JP6502854B2 - ポリユビキチン化基質の同定方法 - Google Patents

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Description

本発明は、ポリユビキチン化基質を効率よく同定するための方法に関する。
ユビキチンは全ての真核生物に存在する７６アミノ酸からなるタンパク質である。Ｅ１（ユビキチン活性化酵素）／Ｅ２（ユビキチン結合酵素）／Ｅ３（ユビキチンリガーゼ）の３種類の酵素群の働きにより、ユビキチンのＣ末端のグリシン残基が、基質タンパク質の主にリジン残基にイソペプチド結合する。多くの場合、ユビキチンにさらにユビキチンが連結したポリユビキチン鎖が形成され、様々な翻訳後修飾因子として機能する（例えば、非特許文献１又は２参照）。ポリユビキチン鎖の生体内機能として最も良く知られている例としては、ポリユビキチン鎖を目印としたプロテアソームによる選択的分解系「ユビキチンープロテアソームシステム」がある。この系において重要なのは、どのタンパク質をどのタイミングで分解するかという基質の選択性であるが、その選択性を担っているのがユビキチンリガーゼである。
ヒトの遺伝子には約６００種類のユビキチンリガーゼがコードされているにもかかわらず、基質が判明しているものはごくわずかである。また、基質が判明しているユビキチンリガーゼであっても、新たな基質が見つかる可能性も十分に考えられる。ユビキチンリガーゼの基質を網羅的かつ高感度に探索できる技術の開発は、広範な生命現象の制御に関わるユビキチン化を理解する上でも重要である。
これまでユビキチン化タンパク質を同定するアプローチとしては、（１）エピトープタグを付けたユビキチンを培養細胞に過剰発現させタグ抗体で免疫沈降したタンパク質を質量分析により網羅的解析を行う方法、（２）ユビキチンリガーゼ活性を持たない変異型ユビキチンリガーゼを発現させ、結合タンパク質の網羅的解析を行う方法、などの方法がとられてきた。前記（１）の方法では、同定されたユビキチン化タンパク質は非常に限られたものであった。これは、ユビキチンの過剰発現に問題があるためと推察される。また、前記（２）の方法では、基質ではない結合タンパク質も多く同定されてしまうため、基質の同定法として効率がよくない。その他、ポリユビキチン鎖に対するアフィニティープローブとして、ユビキチン会合（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ、ＵＢＡ）ドメインが４つ融合したＴａｎｄｅｍ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｅｎｔｉｔｉｅｓ（ＴＵＢＥ）が報告されている（例えば、非特許文献３参照）。
一方で、最近、抗ｄｉＧｌｙ抗体が開発され、ユビキチン化タンパク質の同定に威力を発揮している（例えば、非特許文献４参照）。プロテオーム解析を行う際に一般的な方法としては、サンプルのタンパク質をトリプシン消化したペプチドを質量分析する方法が挙げられる。トリプシンは、リジンとアルギニンのＣ末端を切断するが、ユビキチン化タンパク質をトリプシン消化すると、ユビキチン化サイトであるリジン残基に２つのグリシン残基（ｄｉＧｌｙ）がイソペプチド結合した配列（ユビキチンシグニチャー）をもつユニークなペプチドが生じる。このユビキチンシグニチャーを認識する抗体が抗ｄｉＧｌｙ抗体である。
Komander and Rape，Annual review of biochemistry，2012，vol.81，p.203−229. Grabbe, et al.，Nature reviews. Molecular cell biology，2011，vol.12，p.295−307. Hjerpe，et al.，EMBO reports，2009，vol.10，p.1250−1258. Kim, et al. Molecular Cell，2011，vol.44，p.325−340. Frescas and Pagano，Nature Reviews Cancer，2008，vol.8，p.438−449.
生体内において、ポリユビキチン化されたタンパク質は、プロテアソームにより速やかに分解されるため、一般的にポリユビキチン化蛋白質の同定は困難である。また、ポリユビキチン鎖は脱ユビキチン化酵素により速やかに取り除かれてしまうため（脱ユビキチン化反応）、たとえタンパク質分解を受けないとしても、免疫沈降などでは単離しにくい。これらの理由により、従来の方法では、ユビキチン化基質の同定は困難であった。
本発明は、一般的に同定が困難なポリユビキチン化基質を、効率よく同定するための方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、トリプシン抵抗性ポリユビキチン鎖結合タンパク質（トリプシン抵抗性ポリユビキチン鎖プローブ）を細胞内に発現させることにより、基質タンパク質のポリユビキチン化状態を安定化させることが可能であることを見出した。さらに、トリプシン抵抗性ポリユビキチン鎖プローブとユビキチンリガーゼを細胞内に共発現させることにより、当該ユビキチンリガーゼによりポリユビキチン化される基質を、当該細胞内から効率よく分離して同定可能であることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明に係るポリユビキチン化基質の同定方法は、下記［１］〜［８］である。
［１］（１）細胞内、又は細胞抽出液中において、トリプシン耐性ポリユビキチン鎖結合タンパク質とユビキチンリガーゼを発現させる工程；（２）前記工程（１）後の前記細胞又は前記細胞抽出液から、前記トリプシン耐性ポリユビキチン鎖結合タンパク質を含有する複合体を分離する工程；（３）前記工程（２）により分離された複合体を、トリプシン消化する工程；及び（４）前記工程（３）により得られた消化物中から、ユビキチン化サイトを含むペプチドを同定する工程；を有する、ポリユビキチン化基質の同定方法。
［２］さらに、（１’）前記細胞と同種の別個の細胞内、又は前記細胞抽出液と同種で別個に調製した細胞抽出液において、前記トリプシン耐性ポリユビキチン鎖結合タンパク質と、前記ユビキチンリガーゼのユビキチンリガーゼ活性領域を欠損させたドミナントネガティブ変異体を発現させる工程；（２’）前記工程（１’）後の前記細胞又は前記細胞抽出液から、前記トリプシン耐性ポリユビキチン鎖結合タンパク質を含有する複合体を分離する工程；（３’）前記工程（２’）により分離された複合体を、トリプシン消化する工程；（４’）前記工程（３’）により得られた消化物中から、ユビキチン化サイトを含むペプチドを同定する工程；及び（５）前記工程（４）において同定されたペプチドであり、かつ前記工程（４’）において同定されなかったペプチドを、ポリユビキチン化基質に含まれるペプチドであると判断する工程；を有する、前記［１］のポリユビキチン化基質の同定方法。
［３］前記トリプシン耐性ポリユビキチン鎖結合タンパク質が、リンカーにより連結されている２以上のユビキチン結合ドメインを含む、前記［１］又は［２］のポリユビキチン化基質の同定方法。
［４］前記トリプシン耐性ポリユビキチン鎖結合タンパク質が、４〜８のユビキチン結合ドメインを含む、前記［３］のポリユビキチン化基質の同定方法。
［５］前記ユビキチン結合ドメインが、配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち、１８〜７１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる、前記［３］又は［４］のポリユビキチン化基質の同定方法。
［６］前記トリプシン耐性ポリユビキチン鎖結合タンパク質が、ポリユビキチン鎖との結合部位に加えて、タグ部分を有しており、前記工程（２）において、前記複合体を、前記トリプシン耐性ポリユビキチン鎖結合タンパク質中の前記タグ部分と特異的に結合する抗体又はリガンドを用いた免疫反応を利用して分離する、前記［１］〜［５］のいずれかのポリユビキチン化基質の同定方法。
［７］前記工程（４）が、前記消化工程により得られた消化物中から、ユビキチン化サイトを含むペプチドを選択的に分離回収した後、同定する工程である、前記［１］〜［６］のいずれかのポリユビキチン化基質の同定方法。
［８］抗ｄｉＧｌｙ抗体を用いて、ユビキチン化サイトを含むペプチドを選択的に分離回収する、前記［７］のポリユビキチン化基質の同定方法。
