KR100916651B1 - 단백질 타이로신 탈인산화 효소의 양적 감시에 의한 질환의 진단 방법 - Google Patents

단백질 타이로신 탈인산화 효소의 양적 감시에 의한 질환의 진단 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 생체시료 내에서 단백질 타이로신 탈인산화 효소(protein tyrosine phosphatase; 이하, PTP)의 양을 측정하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로 PTP의 양을 질량분석을 통하여 정량적으로 측정하고 전체 PTP들의 상대적인 양을 프로파일링 함으로써 질환을 진단하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 진단 방법에 따라 생체시료 내의 PTP 양의 측정 및 프로파일링을 통해 다양한 질병의 상태 및 건강상태를 확인할 수 있다.
Figure R1020070125161
단백질 타이로신 탈인산화 효소, 질환 진단 방법, 질량 분석, 혈액, 바이오 마커

Description

단백질 타이로신 탈인산화 효소의 양적 감시에 의한 질환의 진단 방법{Method for diagnosis of disease using quantitative monitoring of protein tyrosine phosphatase}
본 발명은 생체시료 내에서 단백질 타이로신 탈인산화 효소(protein tyrosine phosphatase; 이하, PTP)의 양을 측정하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 PTP의 양을 질량분석을 통하여 정량적으로 측정하고 전체 PTP들의 상대적인 양을 프로파일링 함으로써 질환을 진단하는 방법에 관한 것이다.
단백질 타이로신의 인산화-탈인산화 과정은 세포내 신호전달 체계에서 매우 중요한 수단으로 이용된다. 특히 세포 외부의 자극에 의한 세포의 반응, 세포의 성장, 분화 및 사멸에 단백질 타이로신의 인산화-탈인산화가 핵심적인 역할을 하고 있기 때문에, 상기와 같은 세포상태의 변화를 수반하는 암, 혈관질환, 면역질환 및 신경질환 등의 질환의 치료 표적 단백질로 단백질 타이로신 인산화 효소(protein tyrosine kinase; 이하, PTK; Curr Pharm Des 13:2751-65, 2007; Curr Med Chem 14:2214-34, 2007) 및 단백질 타이로신 탈인산화 효소(protein tyrosine phosphatase; 이하, PTP)가 중요한 위치를 차지한다(Curr Cancer Drug Targets 6:519-32, 2006; Med Res Rev 27:553-73, 2007). 인간에게는 약 100여 종의 PTP가 존재하며(Cell 117:699-711, 2004), 이들 중 20여 종은 질병과의 관련이 밝혀져 신약개발 표적으로 사용되고 있다. 나머지 80여 종도 질병과 관련이 있을 것으로 생각되고 있다.
여러 연구에서 PTP 단백질의 발현량이 질병상태 및 세포상태에 따라 차별적인 것이 알려져 왔다(Crit Rev Oncol / Hemat 52:9-17, 2004; Expert Opin Therapeutic Targets 10:157-177, 2006). 그러나 세포 내 또는 혈액 내에서 PTP 단백질의 양을 직접적으로 측정할 수 있는 수단이 없었기 때문에, 역전사 기법 등에 의한 세포 내 mRNA의 양을 측정하는 간접인 방법 또는 제한된 수의 PTP 단백질에 대해서 상용화된 PTP 항체를 이용하는 웨스턴 블롯 방법 등에 의해 차별적으로 발현되는 PTP 단백질의 양을 측정할 수 있었다. 그러나 mRNA 양으로 단백질 양을 추측하는 방법은 실제로 일치할 확률이 그다지 높지 않아 정확한 양적인 정보를 주지 못하고, 혈액이나 소변 등의 시료에는 적용할 수 없다. 그리고 웨스턴 블롯의 경우는 PTP 항체가 10여 개 내외 밖에 보고되지 않은데다가 민감도가 좋지 않은 경우가 많아서 정확한 측정이 어렵다. 이에 PTP 단백질들이 바이오 마커로서의 높은 가능성을 가짐에 PTP 단백질을 바이오 마커로 이용한 질환의 진단 방법에는 아직까지 별다른 진전이 없었다.
바이오 마커를 이용한 질환진단에서 인체 시료 중 특히 혈액이 좋은 시료로 서 평가되는데, 이는 채취의 용이성 및 혈액 내에 존재하는 물질의 다양성 때문이다. 혈액은 인체의 구석구석을 순환하는데 이때 인체 각 부분의 세포를 조금씩 떼어내게 된다. 상기 세포들은 대부분 깨어져서 세포 내에 포함되어 있던 단백질들이 혈액으로 쏟아져 나오게 되며, 혈액 내에는 상기 단백질들이 포함되어 있어서 혈액은 인체 상태의 대변인이라 할 수 있다. 그러나 상기 단백질들이 혈액 내에 아주 미량으로 존재하기 때문에 보통의 경우는 존재 자체도 모르는 경우가 많을 수 있다. 게다가 혈액 내에는 알부민 및 면역글로불린 등의 단백질이 과량으로 존재해서 미량의 세포 유래 단백질의 분석을 더욱 어렵게 한다.
이에 본 발명자들은 시료 내에 펨토(femto) 또는 아토(atto) 몰 수준으로 미량 존재하는 PTP 단백질의 양을 측정하기 위하여 총 80여 종의 PTP 단백질로부터 질량분석기에서 용이하게 분석될 수 있는 PTP 활성 도메인의 표준 펩타이드를 선정하였고, 항체로 포집한 펩타이드를 질량분석 기법으로 정량분석 하는 방법인 SISCAPA(Stable Isotope Standards and Capture by Anti-peptide Antibodies) 기법에 따라 정량분석 하였다(Mol Cell Proteomics 5:573-588, 2006); Proc Natl Acad Sci USA 100:6940-6945, 2003). 상기 방법으로 정량분석을 수행한 결과, 정상 개체와 여러 암에 걸린 개체에게서 여러 PTP 단백질의 발현량 차이를 측정하였고, 상기 표준 펩타이드 및 항체들을 이용한 PTP 패널을 구성하여 분석함으로써 본 발명의 방법이 질환의 진단에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 정상 및 질병상태에서 세포신호전달에 핵심적인 인간 단백질 타이로신 탈인산화효소(protein tyrosine phosphatase, PTP) 단백질군을 시료(혈액, 조직, 분비물)에서 측정하여 암, 혈관질환, 대사성 질환 등의 질환 및 스트레스 등 건강상태를 진단하는 방법을 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 113 내지 168로 기재된 아미노산 서열을 갖는 타이로신 탈인산화효소(protein tyrosine phosphatase; 이하, PTP) 활성 도메인 및 서열번호 256 내지 260 및 서열번호 271 내지 290으로 기재된 아미노산 서열을 갖는 PTP 단백질을 가수분해 처리하여 생성된 PTP의 발현량 정량 분석용 표준 펩타이드를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 169 내지 255로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가진 PTP의 발현 정량 분석용 합성 표준 펩타이드를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 표준 펩타이드 또는 합성 표준 펩타이드에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 제공한다.
또한, 본 발명은 11) 피검체로부터 분리된 시료를 가수분해하는 단계;
2) 단계 1)의 가수분해된 시료에 동위원소로 치환된 합성 표준 펩타이드를 첨가하는 단계;
3) 단계 2)의 가수분해된 시료로부터 야생형 및 동위원소로 치환된 합성 표준 펩타이드를 추출하여 정량분석하는 단계; 및,
4) 단계 3)의 야생형 펩타이드의 발현량과 동위원소로 치환된 합성 표준 펩타이드의 양을 비교하여 야생형 펩타이드 발현량의 절대값을 구하는 단계를 포함하는 PTP 정량 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 1) 피검체로부터 분리된 시료로부터 PTP를 농축하는 단계;
2) 단계 1)의 농축된 시료를 가수분해하는 단계;
3) 단계 2)의 가수분해된 시료에 동위원소로 치환된 합성 표준 펩타이드를 첨가하는 단계; 및,
4) 단계 3)의 야생형 펩타이드의 발현량과 동위원소로 치환된 합성 표준 펩타이드의 양을 비교하여 야생형 펩타이드 발현량의 절대값을 구하는 단계를 포함하는 PTP 정량 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 1) 암에 걸린 개체로부터 분리된 시료를 가수분해하는 단계;
2) 단계 1)의 가수분해된 시료에 동위원소로 치환된 합성 표준 펩타이드를 첨가하는 단계;
3) 단계 2)의 가수분해된 시료로부터 야생형 및 동위원소로 치환된 합성 표준 펩타이드를 추출하여 정량분석하는 단계;
4) 단계 3)의 야생형 펩타이드의 발현량과 동위원소로 치환된 합성 표준 펩타이드의 양을 비교하여 야생형 펩타이드 발현량의 절대값을 구하는 단계; 및,
5) 단계 4)의 절대값과 정상 개체에게서의 야생형 펩타이드 발현량의 절대값을 비교하여 정상 개체와 통계적으로 유의한 차이를 보이는 표준 펩타이드를 확인하는 단계를 포함하는 암 관련 바이오 마커를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 1) 특정 질환을 앓고 있는 개체로부터 분리된 시료를 가수분해하는 단계;
2) 단계 1)의 가수분해된 시료에 동위원소로 치환된 합성 표준 펩타이드를 첨가하는 단계;
3) 단계 2)의 가수분해된 시료로부터 야생형 및 동위원소로 치환된 합성 표준 펩타이드를 추출하여 정량분석하는 단계;
4) 단계 3)의 야생형 펩타이드의 발현량과 동위원소로 치환된 합성 표준 펩타이드의 양을 비교하여 야생형 펩타이드 발현량의 절대값을 구하는 단계; 및,
5) 단계 4)의 절대값과 정상 개체에게서의 야생형 펩타이드 발현량의 절대값을 비교하여 정상 개체와 통계적으로 유의한 차이를 보이는 표준 펩타이드를 확인하는 단계를 포함하는 특정 질환 특이적 바이오 마커를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 1) 암에 걸린 개체로부터 분리된 시료를 가수분해하는 단계;
2) 단계 1)의 가수분해된 시료에 상기 암 관련 바이오 마커 스크리닝 방법으로 스크리닝된 하나 이상의 바이오 마커의 동위원소로 치환된 합성 표준 펩타이드를 첨가하는 단계;
3) 단계 2)의 가수분해된 시료로부터 야생형 및 동위원소로 치환된 합성 표준 펩타이드를 추출하여 정량분석하는 단계;
4) 단계 3)의 야생형 펩타이드의 발현량과 동위원소로 치환된 합성 표준 펩타이드의 양을 비교하여 야생형 펩타이드 발현량의 절대값을 구하는 단계; 및,
5) 단계 4)의 절대값과 정상 개체에게서의 야생형 펩타이드 발현량의 절대값을 비교하여 정상 개체와 유의한 차이를 보이는 표준 펩타이드를 확인하는 단계를 포함하는 암 질환의 진단 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 1) 피검체로부터 분리된 시료로부터 PTP를 농축하는 단계;
2) 단계 1)의 농축된 시료를 가수분해하는 단계;
3) 단계 2)의 가수분해된 시료에 상기 암 관련 바이오 마커 스크리닝 방법으로 스크리닝된 하나 이상의 바이오 마커의 동위원소로 치환된 합성 표준 펩타이드를 첨가하는 단계; 및,
4) 단계 3)의 야생형 펩타이드의 발현량과 동위원소로 치환된 합성 표준 펩타이드의 양을 비교하여 야생형 펩타이드 발현량의 절대값을 구하는 단계; 및,
5) 단계 4)의 절대값과 정상 개체에게서의 야생형 펩타이드 발현량의 절대값을 비교하여 정상 개체와 유의한 차이를 보이는 개체를 확인하는 단계를 포함하는 암질환의 진단 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 특정 질환 특이적 바이오 마커 스크리닝 방법으로 스크리닝된 바이오 마커의 표준 펩타이드에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 포함하는 질환 진단용 키트를 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 특정 질환 특이적 바이오 마커 스크리닝 방법으로 스크리닝된 바이오 마커의 표준 펩타이드에 특이적으로 결합할 수 있는 제 1 단클론 항체 및 상기 제 1 단클론 항체가 결합한 부위를 제외한 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 제 2 단클론 항체를 포함하는 질환 진단용 키트를 제공한다.
이하, 본 발명에서 사용한 용어를 설명한다.
"야생형 펩타이드"는 피검체의 가수분해된 시료 내에 이미 존재하고 있는 PTP 펩타이드를 의미한다. 본 발명에서는 가수분해된 시료 내에 추가로 첨가되는 방사성 동위원소로 표지 또는 치환된 표준 펩타이드와 대조되어 사용되는 개념이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 113 내지 168로 기재된 아미노산 서열을 갖는 타이로신 탈인산화효소(protein tyrosine phosphatase; 이하, PTP) 활성 도메인 및 서열번호 256 내지 260 및 서열번호 271 내지 290으로 기재된 아미노산 서열을 갖는 PTP 단백질을 가수분해 처리하여 생성된 PTP의 발현량 정량 분석용 표준 펩타이드를 제공한다.
상기 표준 펩타이드는 서열번호 169 내지 255로 기재된 아미노산 서열을 갖는다. 상기 표준 펩타이드는 표 1의 1 내지 56번의 서열번호 113 내지 168로 기재 된 아미노산 서열을 갖는 타이로신 탈인산화효소(protein tyrosine phosphatase; 이하, PTP) 활성 도메인 및 대한민국 등록특허 제 10-0746993호에서 MBP 융합을 통해 발현된 서열번호 271 내지 290으로 기재된 아미노산 서열을 갖는 PTP 단백질 및 MBP 융합을 통하여 발현된 서열번호 256 내지 260으로 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질을 가수분해 처리하여 생성된 펩타이드 중 이온화가 효율적으로 되는 펩타이드로 구성된다.
또한, 본 발명은 서열번호 169 내지 255로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가진 PTP의 발현 정량 분석용 합성 표준 펩타이드를 제공한다.
상기 합성 표준 펩타이드는 시스테인이나 메티오닌과 같은 산화위험성이 있는 잔기가 없고 류신이나 발린과 같이 안정 방사성 동위원소를 가진 아미노산으로 치환할 수 있는 잔기를 포함하는 펩타이드로 구성된다. 상기 치환은 합성 과정에서 안정한 동위원소를 가진 아미노산을 첨가함으로써 이루어지거나 합성 후 특정 아미노산에 안정한 동위원소를 가진 기능기를 표지함으로써 수행될 수 있다. 본 발명에서 상기 방사성 동위원소는 표준 펩타이드에 결합함으로써 야생형 펩타이드와 질량 차이를 주어 야생형 펩타이드와 구별되기 위하여 사용된 것이므로, 꼭 표준 펩타이드 내부에 포함될 필요가 없고, 표준 펩타이드의 OH 말단에 결합한 형태로 포함될 수도 있기 때문이다. 또한, 상기 표준 펩타이드는 산화위험성이 있는 잔기를 포함하는 아미노산을 제외한 아미노산이 안정한 동위원소로 치환될 수 있 다. 상기 안정한 동위원소는 13C, 15N 및 2H로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 13C 및 15N을 이용하였다.
