CN101724025B

CN101724025B - 一种抗肿瘤的蟾蜍多肽及其制备方法和用途

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Publication number: CN101724025B
Application number: CN2009102192306A
Authority: CN
Inventors: 南克俊; 耿信笃; 卢创新; 焦敏; 姚煜; 李春丽; 魏永长; 田涛; 阮之平; 王淑红; 梁璇; 郭卉; 王文娟
Original assignee: Xian Jiaotong University
Current assignee: Xian Jiaotong University
Priority date: 2009-11-26
Filing date: 2009-11-26
Publication date: 2012-02-01
Anticipated expiration: 2029-11-26
Also published as: CN101724025A

Abstract

本发明公开了一种抗肿瘤的蟾蜍多肽及其制备方法和用途，该蟾蜍多肽是一种新的天然的具有抗肿瘤活性的多肽，命名为Bufo peptide 18(P18)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。利用反相高效液相色谱法技术可以精确高效地对其分离纯化：采用分离能力强、洗脱强度好、紫外吸收本底低的乙腈一水一三氟乙酸洗脱系统，经反向高效液相色谱柱二次分离后，得到纯度已在95％以上的蟾蜍多肽。在验证蟾蜍多肽抗肿瘤活性的基础上，表明蟾蜍多肽能够应用于抗肿瘤药物的制备。

Description

一种抗肿瘤的蟾蜍多肽及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于生物制药领域，涉及一种活性肽的提取和利用，特别涉及一种抗肿瘤多肽及其制备方法和用途。

背景技术

恶性肿瘤已成为危害人类健康的主要疾病，其中消化系统恶性肿瘤的发病高居首位。全球每年都投入了大量的人力物力用于研究开发防治癌症的新药物。近年，随着肿瘤基础研究的不断深入，开发针对新靶点和新作用机制的抗肿瘤药物、研发高效低毒的已知抗癌药的衍生物、多药耐药逆转剂的开发和临床应用等，已成为消化道肿瘤研究的热点领域。

中医药是中华民族灿烂文化的重要组成部分，数千年来以其独特的理论体系和浩瀚的文献资料，为中华民族的繁衍昌盛做出了巨大的贡献。近些年来，国内外的医药工作者，对中药给予了更多的重视，期望能够筛选获得新的活性成分。

中华大蟾蜍在我国入药已有悠久的历史。蟾蜍耳后腺及皮脂腺分泌的白色物质称蟾酥，为传统的名贵中药。近几年，从中华大蟾蜍阴干全皮中提取的华蟾酥已经广泛应用于临床，用于治疗各类中、晚期癌肿；从蟾酥内分离的buflin能诱导肿瘤细胞凋亡，分化，大剂量的浓度亦可直接杀死肿瘤细胞。众多文献资料表明，中华大蟾蜍是一个值得开发研究的中药资源。

发明内容

本发明解决的问题在于提供一种抗肿瘤多肽，该多肽是从中华蟾蜍卵子内提取的活性多肽，经证实具有抗肿瘤活性。

本发明是通过以下技术方案来实现的：

一种抗肿瘤的蟾蜍多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

上述抗肿瘤多肽的蟾蜍多肽的制备方法，包括以下步骤：

1)将破碎后的中华蟾蜍卵子细胞，用2～3倍体积的提取液于0℃条件下浸提2～3h，冷冻离心后弃去沉淀，上清液在90℃水浴中保持10min，然后再次离心收集上清液，过滤得到蟾蜍多肽粗提液；

所述的提取液为：4.0～5.0g的NaCl、0.2～0.35g的EDTA和0.6～1.0g的CH₃COONa溶于500ml的水，调节pH值至4.5；

2)将蟾蜍多肽粗提液在反相色谱柱上，在30～70min内进行100％A液到100％B液的线性梯度洗脱，洗脱液的流速为1～1.5ml/min；280nm波长检测，收集包含分子量为1872.30Da的单一多肽的洗脱液；分离得到氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示的具有抗肿瘤活性的蟾蜍多肽；

以体积比计，所述的A液为水∶三氟乙酸＝10∶1；

以体积比计，所述的B液为乙腈∶三氟乙酸＝10∶1。

所述的将破碎后的中华蟾蜍卵子细胞，用2～3倍体积的提取液于0℃条件下浸提2～3h，分离出上清液；

对分离后的沉淀，再次用2～3倍体积的提取液于0℃条件下浸提2～3h，分离出上清液；

合并两次的浸提液，18,000r/min冷冻离心20min，上清液在90℃水浴中保持10min，然后再次离心收集上清液，过滤得到蟾蜍多肽粗提液；

所述的提取液为：4.39g的NaCl、0.29g的EDTA和0.82g的CH₃COONa溶于500ml的水，调节pH值至4.5。

所述的反相色谱柱为C18填充的色谱柱。

所述的蟾蜍多肽在反相色谱柱的洗脱分离为：

1)将蟾蜍多肽粗提液进样于100％A液平衡过的C18高效反相色谱柱上，在30min内进行100％A液到100％B液的线性梯度洗脱，反相色谱柱上的压力为40～70×10⁵Pa，洗脱液的流速为1ml/min，于19.01～19.89min收集包含蟾蜍多肽的洗脱液I；

