WO2003020960A1 - Procede de determination d'une proteine cible d'un medicament - Google Patents

Procede de determination d'une proteine cible d'un medicament Download PDF

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WO2003020960A1
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cell lysate
target protein
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Sreenath V. Sharma
Chitose Oneyama
Hirofumi Nakano
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Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/447—Systems using electrophoresis

Definitions

  • the present invention relates to a method for determining a target protein of a drug.
  • Drugs exhibit their pharmacological effects on living bodies by binding to specific substances in the living body and changing the functions of those substances.
  • this substance in the body is a protein and is called the drug's target protein. It is considered that the change in the function of the target protein caused by the binding of the drug is accompanied by some structural change of the target protein [US Pat. Nos. 5,585,277 and 5,567,9582, JP-A-9-18787. No. 46, International Publication WO97 / 20952].
  • a method for determining the target protein of a drug is to purify the target protein from tissues or cells by affinity chromatography using the binding of the target protein to the drug [Shimizu N et al., Nat. Biotechnol. 18, 877 (2000), Fruichi H et al., Biochem. Biophys. Res.Commun. 270, 1002 (2000), Jbilo 0 et al., J. Biol. Chem.
  • a method for constructing a cDNA library of a protein expression type and isolating an expression clone that binds with a drug as a probe (Japanese Patent Application Laid-Open No. H10-248571, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2000-50989) No. 23) is known.
  • a target protein or a target protein that binds to a drug is identified.
  • the target protein can be determined.
  • the binding to the carrier may disrupt the original tertiary structure of the drug, and the binding between the drug and the target protein may be lost.
  • the carrier must be designed so as not to be disturbed.
  • a drug and a carrier are bonded using a functional group that does not significantly affect the pharmacological activity of the drug, but in order to select a functional group that does not affect the activity, the structure activity of the drug must be determined. There is a problem that correlation data is required, and much effort is required to obtain this structure-activity relationship data. Disclosure of the invention
  • An object of the present invention is to provide a method for determining a target protein of a drug. More specifically, it is an object of the present invention to provide a method that can easily and accurately determine a target protein of a drug without having to bind the drug to a carrier.
  • proteins naturally occurring in cells are known to be extremely stable, with their polypeptide chains folded into their original tertiary structure [Levitt M et al., Annu. Rev. Biochem. 66, 549 (1997)].
  • the present inventors predicted that when a target protein binds to a drug and changes its function, some structural change will occur, thereby increasing the sensitivity to proteases.
  • the present inventors analyzed the changes in protease sensitivity of intracellular proteins by administering a drug to cells to demonstrate the hypothesis that the target protein changes to protease sensitivity, and that It has been found that by detecting a protein that causes a change in the protein, the protein can be determined as a target protein of the drug.
  • the above method can omit the step of binding the drug and the carrier, and it is not necessary to acquire data on the structure-activity relationship of the drug in advance, so that the target protein of the drug can be determined extremely simply and accurately.
  • the present invention has been completed based on the above findings.
  • the present invention provides the following (1) to (13).
  • (1) A method for determining a target protein of a drug comprising a step of determining a protein whose protease sensitivity increases in the presence of the drug as the target protein of the drug.
  • FIG. 1 is a view showing the results of protease degradation of a protein to which UCS 15A was added at different concentrations using a cell lysate of HCT116. The left shows the results of Kumazi-Pliant Blue staining of SDS-PAGE, and the right shows the results of specific detection of Sam68 by Western blot.
  • FIG. 2 is a graph showing the effect of a protease inhibitor on degradation of Sam68 in a cell lysate.
  • the upper panel shows the protease without protease inhibitor, and the lower panel shows the protease-assayed protease with different concentrations of UCS15A when the protease inhibitor was added. This is the result of specifically detecting S am 68.
  • the numbers above each lane indicate the concentration mo 1 / L of UCS 15 A added to the cell lysate
  • M indicates the molecular weight marker.
  • the method of the present invention is a method for determining a target protein of a drug, comprising a step of determining a protein whose protease sensitivity is increased in the presence of the drug as the target protein of the drug. And The method of the present invention can be used to determine whether one protein predicted to be a target protein of a drug is a target protein of the drug. Further, the method of the present invention can be used to select a protein having increased protease sensitivity in the presence of a drug from a mixture containing two or more proteins.
  • the method of the present invention comprises a step of using a cell lysate and selecting from among the proteins contained in the cell lysate a protein having increased protease sensitivity in the presence of a drug.
  • the target protein can be more easily analyzed than in vivo, that is, when analyzing by adding a drug during cell culture.
  • the secondary action of the signaling molecule after the target protein, or during the action on the protein synthesis or degradation mechanism, etc. By excluding changes in protein caused by indirect action, it is possible to detect only changes in protein caused by direct action of the drug.
  • An increase in the protease sensitivity of a protein in the presence of a drug can generally be detected as an increase in the degradation of the protein by a protease.
  • a protein mixture can be treated with a protease in the presence of a drug to detect individual proteins and analyze changes in the amount of each protein.
  • the protein has been degraded by protease, and it is determined that the protein has increased protease sensitivity.
  • a protein having increased protease sensitivity as described above can be determined to be a target protein of the drug.
  • protease a cell-derived protease (sometimes referred to as “endogenous” protease in this specification) may be sufficient, but if necessary.
  • An appropriate type of protease a protein not derived from the cell, sometimes referred to as “exogenous” protease in this specification may be added. Two or more proteases may be appropriately combined and added to the reaction system.
  • Cell lysates can be prepared from cells or tissues for which the target protein of the drug is to be determined. I can do it.
  • any cell or tissue may be used, such as an established cell line, cells separated from blood or tissue, or a tissue collected from a living body.
  • the cell lysate is prepared by physically disrupting the cells and tissues together with an appropriate buffer using a conventional homogenizer, for example, a tissue homogenizer such as a Dounce homogenizer or a Polytron homogenizer (Polytron homogenizer).
  • a tissue homogenizer such as a Dounce homogenizer or a Polytron homogenizer (Polytron homogenizer).
