher Form vorliegen oder können durch Befestigung an einem festen Einfangvehikel wie z. B. einer festen Oberfläche, einem festen Träger, einem festen Teilchen oder einem unlöslichen Teilchen unlöslich gemacht werden.
  • Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Antikörper wie in den Ansprüchen definiert, welcher für Verbindungen der Ecstasy-Klasse spezifisch ist und welcher eine Kreuzreaktivität mit potentiell störenden Substanzen unterhalb eines gewissen Grenzwerts aufweist. Beispielsweise kann der Antikörper eine Kreuzreaktivität mit sowohl Ephedrin, Pseudoephedrin als auch Phenylpropanolamin von weniger als 10%, bevorzugt weniger als 1 und noch bevorzugter weniger als 0,1% aufweisen. Alternativ oder zusätzlich kann der Antikörper eine Kreuzreaktivität mit jeweils Amphetamin, Methamphetamin und 4-Hydroxy-3-methoxymethamphetamin (HMMA) von weniger als ca. 1 aufweisen. Ebenfalls umfaßt von der Erfindung sind Reagenssätze und Reagenssysteme, welche einen Antikörper wie in den Ansprüchen definiert, der für Verbindungen der Ecstasy-Klasse spezifisch ist, und markierte Analoge oder Konjugate mit Analogen nach Anspruch 1 umfassen, die in Kombination verwendet werden können, um einen Immuntest auf Verbindungen der Ecstasy-Klasse durchzuführen. Somit umfaßt die Erfindung ebenfalls Immuntestreagenzien, welche ein Protein- oder Peptidkonjugat eines Analogen der Ecstasy-Klasse der Erfindung umfassen, wobei das Protein oder Peptid ein Enzym ist, das beim Binden des Konjugats an einen Antikörper, der für die Verbindungen der Ecstasy-Klasse spezifisch ist, eine Änderung bei der Enzymaktivität erfährt; oder das Protein oder Peptid ein Enzymdonor ist, wobei die Fähigkeit des Enzymdonors, sich mit einem Enzymakzeptor unter Bildung eines aktiven Enzymkomplexes komplementär zu ergänzen, durch die Bindung des Konjugats an einen Antikörper, welcher für die Verbindungen der Ecstasy-Klasse spezifisch ist, beeinflußt wird.
  • Weitere Ausführungsformen der Erfindung umfassen Immuntestverfahren zum Bestimmen von Verbindungen der Ecstasy-Klasse in einer Probe. Ein solches Verfahren umfaßt die Schritte des Vereinigens der Probe mit einem Antikörper wie in den Ansprüchen definiert, der für Verbindungen der Ecstasy-Klasse spezifisch ist, unter Bedingungen, welche die Bildung eines stabilen Komplexes aus der Verbindung der Ecstasy-Klasse und dem Antikörper erlauben, und des Nachweisens oder Quantifizierens jegliches gebildeten Komplexes aus der Verbindung der Ecstasy-Klasse und dem Antikörper. Zusätzliche Schritte können ein Inkontaktbringen des Antikörpers mit einer markierten Verbindung nach Anspruch 1 unter Bedingungen, welche die Bildung eines stabilen Komplexes zwischen der markierten Verbindung und dem Antikörper erlauben, ein Abtrennen jeglicher markierten Verbindung, die keinen stabilen Komplex bildet, und ein Messen der komplexierten oder abgetrennten Markierung als einem Maß für die Verbindung(en) der Ecstasy-Klasse in der Probe einschließen. Alternativ können die zusätzlichen Schritte einschließen: ein Inkontaktbringen des Antikörpers mit einem Enzym- oder Enzymdonorkonjugat eines Analogen nach Anspruch 1 unter Bedingungen, welche die Bildung eines stabilen Komplexes zwischen dem Konjugat und dem Antikörper erlauben; und ein Messen der enzymatischen Aktivität oder der Enzymkomplementation als einem Maß für die Verbindung(en) der Ecstasy-Klasse in der Probe. Sowohl Separations- als auch homogene Testverfahren sind von der Erfindung umfaßt.
  • Die vorstehenden Ausführungsformen dieser Erfindung können als Immuntestverfahren ausgelegt sein, um Verbindungen der Ecstasy-Klasse allein nachzuweisen. Alternativ können der für eine Verbindung der Ecstasy-Klasse spezifische Antikörper und das markierte Analoge nach Anspruch 1 mit ähnlichen Reagenzien, die zum Nachweisen von Amphetamin und Methamphetamin entworfen wurden, kombiniert werden, was zu einem Amphetamintest führt, welcher eine größere Nachweisempfindlichkeit für Designeramphetamine der Ecstasy-Klasse (d. h. die Verbindungen der Ecstasy-Klasse) zeigt.
  • Weitere Ausführungsformen der Immuntestverfahren der Erfindung sind ein Verfahren zum Nachweisen von Verbindungen der Ecstasy-Klasse in einer Probe durch ein Inkubieren einer Reagensmischung, welche die Probe, einen für Verbindungen der Ecstasy-Klasse spezifischen Antikörper und ein markiertes Analoges der Erfindung umfaßt, unter Bedingungen, welche die Bildung eines stabilen Komplexes zwischen dem Antikörper und jeglicher Verbindung(en) der Ecstasy-Klasse in der Probe erlauben, und ein Nachweisen oder Quantifizieren der Fluoreszenz, Phosphoreszenz, Chemilumineszenz, Elektrochemilumineszenz, einer elektrochemischen Eigenschaft, oder irgendeiner Änderung bei diesen Eigenschaften, als einem Maß für die Verbindung(en) der Ecstasy-Klasse in der Probe. Ein Analoges nach Anspruch 1, das mit einem Enzym oder einem Enzymdonor konjugiert ist, kann ebenfalls in diesem Verfahren verwendet werden, wobei die Mischung ebenfalls ein Substrat für das Enzym und, wenn ein Enzymdonorkonjugat verwendet wird, einen Enzymakzeptor für den Enzymdonor umfaßt, wobei ein Nachweisen oder Quantifizieren der enzymatischen Umwandlung des Substrats in ein Produkt ein Maß für die Verbindungen der Ecstasy-Klasse in der Probe ist. Ein geeignetes Enzym ist β-Galactosidase; wenn eine Enzymdonor/Enzymakzeptorkombination verwendet wird, ist ein nützlicher Enzymdonor/Enzymakzeptorkomplex ein solcher, der β-Galactosidaseaktivität aufweist.
  • Die Erfindung beschreibt ebenfalls ein Verfahren zum Anreichern von Verbindungen der Ecstasy-Klasse aus einer biologischen Probe, welches ein Inkubieren der Probe mit einem für Verbindungen der Ecstasy-Klasse spezifischen Antikörper unter Bedingungen, welche erlauben, daß der Antikörper an jegliche Verbindungen der Ecstasy-Klasse in der Probe bindet, um einen Komplex zu bilden, und ein Abtrennen des Komplexes, welcher sich gebildet hat, von anderen Bestandteilen der Probe umfaßt. Der Antikörper kann an ein festes Einfangvehikel (z. B. einen festen Träger, eine feste Oberfläche, ein festes Teilchen oder ein unlösliches Teilchen) gebunden werden, in welchem Fall auf die Abtrennung des unlöslich gemachten Komplexes aus dem Antikörper und der Verbindung der Ecstasy-Klasse ein Waschen des unlöslich gemachten Komplexes und dann eine Elution des an den Antikörper gebundenen Materials folgt. Nachdem die Lösung im Hinblick auf die Verbindung(en) der Ecstasy-Klasse angereichert wurde, kann diese auf jegliche erhaltene(n) Verbindung(en) der Ecstasy-Klasse getestet werden.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnung
  • Die Figur ist ein graphische Darstellung einer Standardkurve für eine Verbindung der Ecstasy-Klasse.
  • Detaillierte Beschreibung von bevorzugten Ausführungsformen
  • Auf jedes der Dokumente (Patente, Patentanmeldungen, Zeitschriftenartikel, Texte, andere Publikationen usw.), die nachfolgend in dieser detaillierten Beschreibung zitiert werden, wird hiermit vollinhaltlich Bezug genommen.
  • Die vorliegende Erfindung konzentriert sich zum Teil auf die Gestaltung und Herstellung von Analogen nach Anspruch 1, welche dann zur Herstellung von Immunogenen und Konjugaten verwendet werden können, die in Immuntests zur Bestimmung von Verbindungen der Ecstasy-Klasse nützlich sind.
  • Ein solches Analoges der Ecstasy-Klasse hat die folgende Struktur:
    Figure DE000010111224B4_0004
  • Die Analogen der Ecstasy-Klasse (hierin ebenfalls bezeichnet als ”Analoge” oder ”Analoges”) dieser Erfindung können entweder in der gezeigten Form oder z. B. als interner Standard oder kompetitiv bindende Verbindung in einem Testsystem verwendet werden. Sie können ebenfalls weiter angepaßt werden. Beispielsweise können sie durch kovalente Befestigung an einer festen Oberfläche oder einem unlöslichen Teilchen unlöslich gemacht werden, wie weiter unten in dieser Anmeldung beschrieben wird. Alternativ können sie zur Verwendung in einem Testsystem angepaßt werden, indem daran kovalent eine Markierung, entweder direkt oder über eine kovalente Verknüpfungsgruppe, befestigt wird. Geeignete Markierungen umfassen Radioisotope wie z. B. 125I, eine fluoreszierende Gruppe, eine fluoreszenzlöschende Gruppe, eine phosphoreszierende Gruppe, eine chemilumineszente Gruppe, eine elektrochemisch aktive Gruppe, eine elektrochemilumineszente Gruppe, irgendeine Gruppe, die beim Binden eine Änderung bei der Fluoreszenz, Phosphoreszenz, Chemilumineszenz oder einer elektrochemischen Eigenschaft erfährt, ein Enzym oder einen Enzymdonor, einen Enzyminhibitor, ein Enzymsubstrat, einen Enzymcofaktor und ein prosthetische Enzymgruppe. Die Analogen können zur Verwendung in Agglutinationsreaktionen an Latexteilchen befestigt werden; die Latexteilchen können lichtundurchlässig sein oder einen Fluorophor oder Farbstoff enthalten. Die Analogen können ebenfalls an kolloidalem Gold befestigt werden. Beispiele für diese Tests werden in den US-Patenten Nr. 5 120 643 und 5 334 538 und in Price und Newman, ”Light Scattering Immunoassay”, Principles and Practice of Immunoassay, (Price und Newmann, Herausgeber), New York: Stockton Press, 1991, Seiten 446 bis 481 beschrieben.
  • Eine Derivatisierung mit Aminomethylfluorescein wird in dem US-Patent Nr. 4 614 823 gelehrt. Enzym und Enzymdonoren werden in den Testbeschreibungen, die folgen, beschrieben. Die Analogen können ebenfalls als Immunogene ausgelegt werden, indem diese mit einer immunogenen Substanz konjugiert werden, für welche Proteine wie z. B. Napfschneckenhämocyanin (keyhole limpet hemocyanin, KLH) ein Beispiel sind.
  • Poly(aminosäuren) Proteine Peptide und Polypeptide sind Begriffe, die hierin austauschbar verwendet werden, um Polymere von Aminosäuren jeglicher Sequenz, mit typischerweise wenigstens fünf Aminosäuren in der Länge, die durch Peptidbindungen verknüpft sind, zu beschreiben. Einige Beispiele umfassen Proteine, z. B. Enzyme und Enzymdonorpolypeptide, die als immunogene Träger verwendet werden können, und Proteine, die ein nachweisbares Signal für Testzwecke liefern.
  • Konjugate zwischen Analogen und jeglichem Typ von Protein oder Peptid, wie z. B. einem Enzym, Enzymfragment oder immunogenen Protein, können unter Verwendung irgendeiner geeigneten Verknüpfungschemie hergestellt werden. Der Leser wird im allgemeinen auf Hermanson, G. T., ”Bioconjugate Techniques”, Academic Press: New York, 1996; und ”Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking” von S. S. Wong, CRC Press, 1993 verwiesen.
  • Obwohl die Erfindung nicht darauf beschränkt ist, ist es bequem, Proteine und andere Substituenten über den 2-Aminostickstoff in dem Analogen zu befestigen. Ein funktionaler Abstandhalter kann eingeführt werden, welcher die Zugänglichkeit zu dem Derivat erlaubt, wenn es konjugiert ist.
