DE69612457T2

DE69612457T2 - Screening-Verfahren zur Ligand-Identifizierung von Zielproteinen

Info

Publication number: DE69612457T2
Application number: DE69612457T
Authority: DE
Inventors: James Bowie; Andrew Pakula
Original assignee: Anadys Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Anadys Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1995-10-25
Filing date: 1996-10-17
Publication date: 2001-11-08
Anticipated expiration: 2016-10-18
Also published as: DE69612457D1; MX9604183A; EP0770876B1; PT770876E; KR0161256B1; CA2184195C; AU698862B2; JP2952848B2; KR970022315A; JPH09178746A; ES2158269T3; IL119149A; IL119149A0; ATE200579T1; DE770876T1; GR3036138T3; DK0770876T3; BR9604352A; CA2184195A1; AU6429896A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Verfahren zum Absuchen mit hohem Durchsatz (high throughput screening) auf pharmazeutische Verbindungen, insbesondere auf solche, die an Proteine binden, die in die Pathogenese einer Erkrankung oder die Regulation einer physiologischen Funktion involviert sind.

Hintergrund der Erfindung

Pharmazeutika können aus Leitverbindungen entwickelt werden, die durch ein auf ein Ziel, wie einen Rezeptor, abstellendes zufallsgerichtetes Absuch-Verfahren identifiziert werden. Absuch-Ansätze in großem Maßstab können durch eine Anzahl von Faktoren kompliziert werden. Zunächst sind viele Assays arbeitsaufwendig und teuer in der Durchführung. Die Assays können Versuchstiere, Zelllinien oder Zellkulturen involvieren, die schwierig oder teuer in Anschaffung oder Unterhalt sind. Die Verwendung radioaktiven Materials kann erforderlich sein und dadurch Sicherheits- und Entsorgungsprobleme aufwerfen. Diese Überlegungen führen oft zu praktischen Limitierungen der Anzahl an Verbindungen, die vernünftigerweise abgesucht werden können. Daher ist man beim Einsatz der zufallsgerichteten Absuch-Verfahren häufig gezwungen, die Suche auf die Verbindungen zu beschränken, für die ein gewisses Vorwissen nahelegt, daß diese Verbindungen wahrscheinlich wirksam sind. Diese Strategie begrenzt die Bandbreite der getesteten Verbindungen und viele verwendbare Medikamente können übersehen werden.
Darüber hinaus kann die Spezifität vieler biochemischer Assays eine große Vielzahl nützlicher chemischer Verbindungen ausschließen, da die Wechselwirkungen zwischen dem Liganden und dem Rezeptorprotein außerhalb des Assaybereichs liegen.
Zum Beispiel haben viele Proteine multiple Funktionen, wohingegen die meisten Assays lediglich zur Erfassung einer dieser Aktivitäten fähig sind. Mit einem solchen spezifischen Assay werden viele potentielle Pharmazeutika möglicherweise nicht detektiert.
Schließlich muß in den meisten existierenden biochemischen Absuch-Ansätzen zur Auffindung von Arzneimitteln die Aktivität des Zielproteins definiert sein. Dies erfordert, daß das fragliche System gut charakterisiert ist, bevor das Absuchen beginnen kann. Sogar wenn eine Proteinsequenz bekannt ist, wie z. B. bei einem neu klonierten Gen, kann es sein, daß die spezifischen Funktionen des Proteins durch die Analyse seiner Sequenz allein nicht bekannt werden. Konsequenterweise muß das biochemische Absuchen auf therapeutische Arzneimittel, gerichtet gegen viele Zielproteine, bis zur detaillierten biochemischen Charakterisierung zurückstehen, ein Verfahren, das im allgemeinen ausgedehnte Forschung erfordert.
Daher besteht auf dem Fachgebiet ein Bedarf für einen schnellen, kosteneffizienten Assay mit hohem Durchsatz, der das Absuchen großer Zahlen an Verbindungen auf ihre Fähigkeit, therapeutisch oder physiologisch relevante Proteine zu binden, ermöglicht. Darüber hinaus besteht im Fachgebiet ein Bedarf für Absuch-Verfahren, die von der biologischen Aktivität des Zielproteins unabhängig sind und die Verbindungen detektieren, die andere Regionen des Zielproteins als die biologisch aktiven Domänen binden.
Die EP 865 502 (Stand der Technik gemäß Artikel 54(3)(4) EPÜ) offenbart ein Verfahren zur Identifizierung eines Liganden, der ein vorbestimmtes Zielprotein bindet, das das Inkontaktbringen von Test- und Kontrollkombinationen mit einer Konformationssensitiven Fluoreszenzprobe involviert.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Identifizierung eines Liganden, der ein Zielprotein bindet, bereit. Dieses Verfahren wird folgendermaßen durchgeführt:
(a) Auswählen einer Vielzahl an Verbindungen, von denen eine Bindung an das Zielprotein nicht bekannt ist, als Testliganden;
(b) Inkubieren jedes Testliganden und Zielproteins unter für das Entfalten des Zielproteins im geeigneten Ausmaß geeigneten Bedingungen, wodurch eine Testkombination hergestellt wird;
(c) Inkubieren des Zielproteins wie in Schritt (b), aber in Abwesenheit eines Testliganden, um eine Kontrollkombination herzustellen;
(d) Bestimmen des Ausmaßes, zu dem das Testprotein im gefalteten Zustand, im ungefalteten Zustand oder in beiden, in der Testkombination und in der Kontrollkombination vorliegt;
(e) Vergleich der im Schritt (d) gemachten Bestimmung zwischen den Test und Kontrollkombinationen, wobei, falls das Zielprotein in gefaltetem Zustand in größerem oder geringerem Ausmaß in der Testkombination vorliegt als in der Kontrollkombination, der Testligand ein Ligand ist, der an das Zielprotein bindet; und
(f) Wiederholen der Schritte (b)-(e) mit einer Vielzahl an Testliganden, bis mindestens ein Ligand identifiziert ist, der an das Zielprotein bindet;
mit der Maßgabe, daß die Inkubationsschritte (b) und (c) keinen Kontakt der Test- und Kontrollkombinationen mit einer konformationell empfindlichen Fluoreszenzprobe umfassen. Beim Ausführen der vorliegenden Erfindung kann jedes Verfahren zur Bestimmung der Menge an Zielprotein in gefalteten oder ungefalteten Zuständen verwendet werden, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, Proteolyse, Antikörperbindung, Oberflächenbindung, molekulare Chaperonbindung, differentielle Bindung an immobilisierten Ligand und differentielle Bindung von aggregiertem Protein.
In einer Ausführungsform ist das Zielprotein Hämoglobin S (HbS), und Liganden werden durch ihre Fähigkeit identifiziert, die Empfindlichkeit des HbS hinsichtlich Proteolyse zu reduzieren.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt eine SDS-Polyacrylamid-Gelprofil von Carboanhydrase nach Proteolyse in Abwesenheit und Gegenwart ansteigender Konzentrationen an Acetazolamid.
Fig. 2 zeigt ein SDS-Polyacrylamid-Gelprofil von Carboanhydrase nach Proteolyse in Abwesenheit und Gegenwart von 1,0 mM Acetazolamid, in Abwesenheit und Gegenwart eines fungalen Extrakts.
Fig. 3 zeigt eine Auftragung, die eine Titration der Bindung von radiomarkierter humaner neutrophiler Elastase an Nitrocellulosefilter nach Proteolyse in Abwesenheit und Gegenwart ansteigender Konzentrationen von Elastatinal zeigt.
Fig. 4 zeigt eine Auftragung, die eine Titration der ELISA- Detektion von humaner und neutrophiler Elastase nach Proteolyse in Anwesenheit ansteigender Konzentrationen von ICI 200,355 zeigt.
Fig. 5 zeigt eine Auftragung, die die Verteilung von Daten für Testliganden repräsentiert, die auf Bindung an humane neutrophile Elastase getestet sind.
Fig. 6 zeigt eine Auftragung, die die Titration eine Liganden füx humane neutrophile Elastase zeigt.
Fig. 7 zeigt eine Auftragung, die die Titration von fünf Liganden bezüglich ihrer Fähigkeit zur Inhibierung der enzymatischen Aktivität von humaner neutrophiler Elastase zeigt.
Fig. 8 zeigt eine Auftragung, die eine Titration der ELISA- Detektion von humanem Hämoglobin nach Proteolyse in Gegenwart ansteigender Konzentrationen von 2,3- Diphosphoglycerat zeigt.
Fig. 9 zeigt eine Auftragung, die eine Titration der Bindung von humanem Hämoglobin an Nitrocellulosefilter nach Proteolyse in Abwesenheit oder Anwesenheit ansteigender Konzentrationen von 2,3-Diphosphoglycerat zeigt.
Fig. 10 zeigt eine Auftragung, die die Verteilung der Bindungsdaten für auf Bindung von humanem Hämoglobin S getesteten Testliganden zeigt.
Fig. 11 zeigt eine Auftragung, die die Titration eines Liganden für humanes Hämoglobin zeigt.
Fig. 12 zeigt die Strukturen von als Liganden für humanes Hämoglobin (HbS) identifizierten Verbindungen und ihre Aktivitäten bezüglich der Inhibierung der HbS- Gelierung, relativ zu Tryptophan (Trp).
Fig. 13 zeigt eine Auftragung, die die Liganden-Bindungs- aktivität für humanes Hämoglobin von Zink-Bacitracin (BacZ), zinkfreiem Bactracin (Bac), zinkfreiem Bacitracin, zu dem eine äquimolare Konzentration an ZnCl&sub2; zugesetzt wurde (Bac+Z), ZnCl&sub2; und Zink- Bacitracin, zu dem ein molarer Überschuß an EDTA zugegeben wurde (BacZ + EDTA)