2)将包含蟾蜍多肽的洗脱液I进样于100％A液平衡过的C18反相色谱柱上，在40min内进行100％A液到100％B液的线性梯度洗脱，洗脱液的流速为1ml/min，于36.12～36.93min收集包含蟾蜍多肽的洗脱液II；得到纯度95％的蟾蜍多肽。

本发明提供的抗肿瘤的蟾蜍多肽，是一种新的天然的具有抗肿瘤活性的多肽，命名为Bufo peptide 18(P18)；通过BLAST分析，目前没有发现其同源序列的蛋白或多肽。

利用反相高效液相色谱法技术可以精确高效地对其分离纯化：采用分离能力强、洗脱强度好、紫外吸收本底低的乙腈一水一三氟乙酸洗脱系统，用梯度洗脱的方法确定了流动相中的含量，得到了较好的梯度范围，具有较好的首尾分离度；蟾蜍多肽在反相柱上有较好的分离，得到了令人满意的峰型和峰高，经反向高效液相色谱柱二次分离后，得到纯度已在95％以上的蟾蜍多肽。

所述蟾蜍多肽应用于抗肿瘤药物的制备。

所述的抗肿瘤药物是抗消化系统肿瘤的药物。

所述的抗肿瘤药物是抗肝癌、胃癌和/或大肠癌的药物。

所述的抗肿瘤药物包含的蟾蜍多肽用量为10～60mg/kg。

上述蟾蜍多肽的应用是基于以下进行多项抗肿瘤活性验证：

蟾蜍多肽对肝癌HepG2细胞、胃癌SGC7901细胞和大肠癌SW-480细胞都具有广谱的生长抑制和杀伤作用；而对正常细胞作用温和，且没有明显的时间、浓度依赖性，对L-02及GES-1的生长抑制作用及杀伤作用明显小于其对肿瘤细胞的作用；在对正常细胞没有伤害的情况下表现为对肿瘤细胞的特异性的抑制和杀伤，这表明蟾蜍多肽是一种良好的肿瘤抑制分子；

与常规化疗药对肿瘤的抑制效果相比，在相同的质量浓度下，蟾蜍多肽对肿瘤的杀伤作用无明显差异；但在相同摩尔浓度下，却表现出比常规化疗药更强的药效作用；

体外体内实验证明蟾蜍多肽对肝癌细胞的生长抑制及促杀伤作用过诱导凋亡的方式来实现；蟾蜍多肽在诱导肿瘤细胞凋亡的同时，对肝正常细胞系L-02，胃黏膜细胞GES-1诱导凋亡作用却很小，体现了蟾蜍多肽具有一定的肿瘤细胞特异性杀伤的性质，这种选择性针对肿瘤细胞的特性正是抗肿瘤药物研发的一个重要方向；

蟾蜍多肽对构建的裸鼠异种肝癌移植瘤模型的处理结果显示：高浓度蟾蜍多肽组(60mg/kg)与对照组相比，瘤体体积明显缩小；根据对照组瘤体重量和药物干预组重量，高浓度蟾蜍多肽抑瘤率为51.7％(对照组瘤体平均重量＝1.688g，高浓度蟾蜍多肽瘤体平均重量＝0.815g)；

对蟾蜍多肽处理过的裸鼠异种肝癌移植瘤模型的重要脏器HE染色结果显示，与对照组相比，裸鼠的重要脏器并未发现损伤或其他异常改变，说明蟾蜍多肽在10～60mg/kg的用量是安全的。

而且蟾蜍多肽属于短肽，其具有短肽的一般特性，如无抗原性和易于吸收及透过血脑屏障的优点，具有制备抗肿瘤药物的天然优势。

附图说明

图1为蟾蜍多肽粗提液的反相层析洗脱色谱图；

图2为蟾蜍多肽的反相层析洗脱色谱图；

图3为蟾蜍多肽的分子量检测图；

图4为蟾蜍多肽序列的同源性检测图；

图5为蟾蜍多肽诱导不同肿瘤细胞凋亡的分析图；

图6为蟾蜍多肽作用裸鼠肿瘤模型的主要器官切片的HE染色观察形态的结果，其中，a为食管、b为胃脏、c为结肠、d为肝脏、e为胰脏、f为心脏；

图7为蟾蜍多肽组和空白组各检测指标在HepG2细胞中表达的灰度值；

图8为蟾蜍多肽组和空白组DR5及Caspase-8在HepG2细胞中表达的灰度值；

图9为蟾蜍多肽组和空白组Survivin在HepG2细胞中表达的灰度值；

图10为不同浓度蟾蜍多肽作用HepG2细胞24小时后，各组凋亡相关蛋白的Western Blotting检测结果图；其中，图a为Procaspase-9、Bcl-2和Bax蛋白的检测结果，图b为Procaspase-8、survivin和DR5蛋白的检测结果，β-catin为参照蛋白。

