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Technisches
Gebiet
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Bestimmen eines
Zielproteins eines Medikaments.
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Stand der
Technik
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Ein
Medikament zeigt seine pharmakologische Wirkung auf einen lebenden
Organismus durch Bindung an eine spezifische Substanz in dem lebenden
Organismus und Veränderung
einer Funktion der Substanz. In den meisten Fällen ist die Substanz in dem
lebenden Organismus ein Protein, welches als das Zielprotein eines
Medikaments bezeichnet wird. Es wird davon ausgegangen, daß die funktionelle Veränderung
eines Zielproteins, die durch die Bindung eines Medikaments induziert
wird, eine gewisse strukturelle Veränderung des Zielproteins mit
sich bringt [US-Patente Nr. 5,585,277 und 5,679,582, veröffentlichte
ungeprüfte
japanische Patentanmeldung Nr. 9-178746, WO 97/20952]. Für das Screenen
neuer Medikamente, die Beurteilung entdeckter Medikamente und die
Ausräumung
von Nebenwirkungen und dergleichen ist es sehr wichtig, ein Zielprotein
eines Medikaments zu bestimmen und die funktionelle Veränderung
des Zielproteins, wenn das Zielprotein an das Medikament gebunden
ist, und eine Korrelation zwischen den funktionellen Veränderungen
und den pharmakologischen Wirkungen zu untersuchen, d.h. einen Wirkmechanismus
des Medikaments, durch den es seine pharmakologischen Wirkungen
in vivo zeigt, aufzuklären.
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Um
den Wirkmechanismus eines Medikaments aufzuklären, ist es erforderlich, zuerst
ein Zielprotein zu bestimmen. Als Verfahren zum Bestimmen eines
Zielproteins eines Medikaments sind ein Verfahren, umfassend das
Reinigen eines Zielproteins aus Geweben oder Zellen mittels Affinitätschromatographie
unter Ausnutzung der Eigenschaft, daß ein Zielprotein an ein Medikament
bindet [Shimizu, N. et al., Nat. Biotechnol. 18, 877 (2000), Fruichi,
H. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 270, 1002 (2000), Jbilo,
O. et al., J. Biol. Chem. 272, 27107 (1997)], und ein Verfahren,
umfassend das Konstruieren einer Proteinexpressions-cDNA-Bibliothek
und das Isolieren eines exprimierten Klons, der an das Medikament bindet,
als eine Sonde (veröffentlichte
ungeprüfte
japanische Patentanmeldung Nr. 10-248571 und veröffentlichte ungeprüfte japanische
Patentanmeldung Nr. 2000-508923), bekannt. Durch diese Verfahren wird
zuerst ein an ein Medikament bindendes Zielprotein oder ein das
Zielprotein codierendes Gen isoliert, und dann kann ein Zielprotein
durch Analysieren seiner Struktur bestimmt werden.
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Bei
diesen Verfahren müssen
jedoch ein Medikament und ein Träger
konjugiert werden. Weiterhin sollte zur Bestimmung eines Zielproteins
der Träger
so ausgestaltet sein, daß die
inhärente
Stereostruktur des Medikaments nicht zerstört wird oder die Bindung zwischen
dem Medikament und dem Zielprotein nicht gehemmt wird. Im allgemeinen
wird ein Medikament unter Verwendung einer funktionellen Gruppe,
die die pharmakologische Aktivität
des Medikaments nicht signifikant beeinflußt, an einen Träger konjugiert.
Um jedoch eine funktionelle Gruppe auszuwählen, die die Aktivität nicht
beeinflußt,
sind die Daten zum Struktur-Aktivitäts-Verhältnis des Medikaments erforderlich.
Folglich besteht ein Problem dahingehend, daß es großen Aufwand erfordert, um die
Daten zum Struktur-Aktivitäts-Verhältnis zu
erhalten.
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Offenbarung
der Erfindung
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Ein
Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren zum
Bestimmen eines Zielproteins eines Medikaments bereitzustellen.
Spezieller besteht ein Ziel der vorliegenden Erfindung darin, ein Verfahren
zum leichten und präzisen
Bestimmen eines Zielproteins eines Medikaments, ohne das Medikament
an einen Träger
zu konjugieren, bereitzustellen.
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Im
allgemeinen ist bekannt, daß Proteine,
die natürlich
in Zellen vorkommen, ihre ihnen eigene Stereostruktur aufweisen,
in der ihre Polypeptidketten gefaltet und damit überaus stabil ist [Levitt,
M. et al., Annu. Rev. Biochem. 66, 549 (1997)]. Die Erfinder der
vorliegenden Anmeldung haben vorausgesagt, daß, wenn ein Zielprotein an
ein Medikament bindet und dadurch seine Funktion verändert, einige
strukturelle Veränderungen
stattfinden können,
wodurch die Empfindlichkeit gegenüber einer Protease gesteigert
wird. Um die Hypothese zu verifizieren, haben die Erfinder der vorliegenden
Anmeldung ein Medikament an eine Zelle verabreicht und die Veränderungen
der Proteaseempfindlichkeit intrazellulärer Proteine analysiert. Als
Ergebnis haben wir herausgefunden, daß ein Zielprotein sich zu einem
proteaseempfindlichen Protein verändert, und durch die Detektion
eines Proteins, welches eine Veränderung seiner
Proteaseempfindlichkeit zeigt, wird das Protein als ein Zielprotein
des Medikaments bestimmt. In einem Verfahren der vorliegenden Erfindung
kann die Stufe des Konjugierens eines Medikaments an einen Träger ausgelassen
werden, es ist nicht erforderlich, die Daten zum Struktur-Aktivitäts-Verhältnis eines
Medikaments im Vorfeld zu beschaffen, und dementsprechend kann ein
Zielprotein eines Medikaments überaus
leicht und präzise
bestimmt werden. Auf Basis dieser Erkenntnisse wurde die vorliegende Erfindung
ausgearbeitet.