  • the cells can be ground or crushed using an ultrasonic oscillator, and the resulting solution can be prepared as a centrifuged supernatant.
  • phosphate buffer phosphate buffer
  • PBS phosphate buffered saline
  • reticulocyte swelling buffer 1 0 mm o 1 ZL tris monohydrochloride p H 7. 6, 1 Ommo 1 / LN a C l, 1. 5mmo 1 / L Mg C l 2) low concentration of N a C, such as Near-neutral phosphate or tris-based buffers containing salts such as 1 can be used.
  • N a C such as Near-neutral phosphate or tris-based buffers containing salts such as 1 can be used.
  • a drug is added to the cell lysate obtained above.
  • As a control it is desirable to prepare a cell lysate to which no drug is added. It is preferred to test at multiple drug concentrations to see that protein degradation is dependent on drug concentration.
  • the drug is a solid, it can be added after dissolving in a buffer solution for preparing a cell lysate or in an appropriate solvent. In this case, it is preferable that the solvent used for dissolving the drug is also added to the control cell-free cell lysate. It is preferable that the amount of the solvent to be added be the same for each cell lysate.
  • the protease is allowed to act on the cell lysate to which the above-mentioned drug has been added. Since the cell lysate usually contains a sufficient amount of cell-derived protease, the protease is produced by keeping the cell lysate at 25 to 42 ° C, preferably at 37 ° C. Can be used. To confirm that a decrease in the amount of a specific protein was caused by degradation by a protease, prepare a reaction system to which a protease inhibitor, preferably a mixture of protease inhibitors that broadly inhibit various proteases, was added. However, it is preferable to compare the results with those of a system in which a protease is allowed to act under the conditions without adding a protease inhibitor.
  • the time for which the protease is allowed to act is not particularly limited, but an action time that is sufficient for the specific degradation of the target protein having increased protease sensitivity without degrading the entire protein in the cell lysate is appropriately selected. There is a need.
  • typical examples of the method of the present invention using the cell lysate are described in detail and in detail, so that the above-mentioned protease action time depends on the type of cell or drug. It goes without saying that a person skilled in the art can appropriately select an embodiment according to various conditions by referring to the examples in the present specification.
  • a cell lysate to which no drug is added is incubated for 30 hours to 24 hours in the same manner for several hours to allow protease to act, and proteins are detected by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
  • the reaction time can be selected as the reaction time when a large number of well-defined protein bands are seen in the region of 50 kDa or more compared to before the protease was applied, rather than smearing. .
  • a longer time is preferable among the times selected as described above. Since the amount of protease contained varies depending on the cell, the preferred action time varies, but for example, in the case of a cell lysate of HCT116 cells (collated number -247), 6 to 12 hours are preferable.
  • the protease may be, for example, trypsin, chymotrypsin, V8 protease, elastase, carboxypeptidase, lysyl endopeptidase, proteinase, or the like. Thermolysin, papain, subtilisin, or a mixture thereof, and the like.
  • the increase in the protease sensitivity of each protein is detected.
  • the increase in the protease sensitivity of a certain protein is usually a decrease in the protein mass that is specifically observed when analyzing the protein in the cell lysate under each condition. It can be detected as a phenomenon that is detected and its decrease is inhibited in the presence of a protease inhibitor. In this way, a protein in which an increase in protease sensitivity has been detected can be determined as a drug target protein.
  • a method for identifying a target protein contained in a cell lysate and a method for evaluating whether or not a specific protein is a target protein will be described separately.
  • the target protein can be identified by isolating the protein in which the increase in protease sensitivity is detected from the cell lysate and determining the structure. Usually, in this case, it is desirable to analyze the whole protein of the cell lysate.
  • the analysis method include acrylamide gel electrophoresis such as SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and two-dimensional electrophoresis.
  • the gel after electrophoresis, or the polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane onto which the protein has been transferred from the gel, is applied to the nitrocellulose membrane by non-specific methods such as Coomassie 'Brilliant' blue staining and silver staining. Stain and detect.
  • the target proteins that give bands or spots corresponding to bands / spots corresponding to drug-dependently reduced amounts in the above analysis are as follows:
  • the structure can be isolated and determined.
  • the corresponding band or spot is cut out, the protein is cut into a peptide on a gel by a protease such as trypsin, and the peptide mixture is subjected to MALDI-TOF (matrix assisted laser desorption ionization-time of flight) mass spectrometry. It is detected by a meter.
  • the theoretical peptide mass pattern calculated by the protease treatment of the sequence on the sequence database is compared with the experimentally obtained peptide sequence pattern.
  • a protein having a high MO W S E score [Pappin et al., Curr. Biol. 3, 327 (1993)] taking into account the mass pattern coincidence rate of the peptide mixture can be determined to be the target protein.
  • EIA Enzyme immunoassay
  • the protein When the amount of the protein decreases in a drug-dependent manner in the absence of the protease inhibitor and the decrease is inhibited in the presence of the protease inhibitor, the protein is determined to be a target protein of the drug. If no drug-dependent decrease is observed, or if a decrease is observed even in the presence of a protease inhibitor, the protein is not considered to be a target protein of the drug.
  • a preferred typical method of the present invention comprises the following steps (1) to (4).
  • Still another typical method includes the following step (7) following the above steps (1) and (2).
  • UCS 15A was used as a drug.
  • This drug is isolated from the culture solution of Streptomyces genus Actinomycetes and is a substance having an activity of inhibiting bone resorption (Japanese Patent Application Laid-Open No. 8-2688888). This is the same substance as the substance reported as No. 28959).
  • UCS 15A has a bactericidal action (JP-A-58-166686, JP-A-63-22583), an immunosuppressive action, in addition to a bone resorption inhibiting action. It is a substance that has various effects such as kaihei 61-2939220) and antitumor activity (Japanese Patent Application Laid-Open No. 63-48213).
  • the human colon cancer cell line HCT116 (Coll. No. 1 ⁇ -247) was added to 10% fetal jfiL purified Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM). ), In a CO 2 incubator at 37 ° C, 5% CO 2, in a loomm-diameter dish for cell culture, and subculture every 15 days in 15 divided portions. Was. The medium was removed from three HCT116 cell dishes on the third day after the passage, and 1 OmL of ice-cold PBS was added, followed by removal of the cells to wash the cells. This cell, which is hypotonic RSB (1 Ommo l ZL Tris hydrochloride pH 7. 6, l Omm ol ZL N a C l, 1.