본 발명의 바람직한 실시예에서는 정제된 PTP 활성 도메인을 트립신으로 가수분해 처리하여 상기 PTP 활성 도메인의 펩타이드를 수득한 후 탠덤 질량분석 한 결과, 각각의 PTP에 대해서 펩타이드 서열이 결정되는 5 내지 10개의 펩타이드를 얻을 수 있었고 이들 중 안정한 동위원소로 치환할 수 있는 잔기를 포함하고 산화위험이 있는 시스테인, 메티오닌을 포함하지 않고 검출강도가 높은 펩타이드를 표준 펩타이드 선정의 기준으로 삼았다. 상기 자료를 바탕으로 상기 기준에 부합되는 펩타이드들을 선별하여 PTP의 발현량 정량 분석용 PTP 활성 도메인의 표준 펩타이드로 선정하였다(도 1 참조). 상기 방법으로 선정된 서열번호 169 내지 255로 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 시퀀싱을 수행하고(도 2 및 도 3 참조) 상기 표준 펩타이드 별로 절편화 및 이온화가 최적으로 되어서 검출신호가 가장 큰 에너지를 측정한 결과, 각 절편 이온이 절편화 에너지에 따라 검출강도가 선형으로 증감하는 것을 확인하였고 절편 이온들 중에서 검출강도가 가장 큰 이온을 선택하여 검출강도 증감곡선의 최고점에 해당하는 에너지를 최적 절편화 에너지로 선정하였다(표 4 참조).
또한, 본 발명은 상기 표준 펩타이드 또는 상기 합성 표준 펩타이드에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 제공한다.
상기 항체는 다클론 항체 및 단클론 항체를 포함한다. 상기 항체의 용도가 이에 한정되는 것은 아니지만, 다클론 항체는 가수분해된 시료 내 표준 펩타이드를 추출하는 과정 및 정량 분석에 사용될 수 있고, 단클론 항체는 시료 내 표준 펩타이드의 정량 분석에 사용될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 상기 다클론 항체를 이용하여, 여러 암환자 및 정상인으로부터 수득한 가수분해 처리된 후 동위원소로 치환된 합성 표준 펩타이드가 첨가된 혈장으로부터 야생형 및 동위원소 치환된 표준 펩타이드를 수득할 수 있었다. 상기 수득한 야생형 및 동위원소 치환된 표준 펩타이드를 트리플 사극자 분석기를 이용하여 정량 분석한 결과, PTP T46 펩타이드의 경우 야생형 표준 펩타이드가 정량적으로 측정되었으며, 동위원소 치환 표준 펩타이드의 피크 크기와 비교해서 야생형 표준 펩타이드의 절대값을 계산할 수 있었다(도 4 내지 7 참조).
다클론 항체는 PTP 활성 도메인의 표준 펩타이드를 동물에 주사하고 해당 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 종래의 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 당업계에 알려진 어떠한 방법에 의해서든 정제될 수 있고, 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 만들어질 수 있다. 단클론 항체는 연속 세포주의 배양을 통한 항체 분자의 생성을 제공하는 어떠한 기술을 사용하여도 제조할 수 있다. 이러한 기술로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 하이브리도마 기술, 사람 B-세포 하이브리도마 기술 및 EBV-하이브리도마 기술이 포함된다(Kohler G et al., Nature 256:495-497, 1975; Kozbor D et al ., J Immunol Methods 81:31-42, 1985; Cote RJ et al ., Proc Natl Acad Sci 80:2026-2030, 1983; 및 Cole SP et al., Mol Cell Biol 62:109-120, 1984). 또한 PTP 활성 도메인의 표준 펩타이드에 대한 특정 결합 부위를 함유한 항체 단편이 제조될 수 있다. 예를 들면 이들로 한정되는 것은 아니지만 F(ab')2 단편은 항체 분자를 펩신으로 분해시켜 제조할 수 있으며, Fab 단편은 F(ab')2 단편의 디설파이드 브릿지를 환원시킴으로써 제조할 수 있다. 다른 방도로서, Fab 발현 라이브러리를 작제하여 원하는 특이성을 갖는 단클론 Fab 단편을 신속하고 간편하게 동정할 수 있다(Huse WD et al ., Science 254: 1275-1281, 1989).
또한, 본 발명은 11) 피검체로부터 분리된 시료를 가수분해하는 단계;
2) 단계 1)의 가수분해된 시료에 동위원소로 치환된 합성 표준 펩타이드를 첨가하는 단계;
3) 단계 2)의 가수분해된 시료로부터 야생형 및 동위원소로 치환된 합성 표준 펩타이드를 추출하여 정량분석하는 단계; 및,
4) 단계 3)의 야생형 펩타이드의 발현량과 동위원소로 치환된 합성 표준 펩타이드의 양을 비교하여 야생형 펩타이드 발현량의 절대값을 구하는 단계를 포함하는 PTP 정량 방법을 제공한다.
단계 1)의 시료는 혈액, 조직 및 분비물 등을 포함한다. 상기 가수분해는 시료에 포함되어 있는 단백질 내의 절단 부위를 인식하여 펩타이드 수준으로 분해할 수 있는 프로테아제는 모두 사용가능하며, 바람직하게는 트립신, 키모트립신, 펩신, 써몰리신 및 프로티나제 K등이 있으며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 트립신을 사용하였다.
단계 3)의 야생형 및 동위원소로 치환된 합성 표준 펩타이드는 상기 펩타이드에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 리간드를 이용하여 추출할 수 있다. 상기 항체는 다클론 항체 및 단클론 항체를 포함할 수 있으나, 추출의 수율을 높이기 위해서는 다클론 항체를 사용하는 것이 바람직하며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 다클론 항체가 결합한 컬럼을 이용하였다. 표준 펩타이드의 수득은 시료 내의 PTP를 트립신 가수분해 한 후 상기 표준 펩타이드를 농축하는 방법에 의하거나, 단백질 상태의 PTP를 농축한 후 트립신 가수분해하여 수득하는 방법을 사용할 수 있다. 구체적으로, 거의 모든 PTP가 동일한 효소 활성부위를 갖고, 상기 활성부위의 구조가 조금씩 다르지만 활성 시스테인 등 공통점이 있기 때문에 상기 공통점을 활용해서 거의 모든 PTP에 결합하는 저분자 물질을 설계하고 이 저분자에 바이오틴이나 유사물질을 붙여서 PTP 농축에 사용할 수 있다.
단계 3)의 정량분석은 이에 한정되는 것은 아니나, LC/MS 질량분석 방법, SELDI(Surface-Enchanced Laser Desorption/Ionization) 및 샌드위치 ELISA를 이용한 정량분석 방법 등에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에서는 상기 PTP 활성 도메인의 표준 펩타이드로 구성된 PTP 패널을 구성하여, 대장암, 간암 및 위암 환자를 대상으로 상기 표준 펩타이드의 양을 정량 분석한 결과, 총 18 종의 PTP가 검출되었고, 상기 18개 중 10여 종은 암환자에서만 검출되었고 정상인 혈액에서는 검출되지 않았으며, 나머지는 정상인에게서도 검출되었으나 암환자에서 검출된 양이 훨씬 많아서 상기 대장암, 간암 및 위암의 진단에 활용하는 것이 가능하였다(표 5 참조). 특히 이중 3개의 PTP(T46, pk32, pk3)는 매우 정량적으로 검출하는 것이 가능하였다. 그중, PTP T46 표준 펩타이드의 경우, 각 환자별 및 암 종류별로 그 발현량에 약간씩 차이는 있으나 고루 검출되는 것을 질량분석 방법으로 검출하였고(도 4 내지 10 참조), 상기 결과가 PTP 패널을 이용한 결과와 유사한 것을 확인하였다.
또한, 본 발명은 1) 피검체로부터 분리된 시료로부터 PTP를 농축하는 단계;
2) 단계 1)의 농축된 시료를 가수분해하는 단계;
3) 단계 2)의 가수분해된 시료에 동위원소로 치환된 합성 표준 펩타이드를 첨가하는 단계; 및,
4) 단계 3)의 야생형 펩타이드의 발현량과 동위원소로 치환된 합성 표준 펩타이드의 양을 비교하여 야생형 펩타이드 발현량의 절대값을 구하는 단계를 포함하는 PTP 정량 방법을 제공한다.
단계 1)의 시료 내의 PTP의 농축은 PTP 효소 활성부위에 결합하는 화합물을 사용하여 수행될 수 있다. 거의 모든 PTP가 동일한 효소 활성부위를 갖고, 상기 활성부위의 구조가 조금씩 다르지만 활성 시스테인 등 공통점이 있기 때문에 상기 공통점을 활용해서 거의 모든 PTP에 결합하는 저분자 물질을 설계하고 이 저분자에 바이오틴이나 유사물질을 붙여서 PTP 농축에 사용할 수 있다. 시료로부터 PTP를 농축한 후 가수분해하여 펩타이드를 수득할 경우 분석단계를 간소화할 수 있다.
또한, 본 발명은 1) 암에 걸린 개체로부터 분리된 시료를 가수분해하는 단계;
2) 단계 1)의 가수분해된 시료에 동위원소로 치환된 합성 표준 펩타이드를 첨가하는 단계;
3) 단계 2)의 가수분해된 시료로부터 야생형 및 동위원소로 치환된 합성 표준 펩타이드를 추출하여 정량분석하는 단계;
4) 단계 3)의 야생형 펩타이드의 발현량과 동위원소로 치환된 합성 표준 펩타이드의 양을 비교하여 야생형 펩타이드 발현량의 절대값을 구하는 단계; 및,
5) 단계 4)의 절대값과 정상 개체에게서의 야생형 펩타이드 발현량의 절대값을 비교하여 정상 개체와 통계적으로 유의한 차이를 보이는 표준 펩타이드를 확인하는 단계를 포함하는 암 관련 바이오 마커를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 1) 특정 질환을 앓고 있는 개체로부터 분리된 시료를 가수분해하는 단계;
2) 단계 1)의 가수분해된 시료에 동위원소로 치환된 합성 표준 펩타이드를 첨가하는 단계;
3) 단계 2)의 가수분해된 시료로부터 야생형 및 동위원소로 치환된 합성 표준 펩타이드를 추출하여 정량분석하는 단계;
4) 단계 3)의 야생형 펩타이드의 발현량과 동위원소로 치환된 합성 표준 펩 타이드의 양을 비교하여 야생형 펩타이드 발현량의 절대값을 구하는 단계; 및,
5) 단계 4)의 절대값과 정상 개체에게서의 야생형 펩타이드 발현량의 절대값을 비교하여 정상 개체와 통계적으로 유의한 차이를 보이는 표준 펩타이드를 확인하는 단계를 포함하는 특정 질환 특이적 바이오 마커를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 1) 암에 걸린 개체로부터 분리된 시료를 가수분해하는 단계;
2) 단계 1)의 가수분해된 시료에 상기 암 관련 바이오 마커 스크리닝 방법으로 스크리닝된 하나 이상의 바이오 마커의 동위원소로 치환된 합성 표준 펩타이드를 첨가하는 단계;
3) 단계 2)의 가수분해된 시료로부터 야생형 및 동위원소로 치환된 합성 표준 펩타이드를 추출하여 정량분석하는 단계;
4) 단계 3)의 야생형 펩타이드의 발현량과 동위원소로 치환된 합성 표준 펩타이드의 양을 비교하여 야생형 펩타이드 발현량의 절대값을 구하는 단계; 및,
5) 단계 4)의 절대값과 정상 개체에게서의 야생형 펩타이드 발현량의 절대값을 비교하여 정상 개체와 유의한 차이를 보이는 표준 펩타이드를 확인하는 단계를 포함하는 암 질환의 진단 방법을 제공한다.
상기 암질환은 이에 한정되는 것은 아니나, 대장암, 간암, 위암 및 대장암 등이 포함될 수 있다.
단계 5)의 유의한 차이는 피검체의 야생형 표준 펩타이드 발현량의 절대값이 정상 개체의 그것보다 많거나 낮은 경우를 모두 포함한다. 여러 종류의 표준 펩타이드의 발현량이 많고 낮음은 암질환의 종류 및 상태에 따라 각각 다를 수 있다. 이에 상기 표준 펩타이드 별 많고 낮음의 차이에 따라 암질환을 진단할 수 있다. PTP 단백질 군은 세포신호전달 과정에서 서로 상관성을 가지며 기능을 하므로 기존의 바이오 마커와는 달리 각 PTP 사이의 상대적인 양이 생체기능의 중요한 정보가 될 수 있고, 수십 개의 관련성 있는 PTP 발현량의 상대적인 비교는 인체의 여러 가지 다른 요소(나이, 성별, 생활습관)에 따른 변화에 영향을 받지 않는 신뢰성 있는 진단 방법이 될 것이다.
또한, 본 발명은 1) 피검체로부터 분리된 시료로부터 PTP를 농축하는 단계;
2) 단계 1)의 농축된 시료를 가수분해하는 단계;
3) 단계 2)의 가수분해된 시료에 상기 암 관련 바이오 마커 스크리닝 방법으로 스크리닝된 하나 이상의 바이오 마커의 동위원소로 치환된 합성 표준 펩타이드를 첨가하는 단계; 및,
4) 단계 3)의 야생형 펩타이드의 발현량과 동위원소로 치환된 합성 표준 펩타이드의 양을 비교하여 야생형 펩타이드 발현량의 절대값을 구하는 단계; 및,
5) 단계 4)의 절대값과 정상 개체에게서의 야생형 펩타이드 발현량의 절대값을 비교하여 정상 개체와 유의한 차이를 보이는 개체를 확인하는 단계를 포함하는 암질환의 진단 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 특정 질환 특이적 바이오 마커 스크리닝 방법으로 스크리닝된 바이오 마커의 표준 펩타이드에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 포함하는 질환 진단용 키트를 제공한다.
상기 항체는 다클론 및 단클론 항체를 포함한다. 또한, 상기 키트는 추가로 상기 항체에 결합할 수 있으며, 발색 반응용 기질과 반응할 수 있는 효소가 표지 된 2차 항체 또는 바이오틴으로 표지 된 2차 항체를 추가로 포함한다. 상기 2차 항체에 발색 반응용 기질과 반응할 수 있는 효소가 표지 된 경우에는 발색반응용 기질 및 반응 완충용액을 추가로 포함한다.
상기 항체는 고체기판에 고정되어 있을 수 있다. 상기 고체기판은 자성미세입자, 유리판, PLGA 등 생분해성 유기고분자나노입자 또는 각종 (미세)웰플레이트[(micro)well plate]으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다.
아울러, 본 발명은 상기 특정 질환 특이적 바이오 마커 스크리닝 방법으로 스크리닝된 바이오 마커의 표준 펩타이드에 특이적으로 결합할 수 있는 제 1 단클론 항체 및 상기 제 1 단클론 항체가 결합한 부위를 제외한 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 제 2 단클론 항체를 포함하는 질환 진단용 키트를 제공한다.
상기 키트는 제 2 단클론 항체에 결합할 수 있으며, 발색 반응용 기질과 반응할 수 있는 효소가 표지 된 2차 항체 또는 바이오틴으로 표지 된 2차 항체를 추가로 포함한다. 상기 2차 항체에 발색 반응용 기질과 반응할 수 있는 효소가 표지 된 경우에는 발색반응용 기질 및 반응 완충용액을 추가로 포함한다.