  • Der Ausdruck ”ein Linker, welcher wenigstens ein Kohlenstoffatom enthält” soll sich auf irgendeine generische Verknüpfungsgruppe zwischen zwei anderen Gruppen, z. B. einen Linker zwischen Hapten und Protein oder einen Linker zwischen Hapten und einer funktionellen Gruppe, die zur Befestigung an einem anderen Molkül geeignet ist, beziehen, welche wenigstens ein Kohlenstoffatom enthält. Die Linker-Gruppe kann eine C1-C20-Kohlenwasserstoffkette sein, die 0 bis 10 Heteroatome enthält, welche ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus N, Ound S, und welche wenigstens soviele Kohlenstoffatome wie Heteroatome enthält. Beispiele für solche generischen Verknüpfungsgruppen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, -O-(CH2CH2O)n-, wobei n eine ganze Zahl zwischen 1 und 10 ist (d. h. ein Polyethylenglycollinker); -CH2CH2-Phenyl-CH2CH2- (in ortho-, meta- oder para-Verknüpfung); -CH2CH2-CONH-CH2CH2- (d. h. eine Amidverknüpfung), -C(=O)-CHS-NH- (d. h. ein Aminosäurelinker, wobei S eine natürlich oder nicht natürlich auftretende Aminosäureseitenkette ist) oder in der Tat irgendeine geradkettige, verzweigte, cyclische oder Kombination einer geradkettigen, verzweigten oder cyclischen Verknüpfungsgruppe, die als eine kovalente Verknüpfung zwischen den zwei anderen Gruppen dienen kann. Ein weiteres Beispiel sind C1-C20 Alkylgruppen.
  • Konjugate aus Analogem und Protein werden typischerweiser hergestellt, indem das Analoge mit einer proteinreaktiven Gruppe synthetisiert wird, das modifizierte Derivat mit dem Protein unter Bedingungen inkubiert wird, die erlauben, daß die Konjugationsreaktion auftritt, und dann das Konjugat abgetrennt wird. Beispielsweise kann ein Proteinkonjugat hergestellt werden, indem ein Überschuß eines Maleinimidaddukts mit einem Protein mit freien Thiolgruppen vereinigt wird. Freie Sulfhydrylgruppen können in Form von freien Cysteinresten bereitgestellt werden oder indem Proteindisulfidbindungen durch ein Reagens wie z. B. Dithiothreitol reduziert werden. Alternativ können Thiolgruppen an ein Protein mit freien primären Aminogruppen addiert werden, indem diese mit 2-Iminothiolan (IT) in einem wäßrigen Puffer umgesetzt werden, worauf ein Entfernen von nicht umgesetztem IT folgt. Eine detaillierte Vorschrift für die Thiolierung des Proteins KLH wird in dem US-Patent Nr. 5 439 798 angegeben.
  • Um spezifische Antikörper gegen Analoge der Ecstasy-Klasse zu erhalten, kann ein Konjugat aus Analogem und Protein dieser Erfindung eine Mehrzahl von Analogen kovalent gebunden an einen immunogenen Proteinträger umfassen, welcher im Hinblick auf seine Fähigkeit ausgewählt wurde, eine allgemein immunstimulatorische Wirkung zu liefern. Verschieden Proteinträger können eingesetzt werden, einschließlich Serumalbumin, Serumglobulinen, Okularlinsenproteinen, Lipoproteinen, Ovalbumin, throxinbindendem Globulin und synthetischen Polypeptiden. Auf Wunsch kann KLH verwendet werden.
  • Der Begriff ”Antikörper”, wie er in dieser Offenbarung verwendet wird, bezieht sich sowohl auf polyklonale als auch monoklonale Antikörper und verwandte Antigenerkennungseinheiten. Der Umfang dieses Begriffs umfaßt bewußt nicht nur intakte Immunglobulinmolküle, sondern ebenfalls solche Fragmente und Derivate von Immunglobulinmolkülen, wie sie durch Techniken hergestellt werden können, die im Stand der Technik bekannt sind, und welche die Antikörperaktivität eines intakten Immunglobulins beibehalten. In diesem Zusammenhang bezieht sich ”Antikörperaktivität” auf die Fähigkeit eines Antikörpers, ein spezifisches Antigen bevorzugt gegenüber anderen potentiellen Antigenen über die Antigenkombinationsstelle, die innerhalb eines variablen Bereichs eines Immunglobulins lokalisiert ist, zu binden. Fragmente und andere Derivate von Immunglobulinen können durch Verfahren der Standardproteinchemie, wie z. B. ein Unterwerfen des Antikörpers unter eine Spaltung mit einem proteolytischen Enzym wie Pepsin, Papain oder Trypsin, und ein Reduzieren der Disulfidbindungen mit solchen Reagenzien wie Dithiothreitol, hergestellt werden. Gentechnisch veränderte Varianten des intakten Immunglobulins können hergestellt werden, indem ein Polynukleotid erhalten wird, welches den Antikörper codiert, und die allgemeinen Verfahren der Molkularbiologie angewendet werden, um codierende Sequenzen zu spleißen oder Mutationen einzuführen und die Variante zu translatieren. Beispiele für gentechnisch hergestellte Antikörpervarianten umfassen chimäre und humanisierte Antikörper, Fab-ähnliche Fragmente, Einzelkettenfragmente des variablen Bereichs (scFv), und Diabodies.
  • Im Hinblick auf die allgemeinen Techniken, die beim Hervorrufen, Reinigen und Modifizieren von Antikörpern und der Planung und Ausführung von Immuntests verwendet werden, wird der Leser auf das Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir & C. C. Blackwell, Herausgeber); CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY (J. E. Coligan et al., Herausgeber, 1991); David Wild, Herausgeber, The Immunoassay Handbook (Stockton Press NY, 1994); und R. Masseyeff, W. H. Albert und N. A. Staines, Herausgeber, Methods of Immunological Analysis (Weinheim: VHC Verlagsgesellschaft mbH, 1993) verwiesen.
  • Die polyklonalen Antikörper dieser Erfindung werden durch Verabreichung der immunogenen Analog-Protein-Konjugate an einen tierischen Wirt, gewöhnlich gemischt mit einem Adjuvans, hervorgerufen. Jeder tierische Wirt, welcher Antikörper produziert, kann verwendet werden, wobei ein Beispiel ein Wirbeltier wie z. B. ein Säugetier ist. Das Immunogen wird geeigneterweise zur Injektion vorbereitet, indem lyophilisiertes Immunogen rehydratisiert wird, um eine Lösung oder Suspension zu bilden. Beispielhafte Adjuvanzien sind Wasser-in-Öl-Immersionen, z. B. Freund's vollständiges Adjuvans zur ersten Verabreichung und Freund's unvollständiges Adjuvans für Verstärkungsdosen. Die Präparation wird typischerweise an einer Vielzahl von Stellen und typischerweise in zwei oder mehr Dosen über einen Zeitraum von wenigstens vier Wochen verabreicht. Das Serum wird geerntet und auf das Vorliegen eines Antikörpers gegen eine Verbindung der Ecstasy-Klasse getestet, wobei in einem Standardimmuntest oder einer Präzipitationsreaktion ein Konjugat aus der Verbindung der Ecstasy-Klasse und einem Protein oder ein Analoges verwendet wird.
  • Polyklonale Antiseren werden typischerweise Antikörper enthalten, welche nicht mit einer Verbindung der Ecstasy-Klasse reagieren können, als auch Antikörper gegen eine Verbindung der Ecstasy-Klasse, die mit anderen Substanzen einschließlich Amphetamin, Methamphetamin und HMMA kreuzreaktiv sind. Verfahren zur Reinigung spezifischer Antikörper aus einem polyklonalem Antiserum sind im Stand der Technik bekannt. Ein solches Verfahren ist eine Affinitätsreinigung unter Verwendung einer Säule einer Verbindung der Ecstasy-Klasse, die mit einer festen Phase konjugiert ist. Eine Art der Herstellung einer Säule mit einer Verbindung der Ecstasy-Klasse ist es, eine Verbindung der Ecstasy-Klasse oder ein Analoges dieser Erfindung mit einem Protein zu konjugieren, das von dem Protein, das in dem Immunogen verwendet wird, verschieden ist, und dann das Konjugat an einem kommerziell erhältlichen aktivierten Harz wie z. B. CNBr-aktivierter SEPHAROSETM zu befestigen. Der Antikörper gegen die Verbindung der Ecstasy-Klasse wird über die Säule geleitet, die Säule wird gewaschen, und der Antikörper wird mit einem milden denaturierenden Puffer wie z. B. 0,1 M Glycin, 0,2 M NaCl, pH 2,5 eluiert.
  • Die monoklonalen Antikörper dieser Erfindung können durch eine Anzahl verschiedener Techniken hergestellt werden, die im Stand der Technik bekannt sind. Im Hinblick auf die Hybridomtechnologie wird der Leser im allgemeinen auf Harrow & Iane (1988), die US-Patente Nr. 4 491 632 , 4 472 500 und 4 444 887 und auf Methods in Enzymology, 73B:3 (1981) verwiesen. Der häufigste Weg, monoklonale Antikörper zu produzieren, ist es, eine Milzzelle oder eine andere Antikörper-produzierende Zelle, die aus einem Tier gewonnen wurde, das wie vorher beschrieben mit einer Verbindung der Ecstasy-Klasse immunisiert wurde, zu immortalisieren und zu klonieren. Der Klon wird durch ein Verfahren wie z. B. eine Fusion mit einem nicht produzierenden Myelom, durch ein Transfizieren mit Epstein-Barr-Virus oder ein Transformieren mit onkogener DNA immortalisiert. Die behandelten Zellen werden kloniert und kultiviert, und Klone werden ausgewählt, welche einen Antikörper mit der gewünschten Spezifität produzieren. Tests auf die Spezifität werden durch eine Anzahl von Techniken mit Kulturüberständen durchgeführt, beispielsweise indem das immunisierende Antigen in einem Immuntest als das Nachweisreagens verwendet wird. Ein Vorrat des monoklonalen Antikörpers aus dem ausgewählten Klon kann dann aus einem großen Volumen des Kulturüberstands oder aus der Ascitesflüssigkeit von geeignet präparierten Wirtstieren, denen der Klon injiziert wurde, gereinigt werden. Der Antikörper kann im rohen Überstand oder im Ascites auf Aktivität hin getestet werden, und er wird ggf. unter Verwendung von standardmäßigen biochemischen Präparationstechniken wie z. B. Ammoniumsulfatfällung, Ionenaustauschchromatographie und Gelfiltrationschromatograpie gereinigt.
  • Alternative Verfahren zum Erhalten von Antikörpern beinhalten ein Inkontaktbringen einer immunkompetenten Zelle oder eines viralen Teilchens mit einem Analog-Protein-Komplex dieser Erfindung in vitro. In diesem Zusammenhang bedeutet ”immunkompetent”, daß die Zelle oder das Teilchen in der Lage ist, einen Antikörper zu exprimieren, der für das Antigen spezifisch ist, ohne daß eine weitere genetische Umordnung nötig ist, und daß dieser aus einer Zellmischung durch Präsentation des Antigens selektioniert werden kann. Immunkompetente eukaryotische Zellen können aus einem immunisierten Säugetierdonor geerntet werden, oder sie können aus einem nicht immunisierten Donor geerntet werden und in vitro prästimuliert werden, indem diese in Gegenwart von Immunogen und immunstimulatorischen Wachstumsfaktoren kultiviert werden. Zellen der gewünschten Spezifität können durch ein Inkontaktbringen mit dem Immunogen unter Kulturbedingungen, die zu der Proliferation der spezifischen Klone, nicht aber der unspezifischen Klone führen, selektioniert werden. Immunkompetente Phagen können konstruiert werden, um die Immunglobulinabschnitte des variablen Bereichs auf ihrer Oberfläche zu exprimieren. Siehe Marks et al., New Engl. J. Med. 335:730, 1996; WO Patentschriften 94/13804 , 92/01047 und 90/02809 ; und McGuinness et al., Nature Biotechnol. 14: 1149, 1996. Ein Phage mit der gewünschten Spezifität kann beispielsweise durch ein Haften an einem Komplex aus einer Verbindung der Ecstasy-Klasse und einem Protein, welcher an einer festen Phase befestigt ist, selektioniert werden und dann in E. coli amplifiziert werden.