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Definitionen

Der Begriff "Ligand", wie hierin verwendet, betrifft eine Substanz, die an ein Zielprotein bindet. Die Substanz kann das Zielprotein binden, wenn das Zielprotein in seiner nativen Konformation ist, oder wenn es partiell oder total ungefaltet oder denaturiert ist. Gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein Ligand nicht auf eine Substanz limitiert, die eine bekannte funktionelle Region des Zielproteins bindet, z. B. die aktive Seite eines Enzyms, die Antigen-kombinierende Seite eines Antikörpers, die Hormon-bindende Seite eines Rezeptors, eine Kofaktor-bindende Stelle und ähnliches. Bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung kann ein Ligand auch eine Substanz sein, die irgendeine Oberfläche oder interne Sequenzen oder konformationelle Domänen des Zielproteins bindet. Daher beinhalten die erfindungsgemäßen Liganden Substanzen, die für sich gesehen keine offensichtliche biologische Funktion haben, außer Ihrer Fähigkeit zur Bindung an das Zielprotein in der oben beschriebenen Art.
Der Begriff "Testligand", wie hierin verwendet, betrifft eine Substanz, umfassend eine Verbindung, ein Molekül oder einen Komplex, der auf seine Fähigkeit zur Bindung eines Zielproteins getestet wird. Testliganden können nahezu jede Verbindung sein, einschließlich, ohne Limitierung, Metalle, Peptide, Proteine, Lipide, Polysaccharide, Nucleinsäuren, kleine organische Moleküle und Kombinationen daraus. Komplexe Mischungen von Substanzen, wie Naturproduktextrakte, die mehr als einen Testliganden enthalten können, können auch getestet werden, und die das Zielprotein bindende Komponente kann aus der Mischung in einem nachfolgenden Schritt aufgereinigt werden.
Der Begriff "Zielprotein", wie hierin verwendet, betrifft ein Peptid, Protein oder einen Proteinkomplex, für den die Identifikation eines Liganden oder Bindungspartners gewünscht ist. Zielproteine beinhalten, ohne Limitierung, Peptide oder Proteine, von denen bekannt ist oder von denen geglaubt wird, daß sie in die Etiologie einer bekannten Krankheit, eines Zustands oder eines pathophyiologischen Zustands oder in die Regulation einer physiologischen Funktion involviert sind. Zielproteine können von jedem lebenden Organismus abgeleitet werden, wie einem Vertebraten, insbesondere einem Säuger und besonders bevorzugt einem Menschen. Zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung ist es nicht notwendig, daß die biochemische Funktion des Proteins spezifisch identifiziert wird. Zielproteine schließen, ohne Einschränkung, Rezeptoren, Enzyme, onkogene Produkte, Tumorsuppressor-Genprodukte, virale Proteine und Transkriptionsfaktoren ein, entweder in gereinigter Form oder als Teil einer komplexen Mischung von Proteinen und anderen Verbindungen. Darüber hinaus können die Zielproteine Wild-Typ-Proteine oder alternativ mutante oder variante Proteine einschließen, einschließlich solcher mit veränderter Stabilität, Aktivität oder anderen varianten Eigenschaften oder Hybridproteine, zu denen fremde Aminosäuresequenzen zugefügt wurden, z. B. Sequenzen, die eine Aufreinigung erleichtern.
Wie hierin verwendet, betrifft "Testkombination" die Kombination aus einem oder mehreren Testliganden oder einem Zielprotein. "Kontrollkombination" bezieht sich auf das Zielprotein in Abwesenheit des Testliganden.
Wie hierin verwendet, bezieht sich "gefalteter Zustand" eines Proteins auf die native oder nicht denaturierte Form des Proteins, wie es in seiner natürlichen Umgebung vorliegt, oder nach Isolierung oder Reinigung, d. h. vor einem Aussetzen gegenüber denaturierenden Bedingungen. Dies schließt native Proteine ein, die erkennbar in ihrer natürlichen Umgebung in unterschiedlichen Ausmaßen ungefaltet sind, und deren Faltungsmuster sich im Verlauf ihrer natürlichen Funktion ändern kann. Der "ungefaltete Zustand" betrifft eine Situation, in der das Polypeptid Elemente seiner sekundären und/oder tertiären Struktur verloren hat, die in seinem "gefalteten Zustand" vorliegen. Für den Fachmann ist klar, daß es schwierig ist, experimentell zu bestimmen, wann ein Polypeptid vollständig in den vollständig ungefalteten Zustand übergegangen ist, d. h. alle Elemente der sekundären und tertiären Struktur verloren hat. Daher umfaßt der Begriff "ungefalteter Zustand", wie hierin verwendet, ein partielles oder totales Entfalten.
"Detektierbare Fraktion", wie hierin verwendet, betrifft eine Menge, die empirisch bestimmt ist und die in Abhängigkeit des zur Unterscheidung des gefalteten vom ungefalteten Protein verwendeten Verfahrens variiert. Wenn z. B. die Protease- Sensitivität für die Bestimmung der Faltung verwendet wird, werden die Bedingungen so gewählt (z. B. durch Anpassen der Temperatur oder durch Zugabe von denaturierenden Substanzen), daß etwa 80% des Zielproteins innerhalb einer zweckmäßigen Inkubationszeit verdaut werden. Wenn, alternativ, als Detektionsverfahren Antikörper verwendet werden, die für den gefalteten oder ungefalteten Zustand eines Zielproteins spezifisch sind, werden die Bedingungen so gewählt, daß eine hinreichende Menge des Antikörpers gebunden wird, um ein detektierbares Signal zu ergeben.
Die vorliegende Erfindung umfaßt Absuch-Verfahren mit hohem Durchsatz zur Identifizierung eines Liganden, der an ein Zielprotein bindet. Falls das Zielprotein, an den der Testligand bindet, mit einer Krankheit oder einem Zustand assoziiert ist oder für diesen ursächlich ist, kann der Ligand zur Diagnose, zur Vorbeugung oder zur Behandlung der Krankheit oder des Zustands verwendbar sein. Ein nach dem vorliegenden Verfahren identifizierter Ligand kann auch in einem Reinigungs- oder Abtrennungsverfahren verwendet werden, wie einem Verfahren, das in der Aufreinigung oder Abtrennung eines Zielproteins aus einer Mischung resuliert. Die vorliegende Erfindung betrifft auch die nach dem vorliegenden Verfahren identifizierten Liganden und deren therapeutische Verwendungen (für diagnostische, präventive oder für Behandlungszwecke) und die Verwendung in Reinigungs- und Abtrennungsverfahren.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Ligand für ein Zielprotein durch seine Fähigkeit identifiziert, das Ausmaß der Faltung oder die Faltungs- oder Entfaltungsgeschwindigkeit des Zielproteins zu beeinflussen. Die experimentellen Bedingungen werden so gewählt, daß das Zielprotein einem Entfalten unterworfen wird, reversibel oder irreversibel. Falls der Testligand unter diesen Bedingungen an das Zielprotein bindet, ist die relative Menge an gefaltetem zu ungefaltetem Zielprotein oder die Geschwindigkeit der Faltung oder Entfaltung des Zielproteins in Gegenwart des Testliganden anders, d. h. höher oder niedriger, als die in Abwesenheit des Testliganden beobachtete. Daher umfaßt das vorliegende Verfahren die Inkubierung des Zielproteins in Gegenwart und Abwesenheit des Testliganden unter Bedingungen, unter denen (in Abwesenheit des Testliganden) das Zielprotein sich partiell oder total entfalten würde. Dies wird durch Analyse der absoluten oder relativen Mengen des gefalteten gegenüber dem ungefalteten Zielprotein oder der Geschwindigkeit der Faltung oder Entfaltung des Zielproteins verfolgt.
Ein wichtiges Merkmal der vorliegenden Erfindung besteht darin, daß sie jede Verbindung detektiert, die an irgendeine Sequenz oder Domäne des Zielproteins bindet, nicht nur an die Sequenzen oder Domänen, die unmittelbar in die biologische Aktivität oder Funktion involviert sind. Die Bindesequenz, Region oder Domäne kann auf der Oberfläche des Zielproteins vorliegen, wenn dieses sich in seinem gefalteten Zustand befindet, oder sie kann im Inneren des Proteins eingebettet sein. Einige Bindungsstellen werden unter Umständen der Ligandenbindung nur zugänglich, wenn das Protein partiell oder total ungefaltet ist.
Bei der praktischen Ausführung der vorliegenden Erfindung wird der Testligand mit einem Zielprotein kombiniert, und die Mischung wird unter geeigneten Bedingungen für einen hinreichenden Zeitraum gehalten, um das Binden des Testliganden an das Zielprotein zu erlauben. Die experimentellen Bedingungen werden empirisch für jedes Zielprotein bestimmt. Beim Testen der Testliganden werden die Inkubationsbedingungen so gewählt, daß die meisten Liganden:Zielprotein-Wechselwirkungen vollständig ablaufen sollten. Im allgemeinen liegt der Testligand im Verhältnis zum Zielprotein in einem molaren Überschuß vor. Das Zielprotein kann in einer löslichen Form vorliegen, oder es kann alternativ an einer Festphasenmatrix gebunden sein. Die Matrix kann, ohne Einschränkung, Kügelchen, Membranfilter, Kunststoffoberflächen oder andere geeignete feste Trägermaterialien umfassen.
Für jedes Zielprotein werden geeignete experimentelle Bedingungen, z. B. Temperatur, Zeit, pH, Salzkonzentration und zusätzliche Komponenten so gewählt, daß ein detektierbarer Teil des Proteins in Abwesenheit des Testliganden in ungefaltetem Zustand vorliegt. Für ein Zielprotein, das sich irreversibel entfaltet, ermöglichen die bevorzugten experimentellen Bedingungen, daß sich eine detektierbare Menge des Proteins in Abwesenheit des Testliganden innerhalb eines zweckmäßigen Inkubationszeitraums entfalten. Um das Verhältnis gefaltetes:ungefaltetes Protein oder die Geschwindigkeit des Faltens oder Entfaltens anzupassen oder zu optimieren, werden unter Umständen denaturierende Bedingungen benötigt, einschließlich der Anwendung erhöhter Temperaturen, der Zugabe von Chaotropen oder denaturierenden Substanzen, wie Harnstoff oder Guanidiumsalzen, z. B. Guanidiniumthiocyanat oder Detergenzien, oder Kombinationen darvon. Darüber hinaus kann das Einführen von stabilisierenden oder destabilisierenden Aminosäure- Substitutionen verwendet werden, um das Verhältnis gefaltet:ungefaltet des Zielproteins zu steuern.
Die für das Binden des Zielproteins an den Liganden benötigte Zeit variiert in Abhängigkeit des Testliganden, des Testproteins und anderer verwendeter Bedingungen. In einigen Fällen tritt eine Bindung unmittelbar auf (z. B. im wesentlichen simultan mit Zusammenbringen des Testliganden und des Zielproteins), während in anderen Fällen die Kombination aus Testligand und Zielprotein für einen längeren Zeitraum gehalten wird, z. B. 12 bis 16 Stunden, bevor eine Bindung detektiert wird. Wenn viele Testliganden eingesetzt werden, wird die Inkubationszeit so gewählt, daß sie für die meisten Protein:Ligand-Interaktionen hinreichend ist.
Das Binden eines Testliganden an ein Zielprotein wird durch Vergleich der Absolutmenge an gefaltetem oder ungefalteten Zielprotein in Abwesenheit oder Gegenwart des Testliganden bewertet oder alternativ durch Bestimmen des Verhältnisses aus gefaltetem : ungefaltetem Zielprotein oder der Geschwindigkeit der Faltung oder Entfaltung des Zielproteins in Abwesenheit und Gegenwart des Testliganden. Falls ein Testligand an das Zielprotein bindet (d. h., falls der Testligand ein Ligand für das Zielprotein ist), liegt unter Umständen signifikant mehr gefaltetes und weniger ungefaltetes Zielprotein vor (und daher ein höheres Verhältnis von gefaltetem zu ungefaltetem Zielprotein), als in Abwesenheit eines Testliganden vorliegt. Alternativ kann das Binden des Testliganden zu signifikant weniger gefaltetem und mehr ungefaltetem Zielprotein führen, als in Abwesenheit eines Testliganden vorliegt. In ähnlicher Weise kann das Binden des Testliganden eine signifikante Änderung der Geschwindigkeit des Faltens oder Entfaltens des Zielproteins verursachen.
In allen Fällen kann die Bestimmung der absoluten Mengen an gefaltetem oder ungefaltetem Zielprotein, des Verhältnisses gefaltet : ungefaltet und der Geschwindigkeit des Faltens oder Entfaltens unter Verwendung der bekannten Verfahren, wie unten beschrieben, durchgeführt werden. Diese Verfahren schließen, ohne Einschränkung, Proteolyse des Zielproteins, Bindung des Zielproteins an geeignete Oberflächen, Bindung von spezifischen Antikörpern an das Zielprotein, Bindung des Zielproteins an molekulare Chaperone, Bindung des Zielproteins an immobilisierte Liganden und Messung der Aggregation des Zielproteins ein. Andere physikalisch-chemische Techniken können verwendet werden, entweder allein oder in Verbindung mit den obigen Verfahren. Diese schließen, ohne Einschränkung, Messung des zirkularen Dichroismus, Ultraviolett- und Fluoreszenzspektroskopie und Kalorimetrie ein. Eine bevorzugte Ausführungsform involviert das Messen der relativen Proteolyse eines Zielproteins, gefolgt von der Inkubation in Abwesenheit und Anwesenheit eines Testliganden ein. Für den Fachmann ist jedoch klar, daß jedes Zielprotein einzigartige Eigenschaften aufweisen kann, die ein bestimmtes Detektionsverfahren für die Zwecke der vorliegenden Erfindung am geeignetsten machen.
Für die Zwecke des Absuchens mit hohem Durchsatz werden die oben beschriebenen experimentellen Bedingungen so eingestellt, dass ein Schwellenanteil an Testliganden aus den gesamten abgesuchten Verbindungen erhalten wird, die als "positive" Verbindungen oder Liganden identifiziert werden. Dieser Schwellenwert wird nach zwei Kriterien festgesetzt. Zunächst sollte die Anzahl an positiven Verbindungen unter praktischen Bedingungen handhabbar sein. Zweitens sollte die Anzahl an positiven Verbindungen Liganden mit einer nennenswerten Affinität für das Zielprotein darstellen. Ein bevorzugter Schwellenwert ist erreicht, wenn 0,1 bis 1% der gesamten Testliganden als Liganden für ein gegebenes Zielprotein auftreten.
Die Bindung an ein gegebenes Protein ist eine Vorbedingung für Pharmazeutika, die die Wirkung dieses Proteins direkt modifizieren sollen. Falls daher durch die Anwendung des vorliegenden Verfahrens von einem Testliganden gezeigt wird, dass er ein Protein bindet, das die Etiologie eines Zustandes reflektiert oder beeinflusst, so kann dies die potentielle Fähigkeit des Testliganden anzeigen, die Proteinfunktion zu verändern und ein wirksames Pharmazeutikum oder eine Leitverbindung für die Entwicklung eines solchen Pharmazeutikums zu sein. Alternativ kann der Ligand als Basis für die Konstruktion von Hybridverbindungen dienen, die eine zusätzliche Komponente enthalten, die das Potential zum Ändern der Proteinfunktion aufweist. In diesem Fall dient das Binden des Liganden an das Zielprotein der Verankerung oder Orientierung der zusätzlichen Komponente, um seine pharmazeutischen Wirkungen zu ermöglichen. Es kann z. B. eine bekannte Verbindung, die die Aktivität einer Familie von verwandten Enzymen inhibiert, Spezifität für ein Mitglied der Familie verliehen werden, indem die bekannte Verbindung mit einem Liganden konjugiert wird, identifiziert nach dem erfindungsgemäßen Verfahren, der spezifisch an das Mitglied bindet, an einer anderen Stelle als die durch die bekannte Verbindung erkannte.
Die Tatsache, dass das vorliegende Verfahren auf physikalisch-chemischen Eigenschaften beruht, die den meisten Proteinen gemeinsam sind, führt zu seiner weitgefächerten Anwendung. Die vorliegende Erfindung kann auf systematische Vorgehensweisen mit hohem Durchsatz im großen Maßstab angewendet werden, die ein kostengünstiges Absuchen von vielen tausenden Testliganden ermöglichen. Sobald ein Ligand durch die erfindungsgemäßen Verfahren identifiziert worden ist, kann er unter Verwendung bekannter Verfahren, die für das verwendete spezielle Zielprotein spezifisch sind, stärker detailliert weiter analysiert werden. Zum Beispiel kann der Ligand direkt auf Bindung an das Zielprotein getestet werden, z. B. durch Inkubieren eines radiomarkierten Liganden mit einem unmarkierten Zielprotein und anschließendes Trennen des Proteingebundenen vom ungebundenen Liganden. Darüber hinaus kann der Ligand auf seine Fähigkeit getestet werden, eine bekannte biologische Aktivität des Zielproteins positiv oder negativ zu beeinflussen.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Binden des Testliganden an ein Zielprotein durch Verwendung von Proteolyse detektiert. Dieser Assay basiert auf der erhöhten Empfindlichkeit von ungefalteten denaturierten Polypeptiden hinsichtlich eines Proteaseverdaus im Vergleich zu der des gefalteten Proteins. In diesem Fall werden die Testligand-Zielprotein-Kombination und eine Kontrollkombination ohne Testligand mit einer oder mehreren Proteasen behandelt, die vorzugsweise auf das ungefaltete Zielprotein einwirken. Nach einer angemessenen Inkubationsperiode wird der Gehalt an intakten, d. h. unproteolysiertem, Zielprotein unter Verwendung einer der unten beschriebenen Methoden bestimmt, z. B. Gelelektrophorese und/oder Immunoassay.
Es gibt zwei mögliche Ergebnisse, die anzeigen, dass der Testligand an das Zielprotein gebunden hat. Es kann entweder eine signifikante höhere oder eine signifikant niedrigere absolute Menge an intaktem oder abgebautem Protein in Gegenwart des Liganden beobachtet werden, im Vergleich zu seiner Abwesenheit.
Für die Ausführung der vorliegenden Verbindung verwendbare Proteasen schließen, ohne Einschränkung, Trypsin, Chymotrypsin, V8-Protease, Elastase, Carboxypeptidase, Proteinase K, Thermolysin, Papain und Subtilisin ein (die alle von Sigma Chemical Co., St. Louis, M0, bezogen werden können). Das wichtigste Kriterium bei der Auswahl der Protease oder der Proteasen zur Verwendung bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass die Protease(n) zum Verdau des jeweiligen Zielproteins unter den gewählten Inkubationsbedingungen fähig sein muss (müssen), und dass diese Aktivität preferentiell auf die ungefaltete Form des Proteins gerichtet ist. Um "falsch positive" Ergebnisse zu vermeiden, die durch die Protease direkt inhibierende Testliganden verursacht werden, kann mehr als eine Protease, insbesondere Proteasen mit unterschiedlichen enzymatischen Wirkungsmechanismen, simultan oder in parallelen Assays verwendet werden. Zusätzlich werden für die Wirkung der Protease(n) benötigte Kofaktoren im Überschuss zugesetzt, um falsch positive Ergebnisse aufgrund von diese Faktoren maskierenden Testliganden zu vermeiden.
Typischerweise wird ein gereinigtes Zielprotein zunächst in einer Endkonzentration von 1 bis 100 ug/ml in einem Puffer aufgenommen, der 50 mM Tris-Hcl, pH 7, 5, 10% DMSO, 50 mM NaCl, 10% Glycerin und 1,0 mM DTT enthält. Dann werden Proteasen, wie z. B. Proteinase K oder Thermolysin (Proteasen mit unterschiedlichen Wirkungsmechanismen) individuell bis zu einer Endkonzentration von 0,2 bis 10,0 ug/ml zugegeben. Parallele Inkubationen werden für unterschiedliche Zeiträume zwischen 5 Minuten und 1 Stunde, vorzugsweise 30 Minuten, bei 4ºC, 15ºC, 25ºC und 35ºC durchgeführt. Die Reaktionen werden durch Zugabe eines geeigneten Proteaseinhibitors beendet, wie z. B. Phenylmethylsulfonylchlorid (PMSF) bis zu einer Endkonzentration von 1 mM (für Sereinproteasen), Ethylendiaminotetraessigsäure (EDTA) bis zu einer Endkonzentration von 20 mM (für Metalloproteasen) oder Iodacetamid (für Cysteinproteasen). Dann kann die in der Reaktionsmischung am Ende der Inkubationsperiode verbleibende Menge an intaktem Protein nach einem beliebigen Verfahren bestimmt werden, einschließlich, ohne Beschränkung, Polyacrylamid-Gelelektrophorese, ELISA, oder Bindung an Nitrocellulosefilter. Es ist klar, dass zusätzliche Experimente durchgeführt werden können, die einen engeren Temperaturbereich einbeziehen, um geeignete Bedingungen zu etablieren.