상기 제 1 단클론 항체는 고체기판에 고정되어 있을 수 있다. 상기 고체기판은 자성미세입자, 유리판, PLGA 등 생분해성 유기고분자나노입자 또는 각종 (미세)웰플레이트[(micro)well plate]으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 진단 방법에 따라 생체시료 내의 PTP 양의 측정 및 프로파일링을 통해 다양한 질병의 상태 및 건강상태를 확인할 수 있다. 또한 수술 등의 치료 과정에서도 예후의 예측 및 치료전략을 세우는 데도 유용하게 사용될 수 있을 것이다. 특히 혈액과 같이 미량의 PTP가 존재하는 생체시료에서도 정확한 PTP 양의 측정이 가능하게 하므로, 용이한 시료채취를 통해 광범위한 질환의 진단 및 건강상태를 감시하는데 유용하게 사용될 수 있을 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> PTP 활성 도메인의 대량발현 및 정제
<1-1> PTP 활성 도메인의 클로닝
표 1의 번호 1 내지 56의 서열번호 113 내지 168로 기재된 아미노산 서열을 갖는 PTP 활성 도메인 56개를 융합 단백질의 도움없이 발현할 수 있는 벡터를 제조하였다.
pET28a 벡터(Novagen, USA)의 다중 클로닝 부위는 PTP 활성 도메인의 DNA 염기서열(표 1) 내에 포함되지 않은 제한효소부위를 가장 많이 포함하고 있기에 본 발명의 뼈대 벡터로 사용하였다.
표 1에 나타난 바와 같이, 표 1의 번호 1 내지 56의 서열번호 113 내지 168로 기재된 아미노산 서열을 갖는 PTP 활성 도메인 56개의 DNA 염기서열을 증폭하기 위하여, 표 1의 서열번호 1 내지 112로 기재된 프라이머 쌍을 이용하여 뇌, 근육 및 정소의 세 가지 cDNA 라이브러리(Clontech, USA)를 주형 DNA로 하여 95℃ 5분, 95℃ 1분, 55-60℃ 1분, 72℃ 1분 30초, 30회 반복 및 72℃ 10분의 조건으로 PCR을 수행하였다. 세 가지 cDNA 라이브러리를 주형으로 해서 PCR 한 결과 증폭된 DNA의 양이 충분한 것을 선택하였다. 증폭된 PCR 산물을 제한효소 NdeI, EcoRI 또는 BamHI으로 각각 처리하여 pET28a 벡터(Novagen, USA)의 제한효소 NdeI, EcoRI 또는 BamHI자리에 삽입하였고 이를 pET28a-PTP 1 내지 56이라고 명명하였다.
PTP 활성 도메인 1 내지 56의 염기서열 및 프라이머 쌍
번호 이름 아미노산 위치 (서열번호) 정방향 프라이머 서열번호
DNA 위치 역방향 프라이머
1 T4 225-793(113) CGCGACGCTAGCATGGCAGACGACAATAAGCTCTTC 1
673-2379 GCTGCGAAGCTTTACTTGAAGTTGGCATAATCTGA 2
2 T7 1684-1967(114) GGCACCCATATGCTAGTGGCTGTTGTTGCCTTATTG 3
5050-5901 GCGGGATCCTCAATGCCTTGAATAGACTGGATC 4
3 T48 1316-1897(115) GCCCCACATATGCGAGACCACCCACCCATCCCC 5
3946-5691 GGAAGATCTCTACGTTGCATAGTGGTCAAAGCTGCC 6
4 T8 821-1089(116) GCGCCATATGGCAGACAAGTACCAGCAACTCTCCCTG 7
2461-3267 GCGCGGATCCCTCGGCTGGGGCCTGGGCTGACTGTTG 8
5 T23 1024-1335(117) CCGTTACATATGGTGGAGAATTTTGAGGCCTACTTC 9
3070-4005 CCCGAATTCTTAGGCGATGTAACCATTGGTCTTTC 10
6 T39 879-1440(118) CACATTGCTAGCATGAAGACATCAGACAGCTATGGG 11
2635-4320 CGGCTCAAGCTTCTAAGATGATTCCAGGTACTCCAA 12
7 T5 848-1452(119) GCCCACCATATGGCCAGCGATACCAGCAGCCTG 13
2542-4356 GCGAGATCTTCAGCCAGAATTCAAGTATTCCAG 14
8 T38 709-979(120) GACCGGCATATGCTTGCCAAGGAGTGGCAGGCCCTC 15
2125-2935 CCGGGATCCTCACTGGGGCAGGGCCTTGAGGAT 16
9 T12 674-1015(121) CGCCAGCATATGGCCACGCGGCCACCAGACCGA 17
2020-3045 GCGGGATCCTCACTGGGGAAGGGCCTTGAGGAT 18
10 T15 851-1216(122) GAGCATGCTAGCATGGCTAGGGAGTGTGGAGCTGGT 19
2551-3648 GCGGGATCCCTAGGACTTGCTAACATTCTCGTATAT 20
11 T10 327-650(123) CCTTTCCATATGAAGCCCATAGGACTTCAAGAGAGAAG 21
979-1950 GACAGTAAGCTTTCAAAGTCTGCTCTCATACAGGCACA 22
12 T22 1367-1650(124) CGCGAACATATGCTTAGCCACCCGCCAATTCCC 23
4099-4950 GGCGGATCCTCAGCCCACGGCCTCCAGCAGGGCCTC 24
13 T20 890-1180(125) TTCGCTAGCGCCATCCGGGTGGCTGACTTG 25
2668-3540 GCGGGATCCCTAAAAGGAGCTTAAATATTCCAGTGCCA 26
14 PTP1B 1-299(126) ATGGAGATGGAAAAGGAGTTCGAGCAGATC 27
1-897 GTCAACATGTGCGTGGCTACGGTCCTCACG 28
15 T25 1-387(127) GCTCCCGCTAGCATGCCCACCATCGAGCGGGAG 29
1-1161 CGCGGATCCTTAGGTGTCTGTCAATCTTGGCCT 30
16 T41 157-537(128) TCAGAGCATATGGAGGAGAAGATCGAGGATGAC 31
469-1611 GTGGACGCTAGCATGAAATATTTGGGCAGTCCCATT 32
17 T18 1-595(129) GCCCCCCATATGGTGAGGTGGTTTCACCGAGAC 33
1-1785 CCGGAATTCTCACTTCCTCTTGAGGGAACCCTTG 34
18 pk32 63-360(130) GAACCCCATATGTCTGTGAACACACCCCGGGAGGTC 35
187-1080 CGGGATCCTCAGGGGCTGGGTTCCTCAGGCAG 36
19 pk28 1-526(131) CCGCGGCATATGGAACATCACGGGCAATTAAAA 37
1-1578 CGGGATCCTCACCTGCAGTGCACCACGACCGG 38
20 T32 2095-2490(132) GCAGTACATATGAATGGGAAGTTATCAGAAGAG 39
6283-7468 GGCGGATCCTCACTTCAGAAGCTGAGGCTGCTGTTTTT 40
번호 이름 아미노산 위치 (서열번호) 정방향 프라이머 서열번호
DNA 위치 역방향 프라이머
21 T40 866-1187(133) GAGCAGCATATGGCAGGCCTGGAGGCACAGAAG 41
2596-3561 CGCGGATCCTTAAATGAGTCTGGAGTTTTGGAG 42
22 T2 839-1174(134) CTAGGGCATATGAAAAAGACTCGAGTAGATGCA 43
2515-3522 CGCGGATCCTTAGATGAGCCTGGAGCTTTTCAG 44
23 pk4 173-323(135) AGGCCGCATATGGTCATGGAAGTGGGCACCCTG 45
517-969 GGCGGATCCTCAGCTCCCAGCCTCTGCCGAACAG 46
24 pk7 174-338(136) GTTCATATGAGTGCCACAGAGCCCTTGGAC 47
520-1012 GCGGGATCCTCAGGACGTGGCCAGCACCTGGGACTC 48
25 pk8 178-321(137) GCGGACCATATGGGCCCAGTTGAAATCCTTCCCTTC 49
532-962 GCGAGATCTTCACGTGGAGGGCAGGATCTCAGATTCG 50
26 pk9 205-348(138) GGCAGCCATATGTCCTTCCCAGTGGAGATCTTGCCC 51
613-1044 CGCGGATCCTCAGCTGAGTCCCAGCGTCCTCTCGAA 52
27 pk10 192-338(139) GCTGGCCATATGTTGCGCCGCCTGCGCAAGGGC 53
574-1014 CGGGATCCTCACGTGGACTCCAGCGTATTGAG 54
28 T33 160-312(140) TGCCCCCATATGGCTGGGGACCGGCTCCCGAGG 55
478-934 GCGGGATCCTCATGAGGGGGTGCCCGGGTCGCCCTG 56
29 pk12 201-351(141) CGATCGCATATGGAGGGTCTGGGCCGCTCGTG 57
601-1053 CGGGATCCCTAGGTGGGGGCCAGCTCGAAGG 58
30 pk13 320-467(142) CTGGACCATATGCAGCGGCTGAACATCGGCTAC 59
958-1401 CGGGATCCTCACACAACCGTCTCCACTCCCATC 60
31 T27 192-339(143) GTTGCCCATATGGGGCCAACCCGAATTCTTC 61
574-1017 GGATCCTTATGATGCTCCAGTCTGGTTC 62
32 pk6 1-185(144) GCCGCCCATATGTCGGGCTCGTTCGAGCTCTCG 63
1-555 CGGGATCCCTAGGGTTTCAACTTCCCCTCC 64
33 pk14 27-210(145) GCCAAGCATATGGGCGGAAACCACATCCCCGAAAGG 65
79-628 GCGGGATCCTCAGGAATTCCAATTCTTTCTGATAGG 66
34 pk15 21-340(146) AGCGCCCATATGGTCAGCTGTGCCGGGCAGATGCTG 67
61-1020 CGGGATCCTCATATTTTTCCTGTTTGTGATCC 68
35 pk33 1-188(147) GGCTGGCATATGGCTGAGACCTCTCTCCCAGAG 69
1-564 CGGGATCCTCAGCTCTGGCCGGCACCCCGC 70
36 p44 1-198(148) TCCCACCATATGGACTCACTGCAGAAGCAGGAC 71
1-601 GCCAAGGGTCAGGGATCCTGGCTG 72
37 p21 1-157(149) CCCGGGCATATGGGCAATGGCATGACCAAGGTAC 73
1-471 GCGGGATCCTCACTTGCCGCCCTTGCGGGACAG 74
38 pk35 1-188(150) GCGGGATCCTCACTTGCCGCCCTTGCGGGACAG 75
1-564 CGGGATCCTCACAGTGGAATCATCAAACGGAC 76
39 NE1 1-217(151) CCAGGGGCTAGCCGCTAACTGGAAAGAAAA 77
1-651 GTCGGATCCTTAGCTTTCTTTGCCCTCTTG 78
40 p19 1-190(152) ATGACAGCATCCGCGTCCTCCTTTTC 79
1-570 TTACATTGATATCATCATACGTAG 80
41 pk18 1-184(153) GCAGCCCATATGGGGAATGGGATGAACAAGATC 81
1-552 CGGGATCCTTACAGTCTTCTGAGAAAGGCCCAG 82
42 p12 31-211(154) GGGAAGCATATGGGTCGGGCGCACCGGGACTGG 83
91-603 GGCACCAAGCTTTCAGAACTCTTTAAGAACATCCAGCT 84
43 pk17 35-211(155) CTGGAGCATATGCCAACCGTTCAACATCCTTTCC 85
103-633 GCGGGATCCTCATGCTTCCAGACCCTGCCGCAGC 86
번호 이름 아미노산 위치 (서열번호) 정방향 프라이머 서열번호
DNA 위치 역방향 프라이머
44 p16 1-150(156) GCGGCGGCTAGCATGGGCGTGCAGCCCCCCAACTTC 87
1-450 CGCGCCTCGAGTTTCGTTCGCTGGTAGAACTGGAA 88
45 T16 1-210(157) GGCGGCGCTAGCATGGCTCACAACAAGATCCCGCCG 89
1-630 TGAGGATCCTTATGATTCCTTCTTTCCATCCTCATC 90
46 p18 306-450(158) CCGGGACATATGGACAAGCCCTCCCTTATCTTC 91
916-1350 GCGGGATCCTCAGCTTGCATCCAAGATGCCTTC 92
47 NE3 306-350(159) CTTGGTCATATGGATAGCCCTACACAGATATTTG 93
916-1350 GCGGGATCCTCACCTTGCCAGCAAGATCCCCTG 94
48 pk3 4-163(160) GCGGCTCATATGAACCGCCCAGCTCCTGTGGAA 95
10-489 GCGGGATCCTCAGGAATCTTTGAAACGCAGCCGCAT 96
49 p49 14-167(161) CGCCGAGCTAGCATGCGTTTTCTGATAACTCACAAC 97
40-501 CGGGATCCCTACTGAACACAGCAATGCCCATTG 98
50 p26 4-161(162) GCGACCCATATGGCCCCGGTGGAGGTGAGCTACA 99
10-483 CGCGGATCCTCAGGTCTTGTGCGTGTGTGGGTCTTTG 100
51 T29 37-391(163) GGCGGCCATATGTCGTCGACCTCGCCGGGTGTGAAG 101
109-1173 GCCGGATCCTTATTTGGAGAAGGCTGCTCTGTGTTGTC 102
52 T46 1-157(164) ATGGCGGAACAGGCTACCAAGTCCGTG 103
1-471 TCAGTGGGCCTTCTCCAAGAACGCTCTGC 104
53 pk1 336-523(165) GCTCTAGACTTATAGGAGACTTCTCCAAGGG 105
1006-1569 GCCCTAGGTCAGAGCTTCTTCAGACGACTGTAC 106
54 T47 378-566(166) GACCACCATATGCTGATTGGAGATTACTCTAAGGCC 107
1132-1701 CCGGGATCCTCACTGGTCCTGCAGCCGGCTACA 108
55 T45 207-400(167) GATTCTGCTAGCGGGCACCTGATTGGTGATTTTTCC 109
619-1200 CCGGGATCCTCATGGGCTCATGTCCTTCACCAG 110
56 Eya2 244-514(168) GACAATCATATGGAGCGTGTGTTCGTGTGGGAC 111
730-1542 GAATTCTTATAAATACTCCAGCTCCAGGGCGTG 112
<1-2> MBP 융합을 통해 발현된 PTP 단백질 발현용 벡터
대한민국 등록특허 제 10-0746993호에서와 유사한 방법으로 표 2의 번호 1 내지 5의 서열번호 256 내지 260으로 기재된 아미노산 서열을 갖는 PTP 5개가 MBP 융합을 통해 발현되는 벡터 pET28a-MBP-PTP 1 내지 5를 제조하였다. 이때 사용한 프라이머 쌍을 표 2에 정리하였다.
MBP 융합 단백질로 발현된 PTP 1 내지 5의 염기서열 및 프라이머 쌍
번호 이름 아미노산 위치 (서열번호) 정방향 프라이머 서열번호
DNA 위치 역방향 프라이머
1 p45 1-295(256) ATGAGGAGAACTTCCGGAGCAACC 261
1-885 CTATAGGCACGATGATACAAAATATAA 262
2 p46 149-420(257) CCTCTAGCTAGCGATACGCGCAAAATTGTT 263
445-1260 GGATCCTTAATCCAAAGTCAGAAGTTTCC 264
3 p47 1-242(258) CGCCCACATATGACAGCCATCATCAAAGAGAT 265
1-726 CGGGATCCTCAAAGTACATGAACTTGTCTTCC 266
4 T21 166-500(259) CTTGCACATATGGGCTTTGACGTGCAGAACG 267
496-1500 CCGAGATCTTCATTGCACCAGTTTTACCAGGAA 268
5 T53 1-223(260) TCGGCCCATATGCCTGGTTTGCTTTTATGTGAA 269
1-669 CGGAATTCTCAGTAGAGCGGATCCATGATG 270
<1-3> 활성도 및 안정성을 유지하기 위한 대량발현 조건
하나한(Hanahan)이 기술한 방법(Hanahan D, DNA Cloning vol.1 109-135, IRS press 1985)에 의해 실시예 1-1의 56개의 벡터 및 실시예 1-2의 5개의 벡터를 대장균에 각각 형질전환 하였다.