具体实施方式

本发明提供一种新的抗肿瘤多肽，并给出了该多肽的制备方法，并通过多项抗肿瘤活性证明了该多肽的生物活性。下面结合附图对本发明做进一步详细描述，所述是对本发明的解释而不是限定。

1、本发明提供的抗肿瘤的蟾蜍多肽，命名为Bufo peptide 18(P18)，其分子量1872.30Da，等电点11.17，由18个氨基酸构成，具体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2、本发明是以常用的中药中华蟾蜍(Bufo bufogargarizans)作为提取原料，于11月～12月间采集雌性中华大蟾蜍(西安交通大学医学院动物实验中心提供)，分离纯化得到蟾蜍多肽的具体步骤如下：

2.1蟾蜍多肽的分离提取

将中华大蟾蜍毁髓处死后，迅速剖腹取出卵子，用蒸馏水洗涤两次，弃去血水，破碎或磨碎卵子；

提取蟾蜍多肽的提取液为：4.0～5.0g的NaCl、0.2～0.35g的EDTA和0.6～1.0g的CH₃COONa溶于500ml的水，调节pH值至4.5；

以每毫升蟾蜍卵子用2～3倍体积的提取液(具体采用NaCl：4.39g，EDTA：0.29g，NaAc：0.82g，超纯水：500ml，溶解后调节pH值至4.5)于0℃条件下提取2～3h，分离出上清液；

然后以相同体积的提取液在相同条件下对蟾蜍卵子再次浸提，分离上清液；

合并两次的浸提液，高速冷冻离心机中18,000r/min离心20min，弃去沉淀，上清液在90℃水浴中保持10分钟，18,000r/min离心15分钟，收集上清液，0.22μm滤纸过滤，收集滤液，得到蟾蜍多肽粗提液。

2.2蟾蜍多肽的纯化

取蟾蜍多肽粗提液500μl/次，累积进样于已用100％A液平衡过的反相色谱柱上，在30min内进行100％A液到100％B液的线性梯度洗脱，反相色谱柱上的压力为40～70×10⁵Pa，洗脱液的流速为1ml/min，检测波长为280nm；于19.01～19.89min收集包含蟾蜍多肽的洗脱液I，其色谱图如图1所示，图中*峰为目标峰；

对收集到的蟾蜍多肽的洗脱液I，再次进样100％A液平衡过的反相色谱柱上，在40min内进行100％A液到100％B液的线性梯度洗脱，洗脱液的流速为1ml/min，检测波长为280nm；于36.12～36.93min收集包含蟾蜍多肽的洗脱液II，其色谱图如图2所示，图中*峰为目标峰，其中蟾蜍多肽的纯度为95％；

所述的反相色谱柱具体为150×4.6mm的C18填充的反相色谱柱；

所述的A液(体积比)为水∶三氟乙酸＝10∶1，采用500m超纯水与500μl三氟乙酸配制；

所述的B液(体积比)为乙腈∶三氟乙酸＝10∶1，采用500ml乙腈与500μl三氟乙酸配制；

所述的线性梯度洗脱完成后再继续用B液持续洗脱10min使色谱柱再生，最后用100％A液平衡色谱柱，构成一个完整的色谱过程。

3、蟾蜍多肽的生化性质检测

3.1蟾蜍多肽的质谱分子量检测

将蟾蜍多肽的洗脱液II进行MALDI-TOF分子量检测，检测结果如图3所示，可以看出蟾蜍多肽的洗脱液II中的主要成分比较单一，为分子量1869.6Da的多肽。

3.2蟾蜍多肽的氨基酸序列检测

经过Endman反应分析蟾蜍多肽的序列，以高温和非高温处理的样品作为对照，结果表明蟾蜍多肽是一个天然存在的由18个氨基酸组成的短链多肽(而非Endman测序高温后蛋白质断裂的产物)，其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，其理论分子量为1872.30Da，基本与质谱分子量检测结果吻合；

利用ExPASy MW/pI工具(http://au.expasy.org/tools/pi_tool.html)分析蟾蜍多肽的等电点为：11.17；通过BLAST分析，其结果如图4所示，目前没有发现其同源序列的蛋白或多肽。

4、蟾蜍多肽抗肿瘤活性的检测

4.1离体细胞系检测

4.1.1以常规化疗药物作为阳性对照，检测蟾蜍多肽对肿瘤细胞系的生长抑制

所述的化疗药物为氟苷、草酸铂和5-氟尿嘧啶(5-Fu)；

所述的肿瘤细胞系为三种消化道常见肿瘤的细胞系：肝癌HepG2细胞系、胃癌SGC7901细胞系和大肠癌SW480细胞系；

所述的肿瘤细胞系的培养和传代为：

按常规方法进行培养，置于37℃，5％CO₂，饱和湿度的培养箱中，隔天换液；常规胰酶消化法(胰酶浓度为0.25％+EDTA浓度为0.02％)，按1∶2～1∶3的比例进行传代。