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Die
vorliegende Erfindung liefert somit die folgenden (1) bis (13):
- (1) Ein Verfahren zur Bestimmung eines Zielproteins
eines Medikaments, welches die Stufe umfaßt, bei der man beurteilt,
ob ein Protein, welches in Gegenwart eines Medikaments eine Steigerung der
Proteaseempfindlichkeit zeigt, das Zielprotein des Medikaments ist.
- (2) Das Verfahren nach (1), welches die Stufe umfaßt, bei
der man ein Protein, welches in Gegenwart eines Medikaments eine
Steigerung der Proteaseempfindlichkeit zeigt, unter in einem Zelllysat
enthaltenen Proteinen auswählt.
- (3) Das Verfahren nach (1) oder (2), wobei eine endogene zelluläre Protease
als die Protease verwendet wird.
- (4) Das Verfahren nach einem von (1) bis (3), welches weiterhin
die Stufe umfaßt,
bei der man eine exogene Protease zugibt.
- (5) Das Verfahren nach einem von (1) bis (4), wobei die Steigerung
der Proteaseempfindlichkeit als eine Steigerung der Abbaumenge des
Proteins detektiert wird.
- (6) Das Verfahren nach (5), welches weiterhin eine Stufe umfaßt, bei
der man die Inhibition der Steigerung der Abbaumenge des Proteins
in Gegenwart eines Proteaseinhibitors detektiert.
- (7) Das Verfahren nach (5) oder (6), wobei die Veränderung
der Proteinmenge mittels Acrylamidgelelektroforese detektiert wird.
- (8) Das Verfahren nach (7), wobei die Acrylamidgelelektroforese
SDS-Polyacrylamidgelelektroforese oder zweidimensionale Elektroforese
ist.
- (9) Das Verfahren nach einem von (1) bis (8), welches die Stufe
umfaßt,
bei der man das ausgewählte
Protein identifiziert.
- (10) Das Verfahren nach (9), welches die Stufe umfaßt, bei
der man das ausgewählte
Protein isoliert und identifiziert.
- (11) Das Verfahren nach einem von (1) bis (8), welches die Stufe
umfaßt,
bei der man das Protein detektiert.
- (12) Das Verfahren nach (11), wobei die Detektion unter Verwendung
eines das Protein erkennenden Antikörpers durchgeführt wird.
- (13) Das Verfahren nach (12), wobei die Detektion mittels Western-Blot,
Dot-Blot, Enzymimmuntest oder Radioimmuntest durchgeführt wird.
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Kurze Beschreibung der
Zeichnungen
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1 zeigt
das Ergebnis eines Proteaseverdautests eines Proteins unter Verwendung
eines Lysats von HCT116-Zellen, wobei UCS15A in unterschiedlichen
Konzentrationen zugegeben wurde. Die linke Figur zeigt das Ergebnis
der Färbung
eines SDS-PAGE-Gels mit Coomassie-Brilliantblau, und die rechte Figur
zeigt das Ergebnis der spezifischen Detektion von Sam68 mittels
Western-Blotten. In beiden Figuren gibt die Zahl oberhalb jeder
Spur die Konzentration (μmol/l)
an, mit der UCS15A zu dem Zelllysat zugegeben wurde, M gibt Molekulargewichtsmarker
an und die Zahlen auf der linken Seite geben die Molekulargewichte
(kDa) der Molekulargewichtsmarker an.
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2 zeigt
die Wirkung eines Proteaseinhibitors auf den Abbau von Sam68 in
einem Zelllysat. Die Figur zeigt Ergebnisse der spezifischen Detektion
von Sam68 mittels Western-Blotten in einem Proteaseverdautest, wobei
UCS15A in unterschiedlichen Konzentrationen zugegeben wurde: die
obere Figur zeigt die Ergebnisse ohne Zugabe eines Proteaseinhibitors
und die untere Figur zeigt die Ergebnisse mit Zugabe eines Proteaseinhibitors.
In beiden Figuren gibt die Zahl oberhalb jeder Spur die Konzentration
(μmol/l)
an, mit der UCS15A zu dem Zelllysat zugegeben wurde, und M gibt
Molekulargewichtsmarker an.