  • hypotonic RSB (1 Ommo l ZL Tris hydrochloride pH 7. 6, l Omm ol ZL N a C l, 1.
  • 5mm o 1 ZL Mg C 1 2) was added 1 OML. After placing on ice for 10 minutes to allow the cells to swell, the cells were removed from the dish and placed in a Dounce 'homogenizer with a volume of 15 mL per RBS. The cells were disrupted by reciprocating the homogenizer grinding rod 50 times. The cell lysate was centrifuged at 15 ° C., 5000 rpm at 4 ° C. for 30 minutes, and the supernatant was collected and divided into 10 cells each with 1 mL.
  • UCS 15A was isolated and purified from Streptomyces genus Actinomycetes based on the description in Japanese Patent Application Laid-Open No. 58-116686, and dimethylsulfoxide having a concentration of lOmmo1 / L. (DM SO) solution was prepared. The final concentration of 0 (DMS O only), 25, 50, 75 and 75 were added to 10 of the HCT116 cell lysates prepared in (1), respectively.
  • DM SO dimethylsulfoxide having a concentration of lOmmo1 / L.
  • the cell lysate to which UCS 15 A had been added was incubated at 37 ° C. for 12 hours while gently rotating in a rotary culture machine to react with the cell endogenous protease.
  • To each of the cell lysates after the reaction add 33 33 ⁇ L of 4 ⁇ After heating and mixing well, the mixture was heated at 100 ° C. for 10 minutes. This 20 / z L was subjected to 8.5% polyacrylamide gel electrophoresis. The gel after the electrophoresis was stained with Coomassie brilliant blue (manufactured by Nacalai Tesque, Inc.). The results are shown in Fig. 1 (left figure). As the concentration of UCS15A increased, some proteins decreased as the concentration increased.
  • Sam68 in the cell lysate was detected by Western blot as follows. First, proteins were blotted from the gel after electrophoresis in the above (2) onto a nitrocellulose membrane (Protran; Schleicher and Schuell) having a pore size of 0.45 ⁇ . . After placing non-specific binding on a membrane with PBS containing 0.25% gelatin and 0.2% Tween-20 (hereinafter referred to as PBS-TG) at 4 ° C overnight, first block nonspecific binding. A heron anti-Sam68 polyclonal antibody (Santa Cruz) diluted 1: 1000 with PBS-TG as a primary antibody was reacted for 2 hours.
  • Protease inhibitor cocktail (Complete) that can inhibit a wide range of proteases together with UCS 15A during the protease degradation assay described in (2).
  • a target protein of a drug can be simply and accurately determined. This method is extremely useful as a means for drug discovery, such as searching for new drugs, evaluating discovered drugs, and separating side effects.

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Description

明 細 書 薬物の標的蛋白質を決定する方法 技術分野
本発明は薬物の標的蛋白質を決定する方法に関する。 背景技術