Das obige Protokoll erlaubt die Auswahl geeigneter Bedingungen (z. B. Proteasekonzentration und Verdautemperatur), die im Verdau von etwa 70% des Zielproteins innerhalb einer 30- minütigen Inkubationsperiode resultieren, was anzeigt, dass ein signifikanter Grad an Entfaltung aufgetreten ist. Vorzugsweise werden die Bedingungen so gewählt, dass die Proteolyse eine Temperaturabhängigkeit zeigt, die für einen kooperativen Proteinentfaltungsübergang kennzeichnend ist. Um dies zu erreichen, können zusätzliche Variablen angepasst werden, einschließlich z. B. der Konzentrationen von Glycerin, Salz, Reduktionsmitteln, BSA oder anderen "Trägerproteinen", des Zielproteins, sowie denaturierender Substanzen und Detergenzien. Falls ein bekannter Ligand für das Zielprotein erhältlich ist, wird der Ligand in die Reaktionsmischung in einer Konzentration oberhalb des Kd für seine Bindung an das Zielprotein und mindestens gleich der molaren Konzentration des Zielproteins einbezogen, und das Verdauexperiment wird wiederholt. Typischerweise wird zumindest ein zweifacher Anstieg oder Abfall des Ausmaßes des Verdaus des Zielproteins beobachtet, was anzeigt, dass das Binden eines bekannten Liganden das Verhältnis von gefaltetem : ungefaltetem Zielprotein und/oder der Geschwindigkeit der Faltung oder Entfaltung ändert.
Sobald die Bedingungen zum Etablieren eines Absuchens mit hohem Durchsatz, wie oben beschrieben, etabliert sind, wird das Protokoll gleichzeitig mit einer großen Anzahl an Testliganden in Konzentrationen im Bereich von 20 bis 200 uM wiederholt. Das Beobachten eines mindestens zweifachen Anstiegs oder einer zweifachen Verminderung im Ausmaß des Verdaus des Zielproteins zeigt eine "Treffer"-Verbindung an, d. h., einen an das Zielprotein bindenden Liganden. Bevorzugte Bedingungen sind dadurch gekennzeichnet, dass bei Anwendung dieser Vorgehensweise zwischen 0,1 und 1% der Testliganden als "Treffer"- Verbindungen identifiziert werden.
Bei einer anderen Ausführungsform wird die relative Menge an gefaltetem und ungefaltetem Zielprotein in Anwesenheit und Abwesenheit des Testliganden durch Messung der relativen Menge des Zielproteins bestimmt, die an eine geeignete Oberfläche bindet. Dieses Verfahren nutzt die erhöhte Neigung von ungefalteten Proteinen zur Anlagerung an Oberflächen, die auf der erhöhten Oberfläche beruht und der Verminderung der Maskierung von hydrophoben Resten, die aus dem Entfalten resultiert. Falls ein Testligand ein Zielprotein bindet (d. h. ein Ligand des Zielproteins ist), kann er die gefaltete Form des Zielproteins stabilisieren und seine Bindung an eine feste Oberfläche vermindern. Alternativ kann ein Ligand die ungefaltete Form des Proteins stabilisieren und seine Bindung an eine feste Oberfläche verstärken.
In dieser Ausführungsform werden das Zielprotein, ein Testligand und eine ungefaltetes Protein preferentiell bindende Oberfläche kombiniert und unter Bedingungen gehalten, die zur Bindung des Zielproteins an einen Liganden und zur Bindung des ungefalteten Zielproteins an die Oberfläche geeignet sind. Alternativ können das Zielprotein und der Testligand in Abwesenheit der Oberfläche präinkubiert werden, um die Bindung zu erlauben. Für diesen Zweck geeignete Oberflächen schließen, ohne Einschränkung, aus einer Vielzahl von behandelten oder unbehandelten Kunststoffmaterialien hergestellte Mikrotiterplatten, für Zellkultur oder für hohe Proteinbindung behandelte Platten, Nitrocellulosefilter und PVDF-Filter ein.
Die Bestimmung der Menge des Oberflächen-gebundenen Zielproteins oder der Menge des in der Lösung verbleibenden Zielproteins kann unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Standardverfahren durchgeführt werden, z. B. Bestimmung der Radioaktivität oder Immunoassay. Falls signifikant mehr oder weniger Zielprotein in Anwesenheit eines Testliganden Oberflächen-gebunden ist als in Abwesenheit des Testliganden, ist der Testligand ein Ligand des Zielproteins. In ähnlicher Weise wird das Verhältnis von Oberflächen-gebundenem zu löslichem Zielprotein in Gegenwart eines Testliganden signifikant größer oder kleiner sein, falls der Testligand ein Ligand des Zielproteins ist.
In einer anderen Ausführungsform wird das Ausmaß, zu dem gefaltetes und ungefaltetes Zielprotein in der Testkombination vorliegen, durch Verwendung von entweder für den ungefalteten oder den gefalteten Zustand des Proteins spezifischen Antikörper bestimmt, d. h. denaturiert-spezifischen ("DS") bzw. nativ-spezifischen ("NS") Antikörpern (Breyer, 1989, J. Biol. Chem. 264 (5) : 13348-13354).
Polyklonale und monoklonale DS- und NS-Antikörper, die für spezielle Zielproteine spezifisch sind, können durch im Stand der Technik gut bekannte Verfahren hergestellt werden (E. Harlow & D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1987). Für DS-Antikörper können Tiere mit einem Peptid aus der Region des Proteins immunisiert werden, die in seinem nativen Zustand im Inneren des Proteins verborgen ist. Falls die dreidimensionale Struktur des Proteins unbekannt ist, werden Antikörper gegen verschiedene Peptide hergestellt. Alternativ wird ein völlig denaturiertes (d. h. ungefaltetes) Zielprotein als immunogen verwendet.
Die resultierenden Antikörper werden auf preferentielle Bindung an den denaturierten Zustand gescreent. Für monoklonale Antikörper werden von individuell geklonten Hybridoma abgeleitete Kulturüberstände abgesucht und positive Klone werden direkt als Quelle von individuellen DS-Antikörpern verwendet. Für polyklonale Antikörper kann ein unfraktioniertes Antiserum preferentielle Bindung an den denaturierten Zustand zeigen. Alternativ können DS-Antikörper aus polyklonalem Antiserum durch selektive Absorptionstechniken, die im Stand der Technik gut bekannt sind, gereinigt werden.
Für NS-Antikörper, intaktes nicht-denaturiertes Protein, können ein oder mehrere Peptide als Immunogen verwendet werden, von denen bekannt ist, dass sie auf der Oberfläche des nativen Proteins liegen. Die resultierenden Antikörper werden wie oben auf preferentielle Bindung an das native Protein abgesucht und zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung gereinigt.
DS- oder NS-Antikörper können verwendet werden, um eine Ligand-induzierte Änderung im Gehalt an gefaltetem Zielprotein, ungefaltetem Zielprotein, dem Verhältnis gefaltet zu ungefaltet, oder der Geschwindigkeit des Faltens oder Entfaltens zu detektieren.
In einem Ansatz wird eine Testkombination, die DS-Antikörper, das Zielprotein und den Testliganden enthält, einem Feststoffträger ausgesetzt, z. B. einer mit denaturiertem Zielprotein oder einem Peptidfragment davon beschichteten Mikrotiterplatte, unter Bindung des Zielproteins an seinen Liganden und Bindung des DS-Antikörpers an das ungefaltete Zielprotein geeigneten Bedingungen. Eine Kontrollkombination, die die gleiche wie die Testkombination ist, außer dass sie keinen Testliganden enthält, wird auf die gleiche Art wie die Testlösung prozessiert. Durch Vergleich der Menge des an die Platte gebundenen Antikörpers oder der in Lösung verbleibenden Menge, in den Test- und Kontrollkombinationen, wird der Unterschied bei der Proteinfaltung detektiert. Die Menge des an die Platte gebundenen oder in Lösung verbleibenden Antikörpers kann wie unten beschrieben gemessen werden.
In einem zweiten Ansatz wird eine Testkombination, die den DS-Antikörper, den Testliganden und das Zielprotein enthält, einem Feststoffträger ausgesetzt, der mit einem zweiten Antikörper beschichtet ist, bezeichnet als Festphasenantikörper, der das Zielprotein nicht gleichzeitig mit dem DS-Antikörper binden kann und für das Zielprotein spezifisch ist, aber entweder spezifisch für den gefalteten Zustand (NS-Antikörper) oder nicht fähig, zwischen den nativen und dem denaturierten Zuständen zu differentieren ("nicht differenzierender" oder "ND"-Antikörper). Die resultierende Testkombination oder Lösung wird unter Bedingungen gehalten, die zur Bindung des Zielproteins mit einem Liganden des Zielproteins geeignet sind und zur Bindung des Antikörpers an die Proteine, die sie erkennen. Eine Kontrollkombination, die mit der Testlösung identisch ist, außer dass sie einen Testliganden enthält, wird auf gleiche Art wie die Testlösung prozessiert. In beiden Kombinationen bindet denaturiertes (ungefaltetes) Zielprotein den DS-Antikörper und wird bezüglich der Bindung des Festphasenantikörpers inhibiert. Die Fähigkeit des Testliganden, das Zielprotein zu binden, kann durch Bestimmung der Menge des Zielproteins, das in der Testlösung an dem Festphasenantikörper bindet und Vergleich mit dem Ausmaß der Bindung des Zielproteins an den Festphasenantikörper in Abwesenheit des Testliganden bestimmt werden, was die Menge des Zielproteins im gefalteten Zustand wiederspiegelt. Die Menge des über den zweiten Antikörper an die Platte gebundenen oder in Lösung verbleibenden Zielproteins kann durch die unten beschriebenen Methoden bestimmt werden. Dieser Ansatz kann in vergleichbarer Art mit NS-Antikörper als löslichem Antikörper und DS- und ND-Antikörper auf der Festphase angewandt werden.
In einem dritten Ansatz wird eine das Zielprotein und den Testliganden enthaltende Testlösung einem Feststoffträger, z. B. einer mit einem DS- oder NS-Antikörper beschichteten Mikrotiterplatte, ausgesetzt und unter zur Bindung des Zielproteins an seinen Liganden und zur Bindung des Antikörpers an das Zielprotein geeigneten Bedingungen gehalten. Alternativ kann der Antikörper auf der Oberfläche von Kügelchen vorliegen. Die Fähigkeit des Testliganden, das Zielprotein zu binden, wird durch Bestimmung des Ausmaßes gemessen, zu dem das Zielprotein in Lösung bleibt (nicht an den Antikörper gebunden) oder auf der Feststoffoberfläche (an den Antikörper gebunden) oder das Verhältnis der beiden in Anwesenheit und in Abwesenheit des Testliganden. Alternativ kann der Antikörper in Lösung vorliegen und das Zielprotein kann an die Feststoffphase angeheftet sein, wie an eine Plattenoberfläche oder an die Oberfläche eines Kügelchens.
In einer anderen Ausführungsform werden molekulare Chaperone verwendet, um die relativen Gehalte an gefaltetem und ungefaltetem Protein in der Testkombination zu bestimmen. Chaperone umfassen bekannte Proteine, die ungefaltete Proteine als Teil ihrer normalen physiologischen Funktion binden. Diese sind im allgemeinen in den Aufbau oligomerer Proteine, der Sicherstellung der korrekten Faltung bestimmter Proteine, der Erleichterung der Proteinlokalisation und dem Verhindern der Bildung von proteinhaltigen Aggregaten unter physiologischem Stress involviert (Hardy, 1991, Science, 251 : 439-443). Diese Proteine weisen die Fähigkeit auf, mit vielen ungefalteten oder teilweise denaturierten Proteinen ohne spezifische Erkennung definierter Sequenzmotive zu interagieren.
Ein molekulares Chaperon, das in E. coli gefunden wurde, ist ein als SecB bekanntes Protein. Von SecB wurde gezeigt, dass es in den Export einer Unterserie von ansonsten nicht verwandten Proteinen involviert ist. Kompetitionsexperimente haben gezeigt, dass SecB an alle getesteten ungefalteten Proteine stark bindet, einschließlich Proteinen außerhalb seiner speziellen Exportunterserie, aber dass es offenbar nicht mit gefaltetem Protein in Wechselwirkung tritt. Andere zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignete Chaperone schließen, ohne Einschränkung, Hitzeschockprotein 70 s, Hitzeschockprotein 90 s, GroEI und GroES ein (Gething et al., Nature 355: 33, 1992) ein.
In dieser Ausführungsform wird eine den Testliganden und das Ziel enthaltende Testkombination einem Feststoffträger, z. B. einer mit einem molekularen Chaperon beschichteten Mikrotiterplatte oder anderen geeigneten Oberfläche, unter Bedingungen ausgesetzt, die zur Bindung des Zielproteins mit seinem Liganden und zur Bindung des molekularen Chaperons an ungefaltete Zielproteine geeignet sind. Das ungefaltete Zielprotein in der Lösung weist eine größere Tendenz zur Bindung der molekularen Chaperon beschichteten Oberfläche auf, im Vergleich zum Liganden-stabilisierten gefalteten Zielprotein. Daher kann die Fähigkeit des Testliganden zur Bindung des Zielproteins durch Bestimmung der Menge des Zielproteins erfolgen, die ungebunden bleibt, oder der Menge, die an die Chaperon-beschichtete Oberfläche bindet.
Alternativ kann ein Kompetitionsassay zur Bindung an die molekularen Chaperone angewendet werden. Eine gereinigtes Zielprotein, den Testligand und ein molekulares Chaperon enthaltende Testkombination kann einem Feststoffträger ausgesetzt werden, z. B. einem mit denaturiertem (ungereinigtem) Zielprotein beschichteten Napfeiner Mikrotiterplatte, unter zur Bindung des Zielproteins mit seinem Liganden und zur Bindung des molekularen Chaperons an ungefaltetes Zielprotein geeigneten Bedingungen. Eine Kontrollkombination, die mit der Testkombination identisch ist, außer dass sie keinen Testliganden enthält, wird auf die gleiche Art prozessiert. Denaturiertes Zielprotein in Lösung bindet an das Chaperon und inhibiert dadurch dessen Bindung an das denaturierte an den Träger gebundene Zielprotein. Die Bindung eines Testliganden an das Zielprotein führt zu einer Differenz der Menge des ungefalteten Zielproteins und daher ist mehr oder weniger Chaperon zur Bindung an das Festphasen-denaturierte Zielprotein zugänglich, als es bei Nichtvorliegen einer Bindung des Testliganden der Fall ist. Daher kann die Bindung des Testliganden durch Messen des an die Oberfläche oder in Lösung gebundenen Chaperons in der Testkombination und in der Kontrollkombination und Vergleich der Ergebnisse bestimmt werden. In diesem Assay werden die Chaperone im allgemeinen nicht im Überschuß eingesetzt, so dass die Kompetition für ihre Bindung gemessen werden kann.
Alternativ keine eine das Zielprotein, den Testliganden und ein molekulare Chaperon enthaltende Testkombination einem Festphasenträger ausgesetzt werden, z. B. dem Napfeiner Mikrotiterplatte, der mit für das gefaltete Zielprotein spezifischen Antiseren oder für den gefalteten Zustand des Zielproteins spezifischem monoklonalem Antikörper (NS-Antikörper) beschichtet ist, und die zum Binden des an das Chaperon gebundenen Zielproteins nicht fähig ist. Ungefaltetes Zielprotein bindet Chaperon in Lösung und wird daher bezüglich der Bindung des Festphasenantikörpers inhibiert. Durch Nachweis des Zielproteins in der Lösung oder an den Wänden des Napfes gebunden und Vergleich des Ausmaßes von einem davon oder beiden mit einer geeigneten Kontrolle (die gleiche Kombination ohne den Testliganden) kann die Fähigkeit des Testliganden zur Bindung des Zielproteins bestimmt werden. Falls der Testligand ein Ligand für das Zielprotein ist, wird mehr oder weniger Zielprotein in der Testkombination an die Antiseren oder den monoklonalen Antikörper gebunden, die (der) an die Oberfläche des Containers gebunden sind (ist), als in der Kontrollkombination und dementsprechend wird mehr oder weniger Zielprotein in der Testkombination ungebunden (in Lösung) vorliegen, als in der Kontrollkombination.
In einer anderen Ausführungsform wird ein bekannter Ligand, Kofaktor oder Substrat des Zielproteins oder ein Analogon davon verwendet, um die Gegenwart von gefaltetem Zielprotein zu bestimmen. Je höher die Fraktion des Proteins in gefalteter Form, desto größer ist die Menge des Proteins, das für die Bindung an einen Liganden zugänglich ist, der allein den gefalteten Zustand bindet. Falls ein Protein einen bekannten Liganden hat, ist es konsequenterweise möglich, die Bindung des Proteins an den bekannten Liganden durch Zugabe eines Testliganden zu verstärken oder zu schwächen, der an eine andere Stelle des Proteins bindet. Zum Beispiel kann die Bindung von Dehydrofolatreduktase an Methotrexat, einem Folsäureanalog, verwendet werden, um den Grad der Faltung dieses Enzyms zu bestimmen.
In diesem Ansatz wird der Ligand, Kofaktor, das Substrat oder ein Analog davon, von denen bekannt ist, dass sie das Zielprotein binden, auf dem Feststoffsubstrat immobilisiert. Die das Zielprotein und den Testligand enthaltende Lösung wird dann zugegeben. Ein Anstieg oder eine Verminderung der Menge des Zielproteins, die relativ zu dem identischen Assay in Abwesenheit des Testliganden an die immobilisierte Verbindung bindet, zeigt an, dass der Testligand das Zielprotein bindet. Die Menge des an das Feststoffsubstrat gebundenen Zielproteins kann durch Testen des Feststoffsubstrats oder durch Testen der Lösung ermittelt werden.
In einer anderen Ausführungsform wird die Menge des ungefalteten Zielproteins in einer Testkombination durch Messen der Proteinaggregation bestimmt. Bei irreversibel entfaltenden Proteinen bildet entfaltetes Protein oftmals unlösliche Aggregate. Das Ausmaß der Proteinaggregation kann durch im Stand der Technik bekannte Techniken gemessen werden, einschließlich, ohne Beschränkung, Lichtstreuung, Zentrifugation und Filtration.
In diesem Ansatz werden Zielprotein und Testligand inkubiert und das Ausmaß der Proteinaggregation wird gegen die Zeit oder nach einer festgelegten Inkubationszeit gemessen. Das Ausmaß der Proteinaggregation in der Testmischung wird mit der gleichen Messung für einen Kontrollassay in Abwesenheit des Testliganden verglichen. Falls ein Testligand ein Zielprotein bindet, ist die Geschwindigkeit der Entfaltung des Zielproteins niedriger oder höher als in Abwesenheit des Testliganden. Für Messungen gegen die Zeit ist die Geschwindigkeit des Auftretens von aggregiertem Protein niedriger oder höher, falls der Testligand ein Ligand des Zielproteins ist, als wenn er es nicht ist. Bei Messungen zu einer festgesetzten Zeit liegt mehr oder weniger ungefaltetes Protein vor und dementsprechend mehr oder weniger aggregiertes Protein, falls der Testligand ein Ligand für das Zielprotein ist, als für den Fall, daß er es nicht ist. Daher kann die Fähigkeit eines Testliganden ein Zielprotein zu binden durch Bestimmen des Ausmaßes der Proteinaggregation in Anwesenheit und Abwesenheit des Testliganden bestimmt werden.
Es ist klar, dass die erfindungsgemäßen Verfahren auf Fragmente von Zielproteinen angewandt werden können, die stabile strukturelle Domänen darstellen. Wenn hierin verwendet, bezeichnet "Domäne" ein Fragment eines Zielproteins, das nach Isolierung einen signifikanten Anteil der nativ gefalteten Struktur erhält. In einigen Fällen wird ein natives Protein von einer Protease in ein oder mehrere solcher Domänen gespalten, wenn ein proteolytischer Verdau des nativen Proteins z. B. bei Temperaturen durchgeführt wird, die niedriger sind als die, bei denen ein kompletter Verdau des Proteins auftritt. In diesem Fall kann es vorteilhaft sein, die Bindung von Testliganden an jede der Domänen unabhängig zu bestimmen. Dies kann durch einen oder beide der folgenden Ansätze erreicht werden. Als erstes können ein oder mehrere individuelle Domänen des Zielproteins zur Verwendung als Ziele in den oben beschriebenen Assays hergestellt werden, entweder durch kontrollierte Proteolyse des intakten Proteins, gefolgt von Aufreinigung der die Domänen umfassenden Fragmente, oder durch zielgerichtete Synthese solcher Fragmente, entweder in vitro oder in vivo, von rekombinanten DNA-Molekülen ausgehend, die Domänen-umfassende Fragmente des Proteins kodieren. Als zweites kann eine Domänen-spezifische Detektion verwendet werden, um das Falten in einer Reaktionsmischung zu quantifizieren, in der das intakte Protein als Ziel dient. Verfahren für die Domänen-spezifische Detektion schließen, ohne Einschränkung, die Verwendung von Domänen-spezifischen Antikörpern und chemischen oder enzymatischen Verfahren ein, die bestimmte Domänen selektiv markieren. Domänen-spezifische Antikörper können nach jedem im Stand der Technik bekannten Verfahren hergestellt werden. Zum Beispiel können polyklonale Domänen-spezifische Antikörper unter Verwendung entweder gereinigter oder rekombinanter Domänen, wie oben beschrieben, oder Domänen-spezifischer synthetischer Peptide als Immunogene erzeugt werden. Alternativ kann eine Gruppe monoklonaler Antikörper gegen das intakte Protein hergestellt werden und auf Reaktion mit gereinigten oder rekombinanten Domänen getestet werden.
Die oben beschriebenen Ausführungsformen werden in Tabelle 1 zusammengefaßt. TABELLE 1 BESTIMMUNG GEFALTETER UND UNGEFALTETER ZIELPROTEINE