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Beste Ausführungsform
der Erfindung
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Das
Verfahren der vorliegenden Erfindung dient der Bestimmung eines
Zielproteins eines Medikaments und ist dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren
die Stufe umfaßt,
bei der man feststellt, ob ein Protein, welches in Gegenwart eines
Medikaments eine Steigerung der Proteaseempfindlichkeit zeigt, das
Zielprotein des Medikaments ist. Das Verfahren der vorliegenden
Erfindung kann auf ein Protein angewandt werden, von dem vorhergesagt
wird, daß es
das Zielprotein des Medikaments ist, um zu bestimmen, ob das Protein
das Zielprotein des Medikaments ist. Zusätzlich kann das Verfahren der
vorliegenden Erfindung verwendet werden, um ein Protein, welches in
Gegenwart eines Medikaments eine Steigerung der Proteaseempfindlichkeit
zeigt, aus einem Gemisch von zwei oder mehreren Proteinen auszuwählen.
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Vorzugsweise
umfaßt
das Verfahren der vorliegenden Erfindung eine Stufe, bei der man
ein Protein, welches in Gegenwart eines Medikaments eine Steigerung
der Proteaseempfindlichkeit zeigt, unter in einem Zelllysat enthaltenen
Proteinen auswählt. Durch
Durchführen
der vorgenannten Auswahl unter Verwendung eines Zelllysats in vitro
kann ein Zielprotein leichter bestimmt werden als durch Analysieren in
vivo, d.h. wo ein Medikament während
des Kultivierens von Zellen zugegeben wird, und Veränderungen des
Proteins, die nur von direkten Wirkungen des Medikaments abgeleitet
sind, können
detektiert werden, während
andere Veränderungen
des Proteins, die durch indirekte Wirkungen, wie Sekundärwirkungen
durch Signalweiterleitungsmoleküle
abstromig von einem Zielprotein, und Wirkungen auf die Synthese-
oder Abbaumechanismen des Proteins verursacht werden, ausgeschlossen
werden.
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Eine
Steigerung der Proteaseempfindlichkeit eines Proteins in Gegenwart
eines Medikaments kann im allgemeinen als eine Steigerung der Abbaumenge
des Proteins detektiert werden. Beispielsweise wird ein Gemisch
von Proteinen in Gegenwart eines Medikaments mit einer Protease
behandelt, um einzelne Proteine zu detektieren, und eine Veränderung
der Menge jedes Proteins kann analysiert werden. Wenn durch die
Analyse eine Abnahme der Menge eines Proteins detektiert wird, wird
ersichtlich, daß das
Protein durch die Protease verdaut wird und die Proteaseempfindlichkeit
des Proteins zugenommen hat. Für
die vorgenannte Detektion wird vorzugsweise die gleiche Proteasebehandlung
in Abwesenheit des Medikaments durchgeführt, und das Ergebnis wird
als Kontrolle verwendet. Wie es oben beschrieben wurde, kann ein
Protein, welches eine Steigerung der Proteaseempfindlichkeit zeigt,
als das Zielprotein des Medikaments bestimmt werden.
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Als
Protease für
die Ausführung
des Verfahrens der vorliegenden Erfindung kann eine von einer Zelle
abgeleitete Protease (in der Beschreibung manchmal als "endogene Protease" bezeichnet) ausreichend
sein. Falls es erforderlich ist, kann weiterhin ein geeigneter Proteasetyp
(der nicht von der Zelle abgeleitet ist und in der Beschreibung
manchmal als "exogene
Protease" bezeichnet
wird) zugegeben werden. Zwei oder mehr Proteasetypen können in geeigneter
Weise kombiniert und zu dem Reaktionssystem zugegeben werden.
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Weiterhin
kann die Proteasereaktion in der Gegenwart eines Proteaseinhibitors
durchgeführt werden,
und durch Vergleichen des Ergebnisses mit dem Ergebnis der in Abwesenheit
des Proteaseinhibitors durchgeführten
Reaktion kann verifiziert werden, daß, wenn eine Abnahme der Proteinmenge
detektiert wird, diese Abnahme durch eine Zunahme der Menge des
durch die Protease abgebauten Proteins verursacht wird und nicht
auf andere Gründe, wie
die Ansammlung des Proteins, zurückzuführen ist.
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Als
eine bevorzugte Ausführungsform
des Verfahrens der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren, bei
dem ein Zelllysat als Proteingemisch verwendet wird, speziell erläutert. Das
Verfahren der vorliegenden Erfindung ist jedoch nicht auf die Einzelheiten
der nachstehenden Erläuterungen
beschränkt.
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1) Herstellung eines Zelllysats
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Ein
Zelllysat kann aus Zellen oder Geweben hergestellt werden, für die ein
Zielprotein eines Medikaments bestimmt werden soll. Als Zellen oder
Gewebe zur Herstellung eines Zelllysats können jegliche Materialien,
wie eine etablierte Zellinie, aus Blut und Geweben isolierte Zellen
und aus einem lebenden Organismus gesammelte Gewebe, verwendet werden.
Durch die Verwendung von Zellinien, die unter konstanten Kulturbedingungen
gelagert wurden, und durch Anwenden der gleichen Bedingungen für die Herstellung
von Zelllysaten werden qualitative Veränderungen der gesamten in dem
Zelllysat enthaltenen Proteine reduziert, und es können reproduzierbare
Ergebnisse erhalten werden.