MTT方法检测肿瘤细胞的生长抑制：

各设一个空白对照组和5个不同药物浓度组：1组：6.25μg/ml，2组：12.5μg/ml，3组：25μg/ml，4组：50μg/ml，5组：100μg/ml；分别作用于肿瘤细胞24h、48h和72h，根据MTT检测值计算其抑制率。

蟾蜍多肽对肝癌HepG2细胞，胃癌SGC7901细胞和大肠癌SW-480细胞均有一定的杀伤作用，并且在药物浓度6.25μg/ml时，药效作用已经很明显，说明其对消化道三种肿瘤细胞有普遍的生长抑制作用，并随时间的延长，浓度的增加而表现更强的活性，显示出一定的时间和浓度依赖关系。

根据对其IC50的检测，蟾蜍多肽在24小时，对SGC7901细胞的抑制作用最强，对HepG2和SW-480的作用相当；在48小时，对SGC7901细胞的抑制作用最强，对HepG2作用最弱，而在72小时，对SW-480细胞的抑制作用最强，对SGC7901作用最弱，在不同时间，其对不同细胞间的抑制作用变化并不平行。

与化疗药物相比，蟾蜍多肽对三种肿瘤细胞的抑制作用分别如表4.1、表4.2、表4.3所示，其中用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值(OD)可间接反映活细胞数量，一定范围内OD值与活细胞数成正比。

表4.1不同浓度蟾蜍多肽和氟苷作用HepG2细胞不同时间后细胞的抑制作用

表4.2不同浓度蟾蜍多肽和草酸铂在不同时间对胃癌SGC7901细胞生长的抑制作用

表4.3不同浓度蟾蜍多肽和5-Fu在不同时间对大肠癌SW-480细胞生长的抑制作用

由以上检测结果得到蟾蜍多肽在不同时间对不同肿瘤细胞的IC50，具体如表4.4所示：

表4-4蟾蜍多肽在不同时间对不同肿瘤细胞的IC50

蟾蜍多肽在24小时，对SGC7901细胞的IC50值最低，说明其抑制作用最强，其次是HepG2和SW-480；在48小时，对SGC7901细胞的IC50值最低，其次是SW-480和HepG2，而在72小时，对SW-480细胞的IC50值最低，其次是HepG2和SGC7901，在不同时间，其对不同细胞的抑制作用并不稳定，但均显示出时间依赖性关系。

而与其他化疗药物相比：

100μg/ml药物浓度下作用24小时，蟾蜍多肽对肝癌HepG2细胞和大肠癌SW-480细胞的生长抑制率要分别高于同浓度下氟苷和5-Fu的抑制率(P＜0.05)，但和草酸铂相比，对胃癌SGC7901的生长抑制率无明显差异(P＞0.05)；

作用48小时和72小时后，蟾蜍多肽对肝癌HepG2细胞和胃癌SGC7901细胞生长抑制率分别与氟苷和草酸铂相比，并无明显差异(P＞0.05)，而对大肠癌SW-480细胞的生长抑制率却明显高于5-Fu(P＜0.05)。

4.1.2以常规化疗药物作为阳性对照，检测蟾蜍多肽对正常细胞系的生长抑制

所述的正常细胞系为L-02细胞系和GES-1细胞系；

各设一个空白对照组和5个不同药物浓度组：1组：12.5μg/ml，2组：25μg/ml，3组：50μg/ml，4组：100μg/ml，5组：200μg/ml，分别作用于细胞24h、48h和72h，根据MTT检测值计算其抑制率；具体的检测结果如表4.5、4.6所示：

表4.5不同浓度蟾蜍多肽和氟苷在不同时间对L-02细胞生长的抑制作用

表4.6不同浓度蟾蜍多肽和草酸铂在不同时间对GES-1细胞生长的抑制作用

蟾蜍多肽和化疗药物作用L-02细胞及GES-1细胞24小时，48小时和72小时之后，也显示出一定的温和的生长抑制现象，但是蟾蜍多肽对细胞的抑制作用的浓度依赖性并不规律：

在200μg/ml浓度下，蟾蜍多肽对L-02细胞作用48小时后，表现出最高的生长抑制现象，抑制率约为43％，同一浓度下的72小时的抑制率为39％；同样，蟾蜍多肽在100μg/ml浓度下作用48小时后表现出对GES细胞最高的的生长抑制作用，为42％，同一浓度下72小时的抑制率为29％，同一时间200μg/ml浓度的抑制率为38％，所以，其表现出的生长抑制性也无明显的时间依赖性。

0.1mM浓度下作用24小时，蟾蜍多肽对L-02细胞的生长抑制率要高于同浓度下氟苷的抑制率(P＜0.05)，但和草酸铂相比，对GES-1的生长抑制无明显差异(P＞0.05)；作用48小时后，蟾蜍多肽对L-02细胞和GES-1细胞生长抑制率要分别高于氟苷和草酸铂(P＜0.05)；作用72小时后，和氟苷相比，对L-02的生长抑制无明显差异(P＞0.05)，但对GES-1的生长抑制高于草酸铂(P＜0.05)。

