CN104655849B - 一种肿瘤靶标的筛选方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，公开了一种肿瘤靶标的筛选方法，即用差异蛋白显示技术获得特定肿瘤标志物的全蛋白，经过水解获得肽段，经超高效液相和飞行时间质谱获得肽段的序列；将特异性结合所述序列的肽段的单克隆抗体与组织库进行特异性筛选；挑选出与正常组织不表达、仅一种肿瘤组织表达的肽段结合的单抗，该单抗对应的肽段即为目的肿瘤靶标。本发明所述方法获得的肿瘤靶标具有高特异性，氨基酸序列短，适合开展特异性的树突状细胞体外递呈T淋巴细胞进行特异性的CTL杀伤实验和临床细胞免疫治疗，具有良好的应用前景。

Description

一种肿瘤靶标的筛选方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种肿瘤靶标的筛选方法。
背景技术
肿瘤是目前医学面临的重要挑战之一。据统计，每年我国癌症死亡人数约200万，近二十年来癌症的发病率呈直线上升趋势。虽然各国在癌症基础研究和临床治疗领域投入巨大，但所取得的成果仍不令人满意。传统观点认为，体细胞遭遇突变后会比邻近的细胞增殖更快，导致了癌症的发生。这使得癌细胞易受裂解细胞的靶标介质攻击，由此产生如：放射性疗法，细胞毒性化学疗法(cytotoxicchemotherapies)和最近的靶标治疗法。
肿瘤靶向治疗技术是指在无创或微创条件下以肿瘤为目标,采用有选择、针对性较强、患者易于接受、反应小的局部或全身治疗,最终达到有效控制肿瘤,减少肿瘤周围正常组织损伤为目的的各种手段的总称。目前,肿瘤靶向治疗凭借其特异性与靶向性,在肿瘤治疗中发挥越来越重要作用,成为肿瘤治疗的主攻方向。肿瘤靶向治疗技术按治疗原理可分为生物性靶向治疗、化学性靶向治疗、物理性靶向治疗三大类。寻找合适的肿瘤靶标是生物性靶向治疗的紧急任务。
发明内容
本发明的目的是提供一种肿瘤靶标的筛选方法，包含以下步骤：
步骤1：用差异蛋白显示技术获得特定肿瘤标志物的全蛋白，经过水解获得肽段，经超高效液相和飞行时间质谱获得肽段的序列；
步骤2：将特异性结合所述序列的肽段的单克隆抗体与组织库进行特异性筛选；
步骤3：挑选与组织库中阴性组织不表达、仅该特定肿瘤组织表达的肽段结合的单抗，该单抗对应的肽段即为目的肿瘤靶标。
作为优选，步骤1所述全蛋白采用差异蛋白显示技术或单抗捕获技术或其结合获得。
作为优选，步骤2所述筛选为免疫组化、Elisa。
作为优选，步骤3所述组织库阴性组织包括正常组织及不同种类的肿瘤组织。
本发明使用差异蛋白显示技术和肿瘤标志物单克隆技术从肿瘤细胞系、肿瘤活检组织、肿瘤患者血清或体液等临床样本中获得肿瘤标志物全蛋白，经过水解获得肽段，经超高效液相和飞行时间质谱获得肽段的序列。将此序列通过多肽合成、纯化获得高纯度的多肽。将合成肽制备出单克隆抗体与组织库进行特异性筛选，选取与正常组织不表达，只与一种肿瘤组织表达的单克隆抗体进行抗体药物的应用开发，所对应的表位肽进行瘤苗的研制和树突状细胞的体外活化。
本发明所述方法筛选获得的肿瘤靶标特异性高，氨基酸序列较短，适合开展特异性的树突状细胞体外递呈T淋巴细胞进行特异性的CTL杀伤实验和临床细胞免疫治疗，较目前开展的利用细胞因子或肿瘤活检组织等体外诱导的CTL具有较高的特异性，更安全有效，是当今最符合细胞免疫治疗原理的技术。
术语与定义：
靶标：是指在肿瘤细胞中所特有的，并且只存在于某一种肿瘤细胞而不表达于正常细胞或其它种类肿瘤细胞的特异性的抗原决定簇。由肿瘤细胞本身所产生或由机体对肿瘤细胞反应而产生的，反映肿瘤存在和生长的一类物质。靶标可以是肿瘤标志物、表位肽、突变基因等。
DC细胞(Dendritic Cell，即树突状细胞)，是正常人体内存在的一种具有强大的抗原呈递功能的一类特殊细胞，能够直接摄取、加工和呈递抗原，刺激体内的初始型T细胞活化，是机体免疫应答的“启动者”。DC相当于信使，将抗原信息传递给可以发挥免疫效应和杀伤功能的效应者即T细胞。
附图说明
图1示本发明所述方法的流程图。
具体实施方式
本发明公开了一种肿瘤靶标的筛选方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1：靶标设计及抗体制备
1.靶标的设计:取活检肿瘤组织、肿瘤细胞系、肿瘤患者血清或体液等临床样本中，经过蛋白质组学差异蛋白显示技术和与所取肿瘤活检组织相关的标志物单抗捕获技术两路并行获得该肿瘤标志物的蛋白，经过水解，在超高效液相和串联的飞行时间质谱上筛选确定靶标的序列范围。
2.靶标的合成：将确定的靶标序列通过固相合成及在线裂解，经UPLC和Q-TOF进行分子量、纯度及二级结构鉴定，在蛋白纯化系统上获得高纯度的表位肽。
3.靶标单抗的制备和特异性筛选：将合成的高纯度表位肽通过细胞融合制备单克隆抗体。
实施例2：ELISA方法筛选单克隆抗体细胞株
具体步骤如下：
1.包被免疫原合成表位肽
1)将合成纯化的多肽稀释到终浓度1ug/ml
2)每孔200ul,用封口膜封上.