  • Antikörper, die unter Verwendung irgendeiner der oben erwähnten Techniken erhalten wurden, werden nicht nur im Hinblick auf ihre Fähigkeit, mit einer Verbindung der Ecstasy-Klasse zu reagieren, sondern ebenfalls im Hinblick auf eine geringe Kreuzreaktivität mit potentiell störenden Substanzen hin gescreened oder gereinigt. Die ”Kreuzreaktivität” wird in einem quantitativen Immuntest bestimmt, indem unter Verwendung bekannter Verdünnungen des Zielanalyten, z. B. MDMA, eine Standardkurve aufgenommen wird. Die Standardkurve wird dann verwendet, um die apparente Konzentration der störenden Substanz zu berechnen, die in verschiedenen bekannten Mengen in Proben vorlag, die unter ähnlichen Bedingungen getestet wurden. Die Kreuzreaktivität ist die apparente Konzentration, geteilt durch die tatsächliche Konzentration, multipliziert mit 100. Ein Immuntest zum Bestimmen der Kreuzreaktivität ist ein Test vom Typ CEDIA®, welcher ein ED28-(MD-MDA)2-Donorpolypeptid verwendet, wie im Detail in Beispiel 10 beschrieben wird. Alternativ kann die Kreuzreaktivität in demselben Typ von Immuntests bestimmt werden, in welchem der Antikörper schließlich verwendet wird.
  • Es lohnt sich im allgemeinen, Antikörper auf eine Kreuzreaktivität mit anderen pharmazeutischen Verbindungen zu screenen, die Patienten begleitend einnehmen können, insbesondere jene, die im Urin ausgeschieden werden und eine Struktur aufweisen, die eine gewisse Ähnlichkeit mit Verbindungen der Ecstasy-Klasse aufweist. Von besonderem Interesse sind die rezeptfreien Allergie- und Erkältungsmedikamente wie z. B. (±)-Ephedrin, (+)-Pseudoephedrin und Phenylpropanolamin. Wenn die für die Ecstasy-Klasse spezifischen Reagenzien in Kombination mit Reagenzien zum Nachweis von Amphetamin und Methamphetamin verwendet werden sollen, ist zusätzlich eine geringe Kreuzreaktivität gegenüber diesen rezeptfreien Allergie- und Erkältungsmedikamenten erwünscht, um die Wechselwirkung zwischen den verschiedenen Reagenzien zu verringern und somit die Testplanung und Formulierung zu vereinfachen.
  • Antikörper gegen Verbindungen der Ecstasy-Klasse gemäß dieser Erfindung sind nützlich zum Nachweis von Verbindungen der Ecstasy-Klasse und zum Reinigen von Verbindungen der Ecstasy-Klasse aus einer Mischung. Eine Reinigung von Verbindungen der Ecstasy-Klasse unter Verwendung eines Antikörpers in Immunaffinitätstechniken ist nützlich bei der Isolierung präparativer Mengen von Verbindungen der Ecstasy-Klasse aus Verunreinigungen, die durch andere Techniken mitgereinigt werden. Eine Reinigung von Verbindungen der Ecstasy-Klasse in Spurenmengen aus klinischen Proben ist wünschenswert, wenn die Proben potentiell eine Substanz enthalten, die keine Verbindung der Ecstasy-Klasse ist, aber die Ablesung in dem Nachweissystem komplizieren kann. Beispielsweise erfordern die GC/MS-Tests im allgemeinen eine Extraktion des Analyten aus der wäßrigen Probe.
  • Eine gängige Extraktion aus der flüssigen oder festen Phase kann hohe Hintergrundsignale und eine schlechte Nachweisempfindlichkeit ergeben. Eine Analyten-spezifische Immunadsorption verbessert das Ausmaß der Selektion und konzentriert ebenfalls den Analyten in einem kleineren Volumen als dem der ursprünglichen Probe.
  • Mögliche Verfahren der Immunaffinitätsreinigung umfassen eine Präzipitation mit doppeltem Antikörper, eine Präzipitation mit Protein A und die Bildung anderer Typen von Antikörper-Konjugaten. Ein solches Verfahren ist die Festphasenadsorption. Der Antikörper wird an irgendeinem geeigneten Harz befestigt, die ursprüngliche Probe wird mit dem Harz in Kontakt gebracht, das Harz wird gewaschen und die Probe wird eluiert. Bevorzugte Harze umfassen: Sepharose® (Pharmacia), Poros®-Harze (Roche Molcular Biochemicals, Indianapolis), Actigel SuperflowTM-Harze (Sterogene Bioseparations Inc., Carlsbad CA) und DynabeadsTM (Dynal Inc., Lake Success, NY).
  • Ein Kopplungsverfahren ist wie folgt: Die benötigte Menge an aktivierter Sepharose® wird gewogen, wobei das gewünschte Kopplungsverhältnis und die Tatsache berücksichtigt werden, daß 1 g gefriergetrocknetes Material zu einem Gelvolumen von 3,5 ml aufquillt. Das Gel wird rekonstituiert und in einem Waschpuffer (1 mM HCl) (3 ml und dann 200 ml pro Gramm) gewaschen, und dann in einem Kopplungspuffer (0,1 M NaHCO3, 0,5 M NaCl, pH 8,3) (50 ml pro Gramm) gewaschen, wobei ein Buchner-Trichter verwendet wird. Der Antikörper wird in dem Kopplungspuffer gelöst oder dorthinein ausgetauscht, und 5–10 mg werden pro ml gekoppelt. Der Gelkuchen wird in einen Behälter mit geeigneter Größe überführt, der Antikörper wird zugegeben, und das Volumen wird so eingestellt, daß sich eine 50%-ige Aufschlämmung ergibt. Die Suspension wird für 2 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 2 bis 8°C End-über-End gemischt. (Ein Rühren wird vermieden, um ein Scheren der Kügelchen zu verhindern.) Der Anteil des Antikörpers, welcher erfolgreich gekoppelt wurde, wird bestimmt, indem A280 vor und nach dem Koppeln gemessen wird. Dann wird ein Blockierpuffer zugegeben (1 M Ethanolamin, pH 8,0, oder 0,2 M Trispuffer, pH 8,0), und die Suspension wird für weitere 2 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 2 bis 8°C End-über-End gemischt. Das Gel wird in einem Buchner-Trichter mit Kopplungspuffer, einem zweiten Waschpuffer (0,1 M Acetat, 0,5 M NaCl, pH 4,0) und dann Kopplungspuffer (jeweils 100 ml pro Gramm) gewaschen. Das Affinitätsharz kann dann mit präparierter inaktivierter Sepharose® 4B verdünnt werden, um die gewünschte Bindungskapazität zu ergeben.
  • Harze dieser Art werden typischerweise unter gekühlten Bedingungen oder in Gegenwart eines Konservierungsmittels wie z. B. 0,1% Natriumazid konserviert. Eine Trennung kann durch Säulenchromatographie oder eine chargenweise Elution durchgeführt werden. Bei einem typischen Trennverfahren werden 10 ml einer Probe, die auf das Vorliegen einer Verbindung der Ecstasy-Klasse hin getestet wird (wie z. B. eine Urinprobe von einem menschlichen Patienten), mit 200 μl einer 50%-igen Aufschlämmung des Harzes gegen eine Verbindung der Ecstasy-Klasse vereinigt. Die Reaktion und Extraktion kann bequem in einem konischen Probenbehälter mit einem durch eine Kappe abgedeckten 10 ml Vorrat, der am Boden mit einer Fritte und einer zugestopften Spitze ausgerüstet ist, durchgeführt werden. Eine kleine Menge an Puffer kann ebenfalls zu der Probe zugegeben werden, wenn der Antikörper gegenüber einer pH-Änderung zwischen den Proben empfindlich ist. Die Mischung wird dann mit der Kappe abgedeckt, und das Harz wird für ca. 30 bis 120 min auf einem Plattform-Schüttler oder Rotator in Suspension gehalten. Das Harz wird von der Probe getrennt (z. B. durch Filtration oder Zentrifugation) und mit 10 ml phosphatgepufferter Salzlösung und dann zweimal mit Wasser gewaschen. Nach der letzten Wäsche wird das Harz trockengesaugt, indem für 2–5 s ein Vakuum angelegt wird. 1 ml Methanol wird dann zugegeben, das Harz wird für ~2–5 min inkubiert, und das Methanol wird zurückgewonnen. Das Methanoleluat kann dann auf das Vorliegen von Verbindungen der Ecstasy-Klasse hin charakterisiert werden, was mit dem Vorliegen von Verbindungen der Ecstasy-Klasse in der ursprünglichen Probe korreliert. Eine erfolgreiche Elution kann bestätigt werden, indem parallel Extraktionen mit Proben laufengelassen werden, welche Standardmengen einer Verbindung der Ecstasy-Klasse enthalten, oder indem ein interner Standard, wie z. B. eine kreuzreaktive Substanz oder ein stabiler Isotop-markierter interner Standard, in die Probe eingeschlossen wird. Analoge der Ecstasy-Klasse, welche zu diesem Zweck geeignet sind, wurden vorher in dieser Anmeldung beschrieben.
  • Umfaßt von dieser Erfindung sind Immuntestverfahren auf das Vorliegen von Verbindungen der Ecstasy-Klasse in einer interessierenden Probe, einschließlich, aber nicht begrenzt auf Körperflüssigkeiten von Patienten, die in dem Verdacht stehen, MDMA (”Ecstasy”) oder eine verwandte Droge genommen zu haben, z. B. Körperflüssigkeiten von Menschen. Geeignete Proben umfassen biologische Proben, die von Patienten entnommen wurden, welche gegebenenfalls verdünnt oder modifiziert wurden, um den Test zu erleichtern, experimentelle Proben, die durch irgendein chemisches oder biologisches Verfahren erzeugt wurden, und Standards, die bekannte Konzentrationen einer bestimmten Verbindung der Ecstasy-Klasse oder einer anderen Substanz(en) enthalten, die zur Eichung des Tests verwendet werden.
  • Nach Wunsch können die flüssigen biologischen Proben Urin, Serum, Plasma und Flüssigkeiten, die während einer Autopsie entnommen werden (wie z. B. Cerebrospinalflüssigkeit), einschließen. Gewebeproben können für einen Immuntest in ein flüssiges Medium extrahiert werden. Haarproben können ebenfalls getestet werden, indem diese in ein flüssiges Medium extrahiert werden. Beispielsweise kann das Haar in der Luft und Aceton gewaschen werden, um Öle zu entfernen, getrocknet werden und dann in einer Kugelmühle pulverisiert werden. 20–30 mg pulverisiertes Haar werden dann für ca. 5 h bei 40°C in einem neutralen Puffer inkubiert. Ebenso geeignet sind postmortale Cerebrospinalflüssigkeit oder Glaskörperflüssigkeit. Schweißproben können erhalten werden, indem beispielsweise ein PharmChek-Schweißpflaster (Sudormed, Santa Ana, CA) verwendet wird, welches einen Semi-Okklusivverband umfaßt, der aus einem Cellulose-Löschpapier-Sammelkissen für medizinische Zwecke besteht, das von einer dünnen Schicht Polyurethan und Acrylat-Klebstoffen bedeckt ist. Am Ende der Tragdauer wird das Kissen mit einem geeigneten Puffer, wie z. B. 2,5 ml 0,2 M Acetatpuffer mit Methanol bei pH 5,0 (25:75), Fogerson et al., J. Anal. Toxicol. 21: 451, 1997, oder mit Acetonitril eluiert.
  • In den meisten Fällen beinhalten die Tests die Verwendung eines Antikörpers, welcher gegen ein Analog-Protein-Konjugat dieser Erfindung hervorgerufen wurde oder welcher die charakteristischen Eigenschaften eines solchen Antikörpers aufweist.
  • Das Verfahren erfordert ein Vereinigen der Probe mit dem Antikörper unter Bedingungen, welche die Bildung eines stabilen Komplexes zwischen der Substanz, die getestet werden soll (hierin beschrieben als der ”Analyt” und typischerweise eine bestimmte Verbindung der Ecstasy-Klasse), und dem Antikörper erlauben. Darauf folgt ein Nachweisen jegliches gebildeten Komplexes aus einer Verbindung der Ecstasy-Klasse und einem Antikörper. Ein ”stabiler Komplex” ist ein Komplex zwischen Antikörper und Analyten (typischerweise nicht kovalent assoziiert), welcher wenigstens so lange bestehen bleibt, wie es dauert, das Vorliegen des Komplexes durch das geplante Verfahren zu messen.
  • Tests dieser Erfindung umfassen sowohl qualitative als auch quantitative Tests. Typische quantitative Verfahren beinhalten ein Mischen des Analyten mit einer vorbestimmten Menge des Reagensantikörpers und ein Korrelieren der Menge des gebildeten Komplexes mit der Menge des Analyten in der ursprünglichen Probe, indem eine Beziehung verwendet wird, die unter Verwendung von Standardproben festgestellt wurde, die bekannte Mengen des Analyten in dem Bereich enthielten, der für die zu testende Probe erwartet wurde. Bei einem qualitativen Test macht eine hinreichende Menge an Komplex ober- oder unterhalb eines Grenzwertes, der durch Proben aufgestellt wurde, von denen bekannt war, daß sie den Analyten enthielten oder davon frei waren, das Testergebnis aus. Wenn nichts anderes angegeben ist, bezieht sich der Vorgang des ”Messens” oder ”Bestimmens”, wie in dieser Anmeldung verwendet, sowohl auf die qualitative als auch die quantitative Bestimmung.