薬物は生体内で特定の物質と結合し、 その物質の機能を変化させることにより、 生体に対しその薬理効果を示す。 多くの場合、 この生体内の物質は蛋白質であり、 薬物の標的蛋白質と呼ばれる。 薬物の結合により引き起こされるこの標的蛋白質 の機能の変化は、 標的蛋白質の何らかの構造変化を伴なうと考えられている [米 国特許第 5585277号、 同第 5679582号、 特開平 9 _ 1 7 8 7 4 6号公報、 国際公 開 WO 9 7ノ 2 0 9 5 2 ] 。 ある薬物の標的蛋白質を決定し、 薬物とその標的蛋 白質が結合した時の標的蛋白質の機能の変化の内容や、 その機能の変化と薬理効 果の関係を解明していくこと、 すなわち薬物が生体内で薬理効果を示す機構を明 らかにすることは、 新たな薬物の探索や見出された薬物の評価、 副作用の分離等 を行ううえで非常に重要である。
この薬物の作用の機構の解明のためには、 まず標的蛋白質の決定が必要である。 薬物の標的蛋白質の決定法としては、 標的蛋白質が薬物と結合することを利用し て、 ァフィ二ティークロマトグラフィ一により,組織や細胞から標的蛋白質を精製 する方法 [Shimizu N et al. , Nat. Biotechnol. 18, 877 (2000)、 Fruichi H et al. , Biochem. Biophys. Res. Commun. 270, 1002 (2000)、 Jbilo 0 et al. , J. Biol. Chem. 272, 27107 (1997) ] や、 蛋白質発現型の c D N Aライプラリー を構築し、 薬物をプローブとして結合する発現クローンを単離する方法 （特開平 1 0 - 2 4 8 5 7 1号公報、 特表 2 0 0 0— 5 0 8 9 2 3号公報） が知られてい る。 これらの方法により、 まず薬物と結合する標的蛋白質あるいは標的蛋白質を コードする遺伝子を単離し、 その構造を分析することにより標的蛋白質を決定す ることができる。
しかしながら、 これらの方法では薬物と担体とを結合させる必要があり、 標的 蛋白質の決定のためには、 担体との結合により本来の薬物の立体構造がくずれた り、 薬物と標的蛋白質との結合が阻害されないように担体を設計しなければなら ない。 通常は、 薬物の薬理活性に大きな影響をおよぼさない官能基を用いて薬物 と担体とを結合させるが、 活性に影響を及ぼさない官能基を選択するためには、 その薬物についての構造活性相関のデータが必要であり、 この構造活性相関のデ ータを得るためには多くの労力がかかるという問題がある。 発明の開示
本発明の課題は、 薬物の標的蛋白質を決定する方法を提供することにある。 よ り具体的には、 薬物を担体に結合させる必要がなく、 簡便かつ正確に薬物の標的 蛋白質を決定できる方法を提供することが本発明の課題である。
一般に、 細胞内で天然に存在する蛋白質は、 ポリペプチド鎖が折りたたまれて 本来の立体構造をとつており、 非常に安定であることが知られている [Levitt M et al. , Annu. Rev. Biochem. 66， 549 (1997) ] 。 本発明者らは、 標的蛋白質が 薬物と結合してその機能を変化させる場合、 何らかの構造変化がおこり、 そのた めプロテアーゼに対して感受性が高まると予測した。 本発明者らは、 その仮説を 実証すべく、 細胞に薬物を投与して細胞内の蛋白質のプロテアーゼ感受性の変化 を解析したところ、 標的蛋白質がプロテア一ゼ感受性に変化すること、 及びプロ テアーゼ感受性に変化を生じる蛋白質を検出することにより、 その蛋白質を該薬 物の標的蛋白質として決定できることを見出した。 上記方法は、 薬物と担体とを 結合させる工程を省略でき、 予め薬物の構造活性相関のデータを取得する必要が ないことから、 極めて簡便かつ正確に薬物の標的蛋白質を決定できる。 本発明は 上記の知見を基にして完成された。
すなわち、 本発明により、 以下の （1 ) 〜 （1 3 ) が提供される。 (1) 薬物の標的蛋白質を決定する方法であって、 薬物の存在下においてプロテ ァーゼ感受性が上昇する蛋白質を該薬物の標的蛋白質であると判定する工程を含 む方法。
(2) 細胞破砕液に含まれる蛋白質のなかから薬物の存在下においてプロテア一 ゼ感受性が上昇する蛋白質を選択する工程を含む （1) に記載の方法。
(3) プロテアーゼとして細胞の内在性プロテアーゼを用いる （1) 又は （2) に記載の方法。
(4) プロテアーゼとして外来性プロテア一ゼをさらに添加する工程を含む (1) ないし （3) のいずれか 1項に記載の方法。
(5) プロテアーゼ感受性の上昇を該蛋白質の分解量の上昇として検出する (1) ないし （4) のいずれか 1項に記載の方法。
(6) プロテア一ゼ阻害剤の存在下において該蛋白質の分解量の上昇の抑制を検 出する工程をさらに含む （5) に記載の方法。
(7) アクリルアミ ドゲル電気泳動を用いて蛋白質の量の変化を検出する （5) 又は （6) に記載の方法。
(8) アクリルアミ ドゲル電気泳動が S D S—ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動 又は二次元電気泳動である （7) に記載の方法。
(9) 選択された蛋白質を同定する工程を含む （1) ないし （8) のいずれか 1 項に記載の方法。
(10) 選択された蛋白質を単離して同定する工程を含む （9) に記載の方法。
(1 1) 該蛋白質を検出する工程を含む （1) ないし （8) のいずれか 1項に記 載の方法。
(12) 該蛋白質を認識する抗体を用いて検出を行う （1 1) に記載の方法。
(13) ウェスタンプロッ ト、 ドットプロット、 酵素免疫測定法、 又は放射性免 疫測定法により検出を行う （12) に記載の方法。 図面の簡単な説明 第 1図は、 HCT 1 1 6の細胞破砕液を用いた、 UC S 1 5 Aを濃度を変えて 添加した蛋白質のプロテアーゼ分解アツセィの結果を示す図である。 左は SD S — PAGEのクマジ一 ·プリリアント ·ブルー染色の結果、 右は、 ウェスタン . ブロッ 卜により S am68を特異的に検出した結果である。 両者とも各レーンの 上の数字は細胞破砕液に添カ卩した UC S 1 5 Aの濃度 mo 1/L) を示し、 Mは分子量マーカー、 左の数字は分子量マーカーの各分子量 （kDa) を示す。 第 2図は、 細胞破砕液中の S am68の分解に対するプロテアーゼ阻害剤の効 果を示す図である。 上は、 プロテア一ゼ阻害剤を添カ卩しない場合、 下はプロテア ーゼ阻害剤を添加した場合の、 UCS 1 5 Aを濃度を変えて添加したプロテア一 ゼ分解アツセィで、 ウェスタン 'ブロットにより S am 68を特異的に検出した 結果である。 両者とも各レーンの上の数字は細胞破砕液に添加した UC S 15 A の濃度 mo 1 /L) を示し、 Mは分子量マーカーを示す。 発明を実施するための最良の形態