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Ein
Zelllysat kann als ein Überstand
hergestellt werden, der durch physikalisches Aufspalten von Zellen
oder Geweben mit einem geeigneten Puffer unter Verwendung eines
gewöhnlichen
Homogenisierers, beispielsweise eines Homogenisierers für Gewebe,
wie eines Dounce-Homogenisierers und eines Polytron-Homogenisierers,
oder durch Aufbrechen von Zellen mit einer Ultraschallvorrichtung
und anschließendes
Zentrifugieren der resultierenden Flüssigkeit erhalten wird. Als
Puffer kann ein in etwa neutraler Puffer auf Phosphatbasis oder
ein Tris-Puffer, der ein Salz, wie NaCl, in einer geringen Konzentration
enthält,
wie phosphatgepufferte Kochsalzlösung
(PBS) und Retikulozyten-Quellpuffer (RSB: 10 mmol/l Tris-hydrochlorid,
pH 7,6, 10 mmol/l NaCl, 1,5 mmol/l MgCl2),
verwendet werden.
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2) Zugabe eines Medikaments
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Ein
Medikament wird zu dem oben erhaltenen Zelllysat zugegeben. Vorzugsweise
wird auch ein Zelllysat, zu dem das Medikament nicht zugegeben wird,
als Kontrolle hergestellt. Bevorzugt werden Experimente mit mehreren
Konzentrationen des Medikaments durchgeführt, um zu beobachten, ob der Proteinabbau
von der Medikamentenkonzentration abhängig ist. Wenn ein Medikament
eine feste Form hat, kann das Medikament nach Lösen in dem Puffer, der zur
Herstellung des Zelllysats verwendet wurde, oder in irgendeinem
geeigneten Lösungsmittel
zugegeben werden. Für
den obigen Vorgang wird bevorzugt das gleiche Lösungsmittel zu dem Kontrollzelllysat
ohne Medikament zugegeben, wie es zum Lösen des Medikaments verwendet
wird. Bevorzugt wird die Menge des zuzugebenden Lösungsmittels
für alle Zelllysate
auf die gleiche Menge eingestellt.
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3) Proteasereaktion
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Eine
Protease wird mit den obigen Zelllysaten, zu denen das Medikament
zugegeben wurde, umgesetzt. Ein Zelllysat enthält für gewöhnlich eine ausreichende Menge
einer von den Zellen abgeleiteten Protease. Daher kann die Protease
durch Inkubieren eines Zelllysats bei 25 bis 42°C, bevorzugt bei 37°C umgesetzt
werden. Um zu bestätigen,
daß eine Abnahme
der Menge eines bestimmten Proteins durch Proteaseverdau verursacht
wird, wird vorzugsweise eine Reaktion hergestellt, zu der ein Proteaseinhibitor,
bevorzugt ein Proteaseinhibitorgemisch, welcher bzw. welches die
Vielzahl von Proteasen sehr stark hemmt, zugegeben wurde, und das
Ergebnis wird durch Vergleichen mit dem Ergebnis der Reaktion, bei
der eine Protease unter der Bedingung ohne den Pro teaseinhibitor
umgesetzt wird, analysiert. Wenn bei der Reaktion, bei der ein Proteaseinhibitor
zugegeben wurde, keine Abnahme der Proteinmenge beobachtet wird
und bei der Reaktion, bei der kein Proteaseinhibitor zugegeben wurde,
eine Abnahme der Proteinmenge beobachtet wird, wird davon ausgegangen,
daß die
Abnahme durch Proteaseverdau verursacht wird.
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Die
Zeitdauer der Behandlung mit einer Protease ist nicht speziell beschränkt. Die
Zeitdauer der Behandlung sollte jedoch in geeigneter Weise so gewählt werden,
daß kein
Abbau aller Proteine in einem Zelllysat verursacht wird und daß sie für einen
spezifischen Abbau des Zielproteins mit einer gesteigerten Proteaseempfindlichkeit
ausreichend ist. Da die vorliegende Beschreibung speziell ein typisches
Beispiel des Verfahrens der vorliegenden Erfindung unter Verwendung
eines Zelllysats in detaillierten Beispielen ausführt, versteht
es sich, daß Fachleute
auf dem Gebiet die vorgenannte Zeitdauer für die Proteasebehandlung in
Abhängigkeit
von verschiedenen Bedingungen, wie der Art der Zellen und der Art
des Medikaments, unter Bezugnahme auf das Beispiel der vorliegenden
Beschreibung in geeigneter Weise bestimmen können.
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Beispielsweise
werden Zelllysate, denen kein Medikament zugegeben wurde, mit einer
Protease umgesetzt, indem die Lysate für verschiedene Zeitdauern im
Bereich von 30 Minuten bis 24 Stunden in der gleichen Weise inkubiert
werden und dann Proteine mittels SDS-Polyacrylamidgelelektroforese detektiert
werden. Als geeignete Zeitdauer für die Reaktion kann eine Zeitdauer
als Reaktionszeit gewählt werden,
die im Vergleich zu einem Ergebnis vor der Behandlung mit der Protease
viele klare Proteinbanden im Bereich von mehr als 50 kDa liefert,
die nicht verwischt sind. Weiterhin ist von den so gewählten Zeitdauern
eine längere
Zeitdauer bevorzugt. Da die Mengen der enthaltenen Proteasen zwischen
den Zellen verschieden sind, sind auch die bevorzugten Behandlungszeitdauern
unterschiedlich. Beispielsweise sind für ein HCT116-Zelllysat (ATCC-Nummer CCL-247)
6 bis 12 Stunden bevorzugt.