  • Die Tests dieser Erfindung umfassen sowohl auf einer Trennung basierende als auch homogene Tests. Bei den auf einer Trennung basierenden Tests beinhaltet das Nachweisen des Komplexes ein Verfahren, worin der gebildete Komplex physisch von entweder dem nicht umgesetzten Analyten, dem nicht umgesetzten Antikörper oder beiden abgetrennt wird. Siehe z. B. US-Patent Nr. 3 646 346 . Der Komplex kann zuerst in der Flüssigkeitsphase gebildet werden und dann anschließend durch ein Festphasenreagens eingefangen werden oder auf der Grundlage einer veränderten physikalischen oder chemischen Eigenschaft, wie beispielsweise durch Gelfiltration oder Präzipitation, abgetrennt werden. Alternativ kann eines der Reagenzien an einer festen Phase befestigt werden, bevor es mit anderen Reagenzien in Kontakt gebracht wird, und dann kann der Komplex gewonnen werden, indem die feste Phase von nicht umgesetzten Reagenzien freigewaschen wird. Auf einer Trennung basierende Tests beinhalten typischerweise die Verwendung eines markierten Analogen oder eines Antikörpers, um den Nachweis oder die Quantifizierung des Komplexes zu erleichtern. Geeignete Markierungen sind Radioisotope wie z. B. 125I, Enzyme wie z. B. Peroxidase und β-Galactosidase und fluoreszierende Markierungen wie z. B. Fluoresceinisothiocyanat. Der Trennungsschritt beinhaltet ein Entfernen des markierten Reagenzes, das in Komplexform vorliegt, von dem nicht umgesetzten markierten Reagens. Die Menge der Markierung in dem Komplex kann direkt gemessen werden oder aus der Menge, die nicht umgesetzt zurückbleibt, abgeleitet werden.
  • Bei homogenen Tests wird der Komplex typischerweise nicht von nicht umgesetzten Reaktionskomponenten abgetrennt, sondern stattdessen wird das Vorliegen des Komplexes durch eine Eigenschaft nachgewiesen, welche wenigstens einer der Reaktanden als eine Folge des Einbaus in den Komplex erwirbt oder verliert. Homogene Tests, die im Stand der Technik bekannt sind, umfassen Systeme, die Paare aus Fluorochrom und Fluorochrom-Löscher auf unterschiedlichen Reagenzien ( US-Patente Nr. 3 996 345 , 4 161 515 , 4 256 834 und 4 261 968 ); Paare aus Enzym und Enzyminhibitor auf unterschiedlichen Reagenzien ( US-Patente Nr. 4 208 479 , 4 233 401 , 3 817 837 und das Europäische Patent EP 165 716 ); Latex-Trübungsinhibitionstests (Price und Newman ”Light Scattering Immunoassay”, Principles and Practice of Immunoassay (Price und Newman, Herausgeber), New York: Stockton Press, 1991, Seiten 446–481); Paare aus Chromophor und Chromophor-Modifikator auf unterschiedlichen Reagenzien ( US-Patent Nr. 4 208 479 ); und Immuntests mit kloniertem Enzymdonor einschließen.
  • Nützliche Markierungen zur Verwendung bei den Analogen dieser Erfindung für Immuntesttechniken umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Radioisotope, eine fluoreszierende Gruppe, eine Fluoreszenz-löschende Gruppe, eine phosphoreszierende Gruppe, eine chemilumineszente Gruppe, eine elektrochemisch aktive Gruppe, eine elektrochemilumineszente Gruppe, irgendeine Gruppe, die beim Binden eine Änderung bei der Fluoreszenz, Phosphoreszenz, Chemilumineszenz oder einer elektrochemischen Eigenschaft erfährt, ein Enzym, einen Enzymdonor, einen Enzyminhibitor, ein Enzymsubstrat, einen Enzymcofaktor und eine prosthetische Enzymgruppe.
  • Die Tests dieser Erfindung umfassen sowohl Sandwich- als auch Kompetitionstests. Sandwichtests beinhalten typischerweise die Bildung eines Komplexes, bei welchem der zu messende Analyt sandwichartig zwischen einem Reagens, wie z. B. einem ersten Antikörper, der schließlich für die Abtrennung des Komplexes verwendet wird, und einem anderen Reagens, wie z. B. einem zweiten Antikörper, welcher als eine Markierung für den abgetrennten Komplex verwendet wird, liegt. Kompetitionstests beinhalten ein System, bei welchem der zu messende Analyt mit einem Analogen des Analyten um die Bindung an ein anderes Reagens, wie z. B. einen Antikörper, konkurriert. CEDIA® ist ein Beispiel für einen Kompetitionstest. Umfaßt von der Erfindung sind ebenfalls Tests, die weder Sandwich- noch Kompetitionstests sind, wie gewisse Tests, die eine Immunpräzipitation beinhalten.
  • Für Verbindungen der Ecstasy-Klasse spezifische Immuntests, die Antikörper gegen eine Verbindung nach Anspruch 1 dieser Erfindung verwenden, werden mit Hilfe der Spezifität des Antikörpers spezifisch gemacht. Für Tests, die weiterhin Proteinkonjugate einsetzen, wie z. B. in dem Fall, wo ein Hapten (d. h. eine Verbindung der Ecstasy-Klasse oder ein Analoges) mit einem Enzympolypeptid markiert wird, kann das Hapten durch irgendein geeignetes Verfahren an dem Proteinkonjugat befestigt werden. Bei gewissen Ausführungsformen wird die Chemie, die hierin zur Bildung von immunogenen Proteinkonjugaten von Analogen beschrieben wird, ebenfalls verwendet, um das Proteinkonjugat herzustellen, das als ein Testreagens verwendet wird. Auf diese Weise wird der Haptenkern dem Antikörper in ungefähr derselben Orientierung wie während des Immunisierungsereignisses präsentiert, als der Antikörper erzeugt wurde.
  • Die Testverfahren dieser Erfindung umfassen homogene Enzymtests, in welchen eine Verbindung der Ecstasy-Klasse oder ein Analoges nach Anspruch 1 mit einem aktiven Enzym konjugiert werden. Die Konjugation wird so eingerichtet, daß die Bindung eines Antikörpers gegen eine Verbindung der Ecstasy-Klasse an das Analoge die enzymatische Aktivität auf eine quantitative Weise beeinflußt. Wenn eine Probe, die eine Verbindung der Ecstasy-Klasse enthält, mit dem Antikörper vorgemischt wird, komplexiert der Antikörper mit der Verbindung der Ecstasy-Klasse und wird an einer Bindung an das Enzymkonjugat gehindert. Auf diese Weise kann die Aktivität des Enzyms mit der Menge einer Verbindung der Ecstasy-Klasse, die in der Probe vorliegt, korreliert werden. Von Enzymamplifikationstests wird in dem US-Patent Nr. 3 852 157 berichtet.
  • Enzymkomplementationstests werden allgemein in dem US-Patent Nr. 4 708 929 beschrieben. Verwandte Reagenzien und Methoden werden in den US-Patenten Nr. 5 254 577 , 5 444 161 , 5 464 747 und 5 514 560 gelehrt. Immuntests mit einem klonierten Enzymdonor für Procainamid und N-Acetylprocainamid (NAPA) werden in den US-Patenten Nr. 5 439 798 und 5 525 474 beschrieben. Zu Zwecken der Weiterverfolgung von Patenten in den USA wird auf die oben aufgelisteten Patente hiermit vollständig Bezug genommen. Enzymkomplementationstests, die auf dem Enzym β-Galactosidase basieren, sind unter der eingetragenen Marke CEDIA® leicht kommerziell erhältlich. Der Leser wird für weitere Informationen auf die CEDIA®-Produktblätter und technische Handbücher verwiesen.
  • Typischerweise beinhaltet ein Enzymkomplementationsimmuntest dieser Erfindung ein Vereinigen der Probe mit: einem für eine Verbindung der Ecstasy-Klasse spezifischen Antikörper; einem Enzymdonorpolypeptid-Konjugat; einem Enzymakzeptorpolypeptid (worin das Enzymakzeptorpolypeptid in der Lage ist, mit dem Enzymdonorpolypeptid-Konjugat in Abwesenheit eines Antikörpers gegen Verbindungen der Ecstasy-Klasse einen aktiven Enzymkomplex zu bilden); und einem Substrat, das in der Lage ist, durch den aktiven Enzymkomplex in ein Produkt umgewandelt zu werden. Die Menge des Produkts wird dann gewöhnlich als eine Funktion der Zeit gemessen.
  • Für die Zwecke von Komplementationstests ist der für eine Verbindung der Ecstasy-Klasse spezifische Antikörper vorzugsweise ein Antikörper, der gegen ein Analog/Protein-Konjugat dieser Erfindung hervorgerufen wurde oder der die charakteristischen Eigenschaften eines solchen Antikörpers aufweist. Außer, daß diese auf eine Kreuzreaktivität hin gescreent wurden, weisen wünschenswerte Antikörper drei andere Merkmale auf. Eines, welches als ”Inhibition” bezeichnet wird, bezieht sich darauf, wie gut der Antikörper das Enzymdonor-Konjugat bindet und die Bildung aktiver β-Galactosidase blockiert (inhibiert). Eine ausreichende Inhibition (vorzugsweise wenigstens ca. 70%) wird benötigt, um ein angemessenes Signal zu liefern. Ein zweites Kriterium ist der Titer des Antikörpers, welcher benötigt wird, um das gewünschte Inhibitionsniveau zu erhalten, wobei eine Inhibition bei niedrigeren Antikörperniveaus wünschenswert ist. Ein drittes Kriterium, welches als ”Modulation” bezeichnet wird, bezieht sich darauf, wie gut der Analyt der Probe in der Lage ist, mit dem Konjugat um die Enzymbindung zu konkurrieren. Die Modulation wird als der Unterschied bei der Enzymgeschwindigkeit zwischen einer Probe, die eine vorgegebene Konzentration des Analyten aufweist, und einer Probe, die keinen Analyten enthält, geteilt durch die Geschwindigkeit bei der vorgegebenen Konzentration des Analyten, berechnet. Eine bessere Modulation bei der Zielkonzentration für den Entscheidungspunkt positiv/negativ (d. h. ”den Grenzwert” des Tests) korreliert bei Konzentrationen in der Nähe des Grenzwerts mit einer besseren Testempfindlichkeit und -genauigkeit.
  • Das Enzymdonor-Enzymakzeptor-Paar ist ein Paar von Polypeptiden, welche sich spontan im Reagenspuffer unter Bildung eines aktiven Enzymkomplexes zusammenfügen. Der aktive Enzymkomplex ist in der Lage, ein Substrat enzymatisch in ein Produkt umzuwandeln, das unterschiedlich nachgewiesen wird. Typischerweise hat das Produkt eine andere Farbe als das Substrat und kann in einem Spektrophotometer quantifiziert werden. Das Paar aus Donor und Akzeptor sind typischerweise zwei funktionale Untereinheiten eines gemeinsamen Enzyms. Die Untereinheiten können in dem nativen Enzym nicht-kovalent assoziiert sein oder sie können Defektversionen eines gemeinsamen Polypeptids sein, die einander ergänzen, wenn sie zusammen vorliegen.
  • Nach Wunsch können Enzymdonor- und Enzymakzeptorpolypeptide auf dem Enzym β-Galactosidasepolypeptid basieren. Ein ”β-Galactosidasepolypeptid” ist ein Polypeptid, das auf der Grundlage seiner Aminosäuresequenz oder der enzymatischen Aktivität dahingehend identifizierbar ist, daß es sich aus einem Enzym mit β-Galactosidaseaktivität entwickelt hat. Die Definition umfaßt nicht nur natürlich auftretende β-Galactosidase, sondern ebenfalls Fragmente, Deletionsmutanten, Fusionsproteine, Mutanten und andere darauf basierende Varianten, welche durch solche Verfahren wie enzymatische Fragmentierung und Gentechnologie mit den relevanten codierenden Sequenzen erhalten wurden. Besondere β-Galactosidasepolypeptide werden in den oben aufgelisteten US-Patentanmeldungen beschrieben, welche sich auf Immuntests mit kloniertem Enzymdonor beziehen.