Protein-Nachweismethoden

Die oben beschriebenen Ausführungsformen erfordern einen Endschritt zur Detektion und/oder Quantifizierung des Gehalts an Zielprotein oder von Verdauprodukten davon oder Antikörpern, um die relativen Mengen an gefaltetem und ungefaltetem Zielprotein nach der Inkubation mit den Testliganden zu quantifizieren. Bei der praktischen Ausführung der vorliegenden Erfindung werden im Stand der Technik bekannte Verfahren verwendet, um die Gegenwart oder Abwesenheit von Protein, kleinen Peptiden oder freien Aminosäuren nachzuweisen. Das verwendete Verfahren wird durch das zu bestimmende Produkt (Proteine, Peptide, freie Aminosäuren) festgelegt. Zum Beispiel können Techniken zur Bestimmung der Proteingröße angewendet werden, um das Ausmaß des proteolytischen Abbaus des Proteins zu bestimmen, z. B. Gelelektrophorese, Kapillarelektrophorese, Größenausschlusschromatographie, Hochleistungsflüssigchromatographie und ähnliches. Messung der Radioaktivität, Fluoreszenz, Farbstoffbindung (Ciesiolka et al., Anal. Biochem. 168: 280, 1988), der Bindung von kolloidalem Gold (Bradford, Anal. Biochem. 72: 248, 1976) oder der enzymatischen Aktivität können das Vorliegen oder die Abwesenheit von Produkten bestimmten, entweder in Lösung oder auf einem festen Träger. Immunologische Verfahren, einschließlich z. B. ELISA und Radioimmunoassay, können das Vorliegen oder die Abwesenheit eines bekannten Zielproteins in Lösung oder auf einem Substrat bestimmen. Die obigen Methoden werden z. B. in Harlow, E. und D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, 1988; S. F. Y. Li, Capillary Electrophoresis, E1- sevier Press, 1993; Bidlingmeyer, Practical HPLC Methodology and Applications, John Wiley and Sons, Inc., 1992; und Cantor, C. R. und P. R. Schimmel, Biophyslcal Chemistry, WH Freeman and Co., 1980, beschrieben.
In einer Ausführungsform wird Gelelektrophorese zur Bestimmung des Vorliegens oder der Abwesenheit des Proteins verwendet und kann darüber hinaus zur Bestimmung der Größe des Proteins angewendet werden. Das zuletzt genannte Verfahren ist insbesondere im Zusammenhang mit Proteolyse anwendbar, da das Vorliegen einer größeren oder geringeren Menge von unverdautem Zielprotein in der Testkombination, im Vergleich zu der Kontrollkombination, anzeigt, dass der Testligand an das Zielprotein gebunden hat.
Die folgenden Beispiele bezwecken die Erläuterung der Erfindung, ohne diese einzuschränken.

Beispiel 1: Methotrexat-Bindung schützt die Dihydrofolat- Reduktase (DHFR) vor dem proteolytischen Verdau durch Proteinase K

Das folgende wurde kombiniert und bei 54ºC für 5 Minuten inkubiert: DHFR (100 ug/ml), Proteinase K (80 ug/ml), 0,1 M Tris-HCl pH 7, 5 und Methotrexat bei 10 bis 10&supmin;&sup4; M.
Proben wurden entfernt und unverdautes DHFR wurde durch ELISA wie folgt quantifiziert:
(a) Protease-Inkubationen wurden 50-fach mit Tris-gepufferter Saline (TBS) verdünnt;
(b) 50 ul verdünnte Proben wurden in die Näpfe einer ELISA- Platte transferiert und für 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert;
(c) die Näpfe der Platte wurden sorgfältig mit TBS plus 0,1% Tween-20 (TBST) gewaschen;
(d) 50 ul Anti-DHFR-Kaninchenserum, 250-fach in IBST plus 5% fettfreiem Milchpulver verdünnt, wurden zu jedem Napfzugegeben und für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert;
(e) die Näpfe der Platte wurden wie in (c) oben gewaschen;
(f) 50 ul Ziege-Anti-Kaninchen-IgG alkalisches Phosphatase- Konjugat, 500-fach in TBST plus 5% Milch verdünnt, wurden zu jedem Napfzugegeben und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert;
(g) die Näpfe der Platte wurden wie in (c) gewaschen; und
(h) 0,1 ml von 1,0 mg/ml p-Nitrophenylphosphat in 0,1% Diethanolamin wurden zugesetzt. Die Entwicklung der Farbe ist proportional zum gebundenen alkalischen Phosphatase- Antikörper-Konjugat.
Die ELISA-Analyse zeigt, dass Methotrexat bei Konzentrationen von 10-$ M und höher DHFR vor dem Verdau schützt. Durch das gleiche Verfahren wurde gezeigt, dass Nicotinamidadenindinucleotidphosphat (NADPH) und Dihydrofolat bei Konzentrationen von 10&supmin;&sup5; M und darüber die Proteolyse von DHFR in getrennten Experimenten inhibiert.