伴随用量的增加，蟾蜍多肽对正常细胞也显现出一定的生长抑制；但是与对肿瘤细胞的抑制相比，而对正常细胞L-02及GES-1的生长抑制作用及杀伤作用明显小于其对肿瘤细胞的作用，蟾蜍多肽表现为一定的肿瘤特异性。

4.1.3以常规化疗药物做对比，采用Annexin V/PI双染法，流式细胞术检测蟾蜍多肽对肿瘤细胞和正常细胞的凋亡诱导

流式细胞术检测的细胞为：浓度为20×10⁴个/ml的对数生长期的DMEM高糖型培养液的细胞悬浮液；

采用Annexin V/PI双染的燃料结合为：结合缓冲液的重悬细胞加入Annexin V/FITC 5μl，再加入PI 10μl，旋涡混匀，使抗体与细胞充分结合，共孵育15分钟；

细胞凋亡的判定为：

AnnexinV(-)PI(-) 存活细胞

AnnexinV(+)PI(-) 早期凋亡细胞

AnnexinV(+)PI(+) 晚期凋亡细胞

AnnexinV(-)PI(+) 操作损伤细胞

4.1.3.1细胞的周期活动影响检测

流式细胞仪检测发现在肝癌HepG2细胞，对照组细胞的G₁、S和M期比率分别为63.3±8.4％、21.9±5.1％、14.8±4.3％，蟾蜍多肽处理组G₁、S和M期比率分别为分别为58.26±7.5％、24.41±6.2％、17.33±3.7％；

在SGC7901细胞，对照组细胞的G₁、S和M期比率分别为62.61±10.7％、25.11±7.1％、12.28±4.1％，多肽处理组G₁、S和M期比率分别为分别为58.05±9.2％、26.43±5.3％、15.52±3.4％；

在SW-480细胞，对照组细胞的G₁、S和M期比率分别为65.73±6.9％、20.49±5.4％、14.1±5.1％，多肽处理组G₁、S和M期比率分别为分别为60.35±7.1％、22.37±6.2％、16.97±2.6％。

统计结果显示多肽处理组中HepG₂细胞、SGC7901细胞和SW-480细胞各期比率与对照组相比，无明显差异(P＞0.05)，说明蟾蜍多肽并不影响肿瘤细胞的周期活动。

4.1.3.2诱导细胞凋亡的检测

各设一个空白对照组(无药物)，一个蟾蜍多肽组(0.1mM)和一个常规化疗药物组(0.1mM)，常规化疗药物和蟾蜍多肽作用细胞24小时后，AnnexinV/FITC双染色，流式细胞仪检测药物诱导3种肿瘤细胞的凋亡，实验实验重复3次，取平均值计算。

作用肿瘤细胞24小时后，0.1mM的蟾蜍多肽诱导肝癌HepG2凋亡的能力要高于0.1mM的氟苷，且均高于对照，差异有显著性(P＜0.05)，和对照组相比，氟苷和蟾蜍多肽对肝正常细胞L-02也有一定的诱导凋亡作用(P＜0.05)，但两者之间对诱导L-02细胞凋亡的差异无显著性(P＞0.05)(如图5a所示)；

同样，0.1mM的蟾蜍多肽诱导胃癌SGC7901细胞凋亡的能力要高于0.1mM的草酸铂，且均高于对照组，差异有显著性(P＜0.05)，和对照组相比，草酸铂和蟾蜍多肽对胃黏膜正常细胞GES-1也有一定的诱导凋亡作用(P＜0.05)，两者之间对诱导GES-1细胞凋亡的差异无显著性(P＞0.05)(如图5b所示)；

0.1mM的蟾蜍多肽诱导大肠癌SW-480细胞凋亡的能力要高于0.1mM的5-Fu，且均高于对照，差异有显著性(P＜0.05)(如图5c所示)。

4.1.3小结

蟾蜍多肽具有抑制肝癌HepG2细胞，胃癌SGC7901细胞以及大肠癌SW-480细胞生长增殖的作用，并能选择性诱导这些肿瘤细胞的凋亡，而对正常细胞影响甚微。

4.2肿瘤模型动物的检测

4.2.1模型的构建及给药方式

1)肝癌HepG2细胞持续培养24到48h，覆盖瓶底90％以上后，用0.25％胰蛋白酶消化，离心、收集细胞后用PBS重悬，反复两次；用PBS调整浓度到3×10⁶/ml，准备进行肿瘤接种。

2)裸鼠(购自中国科学院上海实验动物中心)在超净生物层流架内适应性饲养1周。然后在无菌室内，将裸鼠常规消毒后，在24只裸鼠后肢右腋背部皮下接种处理好的HepG2细胞，每只裸鼠接种细胞数为0.3ml/只。接种肿瘤细胞后，将裸鼠送回笼罩，每天观察小鼠的精神、饮食及排便等情况，称重。接种1周左右，可见接种部位皮下长出米粒大小的硬结，为移植瘤模型建成。