  • β-Galactosidase-Enzymakzeptoren können über eine Deletionsmutante des β-Galactosidasegens produziert werden. EA22 weist z. B. eine Deletion der Aminosäurereste 13–40 auf. Andere Enzymakzeptorfragmente von β-Galactosidase, welche die natürliche Sequenz enthalten, welche die Aminosäureposition 602 einschließt, können ebenfalls verwendet werden. Andere Beispiele umfassen EA5, 3A11, EA14, EA17, EA18, EA20, EA23 und EA24. Das distale Ende des deletierten Segments liegt normalerweise zwischen den Aminosäurepositionen 26 und 54 der β-Galactosidasesequenz. Bei EA22 ist das distale Ende des Deletionssegments die Aminosäure 40. Ein anderer β-Galactosidase-Enzymdonor ist ED28. ED28 ist ein Peptid mit 90 Aminosäuren, welches die Reste 6–45 von β-Galactosidase enthält, wobei Cysteine an den Positionen 1 und 46 (in Bezug auf die Nummerierung des ursprünglichen β-Galactosidasefragments) vorliegen. Die Sequenz von ED28 ist (SEQ ID NR. 1) Met-Asp-Pro-Ser-Gly-Asn-Pro-Tyr-Gly-Ile-Asp-Pro-Thr-Gln-Ser-Ser-Pro-Gly-Asn-Ile-Asp-Pro-Cys-Ala-Ser-Ser-Asn-Ser-Leu-Ala-Val-Val-Leu-Gln-Arg-Arg-Asp-Trp-Glu-Asn-Pro-Gly-Val-Thr-Gln-Leu-Asn-Arg-Leu-Ala-Ala-His-Pro-Pro-Phe-Ala-Ser-Trp-Arg-Asn-Ser-Glu-Glu-Ala-Arg-Thr-Asp-Cys-Pro-Ser-Gln-Gln-Leu-Ala-Gln-Pro-Glu-Trp-Gly-Leu-Glu-Ser-Arg-Ser-Ala-Gly-Met-Pro-Leu-Glu; siehe ebenfalls die Europäische Patentanmeldung Nr. 90 308 937.3 und die US-Patente Nr. 4 708 929 , 5 444 161 und 5 763 196 . Die zwei Cysteinreste können zur genauen und reproduzierbaren Plazierung von Sulfhydryl-reaktiven Addukten einer Verbindung der Ecstasy-Klasse oder eines Analogen verwendet werden, wie vorher beschrieben wurde. Vor der Konjugation mit dem Hapten wird das reduzierende Reagens, welches normalerweise bei der Lagerung von ED28 verwendet wird, durch eine geeignete Entsalzungstechnik, wie z. B. auf einer Pharmacia NAP5TM-Säule, wie in dem US-Patent Nr. 5 439 798 beschrieben wird, entfernt. Die Verbindung der Ecstasy-Klasse oder das Analoge wird dann mit Maleinimid-Addukten konjugiert, wie an anderer Stelle in dieser Anmeldung beschrieben wird. Eine Anpassung der Verknüpfung kann durchgeführt werden, indem die Enzyminhibition durch einen für eine Verbindung der Ecstasy-Klasse spezifischen Antikörper überwacht wird. Typische verwendete Linkergruppen sind Maleinimid-Addukte, wobei der Maleinimidstickstoff und der Stickstoff der Verbindung der Ecstasy-Klasse oder der Stickstoff des Analogen durch -(CH2CH2) – verknüpft sind.
  • Beispielhafte Substrate zur Verwendung in Immuntests, die auf β-Galactosidase basieren, umfassen jene, die in den US-Patenten Nr. 5,032 503 , 5 254 677 , 5 444 161 und 5 514 560 beschrieben werden. Ein solches Substrat ist Chlorphenolrot-β-D-galactopyranosid. Eine Optimierung der Merkmale und Bedingungen der Tests, welche von dieser Erfindung umfaßt sind, ist eine Sache von Routineversuchen, die ein Durchschnittsfachmann kennt.
  • Reagenzien und Puffer, die in den Tests dieser Erfindung verwendet werden, können getrennt oder in Kombination in Form von Kits verpackt werden, um den Vertrieb zu erleichtern. Die Reagenzien werden in geeigneten Behältern zur Verfügung gestellt und werden typischerweise in einer Verpackung, zusammen mit schriftlichen Anleitungen, die sich auf die Testverfahren beziehen, zur Verfügung gestellt.
  • Die Analogen und die spezifischen Antikörper dieser Erfindung können durch Befestigung an einem festen Einfangvehikel unlöslich gemacht werden. Dieses kann beispielsweise an der Wand eines Gefäßes sein, an einem Feststoffteilchen oder an einem Träger mit großem Molekulargewicht, der in Suspension gehalten werden kann, aber durch physikochemische Mittel wie z. B. durch Zentrifugation oder Mikrofiltration entfernt werden kann. Die Befestigung muß nicht kovalent sein, ist aber zumindest von ausreichender Beständigkeit, um jegliche Trenntechniken (einschließlich Wäschen) auszuhalten, die Teil der Testverfahren sind. Geeignete partikuläre Materialien umfassen Agarose, Polystyrol, Cellulose, Polyacrylamid, Latexteilchen, magnetische Teilchen und fixierte rote Zellen. Geeignete, kommerziell erhältliche Matrizes umfassen Sepharose® (Pharmacia), Poros®-Harze (Roche Molcular Biochemicals, Indianapolis), Actigel SuperflowTM-Harze (Sterngene Bioseparations Inc., Carlsbad CA) und DynabeadsTM (Dynal Inc., Lake Success, NY). Die Wahl ist nicht kritisch und hängt im allgemeinen von solchen Merkmalen wie Stabilität, Kapazität, Zugänglichkeit des gekoppelten Antikörpers, Flussgeschwindigkeit, der Fähigkeit, das Harz in der Reaktionsmischung zu dispergieren, und der Leichtigkeit der Trennung ab.
  • Geeignete Ansätze zur Befestigung der Substanz auf der festen Oberfläche hängen von dem Wesen des Analogen oder des Antikörpers und der festen Phase ab. Befestigungssysteme umfassen jene, die in der folgenden Tabelle gezeigt sind:
    TABELLE 1: Konjugationschemie
    Stelle der Befestigung oder Derivatisierung auf dem Harz Verwendetes Reagens Befestigungsstelle des Antikörpers
    Hydroxylgruppen CNBr Aminogruppen
    Hydroxylgruppen Carbonyldiimidazol Aminogruppen
    Aldehydgruppen NaBH4 oder NaCNBH3 Aminogruppen
    Sulfhydryl-reaktive Gruppe (RCH2I, R-Maleinimid, Disulfid) (Spontan) Disulfidbindungen (nach Reduktion)
    Aminogruppen Wasserlösliche Carbodiimide Carboxylgruppen
    Carboxylgruppen Wasserlösliche Carbodiimide Aminogruppen
    N-Hydroxysuccinimidester (Spontan) Aminogruppen
    Epoxidgruppen (Spontan) Aminogruppen
    Hydrazidgruppen (Spontan) Kohlenhydratgruppen (nach Periodatoxidation)
    Protein A oder Protein G (Spontan) Antikörper Fc-Bereich
  • Beispielsweise können Antikörper, die durch Chromatographie über eine Protein A-Affinitätschromatographie gereinigt wurden, wie von dem Hersteller empfohlen an mit Cyanbromid aktivierter Sepharose® CL-4B (Pharmacia, Piscataway, NJ) befestigt werden. Das Harz wird so präpariert, daß es ungefähr 0,8 mg gebundenen Antikörper pro ml Harzbettvolumen enthält. Das Verfahren kann wie folgt durchgeführt werden: Die benötigte Menge an aktivierter Sepharose® wird gewogen, wobei berücksichtigt wird, daß 1 g gefriergetrocknetes Material zu einem Gelvolumen von 3,5 ml aufquillt. Das Gel wird rekonstituiert und im Waschpuffer (1 mM HCl) (3 Zyklen einer Harzwäsche, bei 200 ml pro Gramm) gewaschen und dann dreimal mit Kopplungspuffer (0,1 M NaHCO3, 0,5 M NaCl, pH 8,3) (50 ml pro Gramm) gewaschen, indem ein Buchner-Trichter verwendet wird. Der Antikörper wird in Kopplungspuffer gelöst oder ausgetauscht, und es werden 5–10 mg pro ml gekoppelt. Der Gelkuchen wird in einen Behälter mit geeigneter Größe überführt, der Antikörper wird zugegeben, und das Volumen wird so eingestellt, daß eine 50%-ige Aufschlämmung erzeugt wird.
  • Die Suspension wird für 2 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 2 bis 8°C End-über-End gemischt. (Ein Rühren wird vermieden, um ein Scheren der Kügelchen zu verhindern). Der Anteil des Antikörpers, der erfolgreich gekoppelt wurde, kann durch ein Messen von A280 vor und nach der Kopplung bestimmt werden. Dann wird Blockierungspuffer zugegeben (1 M Ethanolamin, pH 8,0, oder 0,2 M Trispuffer, pH 8,0), und die Suspension wird für weitere 2 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 2 bis 8°C End-über-End gemischt. Das Gel wird in einem Buchner-Trichter mit Kopplungspuffer, einem zweiten Waschpuffer (0,1 M Acetat, 0,5 M NaCl, pH 4,0) und dann Kopplungspuffer (jeweils 100 ml pro Gramm) gewaschen. Nach der letzten Wäsche mit Kopplungspuffer wird das Harz mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS, pH 7,4, 0,09% Natriumazid) in eine 50%-ige (v/v) Aufschlämmung überführt. Das präparierte Affinitätsharz kann gegebenenfalls mit einer 50%-igen (v/v) Aufschlämmung inaktivierter Sepharose® 4B verdünnt werden, um die gewünschte Bindungskapazität zu ergeben.
  • Natürlich können Antikörper, die zu einer Unlöslichkeit führen sollen, nach anderen Kriterien ausgewählt werden als die, die zu Testzwecken verwendet werden. Eine Modulation ist nicht, aber eine hohe Kapazität (oder Affinität) und eine geringe Kreuzreaktivität mit potentiell störenden Substanzen, wie z. B. Amphetamin und Methamphetamin, ist für einen Festphasenantikörper wünschenswert. Ein Antikörper, welcher für Verbindungen der Ecstasy-Klasse spezifisch ist und zur Verwendung als ein unlöslich gemachter Antikörper geeignet ist, wurde erhalten und weist die Laborbezeichnung 1A9 auf.
  • Ein unlöslich gemachtes Antigen kann in Tests für den Antikörper verwendet werden, und ein unlöslich gemachter Antikörper kann in Tests für das Immunogen verwendet werden. Markierungsverfahren und Prinzipien verschiedener Typen von Immuntests wurden vorher in dieser Offenbarung angegeben. Bei einem Festphasentest wird die Testprobe typischerweise mit der festen Phase gemischt, um ein Binden jeglicher Testsubstanz zu erlauben. Dann wird die feste Phase von der Probe und von jeglichem nicht-gebundenem Material abgetrennt, und die feste Phase wird gewaschen. Der nächste Schritt ist es, jegliche Substanz an der festen Phase zu bestimmen, die aus der Probe gebunden hat. Dieses kann durchgeführt werden, indem in die Reaktionsmischung ein markiertes Äquivalent des Analyten oder des Antikörpers, auf welchen getestet wird, eingeschlossen wird und die Menge des Analyten oder Antikörpers durch Kompetition bestimmt wird. Ein solches Verfahren wird in dem US-Patent Nr. 4 551 426 beschrieben. Alternativ kann die feste Phase in einem Sandwichformat verwendet werden, indem das gewaschene Harz mit einem Nachweismittel umgesetzt wird, das in der Lage ist, jegliche Substanz zu bestimmen, die das Harz spezifisch gebunden hat.
  • Unlöslich gemachtes Antigen und Antikörper können ebenfalls zu Zwecken der Reinigung oder Anreicherung von Substanzen, welche diese binden, als Affinitätsharze verwendet werden. Das Verfahren umfaßt ein Inkubieren des unlöslich gemachten Antigens oder Antikörpers mit dem Ausgangsmaterial unter Bedingungen, welche eine Bindung der Substanz erlauben, ein Entfernen des Ausgangsmaterials, gegebenenfalls ein Waschen der festen Phase und dann ein Gewinnen der gebundenen Substanz. Materialien, die mittels Antigen-Antikörper-Reaktivität binden, können im allgemeinen unter Verwendung organischer Lösungsmittel, Puffer mit hohem oder niedrigem pH (wie z. B. verdünnter Essigsäure oder Glycinpuffer, pH 2,4), hohem Salzgehalt (wie z. B. einer gepufferten Lösung von 1 M KSCN) oder organischen Lösungsmitteln (wie z. B. Methanol) eluiert werden.