本発明に係るポリユビキチン化基質の同定方法においては、トリプシン抵抗性ポリユビキチン鎖プローブを用いることにより、プロテアソームによる分解等によって一般的には細胞内から安定して分離することが困難なポリユビキチン化基質を、ポリユビキチン鎖と結合した状態で安定して分離することができる。この安定して分離したポリユビキチン化基質のアミノ酸配列を調べることにより、ポリユビキチン化基質を従来法よりもはるかに効率的に同定することができる。
ユビキチンリガーゼとトリプシン抵抗性ポリユビキチン鎖プローブとを細胞内で共発現させたときに、ポリユビキチン化蛋白質が、トリプシン抵抗性ポリユビキチン鎖プローブ（ＴＲ-ＰＵＢＰ）により保護されて、脱ユビキチン酵素（ＤＵＢ）及び２６Ｓプロテアソームによる分解から守られる態様を模式的に示した図である。 図１ＡのＴＲ-ＰＵＢＰが結合したポリユビキチン化蛋白質を、抗ＦＬＡＧ抗体による免疫沈降によって分離する態様を模式的に示す図である。 図１Ｂの免疫沈降によって分離したポリユビキチン化蛋白質をトリプシン消化にかけた状態を示す模式図である。 図１Ｃでトリプシン消化にかけたポリユビキチン化蛋白質消化物から、ＬＣ-ＭＳにより、ユビキチン化サイトを含むペプチドを選択的に分離回収する工程を模式的に示した図である。 参考例１で用いたＦｌａｇ−ＴＲ−ＰＵＢＰ１のアミノ酸配列（配列番号１）及びこれをコードするＤＮＡ配列（配列番号２）を示した図である。 参考例１において、各サンプルの全細胞抽出液（図中、「ＷＣＬ」）及び抗Ｆｌａｇ抗体免疫沈降物溶液（図中、「ＩＰ：αＦｌａｇ」）について、抗Flag抗体、又は抗ユビキチン抗体でウエスタンブロッティングを行った結果を示す図である。 参考例１において、各サンプルの全細胞抽出液（図中、「ＷＣＬ」）及び抗Ｆｌａｇ抗体免疫沈降物溶液（図中、「ＩＰ：αＦｌａｇ」）について、抗ＣＤＫＮ１Ｂ抗体でウエスタンブロッティングを行った結果を示す図である。 参考例２において、ＴＲ-ＰＵＢＰとＳｋｐ２又はそのドミナントネガティブ変異体との共発現物の、抗Ｆｌａｇ抗体免疫沈降物溶液について、抗ＣＤＫＮ１Ｂ抗体、抗ＣＤＴ１抗体、抗ＣＤＫ２抗体、及び抗ＨＡ抗体でウエスタンブロッティングを行った結果を示す。 参考例２において、ＴＲ-ＰＵＢＰとＦｂｗ７又はそのドミナントネガティブ変異体との共発現物の、抗Ｆｌａｇ抗体免疫沈降物溶液について、抗Ｍｙｃ抗体、及び抗ＨＡ抗体でウエスタンブロッティングを行った結果を示す。 参考例２において、ＴＲ-ＰＵＢＰとＦｂｗ1又はそのドミナントネガティブ変異体との共発現物の、抗Ｆｌａｇ抗体免疫沈降物溶液について、抗ＮＦＫＢＩＡ抗体でウエスタンブロッティングを行った結果を示す。 参考例２において、ＴＲ-ＰＵＢＰとＦｂｗ1又はそのドミナントネガティブ変異体との共発現物の、抗Ｆｌａｇ抗体免疫沈降物溶液について、抗ＰＤＣＤ４抗体でウエスタンブロッティングを行った結果を示す。 参考例２において、ＴＲ-ＰＵＢＰとＭＤＭ２との共発現物の、抗Ｆｌａｇ抗体免疫沈降物溶液について、抗ｐ５３抗体でウエスタンブロッティングを行った結果を示す。 実施例１において、ＣＤＴ１のｄｉＧｌｙ配列を含むペプチドの定量解析結果を示した図である。 実施例１において、ＣＤＫＮ１ＢのｄｉＧｌｙ配列を含むペプチドの定量解析結果を示した図である。 実施例１において、ＣＤＫＮ１ＡのｄｉＧｌｙ配列を含むペプチドの定量解析結果を示した図である。 実施例２において、ＴＡＲＳ及びＥＩＤ１のｄｉＧｌｙ配列を含むペプチドの定量解析結果を示した図である。
本発明に係るポリユビキチン化基質の同定方法（以下、「本発明に係る同定方法」ということがある）は、特定のユビキチンリガーゼ（以下、「標的ユビキチンリガーゼ」ということがある）によりポリユビキチン化される基質を同定する方法であって、細胞内、又は細胞抽出液中において標的ユビキチンリガーゼとトリプシン耐性ポリユビキチン鎖結合タンパク質（トリプシン抵抗性ポリユビキチン鎖プローブ、ＴＲ−ＰＵＢＰ）を共発現させることを特徴とする。両タンパク質を共発現させた細胞又は細胞抽出液から、ポリユビキチン化されたタンパク質とＴＲ−ＰＵＢＰとの複合体を分離回収した後、当該ポリユビキチン化されたタンパク質を、発現させた標的ユビキチンリガーゼのポリユビキチン化基質として同定する。本発明に係る同定方法においては、細胞内又は細胞抽出液中に、基質を同定する対象である標的ユビキチンリガーゼを発現させることにより、当該ユビキチンリガーゼの基質タンパク質のポリユビキチン化が促進される結果、より多量のポリユビキチン化基質／ＴＲ−ＰＵＢＰ複合体を分離回収することができるため、効率よくポリユビキチン化基質を同定できる。また、ＴＲ−ＰＵＢＰも共発現させることにより、標的ユビキチンリガーゼを発現させた細胞又は細胞抽出液から、当該ユビキチンリガーゼによりポリユビキチン化された基質を、ポリユビキチン化状態を保持したまま安定して分離することができる。
具体的には、本発明に係る同定方法は、下記工程（１）〜（４）を有する：
（１）細胞内、又は細胞抽出液中において、ＴＲ−ＰＵＢＰとユビキチンリガーゼを発現させる工程；
（２）前記工程（１）後の前記細胞又は前記細胞抽出液から、前記ＴＲ−ＰＵＢＰを含有する複合体を分離する工程；
（３）前記工程（２）により分離された複合体を、トリプシン消化する工程；及び
（４）前記工程（３）により得られた消化物中から、ユビキチン化サイトを含むペプチドを同定する工程。
本発明に係る同定方法は、まず、工程（１）において、基質を同定する対象の標的ユビキチンリガーゼを、ＴＲ−ＰＵＢＰと共に細胞内又は細胞抽出液中に共発現させる。標的ユビキチンリガーゼとしては、ユビキチンリガーゼ活性を有することが確認されているタンパク質であってもよく、ユビキチンリガーゼ活性を有するか否かは確認されていないが、アミノ酸配列等からユビキチンリガーゼ活性を有することが推定されるタンパク質であってもよい。
本発明において用いられるＴＲ−ＰＵＢＰとしては、少なくとも１のトリプシン抵抗性ユビキチン結合ドメイン（ＴＲ−ＵＢＤ）を含有するタンパク質であればよいＴＲ−ＵＢＤは、ユビキチン結合能を保持したまま、トリプシン消化を受けるアルギニンやリジンといった塩基性アミノ酸を欠失又はその他のアミノ酸に置換させたドメインである。本発明において用いられるＴＲ−ＰＵＢＰとしては、２以上のＴＲ−ＵＢＤを含むものが好ましく、４以上のＴＲ−ＵＢＤを含むものがより好ましく、４〜８のＴＲ−ＵＢＤを含むものがさらに好ましい。また、２以上のＴＲ−ＵＢＤを有する場合、全てのＴＲ−ＵＢＤが同種（同一のアミノ酸配列）であってもよく、複数のＴＲ−ＵＢＤを有していてもよい。
ＴＲ−ＰＵＢＰが有するＴＲ−ＵＢＤとしては、ユビキチンとの結合能を有するドメインであれば特に限定されるものではなく、例えば、ＵＢＡ（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）ドメイン、ＵＩＭ（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ Ｍｏｔｉｆ）、ＭＩＵ（Ｍｏｔｉｆ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｗｉｔｈ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）ドメイン、ＤＵＩＭ （ｄｏｕｂｌｅ−ｓｉｄｅｄ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｍｏｔｉｆ）、ＣＵＥ（ｃｏｕｐｌｉｎｇｏｆ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｔｏ ＥＲ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）ドメイン、ＮＺＦ（Ｎｐ１４ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ）、Ａ２０ ＺｎＦ（ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ）、ＵＢＰ ＺｎＦ（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ）、ＵＢＺ（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ）、ＵＥＶ（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ Ｅ２ ｖａｒｉａｎｔ）、ＰＦＵ（ＰＬＡＡ ｆａｍｉｌｙ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ）、ＧＬＵＥ（ＧＲＡＭ−ｌｉｋｅ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｉｎ ＥＡＰ４５）、ＧＡＴ（Ｇｏｌｇｉ−ｌｏｃａｌｉｚｅｄ，Ｇａｍｍａ−ｅａｒ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ，Ａｒｆ−ｂｉｎｄｉｎｇ）、Ｊａｂ／ＭＰＮ（Ｊｕｎ ｋｉｎａｓｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ／Ｍｐｒ１ｐ ａｎｄ Ｐａｄ１ｐ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎｉ）、ＵＢＭ （Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｔｉｆ）、及びＵｂｃ（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ）等のＵＢＤについて、塩基性アミノ酸を欠失若しくは置換したものを用いることができる。
ＴＲ−ＰＵＢＰが２以上のＴＲ−ＵＢＤを有する場合、各ＴＲ−ＵＢＤは、直接連結されていてもよいが、フレキシブルなリンカーによって連結されているほうが好ましい。また、ＴＲ−ＰＵＢＰが３以上のＴＲ−ＵＢＤを有し、２以上のリンカーを有する場合、全てのリンカーのアミノ酸配列が同一であってもよく、互いに異なっていてもよい。当該リンカーのアミノ酸配列としては、例えば、ポリグリシン配列やポリセリン配列、ポリグリシン配列中の１又は数個のグリシン残基がセリン、スレオニン、アラニン、プロリン、バリン、グルタミン酸等により置換されている配列、ポリセリン配列中の１又は数個のセリン残基がグリシン、スレオニン、アラニン、プロリン、バリン、グルタミン酸等により置換されている配列等が挙げられる。また、当該リンカーのアミノ酸残基長としては、２以上であればよいが、５以上が好ましく、５〜４０がより好ましく、５〜２０がよりさらに好ましい。
本発明において用いられるＴＲ−ＰＵＢＰとしては、ポリユビキチン鎖との結合部位（ＴＲ−ＵＢＤ及びリンカーからなる領域）のみからなるものであってもよいが、さらにタグ部分を有していることが好ましい。タグ部分は、ポリユビキチン鎖との結合部位のＮ末端側にあってもよく、Ｃ末端側にあってもよい。タグ部分とポリユビキチン鎖との結合部位は、直接連結していてもよく、適当なリンカーにより連結されていてもよい。ＴＲ−ＰＵＢＰがタグ部分を有している場合、当該タグ部分と特異的に結合する抗体又はリガンドを用いた免疫反応を利用することにより、ポリユビキチン化基質とＴＲ−ＰＵＢＰとの複合体をより簡便に細胞のその他の成分から分離して回収することができる。
当該タグ部分としては、一般的にタンパク質に設けられるタグの中から、適宜選択して用いることができる。当該タグとしては、例えば、Ｆｌａｇタグ、ＨＡ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）タグ、Ｈｉｓタグ、Ｍｙｃタグ等のポリペプチドタグ、ビオチン、グルタチオン、ＤＮＰ（ｄｉｎｉｔｏｒｏｐｈｅｎｏｌ）、ジゴキシゲニン、ジゴキシン、ＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ)、ＭＢＰ（マルトース結合タンパク質）、アビジン、ストレプトアビジン等が挙げられるが、これらには限定されない。
工程（１）において、標的ユビキチンリガーゼとＴＲ−ＰＵＢＰを共発現させる細胞としては、当該標的ユビキチンリガーゼによりポリユビキチン鎖が合成され得るユビキチンが発現しており、独自の発現系が機能している細胞であれば特に限定されるものではなく、大腸菌、枯草菌等の原核細胞（細菌）であってもよく、酵母、糸状菌、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞であってもよい。また、生物から採取して培養した細胞であってもよく、培養細胞株等の人工的に調製された細胞であってもよい。また、工程（１）において標的ユビキチンリガーゼとＴＲ−ＰＵＢＰを共発現させる細胞抽出液としては、コムギ胚芽由来、大腸菌由来、ウサギ網状赤血球由来、昆虫細胞由来の合成系等を用いることができる。
細胞内、細胞抽出液中における標的ユビキチンリガーゼとＴＲ−ＰＵＢＰの共発現は、各タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む発現用ベクターを細胞内へ導入することにより行うことができる。発現用ベクターとしては、プラスミドベクター、ウィルスベクター、コスミドベクター、ＢＡＣベクター、λファージベクター等が知られており、導入する細胞種に応じて、当該技術分野において公知のベクターの中から適宜選択して用いることができる。また、公知のベクターを遺伝子組換え技術等により改変したものであってもよい。発現用ベクターへの各タンパク質をコードするＤＮＡ配列の組み込みは、公知の遺伝子組換え技術を用いて、常法により行うことができる。
発現用ベクターを細胞内へ導入する方法も、当該技術分野において公知の方法の中から、発現用ベクターの種類や細胞の種類等を考慮して適宜選択して行うことができる。具体的には、プラスミドベクターを細胞に導入する方法としては、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等が挙げられる。また、市販のベクター導入試薬を用いてもよい。
次いで、工程（２）として、工程（１）において標的ユビキチンリガーゼとＴＲ−ＰＵＢＰを共発現させた細胞又は細胞抽出液から、ＴＲ−ＰＵＢＰを含有する複合体を分離する。具体的には、例えば、当該細胞を可溶化して得られた細胞抽出液、又は工程（１）後の当該細胞抽出液を、ＴＲ−ＰＵＢＰと特異的に結合する部位を有する固相担体に接触させた後、固液分離処理を行うことにより、ＴＲ−ＰＵＢＰを含有する複合体を固相担体と結合させた状態で、その他の細胞由来成分と分離することができる。ＴＲ−ＰＵＢＰが前記タグ部分を有している場合には、当該タグ部分と特異的に結合する抗体又はリガンドが直接若しくは間接的に結合した固相担体を細胞抽出液に添加してインキュベートした後、遠心分離処理等により固液分離処理を行うことができる。当該固相担体としては、磁性ビーズ、非磁性ビーズ、メンブレンフィルター等が挙げられる。なお、タグ部分と特異的に結合する抗体等としては、物理的又は化学的性質が当該タグ部分と類似した他の物質に対する結合よりも、当該タグ部分と優先的に結合するものであればよく、当該タグ部分以外の物質と全く結合しないものである必要はない。
その後、工程（３）として、前記工程（２）により分離された複合体をトリプシン消化する。トリプシン消化により、ＴＲ−ＵＢＤに結合しているポリユビキチン鎖は分解されないが、ポリユビキチン鎖が結合していた基質は断片化される。これにより、ユビキチン化サイトであるリジン残基（ユビキチンが付加していた場所）にｄｉＧｌｙを有するユビキチンシグニチャー配列を有するポリペプチドが産生される。つまり、ユビキチン化サイトは、トリプシン消化物によりｄｉＧｌｙが結合したリジン残基となる。
最後に、工程（４）として、工程（３）により得られた消化物中から、ユビキチン化サイト（ｄｉＧｌｙが結合したリジン残基）を含むペプチドを同定する。当該ペプチドの同定方法としては、特に限定されるものではなく、質量分析法等のペプチドのアミノ酸配列を同定する際に一般的に用いられる方法の中から適宜選択して用いることができる。
トリプシン消化物には、ユビキチン化サイトを含まないペプチドも多数存在している。このため、各ペプチドを質量分析等のプロテオーム解析により同定する前に、トリプシン消化物中からユビキチン化サイトを含むペプチドを選択的に分離回収しておくほうが、効率よくユビキチン化サイトを含むペプチドを同定することができる。ユビキチン化サイトを含むペプチドの分離回収は、例えば、抗ｄｉＧｌｙ抗体を用いた免疫反応を利用して行うことが好ましい。