3)裸鼠分组及处理方法：

待肿瘤长到长径约0.5mm时，即开始进行药物干预，将24只裸鼠随机分为4个不同的处理组(A、B、C、D组)。具体分组情况如下：

A组(对照组)：接种HepG2细胞致瘤，皮下注射PBS；

B组(氟苷组)：接种HepG2细胞致瘤，腹腔注射化疗药氟苷，剂量为0.3mmol/kg体重；

C组(低浓度蟾蜍多肽组)：接种HepG2细胞致瘤，皮下注射蟾蜍多肽，终浓度为10mg/kg体重；

D组(高浓度蟾蜍多肽组)：接种HepG2细胞致瘤，皮下注射蟾蜍多肽终浓度为60mg/kg体重；

上述各组动物，每组6只，平均2天给药一次，连续治疗三周。各组均在同等饲养条件下饲养至实验结束。

4)效果判定：

裸鼠自由摄取食料及水，常规饲养，待皮下肿瘤成瘤后，每隔2天用游标卡尺测量肿瘤结节的长径(a)、短径(b)，计算出肿瘤近似体积(V)，V＝1/2ab²，并每日观察裸鼠进食情况、精神状况、活动情况及体重变化，药物干预3周后，停药1周，按上述分组分别处理裸鼠实验结束时处死小鼠，称取瘤重。

计算肿瘤抑制率：肿瘤抑制率＝(对照组瘤体重量-实验组瘤体重量)/对照组瘤重×100％。

5)肿瘤组织标本的取材和固定：

实验结束时采用拉颈处死，系统解剖，取出肿瘤组织后，分两份保存，一份入4％多聚甲醛溶液中固定后，经常规病理切片，以备HE、免疫组化染色及检测细胞凋亡情况；另一份入液氮冻存，以备提取RNA、蛋白质。

6)并对肿瘤组织标本进行组织切片HE染色和凋亡的原位酶标记检测

4.2.2蟾蜍多肽对肿瘤实体体积的抑制

上述构建的裸鼠异种肝癌移植瘤模型的肿瘤实体体积的结果如表4.7所示：

表4.7处理前后各组裸鼠肿瘤体积的比较

由此可以得到：高浓度蟾蜍多肽组(60mg/kg)与氟苷处理组肿瘤的体积与对照组相比，均有明显缩小(P＜0.05)，氟苷组与高浓度多肽组组间相比，瘤体体积没有差异(P＞0.05)，低浓度与对照组组间相比，瘤体体积也没有差异(P＞0.05)。低浓度蟾蜍多肽组与对照组间相比，瘤体重量没有差异(P＞0.05)。四组裸鼠的平均体重均随时间呈增长趋势，各组之间无明显差异。

4.2.3蟾蜍多肽对肿瘤实体重量的抑制

将裸鼠移植瘤瘤体剥离后，电子天平精确称重，其具体的结果如表4.8所示：

表4.8各组间肿瘤标本的平均重量比较及肿瘤的抑制率

组别(n＝6)	瘤体重量(g)	抑瘤率(％)
			对照组^a	1.688±0.324
低浓度多肽组^b	1.433±0.197	15.1
			高浓度多肽组^c	0.815±0.188	51.7
氟苷组^d	0.774±0.157	54.1

结果发现：与对照组相比，高浓度蟾蜍多肽组和氟苷组瘤体重量均有明显下降，具有统计学差异(P＜0.05)；高浓度蟾蜍多肽抑瘤率为51.7％，氟苷抑瘤率达到54.1％；但低浓度蟾蜍多肽组与对照组间相比，瘤体重量没有差异(P＞0.05)。

4.2.4蟾蜍多肽和氟苷治疗促进裸鼠体内肿瘤细胞凋亡

凋亡原位酶标记(TUNEL)结果显示氟苷组及高浓度多肽组的凋亡细胞数均比对照组明显增多，统计学差异显著(P＜0.05)，同时氟苷组及高浓度多肽组组间的凋亡细胞数没有区别(P＞0.05)；低浓度多肽组与对照组相比，差异没有统计学意义(P＞0.05)；具体如表4.9所示：

表4.9蟾蜍多肽及化疗药物氟苷诱导体内肿瘤细胞凋亡

组别	N	总细胞数	阳性细胞数
				对照组^a	6	200	5±1
低浓度多肽组^b	6	200	7±4
				高浓度多肽组^c	6	200	23±3
氟苷组^d	6	200	21±4

而对细胞凋亡率的分析表明氟苷组及高浓度多肽组的凋亡细胞率均比对照组明显增多，统计学差异显著(P＜0.05)，低浓度多肽组与对照组相比，差异没有统计学意义(P＞0.05)，氟苷组及高浓度多肽组与低浓度多肽组间的凋亡细胞率统计学差异显著(P＜0.05)。