本発明の方法は、 薬物の標的蛋白質を決定する方法であって、 薬物の存在下に おいてプロテア一ゼ感受性が上昇する蛋白質を該薬物の標的蛋白質であると判定 する工程を含むことを特徴としている。 本発明の方法は、 薬物の標的蛋白質であ ることが予想される 1の蛋白質を対象として、 該薬物の標的蛋白質であるか否か を判定するために用いることができる。 また、 本発明の方法は、 2以上の蛋白質 を含む混合物のなかから薬物の存在下においてプロテアーゼ感受性が上昇する蛋 白質を選択するために用いることができる。
好ましくは、 本発明の方法は、 細胞破砕液を用い、 該細胞破砕液中に含まれる 蛋白質のなかから薬物の存在下においてプロテアーゼ感受性が上昇する蛋白質を 選択する工程を含む。 細胞破砕液を用いてイン ' ビトロ （in vitro) の条件で上 記の選択を行うことにより、 イン · ビボ条件、 すなわち細胞の培養時に薬物を添 加して解析する場合よりも簡便に標的蛋白質を決定でき、 標的蛋白質以降の情報 伝達分子による二次的な作用、 あるいは蛋白質の合成や分解機構への作用等の間 接的な作用による蛋白質の変化を排除して、 薬物の直接的な作用による蛋白質の 変化のみを検出することができる。
薬物の存在下における蛋白質のプロテアーゼ感受性の上昇は、 一般的には、 プ 口テアーゼによるその蛋白質の分解量の上昇として検出できる。 例えば、 薬物の 存在下において蛋白質混合物をプロテアーゼで処理して個々の蛋白質を検出し、 各蛋白質の量の変化を解析することができる。 この解析により、 蛋白質の量が減 少した蛋白質が検出された場合には、 その蛋白質がプロテア一ゼによる分解を受 けており、 その蛋白質のプロテアーゼ感受性が上昇したと認定される。 上記の検 出を行うにあたっては、 薬物の非存在下において同様のプロテア一ゼ処理を行つ て対照として用いるのがよい。 上記のようにしてプロテアーゼ感受性が上昇した 蛋白質がその薬物の標的蛋白質であると判定できる。
本発明の方法を行うにあたり、 プロテア一ゼとしては、 細胞に由来するプロテ ァーゼ （本明細書において 「内在性」 のプロテアーゼと呼ぶ場合がある。 ） で十 分な場合もあるが、 必要に応じて適宜の種類のプロテアーゼ （該細胞に由来しな いもの、 本明細書において 「外来性」 プロテア一ゼと呼ぶ場合がある。 ） を添加 してもよい。 2種以上のプロテアーゼを適宜組み合わせて反応系に添加してもよ レ、。
さらに、 プロテアーゼ反応をプロテア一ゼ阻害剤の存在下で行ない、 プロテア —ゼ阻害剤の非存在下で行った場合の結果と比較することにより、 蛋白質の量の 減少が認められた場合に、 その減少がプロテアーゼによる蛋白質の分解量の上昇 によるものであり、 他の原因、 例えば蛋白質の凝集等によるものでないことを証 明できる。
本発明の方法の好ましい態様として、 蛋白質混合物として細胞破砕液を用いる 場合について具体的に説明するが、 本発明の方法は下記の説明の細部に限定され ることはない。
1 ) 細胞破砕液の調製
細胞破砕液は、 薬物の標的蛋白質を決定すべき細胞や組織から調製することが できいる。 細胞破砕液の調製に用いる細胞又は組織としては、 樹立された細胞株、 血液や組織から分離した細胞、 生体から採取した組織など、 いかなるものを用い てもよい。 一定の培養条件下で保存された細胞株を用い、 細胞破砕液の調製時の 条件を同一にすることにより、 細胞破砕液に含まれる総蛋白質の質的な変動が少 なく、 再現性のよい結果を得ることができる。
細胞破砕液は、 細胞や組織を適当な緩衝液と共に通常のホモゲナイザー、 例え ばダウンス · ホモゲナイザー (Dounce homogenizer) やポリ トロン 'ホモゲナイ ザ一 （Polytron homogenizer) 等の組織用のホモゲナイザーを用いて物理的にす りつぶすか、 あるいは超音波発振装置を用いて細胞を破砕し、 得られた液を遠心 分離した上清として調製することができる。 緩衝液としては、 リン酸緩衝液
(phosphate buffered saline; P B S) や網膜状赤血球膨潤緩衝液
(reticulocyte swelling buffer; R S B ： 1 0 mm o 1 Z L トリス一塩酸 p H 7. 6、 1 Ommo 1 /L N a C l、 1. 5mmo 1 /L Mg C l 2) 等 の低濃度の N a C 1等の塩類を含む中性付近のリン酸系や卜リス系の緩衝液を用 いることができる。
2) 薬物の添カロ
上記で得られた細胞破砕液に薬物を添加する。 対照として、 薬物を添加しない 細胞破砕液も用意することが望ましい。 蛋白質の分解が薬物の濃度に依存的であ ることを見るために、 複数の薬物濃度で試験を行うことが好ましい。 薬物が固体 の場合は、 細胞破砕液作成時の緩衝液、 又は適当な溶媒に溶解して添加すること ができる。 この場合はコントロールの薬物非添加の細胞破碎液にも薬物の溶解に 用いた溶媒を添加するのが好ましい。 添加する溶媒の量は、 各細胞破砕液で全て 同じにするのが好ましい。
3) プロテア一ゼ反応
上記の薬物を添加した細胞破砕液にプロテア一ゼを作用させる。 細胞破砕液に は通常は細胞由来のプロテアーゼが十分量含まれているので、 細胞破碎液をその まま 25〜42°C、 好ましくは 3 7°Cで保温することにより、 プロテア一ゼを作 用させることができる。 特定の蛋白質の量の減少がプロテアーゼによる分解によ つて生じたことを確認するために、 プロテアーゼ阻害剤、 好ましくは様々なプロ テアーゼを広範に阻害するプロテアーゼ阻害剤混合物を添加した反応系を用意し、 プロテアーゼ阻害剤を添加しなレ、条件でプロテア一ゼを作用させた系での結果と 比較検討することが好ましい。 プロテアーゼ阻害剤を添加した系においてその蛋 白質の量の減少が認められず、 一方、 プロテアーゼ阻害剤を添加しない系におい て蛋白質量の減少が認められる場合には、 蛋白質の量の減少がプロテアーゼによ る分解で生じたと認定できる。