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Wenn
weiterhin eine exogene Protease zu dem vorgenannten Zelllysat zugegeben
wird, umfassen Beispiele der Protease Trypsin, Chymotrypsin, V8-Protease,
Elastase, Carboxypeptidase, Lysylendopeptidase, Proteinase K, Thermolysin,
Papain, Subtilisin und Gemische davon.
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4) Analyse von Proteinen
und Bestimmung eines Zielproteins
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Jedes
einzelne Protein in dem Zelllysat, das unter allen Bedingungen,
d.h. in Gegenwart oder in Abwesenheit eines Proteaseinhibitors,
mit einer Protease behandelt wurde, wird analysiert, und dann wird
eine Zunahme der Proteaseempfindlichkeit für jedes Protein detektiert.
Eine Zunahme der Proteaseempfindlichkeit eines Proteins korrespondiert
für gewöhnlich mit
einer Abnahme der Proteinmenge, die bei der Analyse von Proteinen
in dem Zelllysat unter allen Bedingungen speziell beobachtet wird
und die als eine von der Menge eines Medikaments abhängige Abnahme
und ebenso als das Phänomen,
daß die Abnahme
in der Gegenwart eines Proteaseinhibitors gehemmt wird, detektiert
wird. Durch das oben genannte Verfahren kann ein Protein, welches
eine Zunahme der Proteaseempfindlichkeit zeigt, als das Zielprotein
des Medikaments bestimmt werden. Ein Verfahren zum Identifizieren
eines in einem Zelllysat enthaltenen Zielproteins und ein Verfahren
zur Bestimmung, ob ein bestimmtes spezifiziertes Protein ein Zielprotein
ist oder nicht, wird unten separat erläutert.
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4-1) Identifizierung eines
Zielproteins
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Wenn
ein Zielprotein unbekannt ist, wird ein Protein, bei dem eine Steigerung
der Proteaseempfindlichkeit detektiert wird, isoliert und einer
Strukturbestimmung unterzogen, wodurch ein Zielprotein identifiziert
werden kann. Für
dieses Verfahren ist es allgemein bevorzugt, alle Proteine in einem
Zelllysat zu analysieren. Beispiele von Analyseverfahren umfassen
Acrylamidgelelektroforese, wie SDS-Polyacrylamidgelelektroforese
und zweidimensionale Elektroforese. Das Gel nach der Elektroforese
oder eine Polyvinylidendifluorid-(PVDF-) Membran oder eine Nitrozellulosemembran,
auf die Proteine aus dem Gel übertragen
wurden, wird einer nicht-spezifischen Färbung, wie Coomassie-Brilliantblau-Färbung oder Silberfärbung usw.,
unterzogen, um dadurch alle Proteine zur Detektion zu analysieren.
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Betreffend
das Zelllysat, dem ein Medikament zugegeben wurde, werden die detektierten Muster
aller Proteine, die unter allen Bedingungen, d.h. in Gegenwart oder
in Abwesenheit eines Proteaseinhibitors, mit einer Protease behandelt
wurden, miteinander verglichen. Eine Bande oder ein Punkt, bei der
bzw. bei dem die Menge speziell in Abwesenheit eines Proteaseinhibitors
in Abhängigkeit
von einem Medikament abnimmt und wobei die Abnahme in Gegenwart
eines Proteaseinhibitors gehemmt wird, wird ausgewählt. Ein
zu der vorgenannten Bande oder dem Punkt korrespondierendes Protein
hat infolge einer Konformationsänderung
durch Bindung an das Medikament eine gesteigerte Proteaseempfindlichkeit
und wird empfindlicher gegenüber
Proteaseverdau, und daher kann das Protein als das Zielprotein des
zugegebenen Medikaments bestimmt werden.
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Von
dem Gel oder der Membran, auf das bzw. auf die die Proteine aus
dem Zelllysat, dem kein Medikament zugegeben wurde, übertragen
wurden, kann das Zielprotein, welches eine Bande oder einen Punkt
liefert, die bzw. der der Bande oder dem Punkt entspricht, deren
bzw. dessen Menge in Abhängigkeit
von dem Medikament in der obigen Analyse abnimmt, isoliert werden,
und seine Struktur kann wie unten beschrieben bestimmt werden. Zuerst
wird die korrespondierende Bande oder der Punkt ausgeschnitten,
das Protein wird mit einer Protease, wie Trypsin, auf dem Gel zu
Peptiden verdaut, und das Peptidgemisch wird unter Verwendung eines
MALDI-TOF-(matrixunterstützte
Laserdesorptions/-ionisations-Flugzeit-) Massenspektrometers detektiert. Ein
theoretisches Massenmuster der Peptide, berechnet aus einer Sequenz
in einer Sequenzdatenbank mit Proteasebehandlung, und das experimentell
erhaltene Peptidsequenzmuster werden verglichen. Das Protein, welches
unter Berücksichtigung einer
Konkordanzrate von Massenmustern von Peptidgemischen eine hohe MOWSE-Maßzahl liefert [Pappin
et al., Curr. Biol. 3, 327 (1993)], kann als das Zielprotein bestimmt
werden.