구체적으로, CaCl2로 처리한 대장균 BL21-DE3-RIL에 상기 벡터들을 열충격 방법으로 각각 형질전환시킨 후, 카나마이신(kanamycin; Sigma, USA)이 포함된 배지에서 배양하여 상기 발현벡터가 형질전환되어 카나마이신 저항성을 나타내는 콜로니를 선별하였다. 상기 콜로니를 하룻밤 동안 LB 배지에서 배양한 종균 배양액의 일부를 30 ㎍/㎖ 카나마이신을 포함하는 LB 배지에 접종한 다음 대장균을 정지기(stationary phase) 전까지 키웠다. 이후, 400 ㎖/플라스크의 LB 배지에 1:100의 비율로 희석하여 접종한 다음 온도를 37℃에서 17℃까지 서서히 낮추면서 2 내지 3시간 동안 배양한 후, 17℃에서 200 rpm으로 배양하였다. 배양액의 OD600이 0.5에 이르렀을 때 IPTG를 가능한 낮은 농도(0.05 ~ 0.1 mM)로 첨가하여 20 내지 16~18시간 배양하여 PTP 활성 도메인의 발현을 유도하였다.
<1-4> 활성도 및 안정성을 유지하는 정제 및 저장 조건
실시예 1-3의 방법으로 배양한 대장균을 4℃에서 6,000 rpm으로 5분간 원심분리하여 균체 침전물을 회수한 후 5 ㎖의 파쇄 용액(10 mM Tris-HCl 완충액, pH 7.5, 10 mM EDTA)에 현탁하여 4℃에서 초음파 파쇄기를 이용하여 파쇄하였다. 파쇄한 후 4℃에서 13,000 rpm으로 10분간 원심분리한 뒤 상등액과 불용성 응집체를 분리하였다. 분리된 상등액을 Ni-NTA 레진(Qiagen, USA)을 이용하여 4℃에서 약 3시간 동안 저농도 완충용액[20 mM Tris-HCl pH 7.5 0.2 M NaCl 1.0 mM PMSF, 4mM β-머캅토에탄올(Sigma, USA)]에서 고농도 완충용액[저농도 완충용액에 0.5M 이미다졸 추가로 포함(Sigma, USA)]으로 선형농도구배법을 이용하여 단백질을 용출하였다. 용출된 단백질의 N-말단의 히스티딘 태그는 프로테아제인 트롬빈(Sigma, USA)을 단백질 100 ㎍ 당 1 유닛의 트롬빈 비율로 처리하여 제거하였고, 이온교환 크로마토그래피(GE Healthcare, USA) 및 겔 여과 크로마토그래피(GE Healthcare, USA)를 이용하여 정제하였다.
PTP 활성 도메인의 정제과정 중 10 mM β-머캅토에탄올(Sigma, USA) 또는 DTT(Promega, USA)를 완충용액에 10 mM의 농도로 계속 첨가하면서 정제하였고, 완충용액의 pH는 6.5 ~ 8.0으로 맞추었다. 상기 방법으로 정제된 PTP 활성 도메인은 10% 글리세롤을 단백질 용액[pH7.5-8.0 트리스 완충용액에 100-250 mM NaCl, 10 mM 환원제(β-머캅토에탄올 또는 DTT), 0.5~2 ㎍/㎖, 프로테아제 저해제(Sigma, USA)를 포함한 10% 글리세롤용액]에 첨가하여 4℃에서 보관하였다.
< 실시예 2> PTP 활성 도메인의 표준 펩타이드 제작
<2-1> PTP 활성 도메인의 트립신 가수분해
실시예 1의 방법으로 수득한 56개의 PTP 활성 도메인 및 MBP 융합을 통해 발현된 5개의 단백질 및 표 3의 대한민국 등록특허 제 10-0746993호에서 MBP 융합을 통해 발현된 20개의 단백질을 트립신(Seqeuncing Grade Modified Trypsin; Promega, USA) 프로테아제로 가수분해하였다. 구체적으로, 1 ㎎/㎖의 농도로 정제된 PTP 활성 도메인 20 ㎕ 당 50 mM Ammonium Bicarbonate 용액 0.1%(w/v) Rapigest 시약(Waters, USA)을 사용하여 60℃에서 30분 동안 변성시켰고, 상온에서 식힌 다음 1 ㎍의 트립신을 가하여 37℃에서 가수 분해 반응을 진행했다. 2시간 후 최종 농도 0.5% TFA(trifluoroacetic acid; Burdick & Jackson Brand, USA)로 반응을 종결시켰고 다시 37℃에서 30분간 인큐베이션한 후 13,000 rpm으로 10분간 원심분리시켜서 침전물을 제외한 가수분해 펩타이드 용액만을 취하여 LC-MS/MS분석을 하였다. 도메인의 변성 시, 상기 Rapigest 이외에도 우레아, 구아니딘·HCL 등을 변성제로 사용할 수 있고 열처리를 90℃에서 하는 것도 가능하다. 이어서, Q-Tof premier 질량분석기(Waters, USA)에서 분석을 수행하기 전 nanoAcquity UPLC용 trap column Symmetry C18(Waters, USA)을 이용하여 온라인으로 시료를 로딩한 후 염을 제거하고 진공에서 건조하여 질량분석용 시료를 하였다.
대한민국 등록특허 제 10-0746993호에서 MBP 융합을 통해 발현된 20개의 단백질
번호 이름 단백질명 Unitprot 접근번호 아미노산 위치 서열번호
1 p13 MTMR8 Q96EF0 122-704 271
2 p20 VHP (DUSP26) Q05923 1-176 272
3 p24 TENC1 Q2NL80 125-320 273
4 pk16 MTMR7 Q9Y216 1-334 274
5 pk19 Laforin (EPM2A) O95278 1-331 275
6 pk30 MKP6 (DUSP14) O95147 1-198 276
7 pk36 SSH3 Q8TE77 11-150 277
8 pk38 MK-STYX Q9Y6J8 1-313 278
9 pk5 PAC-1 (DUSP2) Q05923 1-314 279
10 T1 PTP-PEST (PTPN12) Q05209 1-324 280
11 T17 CD45 (PTPRC) Q5T5R0 465-1143 281
12 T19 MTMR3 Q13615 137-530 282
13 T24 MTMR1 Q13613 1-571 283
14 T26 RPTPδ (PTPRD) P23468 1331-1912 284
15 T30 HD-PTP (PTPN23) Q9H3S7 1060-1636 285
16 T3 PTP-HSCF (PTPN18) Q99952 1-300 286
17 T31 PTPJ (PTPRU) Q92729 817-1430 287
18 T35 LYP (PTPN22) Q9Y2R2 1-326 288
19 T37 RPTP (PTPRE) P23469 100-700 289
20 T6 RPTPγ (PTPRG) P23470 825-1414 290
<2-2> 가수분해된 PTP 활성 도메인의 가수분해 펩타이드 패턴 및 이온화 패턴 분석
실시예 2-1의 방법으로 수득한 가수분해된 PTP 활성 도메인의 펩타이드 서열 결정과 이온화 패턴을 기록하기 위하여 Q-TOF premier/nanoAcquity(Waters, USA) 시스템을 이용하여 분석하였다.
실시예 2-1의 방법으로 수득한 300 nℓ/분의 유속으로 40분간 A용액[0.1% 포름산(Fluka, 일본) 3차 증류수]과 B용액[0.1% 포름산 아세토니트릴(Fluka, Germany)]을 혼합하는 농도구배법으로 Atlantis C18 nanoAcquity column(Waters, USA) 상에서 펩타이드 머무름 시간(retention time)에 따라 분리하였다. 분석시 ESI Source 온도는 80℃, Capillary Voltage는 3.8kV로 유지하였다. 온라인으로 검출되는 펩타이드의 MS스펙트럼을 분석하여 +2와 +3의 전하를 띠는 펩타이드 이온에 대해 최대 10초간 MS/MS분석을 자동으로 수행하였다. MS/MS 스펙트럼의 분석은 MassLynx version 4.1(Waters, USA)을 이용하였고, 펩타이드 시퀸싱 및 단백질 가수분해 펩타이드 분석은 ProteinLynx v2.2(Waters, 미국)와 Mascot release 2.1(Matrix Science, 미국)을 사용해서 각각의 PTP 활성 도메인 가수분해 펩타이드 패턴 및 이온화 경향을 분석하였다.
<2-3> PTP 활성 도메인의 표준 펩타이드 선정 및 합성
실시예 2-2에서 효율적으로 이온화하는 것으로 분석된 펩타이드 중에서 시스테인이나 메티오닌과 같은 산화위험성이 있는 잔기가 없고 류신이나 발린과 같은 안정동위원소로 치환할 수 있는 잔기를 포함하는 펩타이드를 선정하였고, 상기 펩타이드가 동위원소로 치환되도록 각 1~3 ㎎씩 합성하였다(Peptron Inc., 한국).
구체적으로, 트립신 가수분해는 Arg과 Lys 뒤쪽에 Pro이 오지 않는 경우 절단하게 되고 그 결과 항상 Arg 또는 Lys의 C-말단을 가지는 펩타이드가 된다(도 1). 그 중에서 지나치게 친수성이거나 소수성이어서 LC상에서 분리가 힘든 펩타이드는 제외하게 되었고, 또한 지나치게 질량이 작거나 커서 MS에서 검출이 불가능하거나 MS/MS이온화 효율이 낮은 경우는 배제하였다. 가능하면 Trp, Met, Cys등 반응성이 높아서 변형(modification)이 잘 일어나는 경우도 피하였다. BLAST 검색을 통해서 각각의 단백질을 특이하게 대표할 수 있을 만큼 충분한 길이면서 비슷한 이온화 세기를 가지는 경우, 길이가 짧은 펩타이드를 우선적으로 선별하였다.
13C 및 15N의 동위원소로 표지 된 L-아르기닌-N-FMOC-13C6,15N4(+10Da), L-리신-α-N-FMOC-13C6,15N2(+8Da), L-류신-N-FMOC-13C6,15N(+7Da) 및 L-발린-N-FMOC-13C5,15N(+6Da)의 총 4종의 FMOC 아미노산(Cambridge Isotope Laboratories; CIL, USA)을 이용하여 Fmoc solid-phase 합성법에 따라 상기 펩타이드가 동위원소로 치환되도록 각 1~3 ㎎씩 합성하였다(Peptron Inc., 한국). 이때, 모든 트립신 가수분해 효소는 C-말단의 Arg또는 Lys으로 표지 가능하나, 가능한 C-말단 외에 Leu, Val등의 아미노산이 있는 경우, 안정한 동위원소로 표지 된 FMOC 아미노산 가격이 저렴한 Leu, Val을 우선적으로 사용하였다.
그 결과, PTP 활성 도메인을 가수분해 처리하여 생성된 서열번호 169 내지 255로 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드(또는 이온)를 선정하였다. 구체적으로, 도 1a에서 나타낸 가수분해된 LMPTP(T46; 표 1의 번호 52)의 LC-MS/MS분석 결과의 경우 각기 12종의 펩타이드가 검출되었고, 이중 가수분해가 불완전하거나 변형되었거나 변형의 가능성이 있는 펩타이드를 제외하고 남은 2종의 펩타이드(도 1b의 다이아몬드 표시; 41-58, 113-123)을 선별하였다. 상기 선별된 펩타이드를 시퀸싱을 수행한 후(도 2 및 도 3), 분석된 딸이온(daughter ion)에 대해 raw-스펙트럼상의 실제 이온화 세기를 확인한 결과(표 4의 Native 열의 괄호 안에 이온값을 표기함), 각각의 PTP 활성 도메인에 대해서도 같은 방식의 분석을 수행하였고 최종적으로 MRM(multiple reaction monitoring) 시그날을 최적화할 수 있는 딸이온을 생성하는 펩타이드 중 합성이 용이한 펩타이드를 1차적으로 합성하였고, HPLC-MS분석을 이용하여 92~99% 순도를 확인하였다. 표준 펩타이드 서열 중 *로 표시된 아미노산이 CIL에서 구입한 안정한 동위원소 아미노산으로 표지 된 부분이다(표 4의 서열 열에 표기함).
Figure 112007087372569-pat00001
Figure 112007087372569-pat00002
Figure 112007087372569-pat00003
< 실시예 3> 표준 펩타이드의 최적 이온화 에너지 측정
실시예 2의 방법으로 합성된 동위원소로 치환된 합성 표준 펩타이드 별로 탠덤 질량분석기에서 절편화 및 이온화가 최적으로 되어 검출신호가 가장 큰 에너지 값을 측정하였다.
동위원소로 치환된 합성 표준 펩타이드 87종(표 4)을 100 펨토 몰 씩 혼합한 시료 2 ㎕를 nanoAquity UPLC(Waters, USA)에 연결된 Q-Tof 질량분석기(Waters, USA)에서 Full scan MS/MS 방법으로 에너지를 4 내지 30V에서 2V 간격으로 변화시키면서 절편화 패턴을 기록하였다. 각 펩타이드에 대해서 에너지별로 얻어진 MS/MS 스펙트럼을 정렬시켜서 절편화된 이온들의 증감을 분석하여 가장 이온 세기가 큰 딸이온과 그때의 절편화 에너지를 기록하고 이들이 이론적으로 예상되는 절편이온과 전하수 및 질량 값이 일치하는지 확인 후 이를 해당 동위원소 치환 표준 펩타이드의 최적 딸이온 및 절편화 에너지로 확정하였다. 야생형 표준 펩타이드는 동위원소로 치환된 합성 표준 펩타이드와 분자 및 이온 성질이 동일하므로 동위원소로 치환된 합성 표준 펩타이드를 사용하여 결정된 절편이온에 해당하는 야생형 표준 펩타이드의 이온과 동일한 절편화 에너지를 사용하였다.
동위원소로 치환된 합성 표준 펩타이드의 질량은 표 4의 SIS 열에 기재하였고, Q-Tof 및 Quattro 질량분석기기에서의 최적 절편화 에너지는 표 4의 QTOF 및 Quat 열에 각 표준 펩타이드 별로 기재하였다. 표 4의 Native 및 SIS 열에는 야생형 표준 펩타이(Native)와 동위원소로 치환된 합성 표준 펩타이드(SIS)의 표준 펩타이드 질량값 및 이온수(괄호 안 숫자)와 상기 방법으로 결정된 최적 딸이온(최적 절편 펩타이드)의 질량 값 및 이온 수를 기록하였다. 예를 들어 표 4의 Native 및 SIS 열의 A(An) -> B(Bn) 형식의 기록에서 A는 해당 표준 펩타이드의 질량값, An은 해당 표준 펩타이드의 이온수, B는 해당 표준 펩타이드에서 생성된 최적 딸이온의 질량값, 그리고 Bn은 해당 표준 펩타이드에서 생성된 최적 딸이온의 이온수를 지칭하였다. "weak"은 약한 시그날로 해당값을 결정하지 못한 경우를 지칭하였다.
< 실시예 4> 표준 펩타이드에 결합하는 항체 제작
야생형 및 동위원소치환 표준 펩타이드를 시료에서 농축하기 위하여 표준펩타이드에 결합하는 다클론 항체를 제작하였다.