図１Ａ〜図１Ｄに、本発明に係る同定方法のうち、抗ｄｉＧｌｙ抗体を用いてトリプシン消化物からユビキチン化サイトを含むペプチドを選択的に分離回収する処理を含む一態様の概略を示す。まず、細胞１内に、ユビキチンリガーゼ２とＦｌａｇタグ付ＴＲ−ＰＵＢＰ３を共発現させる（図１Ａ 工程１）。ユビキチンリガーゼ２により基質４がポリユビキチン化する。形成されたポリユビキチン鎖にＦｌａｇタグ付ＴＲ−ＰＵＢＰ３が結合するため、当該ポリユビキチン鎖は脱ユビキチン化酵素（ＤＵＢ）５や２６Ｓプロテアソーム６による分解を受けず、安定して存在する。次いで、当該細胞を可溶化して調製された細胞抽出液に、ビーズ８と結合した抗Ｆｌａｇ抗体７を添加し、抗Ｆｌａｇ抗体による免疫沈降反応により、ユビキチン化基質を分離する（図１Ｂ 工程２）。その後、トリプシン消化を行うことにより、ユビキチン化サイト（ｄｉＧｌｙを含むリジン残基）を含むペプチド９が産生される（図１Ｃ 工程３）。抗ｄｉＧｌｙ抗体１１を用いて、このユビキチン化サイトを含むペプチド９を、ユビキチン化サイトを含まないペプチド１０から分離して回収する（図１Ｄ 工程４）。この精製（濃縮）されたユビキチン化サイトを含むペプチド９を、ＬＣ−ＭＳ（液体クロマトグラフィー質量分析法）により同定する（図１Ｄ 工程５）。
一般的には、細胞内には内在性のユビキチンリガーゼも含まれている。標的ユビキチンリガーゼとＴＲ−ＰＵＢＰを共発現させた細胞において、内在性のユビキチンリガーゼの活性が、標的ユビキチンリガーゼに比べて極めて小さい場合、工程（４）において同定されたユビキチン化サイトを含むペプチドの大部分は、標的ユビキチンリガーゼのポリユビキチン化基質由来のものである。一方で、内在性のユビキチンリガーゼが充分な活性を示す場合、工程（４）において同定されたユビキチン化サイトを含むペプチドには、標的ユビキチンリガーゼ以外の、内在性のユビキチンリガーゼのポリユビキチン化基質由来のものも含まれている。標的ユビキチンリガーゼのドミナントネガティブ変異体を発現させることにより、細胞に元々発現している内在性の標的ユビキチンリガーゼの活性を抑えることができる。この原理を利用して、野生型標的ユビキチンリガーゼとＴＲ−ＰＵＢＰを共発現させた場合と、当該標的ユビキチンリガーゼのドミナントネガティブ変異体とＴＲ−ＰＵＢＰを共発現させた場合とを比較することにより、当該標的ユビキチンリガーゼに対応した、内在性のユビキチンリガーゼによる影響を効果的に排除して、過剰発現させた対象の標的ユビキチンリガーゼのポリユビキチン化基質をさらに効率よく同定することができる。すなわち、ドミナントネガティブ変異体発現時に比べて野生型発現時のほうが有意に免疫沈降される量が増加するタンパク質中に、当該標的ユビキチンリガーゼのポリユビキチン化基質が含まれる。
標的ユビキチンリガーゼとＴＲ−ＰＵＢＰを共発現させた細胞から、ポリユビキチン化されたタンパク質とＴＲ−ＰＵＢＰとの複合体を分離回収した後、当該ポリユビキチン化されたタンパク質を同定する。また、これとは別個に、標的ユビキチンリガーゼのドミナントネガティブ変異体とＴＲ−ＰＵＢＰを共発現させた細胞から、ポリユビキチン化されたタンパク質とＴＲ−ＰＵＢＰとの複合体を分離回収した後、当該ポリユビキチン化されたタンパク質を同定する。該ドミナントネガティブ変異体を共発現させた細胞から分離された複合体には、該標的ユビキチンリガーゼ以外の内在性のユビキチンリガーゼによりポリユビキチン化される基質タンパク質が含まれる。このため、標的ユビキチンリガーゼを発現させた細胞から回収した複合体から同定されたペプチドのうち、該標的ユビキチンリガーゼのドミナントネガティブ体を発現させた細胞から回収した複合体からは同定されなかったペプチドが、該標的ユビキチンリガーゼのポリユビキチン化基質に含まれるペプチドである。すなわち、標的ユビキチンリガーゼを共発現させた細胞から同定されたペプチド群から、該ドミナントネガティブ変異体を共発現させた細胞から同定されたペプチド群を除いた残りのペプチドが、該標的ユビキチンリガーゼのポリユビキチン化基質に含まれるペプチドである。
具体的には、前記工程（１）〜（４）に加えてさらに、下記工程（１’）〜（４’）、及び（５）を行う：
（１’）前記細胞と同種の別個の細胞内、又は前記細胞抽出液と同種で別個に調製した細胞抽出液において、前記トリプシン耐性ポリユビキチン鎖結合タンパク質と、前記ユビキチンリガーゼのドミナントネガティブ体を発現させる工程；
（２’）前記工程（１’）後の前記細胞又は前記細胞抽出液から、前記トリプシン耐性ポリユビキチン鎖結合タンパク質を含有する複合体を分離する工程；
（３’）前記工程（２’）により分離された複合体を、トリプシン消化する工程；
（４’）前記工程（３’）により得られた消化物中から、ユビキチン化サイトを含むペプチドを同定する工程；及び
（５）前記工程（４）において同定されたペプチドであり、かつ前記工程（４’）において同定されなかったペプチドを、ポリユビキチン化基質に含まれるペプチドであると判断する工程。
標的ユビキチンリガーゼを発現させず、ＴＲ−ＰＵＢＰのみを発現させた細胞についても同様の手法によりユビキチン化サイトを含むペプチドを同定し、結果を標的ユビキチンリガーゼとＴＲ−ＰＵＢＰを共発現した細胞の結果と比較することもできる。ＴＲ−ＰＵＢＰのみを発現させた細胞において同定されたユビキチン化サイトを含むペプチドは、内在性のユビキチンリガーゼの基質のペプチド断片である可能性が高い。そこで、標的ユビキチンリガーゼとＴＲ−ＰＵＢＰを共発現した細胞からは同定されたが、ＴＲ−ＰＵＢＰのみを発現させた細胞からは同定されなかったユビキチン化サイトを含むペプチドを、当該細胞に過剰発現させた対象の標的ユビキチンリガーゼの基質のペプチド断片であると同定することができる。
また、前記で述べたように、ＴＲ−ＰＵＢＰと複合体を形成させることにより、ポリユビキチン化基質を、ポリユビキチン化状態を保持したまま安定して分離・回収することができる。このため、ＴＲ−ＰＵＢＰは、ポリユビキチン化基質のスクリーニングにも有用である。例えば、本発明に係る同定方法のうち、前記工程（１）及び（２）を行うことによって、細胞内からポリユビキチン化基質をスクリーニングすることができる。また、本発明に係る同定方法自体を、ポリユビキチン化基質のスクリーニングに、ひいてはユビキチン関連疾患の治療薬の候補化合物のスクリーニングに用いることもできる。
なお、前記工程（１）及び（１’）をin vitroの系において行った場合でも、ユビキチンリガーゼとＴＲ−ＰＵＢＰを用いて同様にしてポリユビキチン化基質を同定することができる。例えば、反応溶液中に、ユビキチン等を含む細胞抽出液と、ユビキチンリガーゼ又はそのドミナントネガティブ変異体と、ＴＲ−ＰＵＢＰとを添加してインキュベートすることにより、基質のポリユビキチン化をさせ、ポリユビキチン化された基質とＴＲ−ＰＵＢＰの複合体を形成させる。該複合体を含む反応溶液に対して前記工程（２）〜（４）、又は、前記工程（２）〜（４）及び前記工程（２’）〜（４’）を行うことにより、該ユビキチンリガーゼのポリユビキチン化基質を同定することができる。
次に実施例及び参考例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例等に限定されるものではない。
［参考例１］
＜Ｆｌａｇ−ＴＲ−ＰＵＢＰ１発現ベクターの作製＞
ＵＢＱＬＮ１（ＮＣＢＩのアクセッション番号：Ｑ９ＵＭＸ０）のＵＢＡドメインには３つのアルギニン残基が存在し、トリプシンによる消化を受ける。そこで、当該ＵＢＡドメインのアルギニン残基を全てアラニン残基に置換した変異ＵＢＡドメインを、トリプシン耐性ＵＢＡ（ＴＲ−ＵＢＡ）ドメイン（ＴＲ-ＵＢＤ）として設計した。当該ＴＲ−ＵＢＡドメイン４つを互いに７アミノ酸からなるフレキシブルリンカー配列（Ｎ−ＧＧＧＳＧＧＧ−Ｃ）で連結し、さらにそのＮ末端にＦｌａｇタグを連結したタンパク質をＦｌａｇ−ＴＲ−ＰＵＢＰ１とした。当該Ｆｌａｇ−ＴＲ−ＰＵＢＰ１のアミノ酸配列（配列番号１）及びこれをコードするＤＮＡ配列（配列番号２）を図２に示す。図２中、実線四角で囲まれた領域がＴＲ−ＵＢＡドメインを示し、二点鎖線四角で囲まれた領域がＦｌａｇタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）（配列番号３）を示す。