Beispiel 2: Methotrexat, NADPH und Dihydrofolat-Bindung schützt Dihydrofolat-Reduktase (DHFR) vor proteolytischem Verdau durch Proteinase K in Gegenwart einer Mischung von Aminosäuren

Das folgende wurde kombiniert und bei 54ºC für 5 Minuten inkubiert: DHFR (2,1 ug/ml), Proteinase K (80 ug/ml), 0,1 M Tris-HCl (pH 7,5), 10&supmin;&sup5; M von allen 20 üblichen Aminosäuren und entweder 0 oder 1 W M Ligand. Die verwendeten Liganden waren der Inhibitor Methotrexat und die Substrate Dihydrofolat und NADPH.
Die Proben wurden entfernt und unverdautes DHFR wurde durch ELISA wie folgt quantifiziert:
(a) Protease-Inkubationen wurden 50-fach mit Tris-gepufferter Saline (TBS) inkubiert;
(b) 50 ul verdünnte Proben wurden in die Näpfe einer ELISA- Platte transferiert und 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert;
(c) die Näpfe der Platte wurden sorgfältig mit TBS plus 0,1% Tween-20 (TBST) gewaschen;
(d) 50 ul Anti-DHFR-Kaninchenserum, 250-fach in TBST plus 5% fettfreiem Milchpulver verdünnt, wurden zu jedem Napfzugegeben und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert;
(e) die Näpfe der Platten wurden wie in (c) oben gewaschen;
(f) 50 ul Ziege-Antikaninchen-IgG alkalisches Phosphatase- Konjugat, 500-fach in TBST plus 5% Milch verdünnt, wurden zu jedem Napfzugegeben und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert;
(g) die Näpfe der Platten wurden wie in (c) gewaschen; und
(h) 0,1 ml von 1,0 mg/ml p-Nitrophenylphosphat in 0, 1% Diethanolamin wurden zugesetzt. Die Entwicklung der Farbe ist zu dem gebundenen alkalischen Phosphatase-Antikörper- Konjugat proportional.
Die ELISA-Analyse zeigte, dass Methotrexat und die Substrate DHFR vor dem Verdau schützen, in Relation zur Abwesenheit von Liganden, die DHFR binden. Daher kann eine spezifische Bindung in Anwesenheit einer komplexen Mischung von Verbindungen detektiert werden, die das Zielprotein nicht binden.

Beispiel 3: Methotrexat-Bindung inhibiert die Bindung von DHFR an Mikrotiterplatten

Das folgende wurde in einem Volumen von 60 ul kombiniert und in einer Falcon-3072-"Gewebekultur behandelten"-Mikrotiterplatte bei 20 oder 47ºC inkubiert: 100 mg DHFR, 50 mM Tris-Cl (pH 7, 5) und Methotrexat 10&supmin;¹&sup0; bis 10&supmin;&sup9; M.
50 ul jeder Probe wurden dann in die Näpfe einer ELISA-Platte transferiert und das in Lösung verbleibende DHFR wurde durch ELISA wie folgt quantifiziert:
(a) die 50 ul-Proben wurden für 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert;
(b) die Näpfe der Platte wurden sorgfältig mit TBST plus 0,1% Tween-20 (TBST) gewaschen;
(c) 50 ul Anti-DHFR-Kaninchenserum, 250-fach in TBST plus 5% fettfreiem Milchpulver verdünnt, wurden zu jedem Napfzugegeben und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert;
(d) die Näpfe der Platten wurden wie in (b) oben gewaschen;
(e) 50 ul Ziege-Antikaninchen-IgG alkalisches Phosphatase- Konjugat, 500-fach in TBST plus 5% Milch verdünnt, wurden zu jedem Napfzugegeben und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert;
(f) die Näpfe der Platten wurden wie in (b) gewaschen; und
(g) 0,1 ml von 1,0 mg/ml p-Nitrophenylphosphat in 0,1% Diethanolamin wurden zugesetzt. Die Entwicklung der Farbe ist zu dem gebundenen alkalischen Phosphatase-Antikörper- Konjugat proportional.
Die ELISA-Analyse zeigte, dass Methotrexat die DHFR-Bindung an die Falcon-3072-Platte in Konzentrationen von 10e M und darüber inhibiert.

Beispiel 4: Inhibierung oder Verstärkung der Bindung ungefalteter spezifischer Antikörper

(1) ELISA-Platten werden durch Inkubation für 60 Minuten mit der folgenden Mischung beschichtet: 4 ug/ml irreversibel denaturiertes Zielprotein oder Peptidfragment davon in Tris-gepufferter Saline (10 mM Tris-Cl, pH 7,5, 0,2 M NaCl; TBS).
(2) Die Platten wurden dreifach mit TBS plus 0,1% Tween-20 (TBST) gewaschen.
(3) Die folgende Mischung (Gesamtvolumen 50 ul) wird in beschichteten Näpfen der Mikrotiterplatten für 60 Minuten inkubiert:
(a) für den ungefalteten Zustand des Zielproteins spezifischer Antikörper in einer hinreichenden Konzentration, um 50% der maximalen Bindung zu ergeben (in Abwesenheit des kompetierenden Zielproteins).
(b) Zielprotein bei einer Konzentration, die hinreichend ist, um 90% Inhibierung der Antikörperbindung an die Platte zu inhibieren. Die geeignete Konzentration des Zielproteins ist für jedes Zielprotein unterschiedlich. Die Konzentration hängt, teilweise, von der Stabilität der gefalteten Form des Zielproteins ab. In einigen Fällen kann es wünschenswert sein, die Stabilität des Zielproteins durch erhöhte Temperatur, Einschluß von chemischen Denaturierungsmitteln oder Einbeziehen von destabilisierenden Aminosäure-Substitutionen in das Zielprotein zu reduzieren.
(c) 10&supmin;&sup9; bis 10&supmin;&sup5; M Testliganden
(d) 5% fettfreies Milchpulver in TBST
(4) Die Platten werden 3-fach mit TBST gewaschen.
(5) 50 ul Ziege-Anti-IgG alkalische Phosphatase-Konjugat werden in einer angemessenen Verdünnung in TBST plus 5% fettfreies Milchpulver zugesetzt und für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
(6) Die Platten werden 3-fach mit TBST gewaschen.
(7) 0,1 ml von 1,0 mg/ml p-Nitrophenylphosphat in 0,1% Diethanolamin werden zugesetzt und das Ausmaß der Farbentwicklung wird durch einen ELISA-Plattenleser aufgezeichnet.
ELISA-Analyse zeigt, dass mehr oder weniger Antikörper an die Platte gebunden werden, wenn eine erfolgreiche Testligand- Zielprotein-Bindung aufgetreten ist, als in Abwesenheit einer solchen Bindung.

Beispiel 5: Inhibierung oder Verstärkung der Chaperon-Bindung

(1) ELISA-Platten wurden durch Inkubation für mehrere Stunden mit 4 ug/ml Chaperon in TBS beschichtet.
(2) Die Platten werden dreifach mit TBST gewaschen.
(3) Die folgende Mischung (Gesamtvolumen 50 ul) wird dann in den beschichteten Näpfen der Mikrotiterplatte 10 für 60 Minuten inkubiert:
(a) Zielprotein bei einer Konzentration, die zur Sättigung von etwa 50% der erhältlichen Bindungsseiten, die in dem Chaperonprotein vorliegen, hinreichend ist. In den Fällen, in denen die gefaltete Form des Zielproteins sonst zu stabil ist, um eine nennenswerte Bindung an Chaperon zu ermöglichen, können denaturierende Bedingungen angewandt werden.
(b) 10&supmin;&sup9; bis 10&supmin;&sup5; M Testliganden in TBST
(4) Aliquots der Napflösungen werden in Näpfe einer neuen ELISA-Platte transferiert und für 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
(5) pie Näpfe der Platte werden 3-fach mit TBST gewaschen.
(6) 50 ul für das Zielprotein spezifischer Antikörper in einer angemessen Verdünnung in TBST, plus 5% fettfreies Milchpulver, werden jedem Napfzugegeben und für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
(7) Die Näpfe der Platte werden 3-fach mit TBST gewaschen.
(8) 50 ul Ziege-Anti-IgG alkalische Phosphatase-Konjugat werden in einer angemessenen Verdünnung in TBST plus 5% fettfreiem Milchpulver jedem Napfzugesetzt und für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
(9) Die Näpfe der Platte werden 3-fach mit TBST gewaschen.
(10) 0,1 ml von 1,0 mg/ml p-Nitrophenylphosphat in 0,1% Diethanolamin werden zugesetzt. Die Farbentwicklung (proportional im gebundenen alkalischen Phosphatase- Antikörper-Konjugat) wird mit einem ELISA-Plattenleser aufgezeichnet.
ELISA-Analyse zeigt, dass das Zielprotein in der Lösung in höheren oder niedrigeren Konzentrationen vorliegt, wenn Testligand-Zielprotein-Bindung aufgetreten ist, als wenn sie nicht aufgetreten ist.

Beispiel 6: Verstärkung oder Inhibierung der Bindung an einen bekannten Liganden

(1) Die folgende Mischung (Gesamtvolumen 50 ul) wird in den beschichteten Näpfen der Mikrotiterplatte für 60 Minuten inkubiert:
(a) ein Ligand, von dem man weiß, dass er das Zielprotein bindet, wird an Feststoffkügelchen, wie Sephadex, kovalent gebunden. Dieser Ligand kann ein kleines Molekül oder ein Makromolekül sein.
(b) Zielprotein in einer Konzentration weit unter der Sättigung des Liganden und so, dass nur 10% des Proteins an die Ligandenseiten bindet. Die Lösungsbedingungen sind so, dass das Zielprotein überwiegend im denaturierten Zustand vorliegt.
(c) 10&supmin;&sup9; bis 10&supmin;&sup5; M Testliganden
(d) in TBST plus notwendige denaturierende Substanzen, wie Harnstoff.
(2) Aliquots der Napfüberstände (frei von Kügelchen) werden in Näpfe einer neuen ELISA-Platte transferiert und für 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
(3) Die Näpfe der Platte werden 3-fach mit ISST gewaschen.
(4) 50 ul für das Zielprotein spezifischer Antikörper in einer angemessen Verdünnung in TBST, plus 5% fettfreies Milchpulver, werden jedem Napfzugegeben und für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
(5) Die Näpfe der Platte werden 3-fach mit TBST gewaschen.
(6) 50 ul Ziege-Anti-IgG alkalische Phosphatase-Konjugat werden in einer angemessenen Verdünnung in TBST plus 5% Milch jedem Napfzugesetzt und für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
(7) Die Näpfe der Platte werden 3-fach mit TBST gewaschen.
(8) 0,1 ml von 1,0 mg/ml p-Nitrophenylphosphat in 0,1% Diethanolamin werden zugesetzt. Die Farbentwicklung (proportional im gebundenen alkalischen Phosphatase- Antikörper-Konjugat) wird mit einem ELISA-Plattenleser aufgezeichnet.
ELISA-Analyse zeigt, dass das Zielprotein in der Lösung in höheren oder niedrigeren Konzentrationen vorliegt, wenn eine erfolgreiche Testligand-Zielprotein-Bindung aufgetreten ist.

Beispiel 7: Assay mit niedrigem Durchsatz für HIV-Rev-Protein

Reaktionsmischungen (0,03 ml Gesamtvolumen) enthielten 30 ug/ml HIV-Rev-Protein, das in E. coli produziert worden war, 0,05 M Tris-HCl, pH 7,5, 0,01 M Calciumacetat, 2,5 ug/ml Proteinase K, 10% DMSO und variierende Mengen an tRNA als bekannten Ligand. Die Reaktionen wurden auf Eis für 15 Minuten inkubiert. Nach Zugabe von PMSF und EDTA, wie in Beispiel 8 unten beschrieben, wurden Proben für die Gelelektrophorese vorbereitet und wie in Beispiel 8 beschrieben analysiert.
Die Ergebnisse zeigten, dass in Abwesenheit von tRNA das REV- Protein unter diesen Bedingungen nahezu vollständig durch Proteinase K abgebaut wird. In Gegenwart von tRNA jedoch wird ein Fragment niedrigeren Molekulargewichts des Proteins gegen die Proteolyse stabilisiert. Daher ist die Bindung des bekannten Liganden an HIV-Rev-Protein unter Verwendung der Verfahren der vorliegenden Verbindung detektierbar.