<4-1> 항원 제작
실시예 2의 방법으로 수득한 표준 펩타이드 서열의 N-말단 또는 C-말단에 항체 정제를 위한 시스테인 잔기가 붙은 항원 제작용 펩타이드를 제작하였다(Peptron Inc., 한국).
<4-2> 면역화
실시예 4-1의 방법으로 수득한 표준 펩타이드를 항원으로 하여 상기 표준 펩타이드에 결합할 수 있는 다클론 항체를 (주)에이비프런티어사(한국)에 의뢰하여 제작하였다. 구체적으로 토끼를 면역원으로 사용하여 상기 항원을 면역하고 3개월 후, 면역된 토끼의 혈청을 수거하였다.
<4-3> 항체 정제용 컬럼 제작
아이오도-아세틸잔기를 가지는 컬럼에 실시예 4-1의 방법으로 수득한 표준 펩타이드를 펩타이드의 말단 시스테인이 아세틸화하는 방법으로 SulfoLink(Pierce, USA) 컬럼에 결합시켰다.
<4-4> 항체의 정제
실시예 4-3의 방법으로 준비된 1 ㎖ 부피의 컬럼을 평형화 용액(25 mM Tris-HCl pH8.3 , 250 mM NaCl, 0.05% 소듐 아자이드; Sigma, USA)으로 평형화시킨 후, 실시예 4-2의 방법으로 수득한 혈청 10 ㎖을 넣고, 2시간 동안 상온에서 천천히 흔들어 주면서 항원-항체 반응을 이용하여 항-표준 펩타이드 항체를 컬럼에 붙였다. 세정 용액(25 mM Tris-HCl pH8.3 , 1.0 M NaCl, 0.05% 소듐 아자이드; Sigma, USA)으로 4회 세정하였고, 다시 평형화용액으로 평형화하였다. 마지막으로, 용출 용액(0.2M 글리신 pH 2.5, Sigma, USA) 2.5 ㎖로 항체를 용출시켰다.
< 실시예 5> 시료로부터 PTP 단백질의 추출
<5-1> 혈액 내 미량 단백질의 가수분해
암으로 확정 진단을 받은 대장암, 간암, 위암 환자 각 50여 명으로부터 혈액을 제공받아서 혈청을 분리하여 사용하였다. 정상인 혈액은 상업적으로 판매되는 정상인 혈청 혼합체(Sigma, USA)를 사용하였다. 상기 혈액을 2,000 rpm으로 10분간 원심분리함으로써 혈청을 수득하였고 -70℃에 냉동 보관하였다. 상기 혈청으로부터 Multiple affinity removal cartridge, Hu-7 키트(Agilent, USA)를 이용하여 Agilent사의 매뉴얼대로 혈장에 과량 존재하는 단백질(알부민, 글로불린 등)을 제거하였다.
상기 방법으로 수득한 정제된 혈장을 0.1 M 이탄산 암모늄(ammonium bicarbonate; Sigma, USA)로 희석하여 트립신 가수분해에 적절하도록 치환하였다. 이어서 열처리 또는/및 변성촉진화합물(urea, guanidine-HCl, rapigest 등 detergent) 처리 등의 방법으로 처리하였다. 구체적으로, 95℃에서 10분 정도 처리하거나 6~8 M 우레아 또는 구아니딘·HCL 및 최종농도가 0.1%가 되도록 RapiGest(Waters, USA)를 첨가하여 60℃에 2시간 동안 반응하는 방법으로 처리하였다. 이후 상기 반응액에 처리하고자하는 혈장 단백질 양의 50 내지 100분의 1의 양으로 트립신을 첨가하여 37℃에서 16시간 동안 트립신을 처리하여, 상기 혈장에 포함된 미량 단백질을 가수분해하여 펩타이드 혼합물을 수득하였다.
<5-2> 항체 컬럼을 활용한 표준 펩타이드의 추출
실시예 5-1-1의 방법으로 수득한 가수분해된 혈장 내에 포함된 펩타이드 혼성체 15 ㎕에 실시예 2의 방법으로 수득한 동위원소로 치환된 합성 표준 펩타이드 10-50 펨토몰을 첨가한 뒤, 상온에서 2시간 동안 인큐베이션 하였다.
실시예 4의 방법으로 수득한 항-표준 펩타이드 다클론 항체를 바이오틴화시킨 후, 스트렙타비딘이 고정화되어있는 컬럼(immoblized Streptavidin; Pierce, USA)에 결합시켰다. 바이오틴화는 Sulfo-NHS-LC-Biotin(Pierce, USA)를 최종농도가 10 mM이 되도록 초순수 정제수에 녹인 후, 바이오틴화 시키고자 하는 항체를 몰 비로 바이오틴과 1:20의 비율로 혼합한 후, 상온에서 한 시간 동안 섞으면서 반응시켰다. 반응 후, 반응하지 않은 바이오틴은 PBS(phosphate buffered saline) 완충용액을 이용하여 희석하는 방법으로 제거했다.
상기 방법으로 준비된 다클론 항체가 결합한 컬럼에 표준 펩타이드를 혼합하여 상온에서 2시간 반응하여 결합시킨 후, 세정 용액(25 mM Tris/HCl pH8.3, 1.0 M NaCl, 0.05% 소듐 아자이드)과 0.1 M 이탄산 암모늄 용액으로 차례로 4회씩 세정 후, 2% 포름산으로 결합한 펩타이드를 용출시켰다.
<5-3> 항체 혼합용액을 활용한 표준 펩타이드의 추출
다수의 표준 펩타이드를 동시에 추출해서 분석 및 프로파일링 하기 위하여는 항체 혼합용액을 사용하였다.
구체적으로, 2 내지 80개의 표준 펩타이드에 대한 항체(토끼 혈장 또는 정제된 항체) 각 1-10 ㎍씩 혼합용액(50 mM Tris·HCl pH 8.1, 250 mM NaCl)에 트립신 가수분해된 펩타이드 혼합체(50 mM Tris·HCl pH 8.1, 250 mM NaCl)를 섞은 후 밤새 4℃에서 반응시킨 후 protein G 비드(GE Healthcare, USA)를 사용하여 표준 펩타이드에 결합한 항체를 농축하였다. 항체가 결합한 비드를 세정 용액으로 2회, 1 M NaCl로 1회, ddH2O로 3회 세척한 후 ddH2O 500 ㎕에 혼합하여 85℃, 10분 가열로 비드로부터 항체 및 펩타이드를 용액화 하였다. 용액에 들어 있는 표준 펩타이드를 microcon YM10(Millipore, USA)을 사용하여 필터하였고 flow-through에 들어 있는 표준 펩타이드를 콜드트랩 방식의 스피드백을 이용해 말린 후 이를 0.1% 포름산에 녹여서 질량분석기로 분석하였다.
< 실시예 6> 정량적 질량분석을 통한 표준 펩타이드의 측정
<6-1> 질량분석용 시료의 준비
실시예 2의 방법으로 수득한 동위원소로 치환된 합성 표준 펩타이드, 실시예 5-2의 방법으로 수득한 야생형 및 실시예 5-3의 방법으로 수득한 펩타이드 혼합물로부터 C18 컬럼이 충진된 작은 회전용 컬럼(Waters, USA)을 이용하여 탈염을 실시하였다. 이후 진공상태에서 챔버온도 25℃에서 -85℃로 콜드트랩방식의 스피드백으로 2시간 30분 동안 0.2 torr의 압력으로 건조한 뒤, 이를 다시 0.1% 포름산 용액에 녹여서 NanoAquity UPLC에 결합된 Quattro Premier 질량분석(Waters, USA) 혹은 동일한 종류의 UPLC에 결합된 Q-Tof Premier 질량분석기에서 분석하기 위한 적당한 상태로 준비하였다. Quattro Premier와 Q-Tof Premier 질량분석기는 탠덤 질량 분석기로 NanoAquity UPLC(Waters, USA)에 결합하여 LC-탠덤 질량분석에 사용하였다. Quattro Premier는 트리플 사극자 질량분석기(Triple Quadrupole Mass Spectrometer)로서 민감도가 매우 높아 시료로부터의 펩타이드 정량분석에 주로 사용하였고, 사극자와 TOF를 결합시킨 Q-Tof Premier 질량분석기는 질량정확도가 매우 높은 것이 특징이며 표준 펩타이드 선정 등 펩타이드 질량의 정확성을 요하는 실험에 사용하였다.
<6-2> 탠덤 질량분석기를 이용한 정량분석
Quattro Premiere 질량분석기(Waters, USA)에 연결된 nanoAQUITY UPLC(Waters, USA)인 트리플 사극자 질량분석기에 의해서 실시예 6-1의 방법으로 준비한 질량분석용 야생형 및 동위원소가 치환된 표준 펩타이드를 정량분석 하였다. nanoAQUITY UPLC에는 BEH300 컬럼(입자크기 1.7 μm, ID 75 μm, 길이 100 mm)을 사용하였고 300 nL/분의 유속으로 40분간 A용액(0.1% 포름산 3차 증류수)과 B용액(0.1% 포름산 아세토니트릴)을 혼합하는 농도구배법으로 UPLC를 작동하였다. 질량분석기의 Capillary Voltage는 3.2kV를 사용하였다. 질량분석 데이터의 수집에는 MassLynx software(Waters, USA)의 MRM(multiple reaction monitoring) routine을 사용하였으며, 분석하고자 하는 표준 펩타이드 각각의 최적 절편화 에너지를 사용하였고(표 4), 모든 표준 펩타이드에 대해서 동위원소로 치환된 합성 표준 펩타이드를 동일한 조건으로 스캔하여 정확한 양의 분석이 가능하게 하였다. 한 번에 분석하고자 하는 표준 펩타이드 개수에 따라 0.05-0.02초의 휴지 시간(dwell time) 및 0.02-0.007초의 인터스캔 시간(interscan time)을 사용하였다. 시료 내 존재하는 야생형 표준 펩타이드의 절대양은 넣어준 양을 알고 있는 동위원소 표준 펩타이드에 의해서 나타나는 크로마토그램 피크의 크기와 비교해서 결정하였다.
그 결과, 도 4 내지 7에 나타난 바와 같이 PTP T46 펩타이드의 경우 야생형 표준펩타이드가 정량적으로 측정이 되었으며 동위원소치환 표준 펩타이드의 피크 크기와 비교해서 야생형 표준 펩타이드의 절대적 양을 계산할 수 있었다.
< 실시예 7> PTP 패널을 이용한 질환 진단
<7-1> PTP 패널의 구성
실시예 2의 방법으로 제조한 동위원소로 치환된 합성 표준 펩타이드를 각각 10-50 펩토 몰 씩 섞어서 혼합액을 제조하였다.
<7-2> PTP 패널을 이용한 질환 진단
실시예 5-1의 방법으로 수득한 암 환자 및 정상인의 혈청을 질환의 종류별로 20 내지 30명의 환자의 혈청을 혼합하여 질환별 혼합 혈청을 제조하였다. 상기 혼합 혈청을 실시예 5-1의 방법과 동일한 방법으로 트립신 가수분해함으로써 펩타이드 혼합체를 수득하였다. 상기 15 ㎕의 환자 혈청의 가수분해를 통해 얻어진 펩타이드 혼합체 전량에 실시예 7-1의 방법으로 준비한 동위원소로 치환된 합성 표준 펩타이드 혼합액 10-50 펨토 몰을 주입하였다. 상기 혼합액의 각각의 표준 펩타이드에 결합하는 항체 컬럼 또는 항체 용액 혼합체를 이용하여 야생형 및 동위원소로 치환된 합성 표준 펩타이드를 각각 실시예 5-2 또는 실시예 5-3의 방법으로 농축하고 실시예 6-1의 방법과 동일한 방법으로 탈염 후 스피드백에서 건조하였다. 상기 방법으로 준비한 시료를 0.1% 포름산으로 용액화 한 후 트리플 사극자 질량분석기인 Quattro Premiere 질량분석기(Waters, USA)에 연결된 nanoAquity UPLC(Waters, USA)에 의해서 실시예 6-2와 동일한 방법으로 표준 펩타이드의 양을 분석하였다. 시료 내 존재하는 야생형 표준 펩타이드의 절대양은 넣어준 양을 알고 있는 동위원소 표준 펩타이드에 의해서 나타나는 스펙트럼 피크의 크기와 비교해서 결정하였다.
그 결과, 대장암, 간암 및 위암 환자에게서 총 18 종의 PTP가 검출되었고(표 5), 상기 18개 중 12 종은 암환자에서만 검출되었으며 정상인 혈액에서는 검출되지 않았다. 또한, 6개 종은 정상인에게서도 검출되었으나 암환자에서 검출된 양이 훨씬 많아서 진단에 활용하는 것이 가능하였다(표 5). 특히 이중 3개의 PTP(T46, pk32, pk3)는 매우 정량적으로 검출하는 것이 가능하였다.
암환자 혈청에서 발견되는 PTP 표준 펩타이드(단위: femto mole)
번호 이름 대장암 간암 위암 정상인
1 T18 0.8 1.4 1.0 ×
2 pk3 1.0 0.9 × ×
3 T46 3.3 3.4 3.3 ×
4 T4 2.5 0.6 × ×
5 pk17 2.7 2.5 2.6 1.2
6 pk32 3.8 2.3 1.4 ×
7 T1 4.0 4.4 5.6 3.1
8 T19 2.4 1.6 3.1 1.2
9 T3 10.7 14.3 7.6 ns
10 T41 9.1 7.7 15.6 10.8
11 pk4 ns ns 4.2 ns
12 T25 ns ns 28.8 11.1
13 pk12 2.5 0.7 1.3 ns
14 p12 2.4 ns × ns
15 p16 1.9 1.0 ns ×
16 p19 × 34.5 ns ns
17 pk15 × ns 1.5 ×
18 T32 2.2 10.9 ns 5.3
×, 검출되지 않음; ns, 데이터가 약해서 해석이 힘든 경우.
<7-3> PTP T46 표준 펩타이드의 정량 분석
실시예 7-2에서 각 암환자에게서 고루 검출되었고, 정상인에게서는 검출되지 않은 T46을 대상으로 질환별 혈청에서의 정량분석을 수행하였다.
실시예 5-1의 방법으로 수득한 암 환자 및 정상인의 혈청을 질환의 종류별로 20 내지 30명의 환자의 혈청을 혼합하여 질환별 혼합 혈청을 제조하였다. 상기 혼합 혈청 15 ㎕를 실시예 5-1의 방법과 동일한 방법으로 혈청 내 과량 존재 단백질 제거 및 트립신 가수분해함으로써 펩타이드 혼합체를 수득하였다. 상기 15 ㎕의 환자 혈청의 가수분해를 통해 얻어진 펩타이드 혼합체 전량에 실시예 2의 방법으로 준비한 동위원소로 치환된 합성 표준 펩타이드 T46을 50 펨토몰 첨가하였다. T46 표준 펩타이드에 결합하는 항체를 이용하여 야생형 및 동위원소로 치환된 합성 표준 펩타이드를 각각 실시예 5-2 또는 실시예 5-3의 방법으로 농축하고 실시예 6-1의 방법과 동일한 방법으로 탈염 후 스피드백에서 건조하였다. 상기 방법으로 준비한 시료를 0.1% 포름산으로 용액화 한 후 트리플 사극자 질량분석기인 Quattro Premiere 질량분석기(Waters, USA)에 연결된 nanoAquity UPLC(Waters, USA)에 의해서 실시예 6-2와 동일한 방법으로 표준 펩타이드의 양을 분석하였다. 시료 내 존재하는 야생형 표준 펩타이드의 절대양은 넣어준 양을 알고 있는 동위원소 표준 펩타이드에 의해서 나타나는 스펙트럼 피크의 크기와 비교해서 결정하였다.