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Manchmal
kann durch das obige Verfahren ein Zielprotein nicht bestimmt werden,
wie beispielsweise wenn mehrere Proteine vorhanden sind. Für dieses
Gemisch können
Analysen mittels Tandem-Massenspektrometrie unter Verwendung von ESI(Elektrospray-Ionisation)
durchgeführt
werden, um eine bestimmte Sequenz zu erhalten, und dann kann das
Protein durch Durchsuchen einer Datenbank von EST(Expressed Sequence
Tag), wie GenBank, bestimmt werden [Pandey, A. und Mann, M., Nature
405, 837 (2000), Yaguchi, Experimental Medical Science 17, 2550
(1999)]. Ein Protein in der Datenbank, welches die korrespondierende
Aminosäuresequenz
enthält
und welches als Ergebnis der Durchsuchung mit dem oben beschriebenen
Verfahren gefunden wird, kann als das Zielprotein bestimmt werden.
Wenn die korrespondierende Aminosäuresequenz nicht gefunden wird,
kann das Protein als ein neues Protein mit einer unbekannten Aminosäuresequenz
bestimmt werden.
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4-2) Bestimmung, ob ein
spezifisches Protein ein Zielprotein eines Medikaments ist
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Wenn
ein bestimmtes spezifiziertes Protein einer Beurteilung dahingehend
unterzogen wird, ob das Protein das Zielprotein eines Medikaments
ist oder nicht, wird das betreffende Protein für die Beurteilung spezifisch
detektiert, statt eine Analyse aller Proteine durchzuführen. Beispiele
spezifischer Detektionsverfahren für das Protein umfassen Verfahren
unter Verwendung von Antikörpern,
die das Protein erkennen können,
d.h. Western-Blot, Dot-Blot und Enzymimmuntest (EIA), wie Sandwich-ELISA, und
Radioimmuntest (RIA). Diese Verfahren können unter Bezugnahme auf Veröffentlichungen
[Experimental manuals for monoclonal antibodies, herausgegeben von
Sakuji Toyama und Tamie Ando, veröffentlicht von Kodansha Scientific
(1987), Succeeding issue of lectures on biochemical experiments
5 "Methods for researches
in immunological biochemistry, Tokyo Kagaku Dojin (1986), Goding,
J.W., Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, dritte Auflage,
Academic Press (1996), Harlow, E. und Lane, D., Antibodies: A laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)] durchgeführt werden.
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Wenn
die Proteinmenge in Abwesenheit eines Proteaseinhibitors in Abhängigkeit
von einem Medikament abnimmt und die Abnahme in Gegenwart des Proteaseinhibitors
gehemmt wird, kann das Protein als das Zielprotein des Medikaments
bestimmt werden, wohingegen dann, wenn keine von einem Medikament
abhängige
Abnahme beobachtet wird oder wenn eine Abnahme auch in Gegenwart des
Proteaseinhibitors beobachtet wird, das Protein nicht als das Zielprotein
des Medikaments betrachtet wird.
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Ein
bevorzugtes typisches Verfahren der vorliegenden Erfindung umfaßt die folgenden
Stufen (1) bis (4):
- (1) Ein Zelllysat wird
hergestellt. Es werden sowohl (a) ein Zelllysat, zu dem ein Medikament
zugegeben wurde, (Zelllysat (a)), als auch (b) ein Zelllysat, zu
dem das Medikament und ein Proteaseinhibitor zugegeben wurden (Zelllysat
(b)), hergestellt.
- (2) Das Zelllysat (a) und das Zelllysat (b), die in der obigen
Stufe (1) hergestellt wurden, und ein Kontrollzelllysat, zu dem
kein Medikament oder kein Proteaseinhibitor zugegeben wurde (Kontrollzelllysat),
werden so wie sie sind oder mit einer exogenen Protease inkubiert,
wodurch die Protease mit den Proteinen in dem Zelllysat reagieren
kann.
- (3) Jedes einzelne Protein in jedem Zelllysat wird nach der
Inkubation detektiert. Es wird ein Protein ausgewählt, dessen
Menge in dem Zelllysat (a) im Vergleich zu dem Kontrollzelllysat
abnimmt und wobei die Abnahme der Menge in dem Zelllysat (b) gehemmt
wird.
- (4) Das ausgewählte
Protein (das Zielprotein) wird isoliert und identifiziert. Ein weiteres
typisches Verfahren umfaßt
die folgenden Stufen (5) und (6) nach den obigen Stufen (1) und
(2).
- (5) Jedes einzelne Protein in jedem Zelllysat wird nach der
Inkubation mittels Acrylamidgelelektroforese getrennt und gefärbt. Es
wird eine Bande oder ein Punkt ausgewählt, deren bzw. deren Fläche in dem
Zelllysat (a) im Vergleich zu dem Kontrollzelllysat abnimmt, und
die Abnahme der Fläche
wird in dem Zelllysat (b) gehemmt.