  • Bei einer Abwandlung hiervon können ein unlöslich gemachtes Antigen oder ein Antikörper verwendet werden, um eine Probe vor einem Testen in einem Testsystem vorzubehandeln. Wenn beispielsweise eine Probe im Test auf eine Verbindung der Ecstasy-Klasse positiv ist, kann diese mit einer geeigneten Menge des Harzes gegen eine Verbindung der Ecstasy-Klasse behandelt werden und dann erneut getestet werden. Das Testergebnis wird als positiv bestätigt, wenn das Harz darin erfolgreich ist, den nachweisbaren Analyten aus dem Harz zu entfernen. Eine Weiterentwicklung des Adsorptionsverfahrens zur Durchführung eines bestätigenden Tests wird in der Internationalen Patentanmeldung WO 98/26644 beschrieben.
  • Bei einer anderen Variation wird das Harz nicht verwendet, um den Analyten aus der Probe zu eliminieren, sondern um diese damit anzureichern. Ein System besteht aus einem Probenextraktionskit aus der ImmunEluteTM-Produktserie von Microgenics. Ein Antikörper gegen Verbindungen der Ecstasy-Klasse mit den gewünschten Spezifitätscharakteristika wird, wie schon beschrieben, an Agarose gekoppelt. Das Harz wird als eine Suspension von 5 ml (50% Vol/Vol) in einem geeigneten Puffer, welcher 0,1% Natriumazid als Konservierungsmittel enthält, zur Verfügung gestellt. Der Kit enthält ebenfalls Polyprepsäulen mit jeweils 10 ml, die jeweils oben Kappen und an dem Ausfluß am Boden unterhalb der Fritte oder des Filters, welche das Harz an Ort und Stelle halten, entfernbare Stopfen aufweisen.
  • Um die Affinitätsanreicherung durchzuführen, wird die biologische Probe, wenn nötig, durch Zentrifugation oder Filtration aufgeklart, um eine Trübung zu entfernen. Eine negative Kontrolle und Standards werden hergestellt, indem von Analyten freies Urin zur Verfügung gestellt wird, in verschiedene Teströhrchen aufgeteilt wird und bekannte Mengen des Analyten über den erwarteten Bereich hinweg zugegeben werden. Die Kontrolle, die Standards und die Testproben (Volumina bis zu ~10 ml) werden dann auf eine entsprechende Extraktionsäule geschichtet. Wenn dieses passend ist und gewünscht wird, kann eine interne Kontrolle in jede Probe eingeschlossen werden, solange die Kontrollsubstanz ebenfalls von dem Antikörper erkannt wird und weder die Extraktion noch den Test stört. Gewisse Analoge gemäß dieser Erfindung sind für diesen Zweck geeignet. Das Harz wird gemischt, um eine gleichmäßige Suspension zur Verfügung zu stellen, und 200 μl Suspension werden zu jeder Probensäule zugegeben. Die Säulen werden dann mit Kappen verschlossen und für 30 bis 120 min auf einem Schüttler gemischt und anschließend mit dem dünnen Ende nach unten in ein geeignetes Gestell gestellt. Der Stopfen wird entfernt, und die Säule wird trockenlaufen gelassen. Das Harz wird gewaschen (z. B. 10 ml phosphatgepufferte Salzlösung, gefolgt von zweimal 10 ml deionisiertem und destilliertem Wasser). Nach einem Trocknen des Harzes unter einem schwachen Vakuum wird die Probe dann eluiert. Um dieses zu erreichen, wird die Säule erneut verstopft. 10 ml eines geeigneten Elutionslösungsmittels, wie z. B. Methanol, werden auf die Säule pipettiert, und diese wird 2–5 min stehen gelassen. Dann wird der Stopfen entfernt und das Methanol wird am Boden der Säule eluiert. Der Methanolextrakt kann dann durch ein geeignetes Verfahren, wie z. B. GC/MS, getestet werden. Alternativ kann ein Aliquot in einem wäßrigen Puffer verdünnt und durch einen Immuntest getestet werden.
  • Eine zusätzliche Erläuterung der Entwicklung und der Verwendung der Reagenzien und Tests gemäß dieser Erfindung wird in dem nachstehenden Abschnitt der Beispiele angegeben. Die Beispiele werden als ein weiterer Leitfaden für den Praktiker mit durchschnittlichem Fachwissen angegeben und sollen in keiner Weise als beschränkend aufgefaßt werden.
  • Beispiele
  • Beispiel 1: Herstellung von 3,4-Methylendioxyphenylaceton (3,4-MDPA) (nicht zur Erfindung gehörend)
  • Wasserstoffperoxid (70 ml, 30%) wurde vorsichtig zu einer Lösung von Ameisensäure (350 ml, 88%) in einem Dreihalskolben (1 1) zugegeben, welcher mit laufendem Wasser gekühlt wurde. Isosafrol (72 ml) wurde tropfenweise über einen Tropftrichter zu der Reaktionsmischung bei einer solchen Geschwindigkeit zugegeben, daß die Temperatur der Reaktionsmischung unterhalb von 35°C gehalten wurde. Nach Abschluß der Zugabe von Isosafrol wurde eine nicht-homogene Lösung erhalten. An diesem Punkt wurde Aceton (200 ml) zu der Reaktionsmischung bei einer solchen Geschwindigkeit zugegeben, daß die Temperatur unterhalb von 35°C gehalten wurde. Die Reaktion wurde über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen. Das Lösungsmittel wurde durch einen Rotationsverdampfer entfernt, welcher mit einer Trockeneis-Aceton-Kältefalle, einer Hochvakuumpumpe und einem Wasserbad ausgestattet war, dessen Temperatur 30°C nicht überschritt. Ethyläther (500 ml) wurde zu dem Rückstand zugegeben. Die Lösung wurde in einen Scheidetrichter überführt. Die organische Phase wurde mit Natriumbicarbonat (0,1 N, 2 × 500 ml) und Wasser (3 × 300 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde in einen Rundkolben überführt. Das Lösungsmittel wurde durch Rotationsverdampfung entfernt. Konzentriert Schwefelsäure (75 ml) wurde tropfenweise in Wasser (425 ml) verdünnt. Methanol (160 ml) wurde zu dem öligen Rückstand zugegeben und gemischt, um eine homogene Lösung zu erhalten. Die Schwefelsäurelösung wurde zu der methanolischen Reaktionsmischung zugegeben. Der Kolben wurde mit einem wassergekühlten Rückflußkühler und einem Heizmantel ausgerüstet. Die Reaktionsmischung wurde für vier Stunden unter Rückfluß erhitzt. Der Heizmantel wurde entfernt, und gestoßenes Eis (150 g) wurde zu der Reaktionsmischung zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde in einen Scheidetrichter überführt und mit Ethylether (1 × 350 ml, 1 × 150 ml und 1 × 100 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit Wasser (3 × 150 ml) gewaschen. Natriumhydroxid (40 ml, 0,1 N) wurde in Wasser (360 ml) verdünnt. Die organische Phase wurde mit verdünntem Natriumhydroxid (2 × 200 ml, 10 mM) und gesättigter Natriumchloridlösung (100 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde mit wasserfreiem Natriumsulfat (20 g) über Nacht getrocknet. Das Trockenmittel wurde abfiltriert und der Kuchen wurde mit Ethylether (2 × 10 ml) gewaschen. Das Lösungsmittel wurde durch Rotationsverdampfung entfernt. Das Produkt wurde bei verringertem Druck (2–0,5 mmHg) destilliert. Die zweite Fraktion, welche bei 90–100°C (~1 mmHg) destilliert wurde, enthielt das Produkt. Das Produkt wurde durch EI/MS mit einem m/z von 182 identifiziert. Das Infrarotspektrum (cm–1) zeigte Streckungen bei 1714 (C=O) und 2898 (C-H), welche dem Produkt entsprachen.
  • Beispiel 2: Herstellung von 1-N-tert-Butoxycarbonyl-1,4-diaminobutan (N-boc-DAB) (nicht zur Erfindung gehörend)
  • Dichlormethan (75 ml) wurde zu einem 250 ml-Rundkolben zugegeben. Ein trockener und sauberer Magnetrührer wurde in den Reaktionskolben zugegeben. 1,4-Diaminobutan (4,7 g) wurde in den Reaktionskolben zugegeben. Der Reaktionskolben wurde in Eis für 15 Minuten gekühlt. Di-tert-butyldicarbonat (2,75 g) wurde in Dichlormethan (25 ml) gelöst, und dann in einen Flüssigkeitszugabetrichter überführt. Die Di-tert-butyldicarbonatlösung wurde tropfenweise über einen Zeitraum von einer Stunde zu der Reaktion zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht rühren gelassen. Die Reaktionsmischung wurde mit Natriumhydroxid (3 × 50 ml, 0,1 N), Wasser (2 × 50 ml) und gesättigter Natriumchloridlösung (2 × 25 ml) gewaschen. Das Produkt wurde durch Blitzsäulenchromatographie auf Kieselgel (Lösungsmittel: Dichlormethan/Methanol/Ammoniumhydroxid; 60/40/3 v/v/v) gereinigt. Der Hauptfleck mit einem Rf = 0,3 und mit positiver Reaktion auf Ninhydrin-Spray entsprach dem Produkt. Die Fraktionen, welche das Produkt enthielten, wurden zusammengefaßt, und das Lösungsmittel wurde entfernt. 1,9 g Produkt wurden nach Trocknen unter Hochvakuum über Nacht erhalten.
  • Beispiel 3: Herstellung von N-(4'-tert-Butoxycarbonylaminobutyl)-3,4-methylendioxyamphetamin (N-boc-AB-MDA) (nicht zur Erfindung gehörend)
  • 3,4-MDPA (1,3 g) wurde in Isopropylalkohol (1 ml) in einem 10 ml-Rundkolben gelöst. N-boc-DAB (1,5 g) wurde in Isopropylalkohol gelöst und zu der Reaktionsmischung zugegeben. HgCl2 (50 mg) wurde in einem separaten Behälter in absolutem Ethanol (2 ml) gelöst. Isopropylalkohol (7 ml) wurde zu der HgCl2-Lösung zugegeben. Die HgCl2-Lösung wurde zu der Reaktionsmischung zugegeben. Aluminiumfolie (0,9 g) wurde in kleinen Stücken zu der Reaktionsmischung zugegeben. Die Reaktion wurde durch Erwärmen gestartet, wobei ein Wärmebrenner (heat gun) verwendet wurde. Der Beginn der Reaktion fiel mit der Erzeugung kleiner Wasserstoffbläschen zusammen. Nach einem vollständigen Verschwinden der Aluminiumfolie wurde die Reaktion für 30 min stehen gelassen. An diesem Punkt wies die Reaktionsmischung ein Erscheinungsbild einer grauen Aufschlämmung auf. Methanol (25 ml) wurde zu der Reaktionsmischung zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde zuerst durch ein rauhes Filterpapier, dann über einen Celitkuchen filtriert. Das Lösungsmittel wurde durch Rotationsverdampfung entfernt. Ein klarer öliger Rückstand wurde erhalten. Eine Analyse durch Dünnschichtchromatographie (DSC) auf Kieselgelplatten mit einem fluoreszierenden Indikator zeigt ein Produkt bei einem Rf = 0,3 (Lösungsmitel: Dichlormethan/Methanol/Triethylamin; 93/7/1; v/v/v). Das Produkt wurde durch Blitzchromatographie gereinigt. Geeignete Fraktionen wurden zusammengefaßt, und das Produkt wurde durch DSC als ein einzelner Fleck isoliert. Das Produkt wog nach Trocknen 1,2 g.
  • Beispiel 4: Herstellung von N-(4'-Aminobutyl)-3,4-methylen-dioxyamphetamin (AB-MDA) (nicht zur Erfindung gehörend)
  • N-boc-AB-MDA (300 mg) wurde in Trifluoressigsäure (2 ml) in einem bernsteinfarbigen Glasfläschchen gelöst. Ein Magnetrührer wurde zu der Reaktionsmischung zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde für eine Stunde gerührt. TFA wurde unter vermindertem Druck entfernt. Das fast weiße feste Produkt wurde bis zur weiteren Verwendung beim –80°C gelagert.