그 결과, 도 8 내지 10에 나타난 바와 같이 각 환자별 및 암 종류별로 그 발현량에 약간씩 차이는 있으나 고루 검출되는 것으로 나타났다.
도 1은 PTP 활성 도메인의 표준 펩타이드 선별과정을 나타낸 도이다:
a: LMPTP 활성 도메인 단백질 서열; 및,
b: LMPTP 활성 도메인의 트립신 가수분해 펩타이드 서열.
도 2 내지 3은 LMPTP 활성 도메인의 트립신 가수분해 펩타이드의 시퀀싱 결과를 나타낸 도이다:
2: 41-58의 펩타이드; 및,
3: 113-123의 펩타이드.
도 4 내지 7은 환자 혈액 내에서 측정된 PTP의 질량분석 크로마토그램 결과를 나타낸 도이다:
SISCAPA(Stable Isotope Standards and Capture by Anti-peptide Antibodies): 항체로 포집한 펩타이드를 질량분석 기법으로 정량분석 하는 방법;
MRM(Multiple Reaction Monitoring): 혈액 내에 있는 복잡한 단백질과 펩타이드의 분석을 위해 질량분석기를 이용한 프로테옴 분석방법;
4: 대장암 환자 혈액에서의 PTP T46의 측정(CL18: 대장암 환자 18번);
5: 간암 환자 혈액에서의 PTP T46의 측정(LV32: 간암 환자 32번);
6: 위암 환자 혈액에서의 PTP T46의 측정(ST16: 위암 환자 16번); 및,
7: 정상 개체 혈액에서의 PTP T46의 측정(SPS01: sigma pooled serum 1번; Sigma(USA)로부터 구입한 정상 개체 혈청 혼합체).
도 8 내지 10은 대장암, 간암 및 위암 환자 각각 20명의 혈액에 존재하는 PTP의 절대량을 나타낸 도이다(LV34, LV35 및 ST20은 실험에러로 낮은 양이 검출됨):
8: 대장암 환자(CL: colon);
9: 간암 환자(LV: liver); 및,
10: 위암 환자(ST: stomach).
<110> Korean Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Method for diagnosis of disease using quantitative monitoring of protein tyrosine phosphatase <130> 7P-10-49 <160> 290 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T4 Forward primer <400> 1 cgcgacgcta gcatggcaga cgacaataag ctcttc 36 <210> 2 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T4 Reverse primer <400> 2 gctgcgaagc tttacttgaa gttggcataa tctga 35 <210> 3 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T7 Forward primer <400> 3 ggcacccata tgctagtggc tgttgttgcc ttattg 36 <210> 4 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T7 Reverse primer <400> 4 gcgggatcct caatgccttg aatagactgg atc 33 <210> 5 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T48 Forward primer <400> 5 gccccacata tgcgagacca cccacccatc ccc 33 <210> 6 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T48 Reverse primer <400> 6 ggaagatctc tacgttgcat agtggtcaaa gctgcc 36 <210> 7 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T8 Forward primer <400> 7 gcgccatatg gcagacaagt accagcaact ctccctg 37 <210> 8 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T8 Reverse primer <400> 8 gcgcggatcc ctcggctggg gcctgggctg actgttg 37 <210> 9 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T23 Forward primer <400> 9 ccgttacata tggtggagaa ttttgaggcc tacttc 36 <210> 10 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T23 Reverse primer <400> 10 cccgaattct taggcgatgt aaccattggt ctttc 35 <210> 11 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T39 Forward primer <400> 11 cacattgcta gcatgaagac atcagacagc tatggg 36 <210> 12 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T39 Reverse primer <400> 12 cggctcaagc ttctaagatg attccaggta ctccaa 36 <210> 13 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T5 Forward primer <400> 13 gcccaccata tggccagcga taccagcagc ctg 33 <210> 14 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T5 Reverse primer <400> 14 gcgagatctt cagccagaat tcaagtattc cag 33 <210> 15 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T38 Forward primer <400> 15 gaccggcata tgcttgccaa ggagtggcag gccctc 36 <210> 16 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T38 Reverse primer <400> 16 ccgggatcct cactggggca gggccttgag gat 33 <210> 17 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T12 Forward primer <400> 17 cgccagcata tggccacgcg gccaccagac cga 33 <210> 18 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T12 Reverse primer <400> 18 gcgggatcct cactggggaa gggccttgag gat 33 <210> 19 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T15 Forward primer <400> 19 gagcatgcta gcatggctag ggagtgtgga gctggt 36 <210> 20 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T15 Reverse primer <400> 20 gcgggatccc taggacttgc taacattctc gtatat 36 <210> 21 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T10 Forward primer <400> 21 cctttccata tgaagcccat aggacttcaa gagagaag 38 <210> 22 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T10 Reverse primer <400> 22 gacagtaagc tttcaaagtc tgctctcata caggcaca 38 <210> 23 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T22 Forward primer <400> 23 cgcgaacata tgcttagcca cccgccaatt ccc 33 <210> 24 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T22 Reverse primer <400> 24 ggcggatcct cagcccacgg cctccagcag ggcctc 36 <210> 25 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T20 Forward primer <400> 25 ttcgctagcg ccatccgggt ggctgacttg 30 <210> 26 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T20 Reverse primer <400> 26 gcgggatccc taaaaggagc ttaaatattc cagtgcca 38 <210> 27 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PTP1B Forward primer <400> 27 atggagatgg aaaaggagtt cgagcagatc 30 <210> 28 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PTP1B Reverse primer <400> 28 gtcaacatgt gcgtggctac ggtcctcacg 30 <210> 29 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T25 Forward primer <400> 29 gctcccgcta gcatgcccac catcgagcgg gag 33 <210> 30 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T25 Reverse primer <400> 30 cgcggatcct taggtgtctg tcaatcttgg cct 33 <210> 31 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T41 Forward primer <400> 31 tcagagcata tggaggagaa gatcgaggat gac 33 <210> 32 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T41 Reverse primer <400> 32 gtggacgcta gcatgaaata tttgggcagt cccatt 36 <210> 33 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T18 Forward primer <400> 33 gccccccata tggtgaggtg gtttcaccga gac 33 <210> 34 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T18 Reverse primer <400> 34 ccggaattct cacttcctct tgagggaacc cttg 34 <210> 35 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pk32 Forward primer <400> 35 gaaccccata tgtctgtgaa cacaccccgg gaggtc 36 <210> 36 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pk32 Reverse primer <400> 36 cgggatcctc aggggctggg ttcctcaggc ag 32 <210> 37 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pk28 Forward primer <400> 37 ccgcggcata tggaacatca cgggcaatta aaa 33 <210> 38 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pk28 Reverse primer <400> 38 cgggatcctc acctgcagtg caccacgacc gg 32 <210> 39 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T32 Forward primer <400> 39 gcagtacata tgaatgggaa gttatcagaa gag 33 <210> 40 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T32 Reverse primer <400> 40 ggcggatcct cacttcagaa gctgaggctg ctgttttt 38 <210> 41 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T40 Forward primer <400> 41 gagcagcata tggcaggcct ggaggcacag aag 33 <210> 42 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T40 Reverse primer <400> 42 cgcggatcct taaatgagtc tggagttttg gag 33 <210> 43 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T2 Forward primer <400> 43 ctagggcata tgaaaaagac tcgagtagat gca 33 <210> 44 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T2 Reverse primer <400> 44 cgcggatcct tagatgagcc tggagctttt cag 33 <210> 45 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pk4 Forward primer <400> 45 aggccgcata tggtcatgga agtgggcacc ctg 33 <210> 46 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pk4 Reverse primer <400> 46 ggcggatcct cagctcccag cctctgccga acag 34 <210> 47 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pk7 Forward primer <400> 47 gttcatatga gtgccacaga gcccttggac 30 <210> 48 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pk7 Reverse primer <400> 48 gcgggatcct caggacgtgg ccagcacctg ggactc 36 <210> 49 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pk8 Forward primer <400> 49 gcggaccata tgggcccagt tgaaatcctt cccttc 36 <210> 50 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pk8 Reverse primer <400> 50 gcgagatctt cacgtggagg gcaggatctc agattcg 37 <210> 51 <211> 36 <212> DNA 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primer <400> 58 cgggatccct aggtgggggc cagctcgaag g 31 <210> 59 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pk13 Forward primer <400> 59 ctggaccata tgcagcggct gaacatcggc tac 33 <210> 60 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pk13 Reverse primer <400> 60 cgggatcctc acacaaccgt ctccactccc atc 33 <210> 61 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T27 Forward primer <400> 61 gttgcccata tggggccaac ccgaattctt c 31 <210> 62 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T27 Reverse primer <400> 62 ggatccttat gatgctccag tctggttc 28 <210> 63 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pk6 Forward primer <400> 63 gccgcccata tgtcgggctc gttcgagctc tcg 33 <210> 64 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pk6 Reverse primer <400> 64 cgggatccct agggtttcaa cttcccctcc 30 <210> 65 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pk14 Forward primer <400> 65 gccaagcata tgggcggaaa ccacatcccc gaaagg 36 <210> 66 <211> 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Asn Tyr Ile Asp Gly Tyr Arg Lys Gln Asn Ala Tyr Ile 85 90 95 Ala Thr Gln Gly Ser Leu Pro Glu Thr Phe Gly Asp Phe Trp Arg Met 100 105 110 Ile Trp Glu Gln Arg Ser Ala Thr Val Val Met Met Thr Lys Leu Glu 115 120 125 Glu Arg Ser Arg Val Lys Cys Asp Gln Tyr Trp Pro Ser Arg Gly Thr 130 135 140 Glu Thr His Gly Leu Val Gln Val Thr Leu Leu Asp Thr Val Glu Leu 145 150 155 160 Ala Thr Tyr Cys Val Arg Thr Phe Ala Leu Tyr Lys Asn Gly Ser Ser 165 170 175 Glu Lys Arg Glu Val Arg Gln Phe Gln Phe Thr Ala Trp Pro Asp His 180 185 190 Gly Val Pro Glu His Pro Thr Pro Phe Leu Ala Phe Leu Arg Arg Val 195 200 205 Lys Thr Cys Asn Pro Pro Asp Ala Gly Pro Met Val Val His Cys Ser 210 215 220 Ala Gly Val Gly Arg Thr Gly Cys Phe Ile Val Ile Asp Ala Met Leu 225 230 235 240 Glu Arg Ile Lys His Glu Lys Thr Val Asp Ile Tyr Gly His Val Thr 245 250 255 Leu Met Arg Ala Gln Arg Asn Tyr Met Val Gln Thr Glu Asp Gln Tyr 260 265 270 Ile Phe Ile His Asp Ala Leu Leu Glu Ala Val Thr Cys Gly Asn Thr 275 280 285 Glu Val Pro Ala Arg Asn Leu Tyr Ala Tyr Ile Gln Lys Leu Thr Gln 290 295 300 Ile Glu Thr Gly Glu Asn Val Thr Gly Met Glu Leu Glu Phe Lys Arg 305 310 315 320 Leu Ala Ser Ser Lys Ala His Thr Ser Arg Phe Ile Ser Ala Asn Leu 325 330 335 Pro Cys Asn Lys Phe Lys Asn Arg Leu Val Asn Ile Met Pro Tyr Glu 340 345 350 Ser Thr Arg Val Cys Leu Gln Pro Ile Arg Gly Val Glu Gly Ser Asp 355 360 365 Tyr Ile Asn Ala Ser Phe Ile Asp