- (6) Das die ausgewählte
Bande oder den Punkt bildende Protein (das Zielprotein) wird isoliert
und identifiziert.
Ein weiteres typisches Verfahren umfaßt die folgende
Stufe (7) nach den obigen Stufen (1) und (2).
- (7) Ein bestimmtes spezifiziertes Protein in jedem Zelllysat
wird nach der Inkubation detektiert. Es wird bestätigt, daß die Menge
des Proteins in dem Zelllysat (a) im Vergleich zu dem Kontrollzelllysat abnimmt,
und die Abnahme der Menge wird in dem Zelllysat (b) gehemmt.
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Beispiele
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Die
vorliegende Erfindung wird unter Bezugnahme auf die nachfolgenden
Beispiele ausführlicher erläutert. Der
Schutzumfang der vorliegenden Erfindung wird durch diese Beispiele
jedoch nicht beschränkt.
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In
dem nachfolgenden Beispiel wurde UCS15A als Medikament verwendet.
Dieses Medikament wird aus einer Kulturbrühe von Streptomyces actinobacterium
isoliert und hat eine inhibitorische Wirkung auf die Knochenresorption
(veröffentlichte ungeprüfte japanische
Patentanmeldung Nr. 8-268888). Das Medikament ist identisch zu der
Substanz, über
die in der veröffentlichten
ungeprüften
japanischen Patentanmeldung Nr. 62-28959 als S1-4228 berichtet wird.
UCS15A weist neben der inhibitorischen Wirkung auf die Knochenresorption
verschiedene weitere Wirkungen auf, wie beispielsweise eine bakterizide
Wirkung (veröffentlichte
ungeprüfte japanische
Patentanmeldungen Nr. 58-116686 und 63-22583), eine immunsuppressive
Wirkung (veröffentlichte
ungeprüfte
japanische Patentanmeldung Nr. 61-293920) und eine Antitumorwirkung
(veröffentlichte
ungeprüfte
japanische Patentanmeldung Nr. 63-48213). Die Wirkmechanismen und
die Zielproteine sind jedoch nach wie vor unbekannt. Vor kurzem wurde über UCS15A
berchtet, daß es
die Signalweiterleitung von Tyrosinkinase-src hemmt, die enzymatische
Aktivität
von src per se jedoch nicht hemmt. Über die Verbindung wird auch
berichtet, daß sie
die Bindung zwischen src und Sam68, das als Substrat von src bekannt
ist [Sharma, S.V. et al., Oncogene, 20, 2068 (2001)], spezifisch
hemmt, was stark darauf hindeutet, daß Sam68 eines der Zielproteine
von UCS15A ist.
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(1) Herstellung eines
Zelllysats
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Unter
Verwendung von Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), enthaltend
10% fötales
Rinderserum, wurde die menschliche Darmtumorzellinie HCT116 (ATCC-Nummer
CCL-247) auf Zellkulturschalen mit 100 mm Durchmesser in einem CO2-Inkubator bei 37°C unter 5% CO2 kul tiviert
und mittels Subkultur durch Teilung in fünf Teile alle 3 Tage vermehrt.
Das Kulturmedium wurde am dritten Tag aus drei HCT116-Zellschalen
aus der Subkultur entfernt, und die Zellen wurden durch Zugabe und anschließende Entfernung
von 10 ml eisgekühlter PBS
gewaschen. Zu diesen Zellen wurden 10 ml RSB (10 mmol/l Tris-hydrochlorid,
pH 7,6, 10 mmol/l NaCl, 1,5 mmol/l MgCl2),
was einen niedrigen osmotischen Druck besitzt, zugegeben. Nachdem
die Zellen zur Ausdehnung für
10 Minuten auf Eis gegeben worden waren, wurden die Zellen von den
Schalen abgenommen und zusammen mit dem bereits zugegebenen RSB
in einen Dounce-Homogenisierer mit einem Volumen von 15 ml gegeben.
Die Zellen wurden durch 50 Stöße mit einem
Stößel aufgebrochen. Dieses
Zelllysat wurde bei 4°C,
15.000 U.p.M. für
30 Minuten zentrifugiert. Der erhaltene Überstand wurde gesammelt und
in zehn aliquote Teile von 1 ml geteilt.
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(2) Proteaseverdautest
mit UCS15A
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UCS15A
wurde gemäß der Beschreibung
in der veröffentlichten
ungeprüften
japanischen Patentanmeldung Nr. 58-116686 aus Streptomyces actinobacterium
isoliert und gereinigt, und eine Dimethylsulfoxid- (DMSO-) Lösung mit
einer Konzentration von 10 mmol/l wurde hergestellt. UCS15A wurde
zu jedem der in (1) hergestellten 10 HCT116-Zelllysate zugegeben,
wodurch Endkonzentrationen von 0 (DMSO alleine), 25, 50, 75, 100,
150, 200, 225, 250 und 300 μmol/l
erhalten wurden. Das zugegebene UCS15A wurde zuvor mit DMSO verdünnt, so
daß zu den
Suspensionen das gleiche Volumen an DMSO zugegeben wurde.