Beispiel 8: Assay mit niedrigem Durchsatz auf Carboanhydrase-Liganden

Die Ligandenbindung an Carboanhydrase I (Sigma) wurde unter Verwendung von Proteolyse als Test für die Faltung des Zielproteins verwendet, und denaturierende Gelelektrophorese wurde als Verfahren zur Detektion von nach dem Verdau mit Proteasen verbleibendem intaktem Protein verwendet.
Um den Assay zu validieren, wurde Acetazolamid, ein bekannter Ligand der Carboanhydrase, getestet. Obwohl Acetazolamid ein bekannter Inhibitor der Carboanhydraseaktivität ist, machen sich diese Experimente diese Eigenschaft nicht zunutze und messen nicht die enzymatische Aktivität des Proteins. Zusätzlich wurde die Sensitivität des Verfahrens bezüglich einer Interferenz durch natürliche Produktextrakte untersucht.
Die Reaktionsmischungen enthielten 13,3 ug/ml Carboanhydrase, 0,05 M Tris-HCl, pH 7,5, 0,01 M Calciumacetat, 2,5 ug/ml Proteinase K, 10% DMSO und Acetazolamid (Sigma) in Konzentrationen im Bereich von 0,0 bis 1,0 mM. Die Reaktionen wurden bei 54ºC für 15 Minuten inkubiert und dann auf Eis gekühlt. Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) wurden dann einer 20 mM- Stammlösung in Ethanol auf eine Endkonzentration von 1 mM zugegeben, und EDTA wurde aus einer 0,5 M-Stammlösung auf eine Endkonzentration von 20 mM zugegeben. 0,01 ml SDS-Ladepuffer (10% Natriumdodecylsulfat (SDS), 0,5 M Dithiothreitol, 0,4 M Tris-HCl-Puffer, pH 6,8, 50% Glycerin) wurden zugegeben, und die Proben wude für 3 Minuten auf 95ºC erhitzt. Die Proben wurden durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unter Verwendung eines 4-15%-Polyacrylamid(BioRad)-Gradientengels analysiert, das dann mit Coomassie-Blau-Farbstoff gefärbt wurde. Wie in Fig. 1 gezeigt, resultiert die Bindung des bekannten Liganden Acetazolamid an Carboanhydrase in der Stabilisierung von Carboanhydrase gegenüber Proteolyse durch Proteinase K bei 1 · 10&supmin;&sup5; M Acetazolamid. Die Dissoziationskonstante für diese Wechselwirkung wurde mit 2,6 · 10&supmin;&sup6; M angegeben (Matsumoto, K. et al. (1989), Chem. Pharm. Bull, 37: 1913-1915). Ein fungaler Methanolextrakt wurde in Reaktionen einbezogen, die ansonsten mit den oben beschriebenen identisch waren, so dass die Endkonzentration an zugegebenen kleinen Molekülen gleich ihrer Konzentration in der Ausgangskultur war. Das Vorliegen von Extrakt induzierte weder ein falsches Signal noch verminderte es die Reaktion auf 1,0 mM Acetazolamid (Fig. 2)

Beispiel 9: Absuchen mit hohem Durchsatz von Liganden auf humane Carboanhydrase

Ein Assay mit hohem Durchsatz auf Carboanhydrase T ist etabliert worden. Jede Reaktionsmischung (in einem Endvolumen von 0, 05 ml) enthält: 3, 3 ug Carboanhydrase, 50 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 1,0 mM Ca(OAc)&sub2; und 0,13 ug Proteinase K, 10% DMSO und die geeignete Testverbindung in einer Konzentration von 20 um. Die Kontrollreaktionen sind identisch, außer dass die Testverbindung ausgelassen wird. Die Mischungen werden bei 20ºC für 10 Minuten inkubiert, gefolgt von Inkubation bei 54ºC für 30 Minuten, woraufhin sie auf Eis gestellt werden. Jede Mischung erhält dann 200 ul 50 mM Natriumborat-Puffer, pH 8,5, enthaltend 10 mM EDTA und 1,0 mM PMSF. Nach 20 Minuten Inkubation auf Eis wurden 7,5 ul der Mischung zu Dynatech-Immulon-4-Mikroplattennäpfen zugegeben, die 92,5 ul pro Napfdes oben beschriebenen Borat-Puffers enthielten. Die Platten wurden dann bei 4ºC über Nacht inkubiert, um das Binden von Carboanhydrase zu ermöglichen. Die gebundene Carboanhydrase wird durch direkten ELISA unter Verwendung von HRPkonjugiertem Anti-Carboanhydrase I Antikörper bei einer 1: 2.000-Verdünnung quantifiziert (Biodesign, Kennebunk, ME); cat#K90046P) und Pierce (Rockford, IL) Turbo TMB-Substrat.
Carboanhydrase I Inhibitoren (bezogen von Sigma Chemical Co., St. Louis, M0) wurden im obigen Assay über einen Bereich der Inhibitorkonzentrationen getestet. Tabelle 2 zeigt die Konzentration, die 50% Inhibierung der Proteolyse in dem Assay verursachte (1050), die publizierten Kd-Werte für die Verbindungen (Matsumoto et al., Chem. Pharm. Bull., 37: 1913 (1989)) und das Verhältnis dieser Werte für jede Verbindung. Diese Daten zeigen eine positive Korrelation zwischen dem 1050- und Kd-Werten für jeden Inhibitor. TABELLE 2

Beispiel 10: Absuchen mit hohem Durchsatz auf Liganden für humane neutrophile Elastase

Bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung ist die Fähigkeit, Bindungsassays mit einer großen Anzahl von Verbindungen durchzuführen, für ihre Nützlichkeit bei der Entdeckung von Verbindungen von potentiell pharmazeutischem Wert entscheidend. Zwei verschiedene Ansätze sind erfolgreich in einem Absuchen mit hohem Durchsatz implementiert worden, und jeder dieser ist auf zwei Zielproteine angewandt worden: humane neutrophile Elastase (HNE) und humanes Hämoglobin, sowohl Hämoglobin A (HbA) als auch Hämoglobin 5 (HbS) (beschrieben in Beispiel 11 unten).
Auffallenderweise unterscheiden sich diese Zielproteine voneinander in einer Anzahl von wichtigen Aspekten: HbS ist ein intrazelluläres tetrameres Protein, das eine für seine Funktion kritische prosthetische Gruppe enthält. Man weiß, dass es in zwei Konformationen mit unterschiedlichen strukturellen und funktionalen Eigenschaften vorliegt. Im Gegensatz dazu ist HNE monomer, ohne prosthetische Gruppe und wird sekretiert. HNE weist eine enzymatische Aktivität auf (Proteolyse) und scheint keinen globalen konformationalen Änderungen zu unterliegen.
Für das Absuchen mit hohem Durchsatz mit beiden dieser Zielproteine wird die Proteolyse als Test auf Zielproteinfaltung angewendet. Die beiden Verfahren mit hohem Durchsatz unterscheiden sich in den für die Detektion des nach der Proteolyse vorliegenden Restzielproteins angewendeten Verfahren. Die beiden Detektionsverfahren sind: 1) Auffangen von radiomarkiertem Protein auf Nitrocellulosefiltern, gefolgt von Quantifizierung der gebundenen Radioaktivität und 2) Messung des Proteins durch Enzym-gekoppelten immunosorbenten Assay (ELISA). Jedes dieser Verfahren wurde sowohl mit Hämoglobin als auch mit HNE erfolgreich angewendet.

A) Nitrocellulosebindung an radiomarkiertes HNE:

0,1 mg HNE (Elastin-Produkte) wurde durch Reaktion mit ¹²&sup5;I- Natriumiodid (Amersham) in Gegenwart von Iodogen (Pierce) gemäß dem Protokoll des Herstellers (Pierce) markiert Reaktionsmischungen wurden in einem Endvolumen von 0,05 ml hergestellt, enthaltend radiomarkiertes HNE (20.000 cpm, entsprechend etwa 10 ug), 0,025 mg/ml bovines Serumalbumin, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM Calciumacetat, 2,5 ug/ml Thermolysin (Boeringer Mannheim), 2,5 ug/ml Proteinase K (Merck), 10% DMSO und die Testverbindung in einer Konzentration von 200 uM. Die Kontrollmischungen waren identisch, außer dass die Testverbindung nicht einbezogen wurde.
Die Mischungen wurden bei 20ºC für 15 Minuten inkubiert und dann bei 65ºC für 30 Minuten, woraufhin sie auf Eis gestellt wurden. 0,12 ml 50 mM Natriumacetat-Puffer, pH 4, 5, wurden dann jeder Mischung zugesetzt. Nach einer zusätzlichen 15- minütigen Inkubation auf Eis wurden die Proben durch Nitrocellulose-Membranbögen unter Verwendung von Schleicher und Schuell Minifold filtriert. Jeder Napfdes Apparates wurde dann einmal mit 0,2 ml 50 mM Natriumacetat-Puffer, pH 4,5, und zweimal mit 0,5 ml 50 mM Natriumphosphat, pH 5,5, enthaltend 2% SDS und 1,0% Triton X-100, gewaschen. Nach Trocknen des Filters wurde die gebundene Radioaktivität durch Szintillationzählung unter Verwendung des Wallac-Microßeta-Apparats bestimmt.
Um den Assay zu bestätigen, wurde ein bekannter Ligand für HNE-Elastatinal in Konzentrationen von 1 bis 5 mM in den Assay einbezogen. Wie in Fig. 3 gezeigt, erhöhte das Einbeziehen von Elastatinal die Retention des markierten HNE auf den Nitrocellulosefiltern, wodurch gezeigt wurde, dass es HNE vor Proteolyse schützte.

B) ELISA-Quantifizierung von HNE:

Reaktionsmischungen im Endvolumen von 0,05 ml enthielten 2 ug/ml HNE, 0,020 mg/ml bovines Serumalbumin, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM Calciumacetat, 7,5 ug/ml Thermolysin (Boeringer Mannheim), 7,5 ug/ml Proteinase K (Merck), 10% DMSO und die Testverbindung in einer Konzentration von 20 oder 200 uM. Kontrollmischungen waren identisch, außer dass die Testverbindung weggelassen wurde. Die Mischungen wurden bei 20ºC für 15 Minuten inkubiert, dann bei 63ºC für 30 Minuten, dann auf Eis platziert.
0,1 ml Kaninchen-Anti-HNE-Antikörper (Calbiochem) in einer Verdünnung von 1 : 10.000 in TBST (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,15 M NaCl, 0,05% Tween-20), enthaltend 5% fettfreies Milchpulver (Carnation), wurde dann zu jeder Reaktion zugegeben. Nach 10- minütiger Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Mischungen in 96 Napf-Immulon-4-Platten (Dynatech) transferiert, die durch über-Nacht-Inkubation mit 0,1 ml pro Napfvon 0,2 ug/ml HNE in 50 mM Natriumborat-Puffer, pH 8,5, und 3 mM Natriumazld beschichtet worden waren und dann sorgfältig mit TBST gewaschen. Die Platten wurden dann für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert, woraufhin sie sorgfältig mit TBST gewaschen wurden. 0,1 ml alkalische Phosphatase konjugierter Ziege- Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper (Calbiochem), 1 : 1000 in TBST mit 5% fettfreiem Milchpulver verdünnt, wurden jedem Napfzugesetzt, und die Platten wurden für 1 bis 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden dann sorgfältig mit TBST gewaschen und am Ende mit TBST ohne Tween. 0,1 ml pro ml p-Nitrophenylphosphat (0,5 mg/ml) in 1X Diethanolamin- Substratpuffer (Pierce) wurden jedem Napfzugegeben. Die Platten wurden bei Raumtemperatur bis zur Farbentwicklung inkubiert, woraufhin die Extinktion jedes Napfes bei 405 nm unter Verwendung eines BioRad-3550-UV-Mikroplattenlesers gemessen wurde.
Um den Assay zu bestätigen, wurde ein bekannter Ligand für HNE, ICI 200,355, in Konzentrationen von 0,01 bis 10 uM in den Assay einbezogen. Wie in Fig. 4 gezeigt, führte das Einbeziehen des Liganden zu einer Inhibierung der Antikörperbindung an die Platte, wodurch ein erhöhter Gehalt an immunoreaktiven HNE in der Reaktionsmischung angezeigt wurde.

C) Ergebnisse des Absuchens mit hohem Durchsatz:

3. 600 Verbindungen wurden unter Verwendung von Proteolyse und ELISA-Detektion wie oben (Fig. 5) auf Interaktion mit HNE abgesucht. Von diesen inhibierten 24 die Proteolyse von HNE durch Proteinase K in einem Ausmaß von 50% oder mehr, wenn sie in Konzentrationen von 20 uM dem Assay unterzogen wurden (positive Trefferverbindungen). Für zusätzliche 6 Verbindungen ergab sich ein ansteigendes Ausmaß der Proteolyse um das mindestens 2-fache, wenn sie bei 20 uM getestet wurden (negative Trefferverbindungen). Die Konzentrationsabhängigkeit des Effekts der Trefferverbindungen wurde gemessen. Trefferverbindungen zeigten halbmaximale Effekte bei Konzentrationen bis herunter zu 8 44; ein Beispiel ist in Fig. 6 gezeigt. Die maximale Inhibition lag für gewöhnlich, aber nicht immer, bei nahezu 100%.
Die Trefferverbindungen wurden auf ihre Fähigkeit zur Inhibierung der enzymatischen Aktivität von HNE einem Assay unterzogen. Da die in dem Bindungsassay identifizierten Verbindungen irgendwo auf der Proteinoberfläche binden können, ist nur für einen kleinen Teil zu erwarten, dass sie die enzymatische Aktivität von HNE inhibieren. Die Verbindungen wurden als Inhibitoren der Proteolyse von Suc-(Ala)3-pNA (Elastin Products Co., Owensville, M1), einem chromogenen synthetischen Substrat, gemäß dem Verfahren von Bieth, J. Spiess, B. und Wermuth, C. G. (1974, Biochemicals Medicine, 11: 350-357) getestet. Zwei positive Trefferverbindungen und eine negative Trefferverbindung inhibierten die proteolytische Aktivität von HNE in diesen Assays signifikant (Fig. 7).

D) Vergleich der Bindungsaktivität und inhibitorischen Aktivität von bekannten HNE-Inhibitoren:

Drei nicht-kovalente Inhibitoren der humanen neutrophilen Elastase-katalytischen Aktivität wurden von Merion Merrell Dow, Inc. (Cincinnati, OH) bezogen. Jede dieser Verbindungen wurde auf HNE-Bindungsaktivität unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren über einen Konzentrationsbereich getestet. Die Bindungsaktivität (ICso) wird als die zur Inhibierung der Proteolyse um 50% erforderliche Konzentration ausgedrückt.
Die Verbindungen wurden auch einem Assay auf ihre Fähigkeit zur Inhibierung der katalytischen Aktivität von HNE unterzogen. Zu diesem Zweck wurde die Spaltung des chromogenen Substrats Methoxysuccinal-ala-ala-pro-val-p-nitroanilid. (Elastin Products Co.) gemessen. In diesem Assay wurden 100 ul Reaktionen, enthaltend chromogenes Substrat (1 mM), 100 nM Elastase, 1% DMSO, 100 mM Tris-HCl, pH 7,5, und 0,5 M NaCl, hergestellt. Die Spaltung wurde durch Messen des Anstiegs der Extinktion der Reaktionsmischungen bei 405 nm gegen die Zeit aufgezeichnet.
Die die Bindung an HNE reflektierenden IC&sub5;&sub0;-Werte, die ICso- Werte der Inhibierung der katalytischen HNE-Aktivität und das Verhältnis dieser Werte sind in Tabelle 3 gezeigt. TABELLE 3
a ausgedrückt als IC&sub5;&sub0; für Inhibition der Proteolyse von HNE
b ausgedrückt als IC&sub5;&sub0; für Inhibition von HNE-Aktivität
Diese Daten zeigen eine enge Korrelation zwischen der Bindung an HNE (wie durch die erfindungsgemäßen Verfahren detektiert) und der Inhibierung der katalytischen HNE-Aktivität für jeden der Inhibitoren.