  • Beispiel 5: Herstellung von 4'-Maleinimidobutyl-3,4-methylendioxyamphetamin (NB-NDA)
  • AB-MDA (51 mg) wurde in Tetrahydrofuran (2,5 ml) gelöst. Gesättigte Natriumbicarbonatlösung (1,5 ml) wurde zu der Reaktionsmischung zugegeben. Methoxycarbonylmaleinimid (17 mg) wurde zu der Reaktionsmischung zugegeben. Ein Magnetrührer mit geeigneter Größe wurde zu der Reaktionsmischung zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde für zwei Stunden gerührt. An diesem Punkt war die Reaktion vollständig. Wasser (15 ml) und Ethylacetat (25 ml) wurden zu der Reaktionsmischung zugegeben. Die Mischung wurde in einen Scheidetrichter überführt. Die organische Phase wurde mit Wasser (10 ml) und einer gesättigten Natriumchloridlösung (15 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat (2 g) getrocknet. Das Lösungsmittel wurde durch Rotationsverdampfung entfernt. Das Produkt wurde durch HPLC gereinigt, wobei Wasser und Acetonitril (beide enthielten 0,1% TFA) als mobile Phase verwendet wurden. Eine semipräparative C4-Säule wurde als stationäre Phase verwendet. Der Hauptpeak (Rt = 14 min) wurde gesammelt und lyophilisiert. Dieses ergab 18,4 mg des Produkts.
    Massenspektrum (EI), m/z 329 (M-1), 315 (M-15), 195 (M-135), 1H-NMR (CD3OD), δ (ppm), 6,83 (s, 2H, =CH-), 6,69-6,79 (m, 3H, Ar-H), 5,9 (s, 2H, O-CH 2-O-), 3,55 (t, 3H, Ar-CH 2-), 3,41 (m, 1H, N-CH-), 3,06 (m, 4H, N-CH 2-), 1,67 (m, 4H, -CH 2-), 1,21 (d, 3H, -CH 3).
  • Beispiel 6: Herstellung des ED28-(MB-MDA)2-Konjugats
  • Eine Lösung von MB-MDA (0,2 mg) in Acetonitril (HPLC-Grad, 0,2 ml) wurde zu einer Lösung von entsalztem ED28 (1 mg) in Natriumphosphatpuffer (2,0 ml, 100 mM, pH 7,0) zugegeben. Die Reaktion wurde für eine Stunde bei Raumtemperatur stehen gelassen.
  • Das Konjugat wurde durch HPLC unter Verwendung von Wasser und Acetonitril (beide enthielten 0,1 TFA) als mobile Phase gereinigt. Eine halbpräparative C4-Säule wurde als stationäre Phase verwendet. Das Konjugat eluierte bei Rt = 20,4 min, wobei ein linearer Stufengradient von 20 bis 40 Acetonitril in 20 min bei einer Laufzeit von 25 min verwendet wurde. Die Flußgeschwindigkeit betrug 4 ml pro min. Die Reinigung wurde bei 280 nm überwacht. Das Produkt wurde unter Verwendung von OD280 und ε280 = 22.600 cm–1M–1 auf 0,9 mg quantifiziert.
  • Beispiel 7: Herstellung eines Immunogens der Ecstasy-Klasse
  • Napfschneckenhämocyanin (KLH, 20 mg, Pierce chemicals) wurde in Natriumphosphatpuffer (2 ml, 100 mM, pH = 8,00) rekonstituiert. 2-Iminothiolan (2-IT, 3,1 mg) wurde in Wasser vom HPLC-Grad (0,5 ml) gelöst. Die Lösung von 2-IT wurde in einem Teil zu der KLH-Lösung zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde für 1 min gemischt, wobei eine fast klare graue Lösung erhalten wurde. Die Reaktion wurde für 60 min stehen gelassen. Das aktivierte KLH-(SH)n wurde auf einer Sephadex PD-10-Säule entsalzt, welche mit Natriumphosphatpuffer (100 mM, pH = 7,0) voräquilibriert worden war. Die SH-Beladung wurde auf 1390 pro KLH-Molkül (MG 5.000.000) bestimmt. DMSO (0,6 ml) wurde zu der KLH-(SH)1390-Lösung zugegeben. Das MB-MDA (2,67 mg) wurde in Acetonitril (0,15 ml) gelöst. Die Lösung von MB-MDA wurde zu der KLH-(SH)1390-Lösung zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei 4°C gerührt. Das Immunogen wurde zweimal mit PBS-Lösung (150 mM NaCl, 10 mM Natriumphosphat, pH = 7,0–7,1), welche DMF (20 V/V) enthielt, und zweimal mit PBS-Lösung dialysiert. Die dialysierte Lösung des Immunogens (~34 ml, 0,5 mg/ml) wurde zur Immunisierung von Mäusen verwendet.
  • Beispiel 8: Entwicklung von polyklonalen anti-NDA-Antikörpern
  • Mäuse wurden durch Verabreichung von MDA-MB-2IT-KLH in einer Serie von Injektionen immunisiert. Den Mäusen wurde 10 Tage nach der dritten Immunisierung Blut entnommen. Die Seren wurden in einem β-Galaktosidase-Enzymkomplementationstest auf einer Platte mit 96 Vertiefungen wie folgt getestet:
    • a. Das Enzymakzeptor(EA)-Reagens wurde hergestellt, indem EA-Protein mit CEDIA-Puffer verdünnt wurde. Wenn auf eine Reaktion auf den Analyten getestet wurde, wurde MDMA zu dem EA-Reagens zugegeben. Die verwendeten Bestandteile und Konzentrationen sind nachfolgend aufgelistet:
    Tabelle 2: CEDIA-Puffer
    Bestandteil F. W. oder Stammlösung Konzentration*
    Kaliumphosphat, zweibasig 174,18 g/Mol 30 mM
    Kaliumphosphat, einbasig 136,09 g/Mol 30 mM
    Natriumchlorid 58,44 g/Mol 400 mM
    EGTA 380,35 g/Mol 10 mM
    Tween 20 10% 0,05%
    Magnesiumacetat 214,46 g/Mol 2 mM
    Natriumazid 65,01 g/Mol 0,02%
    Tabelle 3: EA-Reagens
    Bestandteil F. W. oder Stammlösung Konzentration*
    EA-22 variiert 25 Einheiten/ml
    MDMA 0 od. 27,5 ng/ml
    CEDIA-Puffer wie oben
    • b. Das Enzymdonor(ED)-Reagens wurde ebenfalls in CEDIA-Puffer mit den nachstehenden Bestandteilen hergestellt:
    Tabelle 4: ED-Reagens
    Bestandteil F. W. oder Stammlösung Konzentration*
    ED28-(MB-3,4-MDA)2 1 nM
    CPRG 116 mg/m. 0,5 mg/ml
    Ziegen-anti-Maus-Serum rein 0,5
    CEDIA Puffer wie oben
    * Konzentration gibt die Endkonzentration nach Rekonstitution an.
    • c. Das Testprotokoll war wie folgt: 50 μl verdünnter Antikörper wurden zu einer Vertiefung einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen zugegeben. 75 μl EA-Reagens mit oder ohne MDMA (27,5 nM; entspricht einer Konzentration von 1.000 ng/ml in einer Urinprobe) wurden zu jeder Vertiefung zugegeben und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurden 75 μl ED-Reagens zugegeben und für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Extinktion wurde bei 540 nm bei einer Referenzwellenlänge von 690 nm abgelesen.
    • d. Die Analyse der Daten wurde wie folgt durchgeführt: Die prozentuale Inhibition wurde als die Extinktion in Gegenwart des Antikörpers, geteilt durch die Extinktion in Abwesenheit des Antikörpers, mal 100% berechnet. Die prozentuale Modulation wurde wie folgt berechnet: (Extinktion in Gegenwart des Antikörpers und MDMA minus Extinktion in Gegenwart des Antikörpers und in Abwesenheit von MDMA) geteilt durch die Extinktion in Gegenwart des Antikörpers und MDMA, mal 100%.
  • Nach 11 Wochen wurde den Mäusen Blut entnommen, und das Serum wurde unter Verwendung von MDMA auf anti-MDA-Antikörper hin getestet. Die Ergebnisse, welche in Tabelle A gezeigt sind, zeigen die Bindung des Enzymdonor-MDA-Konjugats; die maximale Inhibition betrug für alle 13 Mäuse > 80%, und die maximale Modulation von 22 bis 55% wurde bei Titern von 1:400 bis 1:1600 erreicht. Die Maus 3C wurde aufgrund des Befunds der maximalen Reaktion auf MDMA in dem Test zur Hybridom-Produktion ausgewählt.
    Figure DE000010111224B4_0005
  • Beispiel 9: Entwicklung und Selektion von monoklonalen anti-MDA-Antikörpern, unter Verwendung von MDMA
  • Die Milz aus der Maus 3C wurde entnommen, und die Milzzellen wurden mit Myelomzellen unter Verwendung von Polyethylenglykol als Fusionsmittel fusioniert. Das Parentalmyelom, welches für alle Fusionen verwendet wurde, war P2X63-Ag8.653, das über die American Type Culture Collection (ATCC) gekauft wurde. Die Chronologie der Ereignisse zur Entwicklung monoklonaler Antikörper, die unter Verwendung von KLH-2IT-MB-MDA hervorgerufen wurden, war wie folgt:
    • Erste Immunisierung Zeit 0
    • Zweite Immunisierung 4 Wochen
    • Dritte Immunisierung 8 Wochen
    • Den Mäusen Blut entnommen 9 Wochen
    • Seren aus der ersten Blutentnahme titriert 11 Wochen
    • Vierte Immunisierung 22 Wochen
    • Erste Fusion durchgeführt 25 Wochen
  • Die erste Fusion erzeugte 20 Klone, welche einen Antikörper produzierten, der die Enzymbildung durch das ED-MDA-Konjugat in einem Enzymkomplementationstest vom Typ CEDIA® in einer Platte mit 96 Vertiefungen inhibierte. Wie in Tabelle 6 gezeigt ist, ergaben fünf dieser Antikörper eine Modulation mit MDMA von > 20 der Rest ergab eine Modulation von ≤ 15%. Wie in Tabelle 6 gezeigt ist, ergaben fünf dieser Antikörper eine merkliche Kreuzreaktivität mit den Hauptdrogen der MDMA-Klasse MDMA, MDA, MDEA, BDB und MBDB, aber eine geringe oder keine Kreuzreaktivität mit HMMA (ein pharmakologisch inaktives Analoges von MDMA), Amphetamin oder Methamphetamin. Die fünf Klone, welche in Tabelle 6 aufgelistet sind, wurden zur weiteren Auswertung zurückbehalten, und Kulturflüssigkeitsüberstände, welche das exprimierte Immunglobulin enthielten, wurden zur Analyse in einem automatisierten CEDIA®-Test hergestellt.
  • Figure DE000010111224B4_0006
  • Beispiel 10: Beispiel eines Cedia®-Tests auf Verbindungen der Ecstasy-Klasse, der unter Verwendung eines Hitachi-Analysegeräts für klinische Chemie durchgeführt wurde a. Herstellung der Reagenzien:
    Tabelle 8: Lyophilisiertes Enzymakzeptor-Reagens
    Bestandteil F. W. oder Stammlösung Konzentration*
    Kaliumphosphat, zweibasig 174,18 g/Mol 10 mM
    Kaliumphosphat, einbasig 136,09 g/Mol 10 mM
    Mannitol 182,17 g/Mol 300 mM
    Tween 20 10% 0,01%
    Glutathion 307,30 g/Mol 0,5 mM
    Natriumazid 65,01 g/Mol 9 mM
    EA22-Protein ~25–30 Gew.-% Protein 1,713 g Protein/l
    Tabelle 9: Enzymakzeptor-Rekonstitutionspuffer
    Bestandteil F. W. oder Stammlösung Konzentration*
    PIPES 302,26 g/Mol 100 mM
    Natriumchlorid 58,44 g/Mol 400 mM
    EGTA 380,35 g/Mol 10 mM
    Magnesiumacetat 214,46 g/Mol 10 mM
    Fötales Rinderserum Rein 0,5%
    Natriumazid 65,01 g/Mol 20 mM
    anti-MDA-MAK (1A9)
  • Das Arbeitsenzymakzeptor-(EA)-Reagens wurde durch Rekonstitution des lyophilisierten EA-Reagenzes mit EA-Rekonstitutionspuffer, entsprechend den oben gezeigten Konzentrationen, hergestellt. (*) zeigt die Endkonzentration nach der Rekonstitution an.
  • Das Enzymdonor-(ED)-Reagens wurde als ein flüssiges Reagens mit den nachstehenden Bestandteilen hergestellt.
    Tabelle 10: Enzymdonor-Reagens
    Bestandteil F. W. oder Stammlösung Konzentration*
    PIPES 302,36 g/Mol 100 mM
    Natriumchlorid 58,44 g/Mol 400 mM
    EGTA 380,35 g/Mol 10 mM
    EDTA 1 mM
    Ziegen-anti-Maus-Serum Rein 2,0
    CPRG ~120 mg/ml 1,6 mg/ml
    Fragmentiertes BSA ~38 mg/ml 2 mg/ml
    Natriumazid 65,01 g/Mol 20 mM
    ED28-(MB-MDA)2 2 nM
  • Beide Reagenzien wiesen einen pH von 6,9 auf.