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Die
Zelllysate, zu denen UCS15A zugegeben worden war, wurden bei 37°C für 12 Stunden
inkubiert, um die Reaktion einer zellulären endogenen Protease zu ermöglichen,
während
das Lysat unter Verwendung eines rotierenden Inkubators vorsichtig gedreht
wurde. Zu jedem der Zelllysate wurden nach der Umsetzung 333 μl 4-fach
konzentrierter Laemmli-Probenpuffer zugegeben. Nach ausreichendem
Mischen wurden die Gemische für
10 Minuten auf 100°C
erhitzt. Jeweils 20 μl
der Lösungen
wurden 8,5% Polyacrylamidgelelektroforese unterzogen. Die Gele wurden
nach der Elektroforese mit Coomassie-Brilliantblau (Nacalai Tesque)
gefärbt.
Die Ergebnisse sind in 1 gezeigt (linke Figur). Es
wurden mehrere Proteine beobachtet, deren Menge mit steigender UCS15A-Konzentration abnahm.
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(3) Detektion von Sam68
durch Western-Blotten
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Sam68
in dem Zelllysat wurde mittels Western-Blotten detektiert, wie es
unten beschrieben ist. Die Proteine in dem Gel wurden nach der Elektroforese
auf eine Nitrozellulosemembran mit einem Porendurchmesser von 0,45 μm (Protran,
hergestellt von Schleicher und Schnell) übertragen. PBS, enthaltend
0,25% Gelatine und 0,2% Tween-20 (im folgenden bezeichnet als "PBS-TG"), wurde auf die Membran
geladen und über
Nacht bei 4°C
stehen gelassen, und nicht-spezifische Bindungen zu blockieren.
Dann wurde als primärer
Antikörper
polyklonaler Kaninchen-Anti-Sam68-Antikörper (hergestellt von Santa
Cruz), 1:1000 verdünnt
mit PBS-TG, für
2 Stunden umgesetzt. Nach Waschen mit PBS, die 0,2% Tween-20 enthielt
(im folgenden bezeichnet als "PBS-T"), wurde mit Meerrettichperoxidase
(HRP) konjugierter Ziege-Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper (hergestellt
von Amersham Pharmacia Biotech) als sekundärer Antikörper, verdünnt 1:4000 mit PBS-TG, für eine Stunde
reagieren gelassen. Die Detektion wurde mittels Chemilumineszenz
unter Verwendung von ECL-Reagens (hergestellt von Amersham Pharmacia
Biotech) durchgeführt.
Im Ergebnis wurde, wie es in 1 gezeigt
ist (rechte Figur), beobachtet, daß die Menge an Sam68 in dem
Zelllysat mit steigender UCS15A-Konzentration abnahm.
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(4) Auswirkung des Proteaseinhibitors
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Durch
Zugabe eines Proteaseinhibitors, wie es unten beschrieben ist, wurde
verifiziert, ob die Abnahme der Menge an Sam68 in (3) auf einen
Proteaseverdau zurückzuführen war.
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Bei
Durchführung
des in (2) beschriebenen Proteaseverdautests wurde ein Proteaseinhibitorcocktail
(Complete, hergestellt von Roche), der eine große Vielzahl von Proteasen hemmen
kann, zusammen mit UCS15A zugegeben, und es wurde die gleiche Reaktion
durchgeführt.
Nach der Elektroforese wurde Sam68 mittels Western-Blotten in der
gleichen Weise detektiert wie in (3). Die Bedingungen für die Zugabe
des Inhibitors und andere Bedingungen entsprachen den Anleitungen
des Herstellers, die dem Reagens beigefügt waren. Im Ergebnis wurde,
wie es in 2 gezeigt ist, die Abnahme der
Menge an Sam68 in dem Zelllysat durch Zugabe eines Proteaseinhibitors
gehemmt. Damit wurde verifiziert, daß die Abnahme der Menge an
Sam68 auf Proteaseverdau zurückzuführen ist
und daß Sam68
in Gegenwart von UCS15A gegenüber
einer endogenen Protease empfindlich wird.
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Beim
Western-Blotten in Gegenwart oder in Abwesenheit des Proteaseinhibitors,
siehe 2, wurden die gleichen Mengen an Zelllysaten verwendet,
und auch die Zeitdauern der Exposition für die Detektion waren die gleichen.
Beim Vergleich der jeweiligen Spur 2 in beiden Ergebnissen wurde
jedoch herausgefunden, daß ohne
Zugabe von UCS15A die Menge des Proteins Sam68 in Abwesenheit eines Proteaseinhibitors
sich nicht von der Menge in Gegenwart eines Proteaseinhibitors unterschied,
selbst wenn sie für
12 Stunden bei 37°C
inkubiert wurden. Damit wurde gezeigt, daß Sam68 inhärent sehr stabil gegenüber der
Wirkung der exogenen Protease ist.
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Industrielle Anwendbarkeit
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Gemäß dem Verfahren
der vorliegenden Erfindung kann ein Zielprotein eines Medikaments leicht
und präzise
bestimmt werden. Das Verfahren ist überaus geeignet als ein Mittel
zur Entwicklung von Medikamenten, wie zum Screenen neuer Medikamente,
der Beurteilung entdeckter Medikamente und der Eliminierung von
Nebenwirkungen.