Beispiel 11: Absuchen mit hohem Durchsatz auf Liganden für humanes Hämoglobin

A) Nitrocellulosebindung von radiomarkiertem Hämoglobin:

0,2 mg HbS oder HbA (Sigma) wurden durch Reaktion mit 1 mCi 1251-Bolton-Hunter-Reagenz (Amersham) in 100 mM Natriumborat- Puffer, pH 8,5, für 1 Stunde auf Eis radiomarkiert. Die Markierung wurde durch Zugabe eines 200 mM Glycin enthaltenden Borat-Puffers gestoppt. Die Mischung wurde dann auf einer Execellulose-GF-5-Säule (Pierce) in 50 mM Natriumphosphat- Puffer, pH 7,5, enthaltend 0,25% Gelatine, einer Größenfraktionierung unterworfen.
Für den Bindungsassay enthielten die Reaktionsmischungen in einem Endvolumen von 0,05 ml Hämoglobin (20.000 CPM), 0,063 mg/ml unmarkiertes Hämoglobin, 0,034 mg/ml bovines Seriumalbumin, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM Calciumacetat, 2,5 ug/ml Thermolysin (Boeringer Mannheim), 2,5 ug/ml Proteinase K (Merck), 10% DMSO und die Testverbindung. Die Kontrollmischungen waren identisch, außer dass die Testverbindung weggelassen wurde. Die Mischungen wurden für 15 Minuten bei 20ºC inkubiert, dann für 30 Minuten bei 40ºC, und dann auf Eis gestellt. 0,12 ml 50 mM Natriumacetat-Puffer, pH 4,5, wurden dann zu jeder Mischung zugegeben. Nach zusätzlicher 15- minütiger Inkubation auf Eis wurden die Proben unter Verwendung des Schleicher und Schuell Minifold durch Nitrocellulose-Membranbögen filtriert. Jeder Napfdes Apparates wurde dann einmal mit 0,2 ml 50 mM Natriumacetat-Puffer, pH 4,5, zweimal mit 0,5 ml 50 mM Natriumphosphat-Puffer, pH 5,5, enthaltend 2,0% SDS und 1,0% Triton X-100, gewaschen. Nach Trocknen der Filter wurde die gebundene Radioaktivität unter Verwendung des Wallac-Microßeta-Apparates durch Szintillationszählung bestimmt.
Um den Assay zu bestätigen, wurde ein bekannter Ligand für Hämoglobin, 2,3-Diphosphoglycerat, in Konzentrationen von 10&supmin;&sup5; bis 10&supmin;¹ M, in die Reaktionsmischung einbezogen. Wie in Fig. 8 gezeigt, steigerte 2,3-Diphosphoglycerat die Filterretention des Hämoglobins signifikant.

B) ELISA-Quantifizierung von Hämoglobin:

Die Reaktionsmischungen enthielten in einem Endvolumen von 0,05 ml 0,063 mg/ml Hämoglobin, 0,034 mg/ml bovines Seriumalbumin, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM Calciumacetat, 7,5 ug/ml Thermolysin (Boeringer Mannheim), 7,5 ug/ml Proteinase K (Merck), 10% DM50 und die Testverbindung in Konzentrationen von 20 oder 200 uM. Die Kontrollreaktionen waren identisch, außer dass die Testverbindung weggelassen wurde.
Die Mischungen wurden bei 20ºC für 15 Minuten inkubiert und bei 44ºC für 30 Minuten und dann auf Eis gestellt. Zu jeder Mischung wurden dann 0,05 ml 0,1 M Natriumborat-Puffer, enthaltend 20 mM EDTA und 1 mM PMSF, zugegeben. Nach 10- minütiger Inkubation auf Eis wurden die Mischungen in unbeschichteten 96-Napf-Immuulon-4-Platten (Dynatech) transferiert. Die Platten wurden dann bei 4ºC über Nacht inkubiert, um die Bindung des Proteins an die Platte zu ermöglichen. Die Platten wurden mit TBST sorgfältig gewaschen und 0,1 ml einer 1 : 500-Verdünnung von Kaninchen-Antihuman-Hämoglobin-Antikörper (Calbiochem) wurden zu jedem Napfzugegeben. Die Platten wurden bei Raumtemperatur für 1 Stunde inkubiert und dann sorgfältig mit TBST gewaschen. Als nächstes wurden 0,1 ml alikalische Phosphatase konjugierter Anti-Kaninchen-IgG- Antikörper (Calbiochem), 1 : 1000 in TBST plus 5% fettfreies Milchpulver verdünnt, zu jedem Napfzugegeben, und die Platten wurden bei Raumtemperatur 1 bis 2 Stunden inkubiert. Die Platten wurden dann sorgfältig mit TBST gewaschen und schließlich mit TBST ohne Tween. 0,1 ml pro ml p- Nitrophenylphosphat (0,5 mg/ml) in 1X Diethanolamin-Substratpuffer (Pierce) wurden jedem Napfzugegeben. Die Platten wurden bei Raumtemperatur bis zur Farbentwicklung inkubiert und die Extinktion jedes Napfes bei 405 nm wurde unter Verwendung eines BioRad-3550-UV-Mikroplattenlesers gemessen.
Um den Assay zu bestätigen, wurde ein bekannter Ligand auf Hämoglobin, 2,3-Diphosphoglycerat, in die Reaktion einbezogen. Wie in Fig. 9 gezeigt, erhöhte diese Verbindung die Detektion des immunoreaktiven Hämoglobins.

C) Resultate des Absuchens mit hohem Durchsatz:

4.000 Verbindungen wurden auf Wechselwirkung mit HbS unter Verwendung von Proteolyse und ELISA-Detektion wie oben abgesucht (Fig. 10). Es wurde gefunden, dass 23 von diesen die Proteolyse in einem Ausmaß von 20% oder mehr inhibieren, wenn sie bei einer Konzentration von 20 uM (positiver Trefferverbindungen) einem Assay unterzogen wurden.
Die Konzentrationsabhängigkeit der Wirkungen der Trefferverbindungen wurde gemessen. Die Trefferverbindungen zeigten halbmaximale Wirkungen in Konzentrationen im Bereich bis zu 2,0 uM herab (siehe z. B. Fig. 11).

Beispiel 12: Absuchen mit hohem Durchsatz auf Liganden für humanes Met-Hämoglobin S

Die unten beschriebenen Experimente wurden als Assay auf die Bindung von Testliganden an Hämoglobin S durchgeführt. In diesen Experimenten wird Hämoglobin S in seiner oxidierten Form einbezogen, Met-Hämoglobin (Met-HbS), wobei das Hämeisen in seinem Eisen(III)-Zustand ist.
Die Reaktionsmischungen (in einem Endvolumen von 50 ul) enthielten 0; 32 mg/ml Hämoglobin S. 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, 0,4 mM Kaliumeisen(III)-cyanid, 40 ug/ml Proteinase K, 10% DMSO und die Testverbindung in einer Konzentration von 20 uM. Die Kontrollreaktionen waren identisch, außer dass die Testverbindung weggelassen wurde. Vor Zugabe von Proteinase K (0, 2 ul) und DMSO (5 ul) oder DMSO und Testverbindung (5 u1) zu den obigen Reaktionsmischungen wurden die Mischungen aus Hämoglobin 5, Tris-HCl, NaCl und Kaliumeisen(III)-cyanid (in einem Volumen von 44,8 u1) für 60 Minuten auf Eis inkubiert, um die Oxidation des Hämeisens zu ermöglichen. Die kompletten Mischungen wurden dann für 10 Minuten bei 20ºC inkubiert, für 30 Minuten bei 28,3ºC, und dann auf Eis gestellt. Jede Mischung erhielt dann 150 ul 50 mM Natriumborat-Puffer, pH 8,5, enthaltend 10 mM EDTA und 1,0 mM PMSF. Nach 10-minütiger Inkubation auf Eis wurden 40 ul der Mischung den Mikroplattennäpfen zugegeben, die 160 ul des BioRadTM-Protein-Assay- reagenz enthielten, das vierfach mit Wasser verdünnt worden war. Nach Mischen wurde die Extinktion bei 585 nm für jeden Napf gemessen.
Auf diese Art wurden etwa 40.000 kleine Moleküle mit einer Geschwindigkeit von 3.000 bis 7.000 Assays pro Tag gescreent. Von 108 Verbindungen davon wurde gefunden, dass sie die Proteolyse von Met-HbS in einem Ausmaß zwischen 15 und 100% inhibieren, wenn sie in Konzentrationen von 20 uM vorliegen.
Diese "positiven Treffer"-Verbindungen wurden getestet, um zu bestimmen, ob sie auch die Proteolyse einer homogenen Peptidsubstanz, Succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilid, inhibieren. 51 dieser Verbindungen reduzierten die Geschwindigkeit der chromogenen Peptidhydrolyse zumindest zweifach, was zeigte, dass ihr Effekt auf HbS nicht spezifisch ist, d. h. eher auf der Inhibierung der Protease als auf der Bindung an HbS beruht.
Die verbleibenden 57 Verbindungen wurden individuell auf ihre Wirkung bezüglich des sichtbaren Absorptionsspektrums von met-HBS getestet. Dies erfolgte, um Verbindung zu identifizieren, deren scheinbare Bindung Kontamination mit Cyanid- oder Azidionen reflektiert. Sowohl Cyanid sowie Azid testen unter Verwendung des erfindungsgemäßen Assays positiv, was vermutlich auf der Tatsache beruht, dass beide mit hoher Affinität an Eisen(III)-ionen-Atome des met-HbS binden und dadurch die Stabilität von met-HbS wesentlich steigern. Die Bindung dieser Ionen an HbS verursacht auch charakteristische Änderungen in seinem sichtbaren Extinktionsspektrum. Die Verbindungen wurden auch auf ihre Fähigkeit getestet, die Aggregation von met-HbS unter den oben verwendeten Assay- Bedingungen zu induzieren. Dies wurde durch Messung von Änderung in der Lichtstreuung der BbS-Lösung bei 595 nm verfolgt.
Drei Verbindungen verursachten eine substantielle Aggregation und 23 andere verursachten charakteristische spektrale Änderungen. 31 Verbindungen verursachten weder Aggregation noch spektrale Verschiebungen, die vielleicht Cyanid- oder Azid- Kontamination anzeigen. Diese Verbindungen repräsentieren Liganden von HbS, wie sie durch die erfindungsgemäßen Verfahren definiert sind.

Beispiel 13: Aktivität von HbS-Liganden bei der Inhibierung von HbS-Polymerisation

Als Liganden von Hämoglobin 5 (HbS) identifizierte Verbindungen, wie in Beispiel 12 oben beschrieben, wurden auf ihre Fähigkeit getestet, die in vitro-Polymerisation von HbS zu beeinflussen, unter Verwendung des CSAT-Verfahren. In diesem Verfahren wird die Wirkung verschiedener Substanzen auf die Gleichgewichtslöslichkeit (CSAT) von HbS durch Messung der Hämoglobin-Gelation bestimmt.

A. VERFAHREN

1) Reinigung Von HbS: HbS wurde aus dem Blut von Personen gereinigt, die bezüglich der Sichelzelleigenschaft homozygot waren. Das Blut wurde in Heparin- oder EDTA-Röhrchen gesammelt, um ein Verklumpen zu vermeiden. Erythrozyten wurden mit kalter Phosphat-gepufferter Saline gewaschen, die mit CO equilibriert worden war, und sie wurden mit CO-equilibriertem Wasser lysiert. Das Lysat wurde auf einer Sephadex-G-25-Säule (Pharmacia) in CO-equilibriertem 0,05 M Phosphatpuffer, pH 7,0, entsalzt, und die Hämoglobin-Konzentration wurde auf 15% (g/dl) Tetramer eingestellt.
Es wurde eine weitere Aufreinigung des HbS unter Verwendung einer pH-Gradientelution von DEAE-Sephadex für Proben von Heterozygoten oder von einer Hydroxyharnstoffbehandlung (die in der Produktion von HbF resultiert) unterzogenen Personen verwendet.
Die Tetramer-Konzentration wurde unter Verwendung der folgenden Formel berechnet: C% (g/dl) = 64500 · 0,25 · 0,00001 · f x Extinktion / = 1.61 · 250 · Extinktion / E, wobei
f Verdünnungsfaktor (üblicherweise 250),
= Extinktionskoeffizienten:
(HbCO bei 570 nm) = 14,2; e (HbCO bei 540 nm) = 14,3;
(HbCO bei 560 nm) - 12,1; e (HbCO bei 630 nm) = 0,20;
(MetHb bei 570 nm) = 3, 63; E (MetHb bei 540 nm) = 5,96;
(MetHb bei 560 nm) = 3,72; e (MetHb bei 630 nm) = 3,88.
Vor der Verwendung werden 15% (g/dl) Lösungen von HbSCO für 2 Stunden oxygeniert, woraufhin das Ausmaß der Oxygenierung spektroskopisch aufgezeichnet wurde ( (HbO&sub2; bei 577 nm) = 14,6; (HbCO bei 541 nm) = 13,8). Die oxygenierten Lösungen wurden dann unter Verwendung von Amicon cone- oder CENTRICON- Concentration (0ºC, 3.500 UpM, 1,5 h) auf eine Konzentration von 35% (g/dl) gebracht.

2) Gelationsassay:

Reaktionsmischungen, enthaltend 250 ul HbSO&sub2; (35% g/dl) und 80 ul entweder Puffer, Kontrollverbindungen (L-Phe oder Trp) oder Testliganden. Die Mischungen wurden für 10 Minuten auf Eis inkubiert, woraufhin 10 ul einer kalten Lösung von 0,9 M Natriumdithionit im Stickstoff-gespültem Phosphat-Puffer, pH 8,5, zugegeben wurde, und die Mischungen für weitere 10 Minuten auf Eis inkubiert wurden, um Oxy- in Deoxy-HbS zu überführen. Die Reaktionsmischungen wurden dann bei 30ºC inkubiert, um die HbS-Gelation zu ermöglichen.
Die Reaktionsmischungen wurden dann einer Zentrifugation bei 35.000 UpM für 65 Minuten bei 30ºC in einem Beckmanh-SW55Ti- Rotor unterworfen. Der Überstand jeder Mischung wurde dann in Multiplikaten getestet und 1 : 200 in Drabkins-Lösung (Sigma Chemical Co., St. Louis, M0) verdünnt, und die Extinktion der verdünnten Mischung bei 540 nm wurde gemessen. Die HbS- Konzentration des Überstands wurde gemäß der folgenden Formel berechnet: HbS-Konz. = 1,61 · 200 · Extinktion bei 540 nm/ 11 = 29,32 · Extinktion.
Die Löslichkeitsprofile wurden unter Verwendung der Konzentration des Testliganden (mM) auf der x-Achse und des CSAT (die Konzentration des HbS im Überstand in g/dl) aufgetragen. (Der CgAT bei 0 mM Ligand soll in etwa 16-18% betragen). Die Steigung jeder Auftragung (dy/dx g/dl M) wurde dann erhalten, so wie das Verhältnis jeder Steigung zu den Kontrollverbindungen (L-Phe und Trp). Die Steigungen waren der molaren Wirksamkeit in der Inhibierung der Gelation direkt proportional.