Gly Tyr Arg Gln Gln Lys Ala Tyr 370 375 380 Ile Ala Thr Gln Gly Pro Leu Ala Glu Thr Thr Glu Asp Phe Trp Arg 385 390 395 400 Met Leu Trp Glu His Asn Ser Thr Ile Val Val Met Leu Thr Lys Leu 405 410 415 Arg Glu Met Gly Arg Glu Lys Cys His Gln Tyr Trp Pro Ala Glu Arg 420 425 430 Ser Ala Arg Tyr Gln Tyr Phe Val Val Asp Pro Met Ala Glu Tyr Asn 435 440 445 Met Pro Gln Tyr Ile Leu Arg Glu Phe Lys Val Thr Asp Ala Arg Asp 450 455 460 Gly Gln Ser Arg Thr Val Arg Gln Phe Gln Phe Thr Asp Trp Pro Glu 465 470 475 480 Gln Gly Val Pro Lys Ser Gly Glu Gly Phe Ile Asp Phe Ile Gly Gln 485 490 495 Val His Lys Thr Lys Glu Gln Phe Gly Gln Asp Gly Pro Ile Ser Val 500 505 510 His Cys Ser Ala Gly Val Gly Arg Thr Gly Val Phe Ile Thr Leu Ser 515 520 525 Ile Val Leu Glu Arg Met Arg Tyr Glu Gly Val Val Asp Ile Phe Gln 530 535 540 Thr Val Lys Met Leu Arg Thr Gln Arg Pro Ala Met Val Gln Thr Glu 545 550 555 560 Asp Gln Tyr Gln Phe Ser Tyr Arg Ala Ala Leu Glu Tyr Leu Gly Ser 565 570 575 Phe Asp His Tyr Ala Thr 580 <210> 285 <211> 577 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 285 Met Gly Pro Gln Ala Ala Pro Leu Thr Ile Arg Gly Pro Ser Ser Ala 1 5 10 15 Gly Gln Ser Thr Pro Ser Pro His Leu Val Pro Ser Pro Ala Pro Ser 20 25 30 Pro Gly Pro Gly Pro Val Pro Pro Arg Pro Pro Ala Ala Glu Pro Pro 35 40 45 Pro Cys Leu Arg Arg Gly Ala Ala Ala Ala Asp Leu Leu Ser Ser Ser 50 55 60 Pro Glu Ser Gln His Gly Gly Thr Gln Ser Pro Gly Gly Gly Gln Pro 65 70 75 80 Leu Leu Gln Pro Thr Lys Val Asp Ala Ala Glu Gly Arg Arg Pro Gln 85 90 95 Ala Leu Arg Leu Ile Glu Arg Asp Pro Tyr Glu His Pro Glu Arg Leu 100 105 110 Arg Gln Leu Gln Gln Glu Leu Glu Ala Phe Arg Gly Gln Leu Gly Asp 115 120 125 Val Gly Ala Leu Asp Thr Val Trp Arg Glu Leu Gln Asp Ala Gln Glu 130 135 140 His Asp Ala Arg Gly Arg Ser Ile Ala Ile Ala Arg Cys Tyr Ser Leu 145 150 155 160 Lys Asn Arg His Gln Asp Val Met Pro Tyr Asp Ser Asn Arg Val Val 165 170 175 Leu Arg Ser Gly Lys Asp Asp Tyr Ile Asn Ala Ser Cys Val Glu Gly 180 185 190 Leu Ser Pro Tyr Cys Pro Pro Leu Val Ala Thr Gln Ala Pro Leu Pro 195 200 205 Gly Thr Ala Ala Asp Phe Trp Leu Met Val His Glu Gln Lys Val Ser 210 215 220 Val Ile Val Met Leu Val Ser Glu Ala Glu Met Glu Lys Gln Lys Val 225 230 235 240 Ala Arg Tyr Phe Pro Thr Glu Arg Gly Gln Pro Met Val His Gly Ala 245 250 255 Leu Ser Leu Ala Leu Ser Ser Val Arg Ser Thr Glu Thr His Val Glu 260 265 270 Arg Val Leu Ser Leu Gln Phe Arg Asp Gln Ser Leu Lys Arg Ser Leu 275 280 285 Val His Leu His Phe Pro Thr Trp Pro Glu Leu Gly Leu Pro Asp Ser 290 295 300 Pro Ser Asn Leu Leu Arg Phe Ile Gln Glu Val His Ala His Tyr Leu 305 310 315 320 His Gln Arg Pro Leu His Thr Pro Ile Ile Val His Cys Ser Ser Gly 325 330 335 Val Gly Arg Thr Gly Ala Phe Ala Leu Leu Tyr Ala Ala Val Gln Glu 340 345 350 Val Glu Ala Gly Asn Gly Ile Pro Glu Leu Pro Gln Leu Val Arg Arg 355 360 365 Met Arg Gln Gln Arg Lys His Met Leu Gln Glu Lys Leu His Leu Arg 370 375 380 Phe Cys Tyr Glu Ala Val Val Arg His Val Glu Gln Val Leu Gln Arg 385 390 395 400 His Gly Val Pro Pro Pro Cys Lys Pro Leu Ala Ser Ala Ser Ile Ser 405 410 415 Gln Lys Asn His Leu Pro Gln Asp Ser Gln Asp Leu Val Leu Gly Gly 420 425 430 Asp Val Pro Ile Ser Ser Ile Gln Ala Thr Ile Ala Lys Leu Ser Ile 435 440 445 Arg Pro Pro Gly Gly Leu Glu Ser Pro Val Ala Ser Leu Pro Gly Pro 450 455 460 Ala Glu Pro Pro Gly Leu Pro Pro Ala Ser Leu Pro Glu Ser Thr Pro 465 470 475 480 Ile Pro Ser Ser Ser Pro Pro Pro Leu Ser Ser Pro Leu Pro Glu Ala 485 490 495 Pro Gln Pro Lys Glu Glu Pro Pro Val Pro Glu Ala Pro Ser Ser Gly 500 505 510 Pro Pro Ser Ser Ser Leu Glu Leu Leu Ala Ser Leu Thr Pro Glu Ala 515 520 525 Phe Ser Leu Asp Ser Ser Leu Arg Gly Lys Gln Arg Met Ser Lys His 530 535 540 Asn Phe Leu Gln Ala His Asn Gly Gln Gly Leu Arg Ala Thr Arg Pro 545 550 555 560 Ser Asp Asp Pro Leu Ser Leu Leu Asp Pro Leu Trp Thr Leu Asn Lys 565 570 575 Thr <210> 286 <211> 300 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 286 Met Ser Arg Ser Leu Asp Ser Ala Arg Ser Phe Leu Glu Arg Leu Glu 1 5 10 15 Ala Arg Gly Gly Arg Glu Gly Ala Val Leu Ala Gly Glu Phe Ser Asp 20 25 30 Ile Gln Ala Cys Ser Ala Ala Trp Lys Ala Asp Gly Val Cys Ser Thr 35 40 45 Val Ala Gly Ser Arg Pro Glu Asn Val Arg Lys Asn Arg Tyr Lys Asp 50 55 60 Val Leu Pro Tyr Asp Gln Thr Arg Val Ile Leu Ser Leu Leu Gln Glu 65 70 75 80 Glu Gly His Ser Asp Tyr Ile Asn Gly Asn Phe Ile Arg Gly Val Asp 85 90 95 Gly Ser Leu Ala Tyr Ile Ala Thr Gln Gly Pro Leu Pro His Thr Leu 100 105 110 Leu Asp Phe Trp Arg Leu Val Trp Glu Phe Gly Val Lys Val Ile Leu 115 120 125 Met Ala Cys Arg Glu Ile Glu Asn Gly Arg Lys Arg Cys Glu Arg Tyr 130 135 140 Trp Ala Gln Glu Gln Glu Pro Leu Gln Thr Gly Leu Phe Cys Ile Thr 145 150 155 160 Leu Ile Lys Glu Lys Trp Leu Asn Glu Asp Ile Met Leu Arg Thr Leu 165 170 175 Lys Val Thr Phe Gln Lys Glu Ser Arg Ser Val Tyr Gln Leu Gln Tyr 180 185 190 Met Ser Trp Pro Asp Arg Gly Val Pro Ser Ser Pro Asp His Met Leu 195 200 205 Ala Met Val Glu Glu Ala Arg Arg Leu Gln Gly Ser Gly Pro Glu Pro 210 215 220 Leu Cys Val His Cys Ser Ala Gly Cys Gly Arg Thr Gly Val Leu Cys 225 230 235 240 Thr Val Asp Tyr Val Arg Gln Leu Leu Leu Thr Gln Met Ile Pro Pro 245 250 255 Asp Phe Ser Leu Phe Asp Val Val Leu Lys Met Arg Lys Gln Arg Pro 260 265 270 Ala Ala Val Gln Thr Glu Glu Gln Tyr Arg Phe Leu Tyr His Thr Val 275 280 285 Ala Gln Met Phe Cys Ser Thr Leu Gln Asn Ala Ser 290 295 300 <210> 287 <211> 614 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 287 Ser Thr Arg Gly Asp Gln Arg Ser Gly Gly Val Thr Glu Ala Ser Ser 1 5 10 15 Leu Leu Gly Gly Ser Pro Arg Arg Pro Cys Gly Arg Lys Gly Ser Pro 20 25 30 Tyr His Thr Gly Gln Leu His Pro Ala Val Arg Val Ala Asp Leu Leu 35 40 45 Gln His Ile Asn Gln Met Lys Thr Ala Glu Gly Tyr Gly Phe Lys Gln 50 55 60 Glu Tyr Glu Ser Phe Phe Glu Gly Trp Asp Ala Thr Lys Lys Lys Asp 65 70 75 80 Lys Val Lys Gly Ser Arg Gln Glu Pro Met Pro Ala Tyr Asp Arg His 85 90 95 Arg Val Lys Leu His Pro Met Leu Gly Asp Pro Asn Ala Asp Tyr Ile 100 105 110 Asn Ala Asn Tyr Ile Asp Gly Tyr His Arg Ser Asn His Phe Ile Ala 115 120 125 Thr Gln Gly Pro Lys Pro Glu Met Val Tyr Asp Phe Trp Arg Met Val 130 135 140 Trp Gln Glu His Cys Ser Ser Ile Val Met Ile Thr Lys Leu Val Glu 145 150 155 160 Val Gly Arg Val Lys Cys Ser Arg Tyr Trp Pro Glu Asp Ser Asp Thr 165 170 175 Tyr Gly Asp Ile Lys Ile Met Leu Val Lys Thr Glu Thr Leu Ala Glu 180 185 190 Tyr Val Val Arg Thr Phe Ala Leu Glu Arg Arg Gly Tyr Ser Ala Arg 195 200 205 His Glu Val Arg Gln Ser His Phe Thr Ala Trp Pro Glu His Gly Val 210 215 220 Pro Tyr His Ala Thr Gly Leu Leu Ala Phe Ile Arg Arg Val Lys Ala 225 230 235 240 Ser Thr Pro Pro Asp Ala Gly Pro Ile Val Ile His Cys Ser Ala Gly 245 250 255 Thr Gly Arg Thr Gly Cys Tyr Ile Val Leu Asp Val Met Leu Asp Met 260 265 270 Ala Glu Cys Glu Gly Val Val Asp Ile Tyr Asn Cys Val Lys Thr Leu 275 280 285 Cys Ser Arg Arg Val Asn Met Ile Gln Thr Glu Glu Gln Tyr Ile Phe 290 295 300 Ile His Asp Ala Ile Leu Glu Ala Cys Leu Cys Gly Glu Thr Thr Ile 305 310 315 320 Pro Val Ser Glu Phe Lys Ala Thr Tyr Lys Glu Met Ile Arg Ile Asp 325 330 335 Pro Gln Ser Asn Ser Ser Gln Leu Arg Glu Glu Phe Gln Thr Leu Asn 340 345 350 Ser Val Thr Pro Pro Leu Asp Val Glu Glu Cys Ser Ile Ala Leu Leu 355 360 365 Pro Arg Asn Arg Asp Lys Asn Arg Ser Met Asp Val Leu Pro Pro Asp 370 375 380 Arg Cys Leu Pro Phe Leu Ile Ser Thr Asp Gly Asp Ser Asn Asn Tyr 385 390 395 400 Ile Asn Ala Ala Leu Thr Asp Ser Tyr Thr Arg Arg Ser Ala Phe Met 405 410 415 Val Thr Leu His Pro Leu Gln Ser Thr Thr Pro Asp Phe Trp Arg Leu 420 425 430 Val Tyr Asp Tyr Gly Cys Thr Ser Ile Val Met Leu Asn Gln Leu Asn 435 440 445 Gln Ser Asn Ser Ala Trp Pro Cys Leu Gln Tyr Trp Pro Glu Pro Gly 450 455 460 Arg Gln Gln Tyr Gly Leu Met Glu Val Glu Phe Met Ser Gly Thr Ala 465 470 475 480 Asp Glu Asp Leu Val Ala Arg Val Phe Arg Val Gln Asn Ile Ser Arg 485 490 495 Leu Gln Glu Gly Asp Leu Leu Val Arg His Phe Gln Phe Leu Arg Trp 500 505 510 Ser Ala Tyr Arg Asp Thr Pro Asp Ser Lys Lys Ala Phe Leu His Leu 515 520 525 Leu Ala Glu Val Asp Lys Trp Gln Ala Glu Ser Gly Asp Gly Arg Thr 530 535 540 Ile Val His Cys Leu Asn Gly Gly Gly Arg Ser Gly Thr Phe Cys Ala 545 550 555 560 Cys Ala Thr Val Leu Glu Met Ile Arg Cys His Asn Leu Val Asp Val 565 570 575 Phe Phe Ala Ala Gln Thr Leu Arg Asn Tyr Lys Pro Asn Met Val Glu 580 585 590 Thr Met Asp Gln Tyr His Phe Cys Tyr Asp Val Ala Leu Glu Tyr Leu 595 600 605 Glu Gly Leu Glu Ser Arg 610 <210> 288 <211> 326 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 288 Met Asp Gln Arg Glu Ile Leu Gln Lys Phe Leu Asp Glu Ala Gln Ser 1 5 10 15 Lys Lys Ile Thr Lys Glu Glu Phe Ala Asn Glu Phe Leu Lys Leu Lys 20 25 30 Arg Gln Ser Thr Lys Tyr Lys Ala Asp Lys Thr Tyr Pro Thr Thr Val 35 40 45 Ala Glu Lys Pro Lys Asn Ile Lys Lys Asn Arg Tyr Lys Asp Ile Leu 50 55 60 Pro Tyr Asp Tyr Ser Arg Val Glu Leu Ser Leu Ile Thr Ser Asp Glu 65 70 75 80 Asp Ser Ser Tyr Ile Asn Ala Asn Phe Ile Lys Gly Val Tyr Gly Pro 85 90 95 Lys Ala Tyr Ile Ala Thr Gln Gly Pro Leu Ser Thr Thr Leu Leu Asp 100 105 110 Phe Trp Arg Met Ile Trp Glu Tyr Ser Val Leu Ile Ile Val Met Ala 115 120 125 Cys Met Glu Tyr Glu Met Gly Lys Lys Lys Cys Glu Arg Tyr Trp Ala 130 135 140 Glu Pro Gly Glu Met Gln Leu Glu Phe Gly Pro Phe Ser Val Ser Cys 145 150 155 160 Glu Ala Glu Lys Arg Lys Ser Asp Tyr Ile Ile Arg Thr Leu Lys Val 165 170 175 Lys Phe Asn Ser Glu Thr Arg Thr Ile Tyr Gln Phe His Tyr Lys Asn 180 185 190 Trp Pro Asp His Asp Val Pro Ser Ser Ile Asp Pro Ile Leu Glu Leu 195 200 205 Ile Trp Asp Val Arg Cys Tyr Gln Glu Asp Asp Ser Val Pro Ile Cys 210 215 220 Ile His Cys Ser Ala Gly Cys Gly Arg Thr Gly Val Ile Cys Ala Ile 225 230 235 240 Asp Tyr Thr Trp Met Leu Leu Lys Asp Gly Ile Ile Pro Glu Asn Phe 245 250 255 Ser Val Phe Ser Leu Ile Arg Glu Met Arg Thr Gln Arg Pro Ser Leu 260 265 270 Val Gln Thr Gln Glu Gln Tyr Glu Leu Val Tyr Asn Ala Val Leu Glu 275 280 285 Leu Phe Lys Arg Gln Met Asp Val Ile Arg Asp Lys His Ser Gly Thr 290 295 300 Glu Ser Gln Ala Lys His Cys Ile Pro Glu Lys Asn His Thr Leu Gln 305 310 315 320 Ala Asp Ser Tyr Ser Pro 325 <210> 289 <211> 601 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 289 Met Leu Leu Ser Arg Ser Pro Ser Gly Pro Lys Lys Tyr Phe Pro Ile 1 5 10 15 Pro Val Glu His Leu Glu Glu Glu Ile Arg Ile