プロテアーゼを作用させる時間は特に限定されないが、 細胞破砕液中の蛋白質 全体を分解することなく、 しかもプロテアーゼ感受性の上昇した標的蛋白質の特 異的分解のためには十分である作用時間を適宜選択する必要がある。 本明細書の 実施例には、 細胞破碎液を用いた本発明の方法の典型例が具体的かつ詳細に説明 されているので、 上記のプロテアーゼ作用時間は、 細胞の種類や薬物の種類など の種々の条件に応じて、 本明細書の実施例を参照することにより、 当業者が適宜 選択できることは言うまでもない。
例えば、 薬物を添加しない細胞破砕液を 3 0分〜 2 4時間の間でいくつかの時 間について同様に保温してプロテアーゼを作用させ、 S D S—ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動により蛋白質を検出し、 適用した反応時間のうち、 プロテアーゼ を作用させる前と比較して 5 0 k D a以上の領域にもスメァ状でなくはっきりと した蛋白質のバンドが多数見られる時間を反応時間として選択することができる。 また、 このように選択された時間の中では長い時間の方が好ましい。 細胞により、 含まれるプロテアーゼの量が異なるので、 好ましい作用時間は異なるが、 例えば H C T 1 1 6細胞 （ 丁じ 番号じじ —2 4 7 ) の細胞破碎液では 6〜 1 2時 間が好ましい。
上記の細胞破碎液にさらに外来性プロテアーゼを添加する場合、 プロテアーゼ としては、 例えば、 トリプシン、 キモトリブシン、 V 8プロテアーゼ、 ェラスタ ーゼ、 カルボキシぺプチダ一ゼ、 リジルエンドべプチダーゼ、 プロティナ一ゼ 、 テルモリシン、 パパイン、 ズブチリシン、 又はそれらの混合物などを挙げること ができる。
4 ) 蛋白質の解析と標的蛋白質の決定
プロテアーゼ阻害剤の存在下及び非存在下のそれぞれの条件でプロテアーゼを 作用させた細胞破碎液中の個々の蛋白質を解析し、 各蛋白質のプロテアーゼ感受 性の上昇を検出する。 ある蛋白質におけるプロテアーゼ感受性の上昇は、 通常は、 それぞれの条件下の細胞破碎液中の蛋白質を解析したときに特異的に認めらる蛋 白質量の減少であって、 薬物量に依存した減少として検出され、 かつプロテア一 ゼ阻害剤存在下ではその減少が阻害される現象として検出できる。 このようにし て、 プロテア一ゼ感受性の上昇が検出された蛋白質を薬物の標的蛋白質として決 定することができる。 以下、 細胞破碎液に含まれる標的蛋白質を同定する方法と、 ある特定の蛋白質が標的蛋白質であるかどうかを評価する方法とに分けて説明す る。
4 - 1 ) 標的蛋白質の同定
標的蛋白質が未知の場合は、 プロテアーゼ感受性の上昇が検出された蛋白質を 細胞破碎液から単離して構造決定することにより、 標的蛋白質の同定を行うこと ができる。 通常、 この場合には、 細胞破砕液の蛋白質全体を解析することが望ま しレ、。 解析方法としては、 S D S—ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動、 二次元電 気泳動などのアク リルアミ ドゲル電気泳動法が挙げられる。 電気泳動後のゲル、 あるいはゲルから蛋白質を転写したポリフッ化ビニリデン （P V D F ) 膜ゃニト ロセルロース膜に対して、 クマジー 'ブリリアント 'ブルー染色や銀染色等の方 法により蛋白質全体を非特異的に染色し検出する。
薬物を添加した細胞破砕液について、 プロテア一ゼ阻害剤非存在下及び存在下 それぞれの条件でプロテアーゼを作用させた場合の蛋白質全体のパターンを比較 し、 プロテアーゼ阻害剤非存在下で薬物添加により特異的に量が減少し、 その量 の減少がプロテアーゼ阻害剤存在下では阻害されるバンドゃスポットを選択する。 これらのバンドゃスポットに相当する蛋白質は、 薬物との結合によりコンフオメ —シヨンの変化を起こした結果、 プロテアーゼ感受性が高くなり、 プロテアーゼ の分解をより多く受けるようになった蛋白質であり、 添加した薬物の標的蛋白質 と決定できる。
薬物を添加しなかった細胞破砕液のゲルあるいは蛋白質を転写した膜について、 上記の解析で薬物依存的に量が減少しているバンドゃスポットに相当するバンド やスポットを与える標的蛋白質は、 以下のようにして単離して構造決定すること ができる。 まず、 相当するバンドあるいはスポットを切り出し、 蛋白質をゲル上 でトリプシンなどのプロテア一ゼによりべプチドに切断後、 該ぺプチド混合物を M A L D I— T O F (matrix assisted laser desorption ionization - time of fl ight) 質量分析計により検出する。 シークェンスデータベース上の配列のプロ テアーゼ処理によつて計算された理論上のぺプチドの質量パターンと、 実験的に 得られたぺプチド配列パターンとを比較する。 ぺプチド混合物の質量パターンの 一致率などを加味した MO W S Eスコア [Pappin et al. , Curr. Biol. 3, 327 (1993) ] の高い蛋白質が標的蛋白質であると決定できる。
複数の蛋白質が含まれている場合などには、 以上の方法で決定できない場合も あるが、 その場合には、 E S I (electrospray ionizat ion)を用いたタンデム質 量分析法による解析を行い、 部分シークェンスを得た後に G e n B a n k等の E S T (expressed sequence tag) のデータベースから検索、 決定することができ る [Pandey A and Mann M， Nature 405, 837 (2000)、 谷口， 実験医学 2550 (1999) ] 。 すなわち、 これらの方法から検索の結果見出された、 一致するァミノ 酸配列を含むデータベース中の蛋白質が、 標的蛋白質であると決定できる。 一致 するアミノ酸配列が存在しない場合は、 新規なアミノ酸配列を有する新規な蛋白 質と判断できる。
4 - 2 ) 特定の蛋白質が薬物の標的蛋白質であるかかどうかを評価する場合 ある特定の蛋白質が薬物の標的蛋白質であるかどうかを評価する場合は、 蛋白 質全体を解析する代わりに、 評価の対象となる蛋白質を特異的に検出する。 該蛋 白質の特異的な検出法としては、 該蛋白質を認識できる抗体を用いた方法があげ られ、 ウェスタン ·プロットゃドッ卜 ·プロット、 サンドィツチ E L I S A等の 酵素免疫測定法 （enzyme immunoassay； E I A) 、 放射性免疫測定法