B. ERGEBNISSE:

Von den unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren identifizierten 23 Verbindungen zeigten 19 Verbindungen eine detektierbare Aktivität bei der Inhibierung der HbS-Gelation.
Fig. 12 zeigt Strukturen und kommerzielle Quellen dieser Verbindungen und zeigt ihre Aktivität relativ zu Trp an. 13 dieser Verbindungen zeigten eine Antigelationsaktivität, die der von Trp mindestens gleich war.
Zum Beispiel ist Zink-Bacitracin (in Fig. 12 als ST56 bezeichnet) bei der Inhibierung der HbS-Polymerisation fünffach wirksamer als L-trp. Um die Ligand-Bindungseigenschaften von Zink-Bacitracin zu untersuchen, wurden Bacitracin und Zinkchlorid (ZnCl&sub2;) einzeln in dem in Beispiel 12 (Fig. 13) beschriebenen Hämoglobin S Bindungsassay getestet. Während zinkfreies Bacitracin inaktiv ist, weist ZnCl&sub2; alleine eine dem Zink-Bacitracin äquivalente Aktivität auf. Daher ist Zn&spplus;&spplus; ein Ligand von Hämoglobin und zinkfreies Bacitracin nicht. Der Zink-Bacitracin-Komplex selbst ist unter Umständen ein Ligand des Hämoglobins oder seine Aktivität könnte ausschließlich auf der Freisetzung von Zn&spplus;&spplus; aus dem Komplex beruhen.
Ohne an eine Theorie gebunden sein zu wollen wird geglaubt, dass der Mangel an Aktivität in der verbleibenden acht Verbindungen unter Umständen zumindest teilweise auf ihrer begrenzten Löslichkeit in millimolaren Konzentrationen beruht, die für den Gelationsassay notwendig sind.
Zusammenfassend waren die erfindungsgemäßen Verfahren für die Identifikation einer bestimmten Anzahl an HbS-Liganden aus 40.000 Testliganden erfolgreich.

Claims

1. Verfahren zum schnellen, großangelegten Absuchen zur Identifizierung eines Liganden, der an ein vorher bestimmtes Zielprotein bindet, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

(a) Auswahl einer großen Anzahl von Verbindungen als Testliganden, von denen nicht bekannt ist, ob sie an das Zielprotein binden:

(b) Inkubation jedes der Testliganden und des Zielproteins, wodurch eine Testzusammensetzung hergestellt wird;

(c) Inkubation des Zielproteins in Abwesenheit eines Testliganden, wodurch eine Kontrollzusammensetzung hergestellt wird;

(d) Behandlung der Test- und Kontrollzusammensetzungen, wodurch bewirkt wird, dass sich das Zielprotein in der Kontrollzusammensetzung bis zu einem messbaren Ausmaß entfaltet;

(e) Bestimmung des Ausmaßes, mit dem das Zielprotein im gefalteten Zustand, im ungefalteten Zustand oder in beiden in der Testzusammensetzung und in der Kontrollzusammensetzung vorliegt;

(f) Vergleich der in Schritt (e) durchgeführten Bestimmung der Test- und Kontrollzusammensetzungen, wobei der Testligand ein Ligand ist, der an das Zielprotein bindet, wenn das Zielprotein in der Testzusammensetzung in einem größeren Ausmaß im gefalteten Zustand vorliegt als in der Kontrollzusammensetzung; und

(g) Wiederholung der Schritte (b) bis (f) mit einer großen Anzahl von Testliganden bis ein Ligand identifiziert ist, der an das Zielprotein bindet;

mit der Maßgabe, dass der Behandlungsschritt (d) keinen Kontakt der Test- und Kontrollzusammensetzungen mit einer für die Konformation empfindlichen Fluoreszenzsonde umfasst.

Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Behandlungsschritt mindestens einen der folgenden Schritte umfasst: Änderung der Temperatur, Zugabe von Denaturierungsmitteln und Kombinationen davon.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Behandlungsschritt die Zugabe von Denaturierungsmitteln umfasst und die Denaturierungsmittel aus einer Gruppe ausgewählt sind, die aus Harnstoff, Guanidinium und Salzen davon, Detergenzien und Kombinationen davon besteht.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Behandlungsschritt umfasst, dass die Test- und Kontrollzusammensetzungen einer erhöhten Temperatur unterworfen werden, wodurch bewirkt wird, dass eine nachweisbare Fraktion der Zielsubstanz in einem ungefalteten Zustand vorliegt.

5. Verfahren zum schnellen, großangelegten Absuchen zur Identifizierung eines Liganden, der an ein vorher bestimmtes Zielprotein bindet, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

(a) Auswahl einer großen Anzahl von Verbindungen als Testliganden, von denen nicht bekannt ist, ob sie an das Zielprotein binden;

(b) Inkubation jedes der Testliganden und des Zielproteins unter Bedingungen, die dafür geeignet sind, dass das Zielprotein bis zu einem messbaren Ausmaß entfaltet wird, wodurch eine Testzusammensetzung hergestellt wird;

(c) Inkubation des Zielproteins wie in Schritt (b), jedoch in Abwesenheit eines Testliganden, wodurch eine Kontrollzusammensetzung hergestellt wird;

(d) Bestimmung des Ausmaßes, bis zu dem das Zielprotein im gefalteten Zustand, im entfalteten Zustand oder in beiden in der Testzusammensetzung und in der Kontrollzusammensetzung vorliegt;

(e) Vergleich der in Schritt (d) durchgeführten Bestimmung der Test- und Kontrollzusammensetzungen, wobei der Testligand ein Ligand ist, der an das Zielprotein bindet, wenn das Zielprotein in der Testzusammensetzung in einem größeren Ausmaß im gefalteten Zustand vorliegt als in der Kontrollzusammensetzung; und

(f) Wiederholung der Schritte (b) bis (e) mit einer großen Anzahl von Testliganden bis ein Ligand identifiziert ist, der an das Zielprotein bindet;

mit der Maßgabe, dass die Inkubationsschritte (b) und (c) keinen Kontakt der Test- und Kontrollzusammensetzungen mit einer für die Konformation empfindlichen Fluoreszenzsonde umfassen.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei der Ligand an Oberflächen- oder innere Aminosäurereste oder die Konformation betreffende Domänen des Zielproteins bindet.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der Bestimmungsschritt umfasst, dass die Test- oder Kontrollzusammensetzungen mindestens einem der folgenden Verfahren unterworfen werden: Proteolyse; Antikörperbindung; Oberflächenbindung; molekulare Chaperon-Bindung; Bindung an einen bekannten Liganden, Cofaktor, Substrat oder Analogon davon des Zielproteins; Circulardichroismus-Spektroskopie; Ultraviolett-Spektroskopie; Fluoreszenz-Spektroskopie; Kalorimetrie und Kombinationen davon.

3. Verfahren nach Anspruch 7, wobei der Bestimmungsschritt die folgenden Schritte umfasst:

(i) Inkubation des Zielproteins, jedes der Testliganden und einer oder mehrerer Proteasen, die vorzugsweise das Zielprotein im ungefalteten Zustand spalten, wodurch das Zielprotein im ungefalteten Zustand vorzugsweise gespalten wird; und

(ii) Messung der Fraktion des gespaltenen Zielproteins oder der Fraktion des in einem intakten Zustand verbleibenden Zielproteins, wobei der Testligand ein Ligand ist, der an das Zielprotein bindet, wenn die Fraktion des im intakten Zustand verbleibenden Zielproteins in der Testzusammensetzung größer ist als in der Kontrollzusammensetzung.

9. Verfahren nach Anspruch 7, wobei der Bestimmungsschritt die folgenden Schritte umfasst:

(i) Vereinigung des Zielproteins und jedes der Testliganden;

(ii) Inkontaktbringen des Gemisches aus Zielprotein und Testligand mit einer Oberfläche, die vorzugsweise ungefaltetes Zielprotein bindet, wodurch ungefaltetes Zielprotein an die Oberfläche bindet; und

(iii) Bestimmung der Fraktion des an die Oberfläche gebundenen Zielproteins oder der Fraktion des ungebunden verbleibenden Zielproteins, wobei der Testligand ein Ligand ist, der an das Zielprotein bindet, wenn die Fraktion des ungebunden verbleibenden Zielproteins in der Testzusammensetzung größer ist als in der Kontrollzusammensetzung.

10. Verfahren nach Anspruch 7, wobei der Bestimmungsschritt die folgenden Schritte umfasst:

(i) Vereinigung des Zielproteins und jedes der Testliganden auf einer Oberfläche, an die ein bekannter Ligand des Zielproteins immobilisiert wurde; und

(ii) Bestimmung der Fraktion des an die Oberfläche gebundenen Zielproteins oder der Fraktion des ungebunden verbleibenden Zielproteins, wobei der Testligand ein Ligand ist, der an das Zielprotein bindet, wenn die Fraktion des an die Oberfläche gebundenen Zielproteins in der Testzusammensetzung größer ist als in der Kontrollzusammensetzung.

11. Verfahren nach Anspruch 7, wobei der Bestimmungsschritt die Verwendung von Antikörpern umfasst, die zwischen der gefalteten Form und der ungefalteten Form des Zielproteins unterscheiden.

12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei der Bestimmungsschritt die folgenden Schritte umfasst:

(i) Beschichtung einer Oberfläche mit einem spezifischen Antikörper, der gegen die denaturierte Form des Zielproteins gerichtet ist;

(ii) Inkubation des Zielproteins in Gegenwart jedes der Testliganden auf der Oberfläche; und

(iii) Bestimmung der Fraktion des an die Oberfläche gebundenen oder nicht daran gebundenen Zielproteins.

13. Verfahren nach Anspruch 11, wobei der Bestimmungsschritt die folgenden Schritte umfasst:

(i) Beschichtung einer Oberfläche mit einem Antikörper, der zur Bindung des Zielproteins im nativen Zustand oder im denaturierten Zustand fähig ist;

(ii) Inkubation des Zielproteins in Gegenwart jedes der Testliganden und eines Antikörpers, der zur Bindung des Zielproteins im gefalteten Zustand oder in einem anderen nativen oder denaturierten Zustand fähig ist; und

(iii) Bestimmung des Vorliegens des an die Oberfläche gebundenen oder ungebunden darauf verbleibenden Zielproteins.

14. Verfahren nach Anspruch 7, wobei der Bestimmungsschritt die Bestimmung der Menge des Zielproteins umfasst, das an ein molekulares Chaperon-Protein gebunden ist oder das nicht an ein molekulares Chaperon-Protein gebunden ist.

15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei der Bestimmungsschritt die folgenden Schritte umfasst:

(i) Beschichtung einer Oberfläche mit einem molekularen Chaperon-Protein;

(ii) Inkubation des Zielproteins und jedes der Testliganden auf der beschichteten Oberfläche; und

(iii) Bestimmung der Menge des an die Oberfläche gebundenen oder ungebunden darauf verbleibenden Zielproteins.

16. Verfahren nach Anspruch 14, wobei der Bestimmungsschritt die folgenden Schritte umfasst:

(1) Beschichtung einer Oberfläche mit dem Zielprotein in einem denaturierten Zustand;

(ii) Inkubation einer gereinigten Form des Zielproteins in Gegenwart jedes der Testliganden und eines molekularen Chaperon-Proteins auf der Oberfläche; und

(iii) Bestimmung der Menge von einem oder von beiden des molekularen Chaperon-Proteins und des ungebunden auf der Oberfläche verbleibenden oder daran bindenden Zielproteins.

17. Verfahren nach Anspruch 7, wobei der Bestimmungsschritt die Bestimmung der charakteristischen Bildung von aggregiertem Protein unter Verwendung eines Verfahrens umfasst, das aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist:

(i) Messung der Menge von aggregiertem Protein;

(ii) Messung der Menge von löslichem Protein und Messung der Rate der Bildung von aggregiertem Protein.

18. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Bindung an einen bekannten Liganden, Cofaktor, Substrat oder Analoga davon die folgenden Schritte umfasst:

(i) Immobilisierung des bekannten Liganden, Cofaktors, Substrats oder Analogons davon an einen festen Träger

(ii) Inkontaktbringen des festen Trägers mit den Test- und Kontrollzusammensetzungen unter Bedingungen, bei denen das Zielprotein im gefalteten Zustand an den Träger bindet; und

(iii) Bestimmung der Fraktion des an den Träger gebundenen Zielproteins in den Test- und Kontrollzusammensetzungen,

wobei der Ligand ein beliebiger Testligand ist, der eine Zunahme oder Abnahme dieser Fraktion in der Testzusammensetzung im Vergleich zu dieser Fraktion in der Kontrollzusammensetzung bewirkt.

19. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Proteasen des Inkubationsschrittes aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Proteinase K, Thermolysin und Kombinationen davon besteht.

20. Verfahren nach Anspruch 14, wobei der Messungsschritt umfasst, dass die Test- und Kontrollzusammensetzungen einer denaturierenden Poiyacrylamidgel- Elektrophorese unterworfen werden.

21. Verfahren nach Anspruch 7, wobei der Bestimmungsschritt die folgenden Schritte umfasst:

(i) Beschichtung einer Oberfläche mit Antiseren, die zur Bindung an das gefaltete Zielprotein fähig sind;

(ii) Inkubation des Zielproteins in Gegenwart eines molekularen Chaperons und jedes der Testliganden auf der Oberfläche; und

(iii) Bestimmung der Menge des an die Oberfläche bindenden oder ungebunden darauf verbleibenden Zielproteins.

22. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21, wobei sich das Zielprotein in der Kontrollzusammensetzung irreversibel entfaltet.

23. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21, wobei sich das Zielprotein in der Kontrollzusammensetzung reversibel entfaltet.

24. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 23, wobei das Zielprotein aus einer Gruppe ausgewählt ist, die aus Kohlensäureanhydrase, menschlicher neutrophiler Elastase, menschlichem Hämoglobin, Dihydrofolatreduktase und HIV-Rev-Protein besteht.