3)至于4℃冰箱过夜
2.洗板(洗板机洗3遍)拍干
3.封闭
1)配5％脱脂奶粉,满孔封闭
2)附上封口膜至于37℃水浴锅里温育2小时
4.洗板拍干(同2)
5.吸取亚克隆单克隆抗体孔的培养上清(每孔100ul,37℃水浴锅里温育1小时)，空白对照使用PBS
6.洗板拍干(洗板机洗5遍)
7.加酶标记二抗
1)用PBS 1:5000倍稀释
2)每孔100ul,37℃水浴锅里温育0.5小时
9.洗板拍干(洗板机洗5遍)
10.加底物(每孔100ul,37℃水浴锅里温育10-20分钟)
11.加终止液(每孔50ul)
进行吸光度检测，结果显示，吸光度大于0.5为阳性(标准：0.5-1.0为+；1.0-2.0为++；2.0-3.0为+++；4.0以上为++++)，优选阳性强者。
实施例3：组织库筛选
使用所述单抗经过免疫组化在组织库上进行特异性筛选，确定特异性靶标序列。
阴性组织包括：
1、与所取样本的不同种肿瘤组织，每种30例；
2、正常组织：包括心脏、肺脏、肝脏、脾脏、肾脏、输尿管、胃、垂体、肾上腺、甲状腺、甲状旁腺、淋巴结、膀胱、小脑、大脑皮质、结肠、眼球、乳腺、胰腺、前列腺、皮肤、肌肉、睾丸、胸腺、子宫、卵巢、输卵管、骨髓、胎盘组织、血管(内皮)、血细胞、脊髓。
阳性组织：与所述样本的同种肿瘤组织，包括高、中、低及未分化各种分化程度的活检标本，每种10例；
选取检测结果为：正常组织阴性、不同种肿瘤组织阴性、同种肿瘤阳性的单克隆抗体，该单抗对应的肽段即为目的肿瘤靶标。将该单克隆抗体进行抗体药物的应用开发，所对应的表位肽进行瘤苗的研制和树突状细胞的体外活化。
实施例4：靶标单克隆抗体免疫组化特异性筛选
石蜡切片：取正常组织芯片蜡块、结肠癌组织芯片蜡块和其他肿瘤组织芯片蜡块进行石蜡切片，烤片，58℃，20分钟,
常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水；二甲苯I 20min--二甲苯II 20min--100％酒精I 10min--100％II 10min--95％5min--80％5min--70％5min
阻断：灭活内源性过氧化物酶：3％H2O237℃孵育10min，PBS冲洗3X5min；
抗原修复:置0.01M枸橼酸缓冲液(PH 6.0)中用煮沸(95℃，15－20min)，自然冷却20min以上，再用冷水冲洗缸子，加快冷却至室温，PBS冲洗3X5min。
正常羊血清工作液封闭，37℃10min，倾去勿洗。
滴加结肠癌靶标单克隆抗体4℃冰箱孵育过夜，PBS冲洗3X5min(用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照)；滴加生物素标记二抗,37℃孵育30min,PBS冲洗3X5min；
滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液，37℃孵育0min,PBS冲洗3X5min；
DAB/H2O2反应染色，自来水充分冲洗后，苏木素复染，常规脱水，透明，干燥，封片，镜检。
结果显示，正常组织芯片蜡块阴性，结肠癌组织芯片蜡块中50％以上阳性，其他肿瘤组织芯片蜡块阴性，该单抗对应的靶标即为目的靶标表位肽。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种肿瘤靶标的筛选方法，其特征在于，包含以下步骤：
步骤1：获得特定肿瘤标志物的全蛋白，经过水解获得肽段，经超高效液相和飞行时间质谱获得肽段的序列；
步骤2：将特异性结合所述序列肽段的单克隆抗体与组织库进行特异性筛选；
步骤3：挑选出与组织库中阴性组织不表达、仅该特定肿瘤组织表达的肽段结合的单抗，该单抗对应的肽段即为目的肿瘤靶标。
2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤1所述全蛋白采用差异蛋白显示技术或单抗捕获技术或其结合获得。
3.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤2所述筛选的方法为免疫组化、Elisa。
4.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤3所述组织库阴性组织包括正常组织及不同种类的肿瘤组织。
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