4.2.5蟾蜍多肽和氟苷治疗对裸鼠其他重要脏器的影响

给药期间，密切观察裸鼠的饮食活动及精神状态，未发现异常改变，为了进一步判断药物的副作用，处死裸鼠后，分别取其脑，食管，胃脏，肝脏，结肠，肾脏，心脏等几个重要器官，切片做HE染色，观察其形态学改变。结果显示，包括对照组在内的各个处理组，裸鼠的重要脏器并未发现损伤或其他异常改变(分别如图6所示)，这表明蟾蜍多肽在60mg/kg的用量是安全的。

4.3免疫化学染色和Western blot检测结果显示蟾蜍多肽处理组的凋亡相关蛋白

所述的凋亡相关蛋白包括Survivine、Bcl-2、Bax、DR-5、Caspase-8和Caspase-9，检测所用到上述蛋白的一抗(除抗Survivine为鼠抗人单抗，抗Caspase-9为兔抗人单抗，其余均为兔抗人多抗)分别购自北京中杉金桥公司或武汉博士德公司。

4.3.1免疫细胞化学染色

取对人肝癌HepG2细胞株数生长期的细胞，用0.1％胰蛋白酶消化，制成浓度为1×10⁵/ml单细胞悬液；将上述单细胞悬液接种于装有消毒盖玻片的6孔板中，每孔2ml，培养24h；

实验组加入400ug/ml的蟾蜍多肽500μl//孔；对照组加入500μl//孔的培养液溶液；于37℃、5％CO₂条件下培养；

培养24h后取出；弃去培养液，4％多聚甲醛溶液固定20min；

在细胞爬片上分别滴加一抗、生物素标记二抗、滴辣根酶标记卵白素，每次滴加后37℃下孵育30分钟，PBS冲洗3次×5分钟；

甩去PBS液，每张切片滴加2滴新鲜配置的DAB显色液，显微镜下观察3-10分钟，阳性显色为棕色；自来水充分洗涤10分钟，部分苏木素复染20秒，自来水冲洗5分钟，PBS浸泡5分钟返蓝；最后切片置于80％、95％、100％梯度酒精脱水2分钟、2分钟及5分钟×2次，二甲苯5分钟×2次透明，中性树胶封片。

4.3.2免疫组织化学染色

1)对蟾蜍多肽处理的裸鼠模型组的石蜡切片二甲苯脱蜡10min×2次，梯度酒精脱水各5min，PBS洗5min×3次；

2)标本置于3％H₂O₂溶液中室温孵育20～30min，以阻断内源性过氧化物酶，PBS洗5min×3次；

3)用pH＝6.0的抗原修复液在微波炉中进行抗原修复，先用高火使之沸腾，再用低火使之保持94～98℃的温度15min，然后自然降至室温，PBS洗5min×3次；

4)10～20％的正常山羊血清(PBS稀释)封闭，室温孵育30min后，倾去血清；

5)滴加稀释好的一抗工作液，室温孵育10min后置于湿盒内，4℃冰箱过夜(12h)；PBS洗5min×3次；

6)滴加生物标记二抗，湿盒内室温孵育30～40min；PBS冲洗5min×3次；

7)滴加辣根酶标记链霉卵白素(PBS稀释)，室温孵育30～40min；PBS冲洗，5min×3次；

8)二氨基联本胺(DAB)和H₂O₂孵育2～10min，将DAB底物工作液滴加于切片上，显微镜下控制显色，自来水终止显色反应；

9)苏木素复染，显微镜下观察复染结果；

10)梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。以PBS代替一抗作阴性对照。

结果判定：

Survivin、Caspase-8、Caspase-9、Bcl-2、Bax、DR5以背景无颜色细胞质或(及)胞膜出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性细胞；每张切片随机取5个视野(200×)，每个视野观察200个细胞，计算其中阳性细胞的数值。

4.3.3Western blot检测凋亡相关蛋白表达

实验组加入400ug/ml的蟾蜍多肽500μl//孔；对照组加入500μl//孔的培养液溶液；于37℃、5％CO₂条件下培养；用0.1％胰蛋白酶消化成单细胞悬；

按照常规处理步骤，添加细胞裂解液后，提取蛋白并进行凝胶电泳分离，并转移到准备好的PVDF膜上；

免疫结合和染色为：

1)在表面皿中加5％脱脂牛奶，即封闭液，液面必须过膜。

2)摇床上轻摇60min，保证膜的所有部分同溶液接触。

3)从封闭液中取出PVDF膜，加入用5％脱脂牛奶稀释的合适浓度的一抗，排除空气；Caspase-8一抗浓度1∶300；Caspase-9一抗浓度1∶200；Bcl-2一抗浓度1∶100，Bax一抗浓度1∶100，DR5一抗浓度1∶300，β-actin一抗浓度1∶500；4℃过夜

4)弃去一抗，PBS洗，8min×3次；弃去PBS，将膜放入一个可封口的塑料袋中，加入用5％脱脂牛奶稀释的二抗，在摇床上温和摇动1.5h；弃去二抗，PBS洗8min×3次；