なお、配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち、１８〜７１番目のアミノ酸残基からなる領域、８０〜１３３番目のアミノ酸残基からなる領域、１４２〜１９５番目のアミノ酸残基からなる領域、及び２０４〜２５７番目のアミノ酸残基からなる領域がＴＲ−ＵＢＤであり、７２〜７９番目のアミノ酸残基からなる領域、１３４〜１４１番目のアミノ酸残基からなる領域、及び１９６〜２０３番目のアミノ酸残基からなる領域がリンカー部分である。本発明において用いられるＴＲ−ＰＵＢＰとしては、配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち１８〜７１番目のアミノ酸残基からなるＵＢＤが２個以上リンカーを介して連結しているＴＲ−ＰＵＢＰが好ましく、さらにそのＮ末端又はＣ末端に、直接又はリンカーを介してタグが連結されたＴＲ−ＰＵＢＰがより好ましい。
Ｆｌａｇ−ＴＲ−ＰＵＢＰ１をコードするＤＮＡ配列からなるＤＮＡフラグメントを哺乳類細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３に挿入し、Ｆｌａｇ−ＴＲ−ＰＵＢＰ１発現用ベクターを作製した。
＜Ｆｌａｇ−Ｕｂ発現ベクターの作製＞
ＵＢＱＬＮ１（ＮＣＢＩのアクセッション番号：Ｑ９ＵＭＸ０）のＵＢＡドメインのＮ末端にＦｌａｇタグを連結したタンパク質（Ｆｌａｇ−Ｕｂ）をコードするＤＮＡ配列からなるＤＮＡフラグメントを哺乳類細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３に挿入し、Ｆｌａｇ−Ｕｂ発現用ベクターを作製した。
＜ＨＡ−Ｓｋｐ２発現ベクターの作製＞
ユビキチンリガーゼＳｋｐ２（ＮＣＢＩのアクセッション番号：Ｑ９Ｚ０Ｚ３）をコードするＤＮＡ配列のＮ末端にＨＡタグをコードするＤＮＡ配列を連結したＤＮＡ配列からなるＤＮＡフラグメントを哺乳類細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３に挿入し、ＨＡ−Ｓｋｐ２発現用ベクターを作製した。
＜哺乳類培養細胞へのＦｌａｇ−ＴＲ−ＰＵＢＰ１発現用ベクターのトランスフェクション＞
１０ｃｍφディッシュに１．３ｘ１０６個の２９３Ｔ細胞又はＨｅＬａ細胞を、１０容量％ウシ胎児血清を添加したダルベッコ−イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いて、３７℃のＣＯ２インキュベーター内で２４時間培養した。２９３Ｔ細胞は、３．５μｇのＦｌａｇ−ＴＲ−ＰＵＢＰ１発現用ベクターと３．５μｇのＨＡ−Ｓｋｐ２発現用ベクターを、２１μＬのＰＥＩ溶液〔１ｍｇ／ｍＬ Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎ、ｌｉｎｅａｒ(Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社製)、ｐＨ７．４〕を用いてトランスフェクションし、４８時間培養した。ＨｅＬａ細胞は、２．５μｇのＦｌａｇ−ＴＲ−ＰＵＢＰ１発現ベクターと２．５μｇのＨＡ−Ｓｋｐ２発現用ベクターを３０μＬのリポフェクトアミン、２１μＬのプラス試薬（ライフテクノロジーズ社製）を用いてトランスフェクションし、２４時間培養した。
対照として、ＨＡ−Ｓｋｐ２発現用ベクターに代えて、ＨＡタグをコードするＤＮＡ配列からなるＤＮＡフラグメントのみをｐｃＤＮＡ３に挿入したＨＡ−空ベクターを用いて、同様に２９３Ｔ細胞又はＨｅＬａ細胞にトランスフェクションし、培養した。
なお、トランスフェクションは、各サンプルについて３ディッシュずつ行い、３枚の内の２枚については、プロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２を、培養の最後の４時間に終濃度２０μＭとなるように添加して培養した。
＜哺乳類培養細胞へのＦｌａｇ−Ｕｂ発現用ベクターのトランスフェクション＞
Ｆｌａｇ−ＴＲ−ＰＵＢＰ１発現用ベクターに代えて、Ｆｌａｇ−Ｕｂ発現用ベクターを用いた以外は、前記と同様にして、２９３Ｔ細胞又はＨｅＬａ細胞にトランスフェクションし、培養した。
＜ポリユビキチン化タンパク質の分離＞
トランスフェクション後、培養した細胞の培養上清を除去し、セルスクレーパーを用いて細胞を掻き取り、１．５ｍＬ容サンプルチューブに移した後、２，０００ｒｐｍ、３分間の遠心分離処理によって細胞を集め、培地を除去した。培地除去後の細胞に１ｍＬのＰＢＳを加えて細胞を懸濁した後、２，０００ｒｐｍ、３分間の遠心分離処理によって細胞を集めて上清を除去した。回収した細胞に対して、氷冷したタンパク質抽出バッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％ＮＰ−４０、ｃｏｍｐｌｅｔｅ−ＥＤＴＡ ｆｒｅｅ（Ｒｏｃｈｅ社製））１ｍＬを添加し、ボルテックスミキサーにより激しく撹拌した後、１０分間氷上に置いた。次いで、１５，０００ｒｐｍ、２０分間の遠心分離処理を行い、上清（全細胞抽出液、ＷＣＬ）を新しい１．５ｍＬ容サンプルチューブに回収した。回収した上清の一部をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動及び銀染色用サンプルとして分取した後、残りに、６μｇのＤＤＤＫ抗体（抗Ｆｌａｇ抗体）（ＦＬＡ−１、ＭＢＬ社製）を結合させたＤｙｎａｂｅａｄｓ−ＰｒｏｔｅｉｎＧ（Ｖｅｒｉｔａｓ社製）を添加し、４℃で３０分間ローテーターを用いて穏やかに混和することにより、Ｆｌａｇタグタンパク質及びこれと結合するタンパク質を免疫沈降させた。
各サンプルのうち、プロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２を添加した２枚のディッシュのうちの１枚から調製されたＷＣＬには、ＤＤＤＫ抗体と共に脱ユビキチン化酵素阻害剤Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）を添加した。
その後、抗Ｆｌａｇ抗体による免疫沈降物が結合したビーズを、１ｍＬのＴＢＳ−Ｎ（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で３回、続いて１ｍＬの５０ｍＭ 重炭酸アンモニウムで２回洗浄した。上清を完全に除いた後、２０μＬの２００μｇ／ｍＬ Ｆｌａｇペプチド（Ｓｉｇｍａ社製）を加え、ビーズを懸濁後１０分間静置した。この際、２分おきにタッピングにより懸濁した。続いて、上清を新しい１．５ｍＬ容サンプルチューブに移した後、同様の溶出操作をさらに２回繰り返し、６０μＬの抗Ｆｌａｇ抗体免疫沈降物溶液を集めた。当該溶液のうちの１０μＬについて、分取しておいたＷＣＬサンプルと共に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行い、銀染色、ＤＤＤＫ抗体又は抗ユビキチン抗体を用いてウエスタンブロッティング、及びＳｋｐ２の基質ＣＤＫＮ１Ｂ（ＮＣＢＩのアクセッション番号：Ｐ４６５２７）に対する抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った。
ＤＤＤＫ抗体又は抗ユビキチン抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った結果を図３Ａに示す。図３Ａの左側は、全細胞抽出液を使用した結果を、図３Ａの右側は、抗Ｆｌａｇ抗体免疫沈降物溶液を使用した結果を示す。同様に、Ｓｋｐ２の基質ＣＤＫＮ１Ｂに対する抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った結果を図３Ｂに示す。図３Ｂの左側は、全細胞抽出液を使用した結果を、図３Ｂの右側は、抗Ｆｌａｇ抗体免疫沈降物溶液を使用した結果を示す。図３Ａ及び図３Ｂ中、「Ｆｌａｇ−ｔａｇｇｅｄ」の「Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ」はＦｌａｇ−Ｕｂ発現用ベクターをトランスフェクションした細胞の結果を、「ＴＲ−ＰＵＢＰ」はＦｌａｇ−ＴＲ−ＰＵＢＰ１発現用ベクターをトランスフェクションした細胞の結果をそれぞれ示し、「ＨＡ−ｔａｇｇｅｄ」の「ｅｍｐｔｙ」はＨＡ−空ベクターをトランスフェクションした細胞の結果を、「Ｓｋｐ２」はＨＡ−Ｓｋｐ２発現用ベクターをトランスフェクションした細胞の結果をそれぞれ示す。また、「ＭＧ１３２」欄及び「ＮＥＭ」欄については、「＋」が各試薬を添加したサンプルの結果を、「−」は添加しなかったサンプルの結果を示す。さらに、ブロットの下の抗体名は、ウエスタンブロッティングに用いた抗体を示し、「（Ｕｂ）ｎ−ＣＤＫＮ１Ｂ」は、ポリユビキチン化ＣＤＫＮ１Ｂのバンドを示す。