  • b. Testprotokoll:
  • Der Test wurde auf einem Hitachi-Analysator für klinische Chemie wie folgt durchgeführt: Die Probe wurde in eine Reaktionsküvette pipettiert. EA-Reagens, welches den Antikörper enthielt, wurde zugegeben. Die Mischung wurde für ungefähr 5 min bei 37°C inkubiert. Das ED-Reagens, welches monoklonales anti-MDA-Substrat enthielt, wurde anschließend zugegeben, und die Inkubation wurde für 4 min bei 37°C fortgesetzt. Die Geschwindigkeit der Substrathydrolyse wurde photometrisch bei 570 nm (unter Subtraktion eines Hintergrunds bei 660 nm) von vier bis fünf Minuten nach der ED-Zugabe gemessen. Die folgende Tabelle faßt das Testprotokoll zusammen:
    Tabelle 11: Automatisiertes Testprotokoll
    Parameter Wert
    Probenabgabe 3 μl
    EA-Reagens (R1) 130 μl
    Inkubation ~300 s
    ED-Reagens (R2) 130 μl
    Inkubation ~240 s
    Ableserahmen ~240–300 s nach Zugabe von R2 (FD-Reagens)
    Wellenlänge 660/570 (2°/1°)
  • c. Ergebnisse
  • Die Figur zeigt eine Standardkurve für eine Verbindung der Ecstasy-Klasse, die auf der Grundlage von Daten, die unter Verwendung des 1A9-Antikörpers, wie oben beschrieben, abgeleitet wurden, aufgestellt wurde. Tabelle 12 zeigt die Kreuzreaktivität mehrerer Drogen der Ecstasy-Klasse, wie auch von HMMA, Amphetamin und Methamphetamin. Wie man in der Tabelle sieht, ist der Antikörper 1A9 in der Lage, zahlreiche Verbindungen der Ecstasy-Klasse in einem homogenen Immuntest nachzuweisen, welcher auf der CEDIA®-Technologie basiert. Die Nachweisempfindlichkeit (d. h. die prozentuale Modulation) ist akzeptabel, wobei bei einer Analytenkonzentration von 300 ng/ml eine ausgezeichnete Dosiswirkung besteht. Die nachgewiesenen Verbindungen der Ecstasy-Klasse zeigen Kreuzreaktivitäten, wie sie nachstehend zusammengefaßt sind:
    Verbindung Kreuzreaktivität
    MDMA 100%
    MDA 55%
    MDEA 155%
    MBDB 23%
    BDB 33%
  • In vorteilhafter Weise wies der CEDIA®-MDMA-Test auf Verbindungen der Ecstasy-Klasse weder die pharmakologisch inaktive Verbindung HMMA, noch die aktiven Verbindungen Amphetamin und Methamphetamin nach.
  • Figure DE000010111224B4_0007
  • Figure DE000010111224B4_0008
  • Beispiel 11: Verstärkung der Kreuzreaktivität gegenüber Drogen der Ecstasy-Klasse in dem CEDIA® DAU-Test auf Amphetamine, durch die Zugabe des anti-Ecstasy-Antikörpers 1A9 und von ED-MDA-Konjugat
  • Der CEDIA® DAU-Test auf Amphetamine wurde im Hinblick auf seine Kreuzreaktivität mit den Ecstasy-Drogen MDA, MDMA, MDEA, BDB und MBDB durch die Zugabe des anti-Ecstasy-Antikörpers 1A9 und von ED28-(MB-MDA)2-Konjugat verstärkt. CEDIA® DAU-Amphetamintestkits wurden von der Microgenics Corporation, Fremont, CA, erhalten. Die Kits wurden rekonstituiert, und die Tests wurden gemäß den Anleitungen für einen Test mit einem Grenzwert von 500 ng/ml auf einem Hitachi 911-Analysator laufen gelassen. Methamphetamine wurden zur Grenzwert-Kalibrierung verwendet.
  • Ein direkter Vergleich des CEDIA® DAU-Amphetamintests und der verstärkten Version wurde durchgeführt. Die verwendeten Reagenzien waren wie folgt:
  • Standard CEDIA® DAU-Test auf Amphetamine
    • • R1: CEDIA® DAU-Amphetamin-EA-Reagens wurde in CEDIA® DAU-Amphetamin-EA-Rekonstitutionspuffer rekonstituiert
    • • R2: CEDIA® DAU-Amphetamin-EA-Reagens wurde in CEDIA® DAU-Amphetamin-ED-Rekonstitutionspuffer rekonstituiert
  • Verstärkter CEDIA® DAU-Test auf Amphetamine
    • • R1: CEDIA® DAU-Amphetamin-EA-Reagens wurde in CEDIA® DAU-Amphetamin-ED-Rekonstitutionspuffer rekonstituiert, und dann wurde Ascitesflüssigkeit mit dem MAK 1A9 bei einer Endverdünnung von 1:1200 zugegeben.
    • • R2: CEDIA® DAU-Amphetamin-ED-Reagens wurde in CEDIA® DAU-Amphetamin-ED-Rekonstitutionspuffer rekonstituiert, und dann wurde ED28-(MB-MDA)2 bis zu einer Endkonzentration von 1 nM zugegeben.
  • Das Testprotokoll für beide Reagenziensätze ist in Tabelle 13 gezeigt:
    Tabelle 13: Automatisiertes Testprotokoll
    Parameter Wert
    Probenabgabe 6 μl
    EA-Reagens (R1) 130 μl
    Inkubation ~300 s
    ED-Reagens (R2) 130 μl
    Inkubation ~240 s
    Ableserahmen ~240–300 s nach Zugabe von R2 (FD-Reagens)
    Wellenlänge 660/570 (2°/1°)
  • Ergebnisse
  • Die Mengen des monoklonalen Antikörpers 1A9 und des ED-MDA-Konjugats, die zu dem verstärkten CEDIA® DAU-Test auf Amphetamine zugegeben wurden, wurden optimiert, so daß diese ungefähr dieselbe Reaktion auf 500 ng/ml MDA wie auf 500 ng/ml Methamphetamin ergaben. Die Standardkurven für MDA und Methamphet-amin in dem regulären und dem verstärkten Test sind in Tabelle 14 gezeigt.
    Tabelle 14: Standardkurven für den normalen und den verstärkten CEDIA® DAU-Test auf Amphetamine
    Probe ng/ml Standard-CEDIA® auf Amphetamine Verstärkter CEDIA® auf Amphetamine
    Mittlere Geschwindigkeiten mAU/min Mittlere Geschwindigkeiten mAU/min
    Methamphetamin 0 153,6 202,2
    150 187,2 233,7
    300 223,4 271,4
    500 262,3 308,3
    700 289,9 334,6
    1000 320,9 360,8
    MDA 0 155,6 202,2
    150 155,6 228,4
    300 156,7 257,3
    500 157,9 300,3
    700 159,1 343,1
    1000 160,7 388,0
  • Die Kreuzreaktivität für Methamphetamin und die Drogen der Ecstasy-Klasse bei dem Standard- und dem verstärkten CEDIA® DAU-Test auf Amphetamine sind in Tabelle 15 gezeigt. In allen Fällen gibt es eine Verbesserung bei der Erkennung der Drogen der Ecstasy-Klasse bei dem verstärkten Testsystem. Somit verbesserte die Zugabe des Antikörpers gegen das MDP-Derivat und das markierte MDP-Analoge die Fähigkeit eines herkömmlichen Tests für die Amphetamin-Klasse, einen breiten Bereich von Designer-Amphetaminen nachzuweisen.
    Tabelle 15: Kreuzreaktivitäten des Standard- und des verstärkten CEDIA® DAU-Tests auf Amphetamine
    Verbindung Konzentration Standard-CEDIA® auf Amphetamine Verstärkter CEDIA® auf Amphetamine
    ng/ml
    Methamphetamin 300 500 100 100 100 100
    MDA 300 500 5 4 81 91
    MDMA 300 500 49 50 129 *
    MDEA 300 500 22 21 153 *
    MBDB 300 500 64 73 80 97
    BDB 300 500 5 7 105 125
    * Nicht bestimmt; oberhalb des Testbereichs
  • Verschiedene Änderungen, Modifikationen oder Variationen können im Hinblick auf die Erfindung, welche oben im Detail beschrieben wurde, durchgeführt werden, ohne den Umfang der vorliegenden Erfindung zu verlassen, welcher nur durch die folgenden Ansprüche definiert wird.

Claims (19)

  1. Eine Verbindung oder ein Salz dieser Verbindung mit folgender Struktur
    Figure DE000010111224B4_0009
  2. Immunogenes Reaktionsprodukt der Verbindung nach Anspruch 1, die mit einem immunogenen Träger umgesetzt wurde.
  3. Ein Antikörper, der gegen das immunogene Reaktionsprodukt nach Anspruch 2 hervorgerufen wurde.
  4. Der Antikörper gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass er in der Lage ist, bevorzugt an eine Verbindung der Ecstasy-Klasse zu binden.
  5. Der Antikörper gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass er eine Kreuzreaktivität von weniger als 10% mit jeweils Ephedrin, Pseudoephedrin und Phenylpropanolamin aufweist.
  6. Der Antikörper gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass er eine Kreuzreaktivität von weniger als 1% mit jeweils Ephedrin, Pseudoephedrin und Phenylpropanolamin aufweist.
  7. Der Antikörper gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass er eine Kreuzreaktivität von weniger als 0,1% mit jeweils Ephedrin, Pseudoephedrin und Phenylpropanolamin aufweist.
  8. Der Antikörper gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass er eine Kreuzreaktivität von weniger als 1% mit jeweils Amphetamin, Methampthetamin und 4-Hydroxy-3-methoxymethamphetamin (HMMA) aufweist.
  9. Immuntestkit, das die Verbindung gemäß Anspruch 1 und optional eine nachweisbare Markierung umfasst.
  10. Immuntestkit gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung und die Markierung in Form eines Konjugats vorliegen.
  11. Immuntestkit gemäß Anspruch 9, welches zusätzlich einen Antikörper gemäß Anspruch 6 enthält.
  12. Immuntestkit nach Anspruch 9, welches zusätzlich den Antikörper gemäß Anspruch 8 enthält.
  13. Immuntestkit, welches den Antikörper gemäß Anspruch 4 und eine nachweisbare Markierung enthält.
  14. Verfahren zum Nachweis einen Analyten, welches folgende Schritte umfasst: – Inkontaktbringen des Antikörpers gemäß Anspruch 4 mit einer Verbindung der Ecstacsy-Klasse (”Analyt”) und einer nachweisbaren Markierung unter Bedingungen, die erlauben, dass der Analyt und die Markierung an den Antikörper binden und welche eine Konkurrenz zwischen dem Analyten und der Markierung um die Bindung an den Antikörper erlauben; und – Nachweis des Analyten.
  15. Immuntestkit, welches enthält: – einen Antikörper, der in der Lage ist, eine Verbindung aus der Gruppe Amphetamin, Methamphetamin und deren Kombinationen zu binden; und – einen Kit-Bestandteil aus der Gruppe Verbindung gemäß Anspruch 1 und nachweisbare Markierung, Antikörper gemäß Anspruch 4 und deren Kombinationen.
  16. Verfahren zum Nachweis eines Analyten, welches folgende Schritte enthält: – Inkontaktbringen (a) eines Antikörpers, der in der Lage ist, eine Verbindung aus der Gruppe Amphetamin, Methamphetamin und deren Kombinationen zu binden (”Antikörper für Amphetamine”); (b) einer Verbindung aus der Gruppe aus Verbindung gemäß Anspruch 1 und nachweisbarer Markierung, Antikörper gemäß Anspruch 4 und deren Kombinationen; und (c) eine Verbindung der Ecstacy-Klasse (”Analyt”) unter Bedingungen, die erlauben, dass der Analyt an eine Verbindung bindet, die aus folgender Gruppe stammt: Antikörper für Amphetamine; Verbindung gemäß Anspruch 1 und nachweisbarer Markierung; Antikörper gemäß Anspruch 4; und deren Kombinationen; und – Nachwels des Analyten.
  17. Immuntestkit, welches die Verbindung nach Anspruch 1 und ein festes Einfangvehikel umfasst.
  18. Immuntestkit gemäß Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass das feste Einfangvehikel aus folgender Gruppe stammt: ein festes Teilchen, eine feste Oberfläche und deren Kombinationen.
  19. Der Antikörper gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass er eine Kreuzreaktivität von weniger als 1% mit jeweils Amphetamin, Methampthetamin und 4-Hydroxy-3-methoxymethamphetamin (HMMA) aufweist.
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