(Radioimmunoassay； R I A) などをあげることができる。 これらの方法は、 文 献 [富山朔ニ .安東民衛編， 単クロ一ン抗体実験マニュアル， 講談社サイェンテ ィフィック （1987)、 続生化学実験講座 5， 免疫生化学研究法， 東京化学同人 (1986)、 Goding JW, Monoclonal Antibodies： Principles and Practice, Third edition, Academic Press (1996)、 Harlow E and Lane D, Antibodies： A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) ] に基レヽて行うこ とができる。
該蛋白質の量がプロテア一ゼ阻害剤非存在下で薬物依存的に減少し、 その減少 がプロテアーゼ阻害剤存在下では阻害される場合には、 該蛋白質が薬物の標的蛋 白質であると決定することができ、 薬物依存的な減少が見られない場合、 あるい はプロテア一ゼ阻害剤存在下でも減少が見られる場合は、 該蛋白質は薬物の標的 蛋白質ではないと考えられる。
本発明の好ましい典型的な方法は、 以下の工程（1)から（4)を含む。
(1)細胞破砕液を調製し、 （a)薬物を添加した細胞破砕液 （細胞破砕液（a) ) 、 及 び (b)薬物及びプロテアーゼ阻害剤を添加した細胞破砕液 （細胞破碎液 (b) ) をそ れぞれ調製する。
(2)上記工程（1)で調製した細胞破砕液 (a)、 細胞破砕液 (b)、 及び薬物もプロテア ーゼ阻害剤も添加しない対照の細胞破砕液 （対照細胞破砕液） をそのまま、 ある いは外因性プロテアーゼを添加して保温することにより、 プロテア一ゼを細胞破 砕液中の蛋白質に作用させる。
(3)保温後のそれぞれの細胞破砕液中の個々の蛋白質を検出し、 対照細胞破砕液 と比較したときに、 細胞破砕液（a)では量が減少しており、 細胞破碎液 (b)ではそ の量の減少が阻害される蛋白質を選択する。
(4)選択した蛋白質 （標的蛋白質） を単離して同定する。
また、 別の典型的な方法では、 上記工程（1)及び (2)に続けて以下の工程 (5)及 び (6)を含む。
(5)保温後のそれぞれの細胞破砕液中の個々の蛋白質をァクリルアミ ドゲル電気 泳動によって分離して染色し、 対照細胞破砕液と比較したときに、 細胞破砕液 (a)では面積が減少しており、 細胞破砕液 (b)ではその面積の減少が阻害されるバ ンド又はスポットを選択する。
(6)選択したバンド又はスポッ トを形成する蛋白質 （標的蛋白質） を単離して同 定する。
さらに別の典型的な方法では、 上記工程（1)及び (2)に続けて以下の工程（7)を 含む。
(7)保温後のそれぞれの細胞破砕液中のある特定の蛋白質を検出し、 対照細胞破 砕液と比較したときに、 細胞破砕液（a)では該蛋白質の量が減少しており、 細胞 破砕液 (b)ではその量の減少が阻害されることを検出する。 実施例
以下、 本発明を実施例によりさらに具体的に例示するが、 本発明の範囲は実施 例によって限定されるものではない。
以下の実施例においては薬物として UC S 1 5 Aを用いた。 この薬物は、 スト レブトマイセス属放線菌の培養液中から単離され、 骨吸収抑制作用を有する物質 (特開平 8— 26 88 88号公報） であり、 S I— 42 2 8 (特公昭 6 2— 2 8 9 5 9号公報） として報告されていた物質と同一の物質である。 UC S 1 5Aは 骨吸収抑制作用の他、 殺菌作用 （特開昭 5 8— 1 1 6 6 8 6号公報、 特開昭 6 3 - 2 2 5 8 3号公報） 、 免疫抑制作用 （特開昭 6 1— 2 9 39 20号公報） 、 抗 腫瘍活性 （特開昭 6 3 -48 2 1 3号公報） 等の多様な作用を有する物質である 1 その作用機構及び標的蛋白質は不明であった。 最近、 UC S 1 5Aが、 チロ シンキナーゼ s r cの情報伝達を阻害するが、 s r cの酵素活 '性自体は阻害しな いこと、 さらに s r cと s r cの基質として知られている S a m68の結合を特 異的に阻害することが報告された [Sharma SV et al. , Oncogene, 20, 2068 (2001)] 。 このことは、 UC S 1 5 Aの標的蛋白質の一つが S a m 6 8であるこ とを強く示唆するものである。
( 1 ) 細胞破碎液の調製
ヒ ト大腸癌細胞株 HCT 1 1 6 ( 丁じ。番号じじ1^— 24 7) を 1 0%ゥシ 胎児 jfiL清を含むダルベッコ変法イーグル培地 （Dulbecco' s modification of Eagle' s medium; DMEM) を用いて、 3 7°C、 5 % C O 2条件の C O 2インキ ュベータ—で細胞培養用 loo mm径ディッシュに培養し、 3日ごとに 1 5ず つに分けて継代して増殖させた。 継代して 3日目の HCT 1 1 6細胞ディッシュ 3枚分に対し、 培地を取り除き、 1 OmLの氷冷した P B Sを加えてから取り除 くことにより細胞を洗浄した。 この細胞に、 低浸透圧である R S B ( 1 Ommo l ZLトリスー塩酸 pH 7. 6、 l Omm o l ZL N a C l、 1. 5mm o 1 ZL Mg C 1 2) 1 OmLを加えた。 氷上に 1 0分間置き、 細胞を膨張させ た後、 細胞をディッシュからはがして、 RB Sごと 1 5 mL容量のダウンス 'ホ モゲナイザーにいれた。 ホモゲナイザーのすりつぶし棒を 5 0往復させて細胞を 破砕した。 この細胞破砕液を 4 °C、 1 5、 0 0 0 r p mで 3 0分間遠心分離し、 上清を回収し、 1 mLずつ 1 0本に分けた。
(2) UC S 1 5 Aのプロテアーゼ分解アツセィ
UC S 1 5 Aは特開昭 5 8 - 1 1 6 6 8 6号公報の記載に基づきストレプ卜マ イセス属放線菌より単離精製し、 l Omm o 1 /Lの濃度のジメチルスルホキシ ド （DM S O) 溶液を調製した。 UC S 1 5 Aを （1 ) で調製した HCT 1 1 6 細胞破砕液 1 0本にそれぞれ、 終濃度 0 (DMS Oのみ） 、 2 5、 5 0、 7 5、
1 0 0、 1 5 0、 2 0 0、 2 2 5、 2 5 0及び 3 0 0 m o 1 になるように 添カ卩した。 なお、 添加する UC S 1 5 Aはあらかじめ DMS Oで希釈し、 添加す る DMS Oの量はどれも同じになるようにした。