２９３Ｔ細胞を用いて、Ｆｌａｇ−ｔａｇを付加したユビキチン（Ｆｌａｇ−Ｕｂ）を過剰発現させる従来法と、Ｆｌａｇ−ＴＲ−ＰＵＢＰ１を発現させる方法とについて、細胞内に蓄積するユビキチン化タンパク質の量を比較した（図３Ａ）。プロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２や脱ユビキチン化酵素阻害剤ＮＥＭを添加することにより、細胞内によりポリユビキチン化タンパク質量の増加がみられた（図３Ａの左パネル））。これらのポリユビキチン化タンパク質は、過剰発現させたＦｌａｇ−ＵｂやＦｌａｇ−ＴＲ−ＰＵＢＰ１の免疫沈降により濃縮することができた（図３Ａの右パネル）。
ユビキチンリガーゼＳｋｐ２がＣＤＫ阻害タンパク質ＣＤＫＮ１Ｂをポリユビキチン化することはよく知られている（例えば、非特許文献５参照）。そこで、本発明に係る同定方法の有効性を検討するため、Ｓｋｐ２：ＣＤＫＮ１Ｂをモデルケースとして以下の解析を行なった。まず、Ｓｋｐ２を共発現させた際に、Ｆｌａｇ−Ｕｂ又はＦｌａｇ−ＴＲ−ＰＵＢＰ１の免疫沈降物の中にポリユビキチン化されたＣＤＫＮ１Ｂが検出されるかどうかを、２９３Ｔ細胞を用いて解析した（図３Ｂの右パネル）。その結果、ユビキチンを過剰発現させて免疫沈降させたものの中には、ポリユビキチン化されたＣＤＫＮ１Ｂはほとんど検出されなかった（図３Ｂの右パネルの１〜６番目のレーン）。一方、Ｆｌａｇ−ＴＲ−ＰＵＢＰ１の免疫沈降物の中には、Ｓｋｐ２を過剰発現していない状態でも（ＨＡ-ｔａｇｇｅｄがｅｍｐｔｙのもの）、さらに阻害剤が無い状態（ＭＧ132、ＮＥＭがともに「-」のもの）でもポリユビキチン化したＣＤＫＮ１Ｂが検出された（図３Ｂの右パネルの７番目のレーン）。これは、内在するＳｋｐ２によりユビキチン化を受けたＣＤＫＮ１Ｂに対して、発現しているＦｌａｇ−ＴＲ−ＰＵＢＰ１が結合し、分解や脱ユビキチン化を阻害しているためと考えられる。さらにＳｋｐ２を共発現させた場合には、ポリユビキチン化ＣＤＫＮ１Ｂ量が増加していた（図３Ｂの右パネルの７番目と１０番目のレーン比較）。また、細胞全抽出液（ＷＣＬ）からも、Ｓｋｐ２とＦｌａｇ−ＴＲ−ＰＵＢＰ１を共発現させたものでは、ポリユビキチン化ＣＤＫＮ１Ｂの蓄積がみられた（図３Ｂの左パネルの10番目〜13番目）。これらの結果より、Ｆｌａｇ−ＴＲ−ＰＵＢＰ１と様々なユビキチンリガーゼを共発現させることにより、各ユビキチンリガーゼの基質をポリユビキチン化した状態で効率よく蓄積させることが可能なことがわかった。
［参考例２］
参考例１で示したように、ＴＲ−ＰＵＢＰはポリユビキチン化タンパク質を効率よく細胞内に蓄積させることができる。このため、Ｆｌａｇ−ＴＲ−ＰＵＢＰ１の免疫沈降物の中には内在性のユビキチンリガーゼによるユビキチン化タンパク質も濃縮されてしまう（図３Ｂ）。ユビキチンリガーゼを共発現させた場合には、より強く基質タンパク質のポリユビキチン化は進行した。
そこで、逆にユビキチンリガーゼのドミナントネガティブ変異体を発現させることにより、基質のポリユビキチン化を抑制できるかを解析した。
＜ＨＡ−Ｓｋｐ２ΔＦ発現ベクターの作製＞
ユビキチンリガーゼＳｋｐ２（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＮＭ＿０１３７８７）のユビキチンリガーゼ活性領域を欠損させたドミナントネガティブ変異体Ｓｋｐ２ΔＦ（配列番号４）をコードするＤＮＡ配列のＮ末端にＨＡタグをコードするＤＮＡ配列を連結したＤＮＡ配列からなるＤＮＡフラグメントを哺乳類細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３に挿入し、ＨＡ−Ｓｋｐ２ΔＦ発現用ベクターを作製した。
＜ＨＡ−Ｆｂｗ７発現ベクター及びＨＡ-Ｆｂｗ１発現ベクターの作製＞
ユビキチンリガーゼＦｂｗ７（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＮＭ＿０３３６３２）又はユビキチンリガーゼＦｂｗ１（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＮＭ＿０３３６３７）をコードするＤＮＡ配列のＮ末端にＨＡタグをコードするＤＮＡ配列を連結したＤＮＡ配列からなるＤＮＡフラグメントを哺乳類細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３に挿入し、それぞれＨＡ−Ｆｂｗ７発現用ベクター、ＨＡ-Ｆｂｗ１発現用ベクターを作製した。
＜ＨＡ−Ｆｂｗ７ΔＦ発現ベクター及びＨＡ−Ｆｂｗ１ΔＦ発現ベクターの作製＞
ユビキチンリガーゼＦｂｗ７（ＮＣＢＩのアクセッション番号：Ｑ９６９Ｈ０）又はユビキチンリガーゼＦｂｗ１（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＮＭ＿０３３６３７）のユビキチンリガーゼ活性領域を欠損させたドミナントネガティブ変異体Ｆｂｗ７ΔＦ（配列番号５）、変異体Ｆｂｗ１ΔF（配列番号１１）をコードするＤＮＡ配列のＮ末端にＨＡタグをコードするＤＮＡ配列を連結したＤＮＡ配列からなるＤＮＡフラグメントを哺乳類細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３に挿入し、それぞれＨＡ−Ｆｂｗ７ΔＦ発現用ベクター、ＨＡ−Ｆｂｗ１ΔＦ発現用ベクターを作製した。
＜ＨＡ-ＭＤＭ２発現ベクターの作製＞
ユビキチンリガーゼ（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＸＭ＿００５２６８８７２）をコードするＤＮＡ配列のＮ末端にＨＡタグをコードするＤＮＡ配列を連結したＤＮＡ配列からなるＤＮＡフラグメントを哺乳類細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３に挿入し、ＨＡ‐ＭＤＭ２発現用ベクターを作製した。
参考例１と同様にして、２９３Ｔ細胞、ＨｅＬａ細胞に、Ｆｌａｇ−ＴＲ−ＰＵＢＰ１発現用ベクターと、ＨＡ−空ベクター、ＨＡ−Ｓｋｐ２発現ベクター、ＨＡ−Ｓｋｐ２ΔＦ発現ベクター、ＨＡ−Ｆｂｗ７発現ベクター、ＨＡ−Ｆｂｗ７ΔＦ発現ベクター、ＨＡ−Ｆｂｗ１発現ベクター、ＨＡ−Ｆｂｗ１ΔＦ発現ベクター、又はＨＡ-ＭＤＭ２発現ベクターとを共発現させた。プロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２は、培養の最後の４時間、終濃度２０μＭとなるように添加した。その後、参考例１と同様にして、ＤＤＤＫ抗体を用いてＦｌａｇ−ＴＲ−ＰＵＢＰ１の免疫沈降物を得、この免疫沈降物を電気泳動し、抗ＣＤＫＮ１Ｂ抗体、抗ＣＤＴ１抗体、抗ＣＤＫ２抗体、抗ＨＡ抗体、抗ｃＭｙｃ抗体、抗ＮＦＫＢＩＡ抗体、抗ＰＤＣＤ４抗体、又は抗ｐ５３抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った（抗ＮＦＫＢＩＡ抗体、抗ＰＤＣＤ４抗体、及び抗ｐ５３抗体を使った実験は、２９３Ｔ細胞のみを使った実験とした）。抗ＣＤＴ１抗体、抗ＣＤＫ２抗体、抗ｃＭｙｃ抗体、抗ＮＦＫＢＩＡ抗体、抗ＰＤＣＤ４抗体、及び抗ｐ５３抗体は何れも、ユビキチンリガーゼの基質に対する抗体である。これらの結果を図４Ａ〜図４Ｅに示す。これらの図中、「ＨＡ−ｔａｇｇｅｄ」の「ｅｍｐｔｙ」はＨＡ−空ベクターをトランスフェクションした細胞の結果を、「Ｓｋｐ２」はＨＡ−Ｓｋｐ２発現用ベクターをトランスフェクションした細胞の結果を、「ΔＦ」はＨＡ−Ｓｋｐ２ΔＦ発現用ベクター、ＨＡ-Ｆｂｗ７ΔＦ発現用ベクター、又はＨＡ-Ｆｂｗ１ΔＦ発現用ベクターをトランスフェクションした細胞の結果を、「Ｆｂｗ７」はＨＡ-Ｆｂｗ７発現用ベクターをトランスフェクションした細胞の結果を、それぞれ示す。また、「ＭＧ１３２」欄については、「＋」が各試薬を添加したサンプルの結果を、「−」は添加しなかったサンプルの結果を示す。さらに、図４Ａ及び図４Ｂのブロットの左欄の抗体名、及び図４Ｃ〜図４Ｅのブロットの下欄の抗体名は、ウエスタンブロッティングに用いた抗体を示す。図４Ｃ〜図４Ｅの結果は、２９３Ｔ細胞を用いた実験の結果である。