Arg Ser Ala Asp Asp 20 25 30 Cys Lys Gln Phe Arg Glu Glu Phe Asn Ser Leu Pro Ser Gly His Ile 35 40 45 Gln Gly Thr Phe Glu Leu Ala Asn Lys Glu Glu Asn Arg Glu Lys Asn 50 55 60 Arg Tyr Pro Asn Ile Leu Pro Asn Asp His Ser Arg Val Ile Leu Ser 65 70 75 80 Gln Leu Asp Gly Ile Pro Cys Ser Asp Tyr Ile Asn Ala Ser Tyr Ile 85 90 95 Asp Gly Tyr Lys Glu Lys Asn Lys Phe Ile Ala Ala Gln Gly Pro Lys 100 105 110 Gln Glu Thr Val Asn Asp Phe Trp Arg Met Val Trp Glu Gln Lys Ser 115 120 125 Ala Thr Ile Val Met Leu Thr Asn Leu Lys Glu Arg Lys Glu Glu Lys 130 135 140 Cys His Gln Tyr Trp Pro Asp Gln Gly Cys Trp Thr Tyr Gly Asn Ile 145 150 155 160 Arg Val Cys Val Glu Asp Cys Val Val Leu Val Asp Tyr Thr Ile Arg 165 170 175 Lys Phe Cys Ile Gln Pro Gln Leu Pro Asp Gly Cys Lys Ala Pro Arg 180 185 190 Leu Val Ser Gln Leu His Phe Thr Ser Trp Pro Asp Phe Gly Val Pro 195 200 205 Phe Thr Pro Ile Gly Met Leu Lys Phe Leu Lys Lys Val Lys Thr Leu 210 215 220 Asn Pro Val His Ala Gly Pro Ile Val Val His Cys Ser Ala Gly Val 225 230 235 240 Gly Arg Thr Gly Thr Phe Ile Val Ile Asp Ala Met Met Ala Met Met 245 250 255 His Ala Glu Gln Lys Val Asp Val Phe Glu Phe Val Ser Arg Ile Arg 260 265 270 Asn Gln Arg Pro Gln Met Val Gln Thr Asp Met Gln Tyr Thr Phe Ile 275 280 285 Tyr Gln Ala Leu Leu Glu Tyr Tyr Leu Tyr Gly Asp Thr Glu Leu Asp 290 295 300 Val Ser Ser Leu Glu Lys His Leu Gln Thr Met His Gly Thr Thr Thr 305 310 315 320 His Phe Asp Lys Ile Gly Leu Glu Glu Glu Phe Arg Lys Leu Thr Asn 325 330 335 Val Arg Ile Met Lys Glu Asn Met Arg Thr Gly Asn Leu Pro Ala Asn 340 345 350 Met Lys Lys Ala Arg Val Ile Gln Ile Ile Pro Tyr Asp Phe Asn Arg 355 360 365 Val Ile Leu Ser Met Lys Arg Gly Gln Glu Tyr Thr Asp Tyr Ile Asn 370 375 380 Ala Ser Phe Ile Asp Gly Tyr Arg Gln Lys Asp Tyr Phe Ile Ala Thr 385 390 395 400 Gln Gly Pro Leu Ala His Thr Val Glu Asp Phe Trp Arg Met Ile Trp 405 410 415 Glu Trp Lys Ser His Thr Ile Val Met Leu Thr Glu Val Gln Glu Arg 420 425 430 Glu Gln Asp Lys Cys Tyr Gln Tyr Trp Pro Thr Glu Gly Ser Val Thr 435 440 445 His Gly Glu Ile Thr Ile Glu Ile Lys Asn Asp Thr Leu Ser Glu Ala 450 455 460 Ile Ser Ile Arg Asp Phe Leu Val Thr Leu Asn Gln Pro Gln Ala Arg 465 470 475 480 Gln Glu Glu Gln Val Arg Val Val Arg Gln Phe His Phe His Gly Trp 485 490 495 Pro Glu Ile Gly Ile Pro Ala Glu Gly Lys Gly Met Ile Asp Leu Ile 500 505 510 Ala Ala Val Gln Lys Gln Gln Gln Gln Thr Gly Asn His Pro Ile Thr 515 520 525 Val His Cys Ser Ala Gly Ala Gly Arg Thr Gly Thr Phe Ile Ala Leu 530 535 540 Ser Asn Ile Leu Glu Arg Val Lys Ala Glu Gly Leu Leu Asp Val Phe 545 550 555 560 Gln Ala Val Lys Ser Leu Arg Leu Gln Arg Pro His Met Val Gln Thr 565 570 575 Leu Glu Gln Tyr Glu Phe Cys Tyr Lys Val Val Gln Asp Phe Ile Asp 580 585 590 Ile Phe Ser Asp Tyr Ala Asn Phe Lys 595 600 <210> 290 <211> 590 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 290 Met Glu Ala Ile Pro Val Lys Gln Phe Val Lys His Ile Gly Glu Leu 1 5 10 15 Tyr Ser Asn Asn Gln His Gly Phe Ser Glu Asp Phe Glu Glu Val Gln 20 25 30 Arg Cys Thr Ala Asp Met Asn Ile Thr Ala Glu His Ser Asn His Pro 35 40 45 Glu Asn Lys His Lys Asn Arg Tyr Ile Asn Ile Leu Ala Tyr Asp His 50 55 60 Ser Arg Val Lys Leu Arg Pro Leu Pro Gly Lys Asp Ser Lys His Ser 65 70 75 80 Asp Tyr Ile Asn Ala Asn Tyr Val Asp Gly Tyr Asn Lys Ala Lys Ala 85 90 95 Tyr Ile Ala Thr Gln Gly Pro Leu Lys Ser Thr Phe Glu Asp Phe Trp 100 105 110 Arg Met Ile Trp Glu Gln Asn Thr Gly Ile Ile Val Met Ile Thr Asn 115 120 125 Leu Val Glu Lys Gly Arg Arg Lys Cys Asp Gln Tyr Trp Pro Thr Glu 130 135 140 Asn Ser Glu Glu Tyr Gly Asn Ile Ile Val Thr Leu Lys Ser Thr Lys 145 150 155 160 Ile His Ala Cys Tyr Thr Val Arg Arg Phe Ser Ile Arg Asn Thr Lys 165 170 175 Val Lys Lys Gly Gln Lys Gly Asn Pro Lys Gly Arg Gln Asn Glu Arg 180 185 190 Val Val Ile Gln Tyr His Tyr Thr Gln Trp Pro Asp Met Gly Val Pro 195 200 205 Glu Tyr Ala Leu Pro Val Leu Thr Phe Val Arg Arg Ser Ser Ala Ala 210 215 220 Arg Met Pro Glu Thr Gly Pro Val Leu Val His Cys Ser Ala Gly Val 225 230 235 240 Gly Arg Thr Gly Thr Tyr Ile Val Ile Asp Ser Met Leu Gln Gln Ile 245 250 255 Lys Asp Lys Ser Thr Val Asn Val Leu Gly Phe Leu Lys His Ile Arg 260 265 270 Thr Gln Arg Asn Tyr Leu Val Gln Thr Glu Glu Gln Tyr Ile Phe Ile 275 280 285 His Asp Ala Leu Leu Glu Ala Ile Leu Gly Lys Glu Thr Glu Val Ser 290 295 300 Ser Asn Gln Leu His Ser Tyr Val Asn Ser Ile Leu Ile Pro Gly Val 305 310 315 320 Gly Gly Lys Thr Arg Leu Glu Lys Gln Phe Lys Leu Val Thr Gln Cys 325 330 335 Asn Ala Lys Tyr Val Glu Cys Phe Ser Ala Gln Lys Glu Cys Asn Lys 340 345 350 Glu Lys Asn Arg Asn Ser Ser Val Val Pro Ser Glu Arg Ala Arg Val 355 360 365 Gly Leu Ala Pro Leu Pro Gly Met Lys Gly Thr Asp Tyr Ile Asn Ala 370 375 380 Ser Tyr Ile Met Gly Tyr Tyr Arg Ser Asn Glu Phe Ile Ile Thr Gln 385 390 395 400 His Pro Leu Pro His Thr Thr Lys Asp Phe Trp Arg Met Ile Trp Asp 405 410 415 His Asn Ala Gln Ile Ile Val Met Leu Pro Asp Asn Gln Ser Leu Ala 420 425 430 Glu Asp Glu Phe Val Tyr Trp Pro Ser Arg Glu Glu Ser Met Asn Cys 435 440 445 Glu Ala Phe Thr Val Thr Leu Ile Ser Lys Asp Arg Leu Cys Leu Ser 450 455 460 Asn Glu Glu Gln Ile Ile Ile His Asp Phe Ile Leu Glu Ala Thr Gln 465 470 475 480 Asp Asp Tyr Val Leu Glu Val Arg His Phe Gln Cys Pro Lys Trp Pro 485 490 495 Asn Pro Asp Ala Pro Ile Ser Ser Thr Phe Glu Leu Ile Asn Val Ile 500 505 510 Lys Glu Glu Ala Leu Thr Arg Asp Gly Pro Thr Ile Val His Asp Glu 515 520 525 Tyr Gly Ala Val Ser Ala Gly Met Leu Cys Ala Leu Thr Thr Leu Ser 530 535 540 Gln Gln Leu Glu Asn Glu Asn Ala Val Asp Val Phe Gln Val Ala Lys 545 550 555 560 Met Ile Asn Leu Met Arg Pro Gly Val Phe Thr Asp Ile Glu Gln Tyr 565 570 575 Gln Phe Ile Tyr Lys Ala Arg Leu Ser Leu Val Ser Thr Lys 580 585 590

Claims (27)

  1. 서열번호 113 내지 168로 기재된 아미노산 서열 중 어느 하나의 서열을 갖는 타이로신 탈인산화효소(protein tyrosine phosphatase; 이하, PTP) 활성 도메인 또는 서열번호 256 내지 260 및 서열번호 271 내지 290으로 기재된 아미노산 서열 중 어느 하나의 서열을 갖는 PTP 단백질을 가수분해 처리하여 생성된 PTP의 발현량 정량 분석용 표준 펩타이드.
  2. 제 1항에 있어서, 서열번호 169 내지 255로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 표준 펩타이드.
  3. 서열번호 169 내지 255로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가진 PTP의 발현 정량 분석용 합성 표준 펩타이드.
  4. 제 3항에 있어서, 산화위험성이 있는 잔기를 포함하는 아미노산인 시스테인 및 메티오닌을 제외한 아미노산이 안정한 동위원소를 가진 아미노산인 류신, 발린, 아르기닌 또는 리신으로 치환되는 것을 특징으로 하는 합성 표준 펩타이드.
  5. 제 4항에 있어서, 치환은 합성 과정에서 안정한 동위원소를 가진 아미노산인 류신, 발린, 아르기닌 또는 리신을 첨가함으로써 이루어지거나, 합성 후 특정 아미노산에 안정한 동위원소를 가진 기능기를 표지함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 합성 표준 펩타이드.
  6. 삭제
  7. 제 4항에 있어서, 안정한 동위원소는 13C, 15N 및 2H로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 표준 펩타이드.
  8. 제 1항의 표준 펩타이드 또는 제 3항의 합성 표준 펩타이드에 특이적으로 결합할 수 있는 항체.
  9. 제 8항에 있어서, 항체는 다클론 항체 또는 단클론 항체인 것을 특징으로 하 는 항체.
  10. 1) 피검체로부터 분리된 시료를 가수분해하는 단계;
    2) 단계 1)의 가수분해된 시료에 제 4항의 합성 표준 펩타이드를 첨가하는 단계;
    3) 단계 2)의 가수분해된 시료로부터 야생형 및 동위원소로 치환된 합성 표준 펩타이드를 추출하여 정량분석하는 단계; 및,
    4) 단계 3)의 야생형 펩타이드의 발현량과 동위원소로 치환된 합성 표준 펩타이드의 양을 비교하여 야생형 펩타이드 발현량의 절대값을 구하는 단계를 포함하는 PTP 정량 방법.
  11. 제 10항에 있어서, 단계 1)의 시료는 혈액, 조직 및 분비물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 10항에 있어서, 단계 1)의 가수분해는 트립신, 키모트립신, 펩신, 써몰리신 및 프로티나제 K로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 10항에 있어서, 단계 3)의 표준 펩타이드의 추출은 상기 펩타이드에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 리간드를 이용하여 추출할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 13항에 있어서, 항체는 다클론 항체 또는 단클론 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 13항에 있어서, 항체는 다클론 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 10항에 있어서, 단계 3)의 정량분석은 LC/MS 질량분석 방법, SELDI(Surface-Enchanced Laser Desorption/Ionization) 및 샌드위치 ELISA를 이용한 정량분석 방법으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 방법에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 1) 피검체로부터 분리된 시료로부터 PTP를 농축하는 단계;
    2) 단계 1)의 농축된 시료를 가수분해하는 단계;
    3) 단계 2)의 가수분해된 시료에 제 4항의 합성 표준 펩타이드를 첨가하는 단계; 및,
    4) 단계 3)의 야생형 펩타이드의 발현량과 동위원소로 치환된 합성 표준 펩타이드의 양을 비교하여 야생형 펩타이드 발현량의 절대값을 구하는 단계를 포함하는 PTP 정량 방법.
  18. 제 17항에 있어서, 단계 1)의 PTP 농축은 PTP 효소 활성부위에 결합하는 화합물을 사용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 1) 암에 걸린 개체로부터 분리된 시료를 가수분해하는 단계;
    2) 단계 1)의 가수분해된 시료에 제 4항의 합성 표준 펩타이드를 첨가하는 단계;
    3) 단계 2)의 가수분해된 시료로부터 야생형 및 동위원소로 치환된 합성 표준 펩타이드를 추출하여 정량분석하는 단계;
    4) 단계 3)의 야생형 펩타이드의 발현량과 동위원소로 치환된 합성 표준 펩타이드의 양을 비교하여 야생형 펩타이드 발현량의 절대값을 구하는 단계; 및,
    5) 단계 4)의 절대값과 정상 개체에게서의 야생형 펩타이드 발현량의 절대값을 비교하여 정상 개체와 통계적으로 유의한 차이를 보이는 표준 펩타이드를 확인하는 단계를 포함하는 암 관련 바이오 마커를 스크리닝하는 방법.
  20. 1) 특정 질환을 앓고 있는 개체로부터 분리된 시료를 가수분해하는 단계;
    2) 단계 1)의 가수분해된 시료에 제 4항의 합성 표준 펩타이드를 첨가하는 단계;
    3) 단계 2)의 가수분해된 시료로부터 야생형 및 동위원소로 치환된 합성 표준 펩타이드를 추출하여 정량분석하는 단계;
    4) 단계 3)의 야생형 펩타이드의 발현량과 동위원소로 치환된 합성 표준 펩타이드의 양을 비교하여 야생형 펩타이드 발현량의 절대값을 구하는 단계; 및,
    5) 단계 4)의 절대값과 정상 개체에게서의 야생형 펩타이드 발현량의 절대값을 비교하여 정상 개체와 통계적으로 유의한 차이를 보이는 표준 펩타이드를 확인하는 단계를 포함하는 특정 질환 특이적 바이오 마커를 스크리닝하는 방법.
  21. 1) 암에 걸린 개체로부터 분리된 시료를 가수분해하는 단계;
    2) 단계 1)의 가수분해된 시료에 제 19항의 방법으로 스크리닝된 하나 이상의 바이오 마커의 동위원소로 치환된 합성 표준 펩타이드를 첨가하는 단계;
    3) 단계 2)의 가수분해된 시료로부터 야생형 및 동위원소로 치환된 합성 표준 펩타이드를 추출하여 정량분석하는 단계;
    4) 단계 3)의 야생형 펩타이드의 발현량과 동위원소로 치환된 합성 표준 펩타이드의 양을 비교하여 야생형 펩타이드 발현량의 절대값을 구하는 단계; 및,
    5) 단계 4)의 절대값과 정상 개체에게서의 야생형 펩타이드 발현량의 절대값을 비교하여 정상 개체와 유의한 차이를 보이는 표준 펩타이드를 확인하는 단계를 포함하는 암 질환의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  22. 1) 피검체로부터 분리된 시료로부터 PTP를 농축하는 단계;
    2) 단계 1)의 농축된 시료를 가수분해하는 단계;
    3) 단계 2)의 가수분해된 시료에 제 19항의 방법으로 스크리닝된 하나 이상의 바이오 마커의 동위원소로 치환된 합성 표준 펩타이드를 첨가하는 단계; 및,
    4) 단계 3)의 야생형 펩타이드의 발현량과 동위원소로 치환된 합성 표준 펩타이드의 양을 비교하여 야생형 펩타이드 발현량의 절대값을 구하는 단계; 및,
    5) 단계 4)의 절대값과 정상 개체에게서의 야생형 펩타이드 발현량의 절대값을 비교하여 정상 개체와 유의한 차이를 보이는 개체를 확인하는 단계를 포함하는 암질환의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  23. 제 22항에 있어서, 단계 1)의 PTP 농축은 PTP 효소 활성부위에 결합하는 화합물을 사용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 8항의 항체를 포함하는 암 질환 진단용 키트.
  25. 제 24항에 있어서, 항체는 다클론 또는 단클론 항체인 것을 특징으로 하는 암 질환 진단용 키트.
  26. 제 1항의 표준 펩타이드 또는 제 3항의 합성 표준 펩타이드에 특이적으로 결합할 수 있는 제 1 단클론 항체 및 상기 제 1 단클론 항체가 결합한 부위를 제외한 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 제 2 단클론 항체를 포함하는 암 질환 진단용 키트.
  27. 제 26항에 있어서, 제 2 단클론 항체에 결합할 수 있으며, 발색 반응용 기질과 반응할 수 있는 효소가 표지 된 2차 항체 또는 바이오틴으로 표지 된 2차 항체를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 암 질환 진단용 키트.
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