UC S 1 5 Aを添カ卩した細胞破砕液を、 回転培養機でゆるやかに回転させなが ら 3 7°Cで 1 2時間保温して、 細胞内在性プロテアーゼを反応させた。 反応後の 細胞破砕液それぞれに 3 3 3 μ Lの 4 X濃度のレムリのサンプノレバッファーを添 加し、 よく混合させた後、 1 00°Cで 1 0分間加熱した。 この 20 /z Lをそれぞ れ 8. 5%ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動に供した。 電気泳動後のゲルをクマ ジー♦ブリ リアント ·ブルー （Coomassie brilliant blue; ナカライテスク株式 会社製） で染色した。 その結果を第 1図 （左図） に示したが、 UCS 1 5Aの濃 度が上昇するとともに量が減少しているいくつかの蛋白質が観察された。
(3) ウェスタンプロッ トによる S a m68の検出
以下のようにしてウェスタンブロットにより細胞破砕液中の S a m68を検出 した。 まず、 上記 （2) の電気泳動後のゲルから蛋白質を孔径 0. 45 μιηの二 トロセルロース膜 〔プロ トラン （Protran) ； シユライシャ一 ' アンド ' シユエ ル （Schleicher and Schuell) 社製〕 にブロットした。 膜に 0. 25%ゼラチン と 0. 2%Tw e e n— 20を含む PB S (以下 P B S—TGとよぶ。 ） を乗せ て 4 °Cで一晩置いて非特異的結合をプロックした後、 まず一次抗体として PB S — TGで 1 ： 1 000に希釈したゥサギ抗 S a m6 8ポリクロ一ナル抗体 〔サン タ · クルズ （Santa Cruz) 社製〕 を 2時間反応させた。 0. 2%Twe e n— 2 0を含む P B S (以下 PB S _Tとよぶ） で洗浄した後、 次に二次抗体として Ρ B S— TGで 1 ： 4000に希釈したホース ·ラディッシュ ·パーォキシダ一ゼ (HRP) 結合ャギ抗ゥサギ I g G抗体 〔アマシャム ' フアルマシア 'バイオテ ク （Amersham Pharmacia Biotech) 社製〕 を 1時間反応させた。 検出は EC L試 薬 （アマシャム ' フアルマシア ·バイオテク社製） を用いた化学発光により行つ た。 その結果、 第 1図 （右図） に示すように UCS 1 5 Aの濃度が上昇するとと もに細胞破砕液中の S a m6 8の量が減少していることが確認された。
(4) プロテア一ゼ阻害剤の効果
(3) の S am6 8の量の減少がプロテアーゼによる分解によるものであるこ とを、 以下に示すプロテアーゼ阻害剤の添加により確認した。
(2) に記載したプロテアーゼ分解アツセィの際に、 UC S 1 5Aと共に広範 囲のプロテアーゼを阻害できるプロテアーゼ阻害剤カクテル 〔コンプリート
(Complete) ； ロシュ （Roche) 社製〕 を添加して同様に反応を行い、 電気泳動 後、 （3) と同様にしてウェスタンプロットによる S a m68の検出を行った。 阻害剤の添加条件等は試薬に付属するメーカ一のマニュアルに従った。 その結果、 図 2に示すように、 プロテアーゼ阻害剤の添加により細胞破砕液中の S am68 の量の減少は抑えられた。 したがって、 S am68の量の減少はプロテアーゼに よる分解であることが確認され、 S am68は UCS 1 5 A存在下で内在性プロ テアーゼに感受性になることが確認された。
なお、 第 2図のプロテアーゼ阻害剤存在下と非存在下でのゥヱスタンブロット は両者とも同量の細胞破砕液を使用し、 検出のための感光時間も同一で行ったが、 両者のレーン 2を比較すると、 UC S 1 5 Aを添加しなかった場合は、 37でで 12時間保温しても、 プロテアーゼ阻害剤の非存在下での S a m68の蛋白質量 は、 プロテアーゼ阻害剤存在下での S am68の蛋白質量と変わらなかった。 し たがって、 S am68は内在性プロテアーゼに対して元来非常に安定な蛋白質で あることがわかった。 産業上の利用可能性
本発明の方法によれば、 簡便かつ正確に薬物の標的蛋白質を決定できる。 該方 法は、 新たな薬物の探索や見出された薬物の評価、 副作用の分離等の医薬の創製 のための手段として極めて有用である。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 薬物の標的蛋白質を決定する方法であって、 薬物の存在下においてプロテア ーゼ感受性が上昇する蛋白質を該薬物の標的蛋白質であると判定する工程を含む 方法。
2 . 細胞破砕液に含まれる蛋白質のなかから薬物の存在下においてプロテアーゼ 感受性が上昇する蛋白質を選択する工程を含む請求の範囲第 1項に記載の方法。
3 . プロテアーゼとして細胞の内在性プロテアーゼを用いる請求の範囲第 1項又 は第 2項に記載の方法。
4 . プロテアーゼとして外来性プロテアーゼをさらに添加する工程を含む請求の 範囲第 1項ないし第 3項のいずれか 1項に記載の方法。
5 . プロテアーゼ感受性の上昇を該蛋白質の分解量の上昇として検出する請求の 範囲第 1項ないし第 4項のいずれか 1項に記載の方法。
6 . プロテアーゼ阻害剤の存在下において該蛋白質の分解量の上昇の抑制を検出 する工程をさらに含む請求の範囲第 5項に記載の方法。
7 . アクリルアミ ドゲル電気泳動を用いて蛋白質の量の変化を検出する請求の範 囲第 5項又は第 6項に記載の方法。
8 . アクリルアミ ドゲル電気泳動が S D S—ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動又 は二次元電気泳動である請求の範囲第 7項に記載の方法。
9 . 選択された蛋白質を同定する工程を含む請求の範囲第 1項ないし第 8項のい ずれか 1項に記載の方法。
1 0 . 選択された蛋白質を単離して同定する工程を含む請求の範囲第 9項に記載 の方法。
1 1 . 該蛋白質を検出する工程を含む請求の範囲第 1項ないし第 8項のいずれか 1項に記載の方法。
1 2 . 該蛋白質を認識する抗体を用いて検出を行う請求の範囲第 1 1項に記載の 方法。
1 3. ウェスタンプロット、 ドットプロット、 酵素免疫測定法、 又は放射性免疫 測定法により検出を行う請求の範囲第 1 2項に記載の方法。
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