２９３Ｔ細胞において、Ｆｌａｇ−ＴＲ−ＰＵＢＰ１単独発現細胞の免疫沈降物の中には、プロテアソーム阻害剤（ＭＧ１３２）未処理時においてもポリユビキチン化されたＣＤＫＮ１Ｂが検出された（図４Ａの１番目のレーン）。一方、ＨＡ−Ｓｋｐ２とＦｌａｇ−ＴＲ−ＰＵＢＰ１の共発現させた細胞の免疫沈降物中のポリユビキチン化ＣＤＫＮ１Ｂの量は著しく増加した。しかし、ドミナントネガティブ体（図中、「ΔＦ」）を共発現させた細胞では、ポリユビキチン化ＣＤＫＮ１Ｂはほぼ検出されなかった。同様の結果は、Ｓｋｐ２のもう一つの既知の基質であるＣＤＴ１(ＮＣＢＩのアクセッション番号：Ｑ９Ｈ２１１)でも得られた。一方で、ＭＧ１３２を添加した場合は、ドミナントネガティブ体（ΔＦ）の発現下でもＣＤＫＮ１ＢやＣＤＴ１が免疫沈降物の中に認められてしまうため、ＭＧ１３２未処理時の方が、ユビキチンリガーゼやその変異体の明確な差がみられるものと考えられた。
また、ＣＤＫ２（ＮＣＢＩのアクセッション番号：Ｐ２４９４１）は、ＣＤＫＮ１ＢやＳｋｐ２と直接結合することが知られているキナーゼタンパク質である。このタンパク質はＣＤＫＮ１Ｂと同様の挙動を示すが、単一のバンドとして検出され、ポリユビキチン化された状態で検出されなかった。このように、免疫沈降物の中にはポリユビキチン化されたもののみならずそれと複合体を形成するものまで含まれてしまうことがわかった。
次に、別のユビキチンリガーゼＦｂｗ７、Ｆｂｗ１、ＭＤＭ２について、それぞれの既知の基質である、ｃ−Ｍｙｃ（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＮＭ＿００２４６７）；ＮＦＫＢＩＡ（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＮＭ＿０２０５２９）及びＰＤＣＤ４（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＮＭ＿０１４４５６）；及びｐ５３（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＮＭ＿０００５４６）のポリユビキチン化について、同様の解析を行なった。その結果、Ｆｌａｇ−ＴＲ−ＰＵＢＰ１の発現によりポリユビキチン化された、ｃ−Ｍｙｃ、ＮＦＫＢＩＡ，ＰＤＣＤ４、及びｐ５３が容易に検出された（図４Ｂ〜図４Ｅ）。Ｆｂｗ１の基質については細胞外刺激（図４C中のTNFはTNF刺激を、図４D中のSerum depl.は血清飢餓を意味する）に応じてユビキチン化が検出されるものとされていたが、高感度に検出可能なＴＲ‐ＰＵＢＰ１を用いた系においては細胞外刺激なしでもユビキチン化が検出可能であった。また、ＳＣＦ型ユビキチンリガーゼ複合体以外の単独型ユビキチンリガーゼＭＤＭ２でも基質のユビキチン化が容易に検出された。このことは、本発明に係る同定方法が様々なユビキチンリガーゼに応用可能であることを示唆している。
また、以上より、基質同定のスクリーニング法として、２９３Ｔ細胞にＦｌａｇ−ＴＲ−ＰＵＢＰ１とユビキチンリガーゼを共発現させたものと、Ｆｌａｇ−ＴＲ−ＰＵＢＰ１とユビキチンリガーゼのドミナントネガティブ変異体を共発現させたものについて、各々の免疫沈降物に含まれるタンパク質を比較することにより、ポリユビキチン化基質を同定するというストラテジーが簡便かつ有効と考えられた。
［実施例１］
これまでの結果を踏まえ、Ｆｌａｇ−ＴＲ−ＰＵＢＰ１を発現させた細胞から抗Ｆｌａｇ抗体を用いて免疫沈降したものをトリプシン分解したものについて、質量分析を行い、ユビキチン化サイトを含むペプチドを同定した。
＜トリプシン消化＞
参考例１において調製された各サンプルの抗Ｆｌａｇ抗体免疫沈降物溶液のうちの残りの５０μＬに、５μＬの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（２−ｃａｒｂｏｘｙ−ｅｔｈｙｌ）ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（Ｓｉｇｍａ社製）を添加し、６０℃で３０分間処理した後、２．５μＬの２００ ｍＭ Ｍｅｔｈｙｌ Ｍｅｔｈａｎｅｔｈｉｏｓｕｌｐｈｏａｔｅ（和光純薬社製）を添加し、室温で１０分置いた。その後、当該溶液に５０μｇのＴｒｙｐｓｉｎ Ｇｏｌｄ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し、３７℃で１６時間反応させ、トリプシン消化物を得た。
＜ｄｉＧｌｙペプチドの精製＞
前記トリプシン消化物に、２０μＬの２５ｘｃｏｍｐｌｅｔｅ−ＥＤＴＡ ｆｒｅｅと１０２．５μＬの純水を添加した。ＰＴＭＳｃａｎ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｒｅｍｎａｎｔ Ｍｏｔｉｆ（Ｋ−ε−ＧＧ）ｋｉｔ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）に付属の１０ｘＩＡＰ Ｂｕｆｆｅｒを２０μＬ添加した２００μＬの溶液に、予めＰＢＳで洗浄した１５μＬのＰＴＭＳｃａｎ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｒｅｍｎａｎｔ Ｍｏｔｉｆ（Ｋ−ε−ＧＧ） ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｂｅａｄ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（抗ｄｉＧｌｙ抗体結合ビーズ）を添加し、ローテーターを用いて４℃で２時間穏やかに混和した。その後、ビーズを１ｘＩＡＰ Ｂｕｆｆｅｒで２回洗浄し、続いて純水で３回洗浄した。上清を完全に除いた後、当該ビーズから２０μＬの０．１５％ トリフルオロ酢酸で３回抽出した。
＜質量分析＞
得られた抽出物（ｄｉＧｌｙペプチド精製物）から、ＺｉｐＴｉｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）やＳｔａｇｅＴｉｐｓ（Ｔｈｅｒｍｏ社製）などのＣ１８カラムを用いて精製したペプチドを質量分析により解析した。質量分析は、質量分析計（ｎａｎｏ−ＬＣ−ＨＲＭＳ：Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｑ−ｅｘａｃｔｉｖｅ）を用いて行った。更に、ＭＡＳＣＯＴサーチエンジンによるProteome Discovere software version 1.3（Thermo Scientific社製）を用いて、ｄｉＧｌｙペプチドを含んでいた、ポリユビキチン化基質蛋白質の同定を行った。２９３Ｔ細胞にＦｌａｇ−ＴＲ−ＰＵＢＰ１とＨＡ−Ｓｋｐ２を発現させた細胞からは、最終的に９３２個の確実性の高いペプチドが同定され、そのうち９０２個がユビキチンシグニチャーであるｄｉＧｌｙを有していた。これらは３３２個のタンパク質に帰属された。このうち、Ｓｋｐ２のドミナントネガティブ体（ΔＦ）を発現させた場合にはみられなかったものは１５個有り、その中には、ＣＤＴ１、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＣＤＫＮ１Ａの３つの既知の基質が含まれており、これらはウエスタンブロッティングでもユビキチン化が確認できた。ＣＤＴ１のｄｉＧｌｙ配列を含むペプチドのアミノ酸配列は、ＩＡＰＰＫ［ｄｉ−ＧｌｙＧｌｙ］ＬＡＣ［ｍｅｔｈｙｌｔｈｉｏ］Ｒ（配列番号６）であり、ＣＤＫＮ１ＢのｄｉＧｌｙ配列を含むペプチドのアミノ酸配列は、Ｋ［ｄｉ−ＧｌｙＧｌｙ］ＲＰＡＴＤＤＳＳＴＱＮＫ［ｄｉ−ＧｌｙＧｌｙ］Ｒ（配列番号７）であり、ＣＤＫＮ１ＡのｄｉＧｌｙ配列を含むペプチドのアミノ酸配列は、ＱＴＳＭ［Ｏｘｉｄ］ＴＤＦＹＨＳＫ［ｄｉ−ＧｌｙＧｌｙ］Ｒ（配列番号８）であった。
これらの既知基質の同定されたｄｉＧｌｙ配列を含むペプチドの量比を、ＰｉｎＰｏｉｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて定量解析を行った。図５ＡがＣＤＴ１のｄｉＧｌｙ配列を含むペプチドの定量解析結果を、図５ＢがＣＤＫＮ１ＢのｄｉＧｌｙ配列を含むペプチドの定量解析結果を、図５ＣがＣＤＫＮ１ＡのｄｉＧｌｙ配列を含むペプチドの定量解析結果を、それぞれ示す。また、図５Ａ〜図５Ｃにおいて、右パネルは、左パネル中のピーク面積を定量したものである。これら３種の既知基質は、ウエスタンブロッティングの結果を反映し、Ｓｋｐ２の過剰発現により極めて有意に増加していることが分かった。他の候補タンパク質についても、それらに対する抗体を入手しウエスタンブロッティングによりポリユビキチン化を確認することができる。
［実施例２］
また、Ｓｋｐ２に代えて、機能未知であり、多くの臓器や細胞で発現がみられるＦ−ｂｏｘタンパク質Ｆｂｘｏ２１（ＮＣＢＩのアクセッション番号：Ｏ９４９５２）を用いて、実施例１と同様にして、新たなポリユビキチン化基質の探索を行った。
＜Ｆｂｘｏ２１発現ベクターの作製＞
Ｆ−ｂｏｘタンパク質Ｆｂｘｏ２１をコードするＤＮＡ配列のＮ末端にＨＡタグをコードするＤＮＡ配列を連結したＤＮＡ配列からなるＤＮＡフラグメントを哺乳類細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３に挿入し、ＨＡ−Ｆｂｘｏ２１発現用ベクターを作製した。
＜ＨＡ−Ｆｂｘｏ２１ΔＦ発現ベクターの作製＞
Ｆｂｘｏ２１のユビキチンリガーゼ活性領域と推定される領域を欠損させたドミナントネガティブ変異体Ｆｂｘｏ２１ΔＦ（配列番号９）をコードするＤＮＡ配列のＮ末端にＨＡタグをコードするＤＮＡ配列を連結したＤＮＡ配列からなるＤＮＡフラグメントを哺乳類細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３に挿入し、ＨＡ−Ｆｂｘｏ２１ΔＦ発現用ベクターを作製した。
参考例１と同様にして、２９３Ｔ細胞にＦｌａｇ−ＴＲ−ＰＵＢＰ１発現用ベクターと、ＨＡ−空ベクター、ＨＡ−Ｆｂｘｏ２１発現ベクター、又はＨＡ−Ｆｂｘｏ２１ΔＦ発現ベクターとを共発現させた。プロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２は、培養の最後の４時間、終濃度２０μＭとなるように添加した。その後、参考例１と同様にして、ＤＤＤＫ抗体を用いて抗Ｆｌａｇ抗体免疫沈降物溶液を得た。
次いで、実施例１と同様にして、各サンプルの抗Ｆｌａｇ抗体免疫沈降物溶液をトリプシン消化し、得られたトリプシン消化物からｄｉＧｌｙペプチドを精製し、このｄｉＧｌｙペプチド精製物からＣ１８カラムを用いて精製したペプチドを質量分析により解析した。その結果、いくつかのタンパク質がポリユビキチン化基質として同定された。
ＭＡＳＣＯＴサーチエンジンによるProteome Discovere software version 1.3（Thermo Scientific社製）を用いて蛋白質の同定を行い、個々の蛋白質のＰＳＭs（peptide spectrum matches）の値が野生型Fbxo21で増加しＦｂｘｏ２１ΔＦで減少するものを選び出した。３度の独立した実験で再現性があったＴＡＲＳ（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＮＭ＿１５２２９５）、及びＥＩＤ１（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＮＭ＿０１４３３５）を基質として同定した。図６に、ＴＡＲＳ及びＥＩＤ１のｄｉＧｌｙ配列を含むペプチドのＰＳＭｓ値に基づく定量解析結果を示す。なお、ＴＡＲＳのｄｉＧｌｙ配列を含むペプチドのアミノ酸配列は、ＩＬＮＥＫ［ｄｉ−ＧｌｙＧｌｙ］ＶＮＴＰＴＴＴＶＹＲ（配列番号１０）、ＮＳＳＴＹＷＥＧＫ[ｄｉ-ＧｌｙＧｌｙ]ＡＤＭＥＴＬＱＲ（配列番号１２）、ＦＱＥＥＡＫ[ｄｉ-ＧｌｙＧｌｙ]ＮＲ（配列番号１３）、及びＨＴＧＫ[ｄｉ-ＧｌｙＧｌｙ]ＩＫ（配列番号１４）であり、ＥＩＤ１のｄｉＧｌｙ配列を含むペプチドのアミノ酸配列は、ＶＳＡＡＬＥＥＡＤＫ[ｄｉ-ＧｌｙＧｌｙ]Ｍ[Ｏｘｉｄ]ＦＬＲ（配列番号１５）、及びＳＧＡＱＱＬＥＥＥＧＰＭ[Ｏｘｉｄ]ＥＥＥＥＡＱＰＭ[Ｏｘｉｄ]ＡＡＰＥＧＫ[ｄｉ-ＧｌｙＧｌｙ]Ｒ（配列番号１６）であった。ＴＡＲＳのｄｉＧｌｙ配列を含むペプチドは、Ｆｂｘｏ２１ΔＦの過剰発現では空ベクターを発現させた場合よりも少なく、Ｆｂｘｏ２１の過剰発現により極めて有意に増加していることが分かった。ＴＡＲＳのｄｉＧｌｙ配列を含むペプチド量比の傾向は、Ｓｋｐ２を発現させた場合のＣＤＴ１等と同様であることから、Ｆｂｘｏ２１はユビキチンリガーゼであり、ＴＡＲＳがＦｂｘｏ２１のポリユビキチン化基質である可能性が高い。ＥＩＤ１のｄｉＧｌｙ配列を含むペプチドは、Ｆｂｘｏ２１の過剰発現によってのみ検出され、空ベクターを発現させた場合やＦｂｘｏ２１ΔＦの過剰発現させた場合には検出限界以下であった。これらの結果から、本発明に係る同定方法により、新規のポリユビキチン化基質を効率よく同定できることが明らかである。
１…細胞、２…ユビキチンリガーゼ、Ｕｂ…ユビキチン、３…Ｆｌａｇタグ付ＴＲ−ＰＵＢＰ、４…基質、５…ＤＵＢ、６…２６Ｓプロテアソーム、７…抗Ｆｌａｇ抗体、８…ビーズ、９…ユビキチン化サイトを含むペプチド、１０…ユビキチン化サイトを含まないペプチド、１１…抗ｄｉＧｌｙ抗体。

Claims (8)

  1. （１）細胞内、又は細胞抽出液中において、トリプシン耐性ポリユビキチン鎖結合タンパク質とユビキチンリガーゼを発現させる工程；
    （２）前記工程（１）後の前記細胞又は前記細胞抽出液から、前記トリプシン耐性ポリユビキチン鎖結合タンパク質を含有する複合体を分離する工程；
    （３）前記工程（２）により分離された複合体を、トリプシン消化する工程；及び
    （４）前記工程（３）により得られた消化物中から、ユビキチン化サイトを含むペプチドを同定する工程；
    を有する、ポリユビキチン化基質の同定方法。
  2. さらに、
    （１’）前記細胞と同種の別個の細胞内、又は前記細胞抽出液と同種で別個に調製した細胞抽出液中において、前記トリプシン耐性ポリユビキチン鎖結合タンパク質と、前記ユビキチンリガーゼのユビキチンリガーゼ活性領域を欠損させたドミナントネガティブ変異体を発現させる工程；
    （２’）前記工程（１’）後の前記細胞又は前記細胞抽出液から、前記トリプシン耐性ポリユビキチン鎖結合タンパク質を含有する複合体を分離する工程；
    （３’）前記工程（２’）により分離された複合体を、トリプシン消化する工程；
    （４’）前記工程（３’）により得られた消化物中から、ユビキチン化サイトを含むペプチドを同定する工程；及び
    （５）前記工程（４）において同定されたペプチドであり、かつ前記工程（４’）において同定されなかったペプチドを、ポリユビキチン化基質に含まれるペプチドであると判断する工程；
    を有する、請求項１に記載のポリユビキチン化基質の同定方法。
  3. 前記トリプシン耐性ポリユビキチン鎖結合タンパク質が、リンカーにより連結されている２以上のユビキチン結合ドメインを含む、請求項１又は２に記載のポリユビキチン化基質の同定方法。
  4. 前記トリプシン耐性ポリユビキチン鎖結合タンパク質が、４〜８のユビキチン結合ドメインを含む、請求項３に記載のポリユビキチン化基質の同定方法。
  5. 前記ユビキチン結合ドメインが、配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち、１８〜７１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる、請求項３又は４に記載のポリユビキチン化基質の同定方法。
  6. 前記トリプシン耐性ポリユビキチン鎖結合タンパク質が、ポリユビキチン鎖との結合部位に加えて、タグ部分を有しており、
    前記工程（２）において、前記複合体を、前記トリプシン耐性ポリユビキチン鎖結合タンパク質中の前記タグ部分と特異的に結合する抗体又はリガンドを用いた免疫反応を利用して分離する、請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリユビキチン化基質の同定方法。
  7. 前記工程（４）が、前記消化工程により得られた消化物中から、ユビキチン化サイトを含むペプチドを選択的に分離回収した後、同定する工程である、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリユビキチン化基質の同定方法。
  8. 抗ｄｉＧｌｙ抗体を用いて、ユビキチン化サイトを含むペプチドを選択的に分離回収する、請求項７に記載のポリユビキチン化基質の同定方法。
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