5)将配置好的PBS缓冲液和DAB溶液在保鲜膜上等体积混合，1min后将膜蛋白面朝下与此混合液充分接触，1min后将膜移至另一张保鲜膜上，去尽残液，包好，放入X光片夹中；

6)在暗室中，将显影液和定影液分别放入塑料盘中，在红光灯下取出X线片，剪成适当大小，打开X光片夹，把X光片放在膜上，关上X光片夹，开始计时，根据信号的强弱调整曝光时间。曝光完成后，取出X光片，迅速放入显影液中，才出现明显条带后放入定影液中，室温下晾干；

7)凝胶图像分析：将胶片进行扫描或者拍照，用凝胶图像处理系统Quantity One分析目标带的分子量和净光密度值；每个指标的相对含量用指标灰度值/β-actin灰度比值表示，每组重复3次。

4.3.4蟾蜍多肽可能通过两种途径促进细胞凋亡：线粒体途径和死亡受体途径

1)线粒体凋亡途径相关蛋白的表达

线粒体凋亡途径或内在途径(mitochondrial pathway或intrinsic pathway)，是细胞凋亡的经典通路之一，其过程有许多重要调节蛋白及凋亡执行蛋白的参与，如Bcl-2，Bax及Caspase-9等。

蟾蜍多肽(100μg/ml)作用HepG2细胞24小时后，免疫细胞化学方法检测了空白对照组和多肽处理组细胞的Bcl-2，Bax及Caspase-9蛋白染色。可见Caspase-9、Bax和Bcl-2均在细胞胞膜及胞浆表达，主要在胞浆表达，呈棕黄色，均为阳性表达。采用德国LeicaQ550cw图像分析系统进行灰度分析，灰度值与实际表达强度成反比，即阳性表达越强，灰度值越低；阳性表达越弱，灰度值越高；具体如表4.10所示：

表4.10空白组与蟾蜍多肽组HepG2细胞Bcl-2，Bax及Caspase-9表达的灰度值

可以看出实际表达蟾蜍多肽组Caspase-9和Bax表达高于空白组，而Bcl-2的表达低于空白组。对各组结果做统计检验，如图7所示，结果两组间差异显著(P＜0.05)。

2)死亡受体凋亡通路相关蛋白的表达

死亡受体(Death receptor，DR)又称为肿瘤坏死因子相关诱导配体受体，此途径是细胞凋亡的又一重要方式，其过程包括受体配体的结合甚至表达上调以及Caspase-8的激活等。

免疫细胞化学技术检测了空白对照组和多肽处理组细胞的DR5及Caspase-8蛋白的表达。Caspase-8均在细胞胞膜及胞浆表达，主要在胞浆表达，呈棕黄色，均为阳性表达。DR5主要表达于胞浆和(或)胞膜，每组各取5张图，采用德国LeicaQ550cw图像分析系统进行灰度分析，灰度值与实际表达强度成反比，即阳性表达越强，灰度值越低；阳性表达越弱，灰度值越高。具体如表4.11所示：

表4.11空白组与蟾蜍多肽组HepG2细胞DR5及Caspase-8表达的灰度值

可以看出实际表达蟾蜍多肽组Caspase-8表达高于空白组(P＜0.05)，而DR5的表达两组间无明显差异(P＞0.05)，如图8所示。

3)Survivin蛋白的表达

Survivin是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein，IAP)家族的一个成员，具有很强的抗凋亡活性，人类Survivin在正常成熟组织很少表达，但在恶性细胞和人类肿瘤却表达丰富。它能提高癌细胞的生存能力，并易于躲避机体的免疫监护及细胞毒素作用；Survivin可以通过与Caspase-3和Caspase-7结合，抑制Caspase-3和Caspase-7的活性，从而抑制细胞凋亡；Survivin也可以通过P21间接抑制Caspase，而抑制凋亡。

Survivin主要表达于胞浆，呈棕黄色染色，其具体结果如表4.12所示，统计显示如图9所示，结果可以看出，各组细胞均为阳性表达，在蟾蜍多肽处理组，Survivin蛋白的表达明显下降(P＜0.05)，说明凋亡抑制基因的功能受到抑制。

表4.12空白组与蟾蜍多肽组HepG2细胞Survivin表达的灰度值

4)蟾蜍多肽各浓度(0，10，50，100ug/ml)处理HepG2细胞24小时后，Western Blotting结果如图10所示，显示随蟾蜍多肽浓度的增大，Bcl-2，前体Caspase8，9及Survivin蛋白的表达出现显著下降，Bax蛋白的表达逐渐增多，而DR5蛋白的表达无明显变化。

5)Bcl-2、Bax、Caspase-8、Caspase-9及survivin、DR5蛋白免疫组化阳性信号主要位于细胞浆中；从表4.12、4.13、4.14中可以看出，与对照组相比，蟾蜍多肽处理组中Bcl-2、Caspase-8、Caspase-9及survivin表达明显下降(P＜0.05)，Bax蛋白的表达上升(P＜0.05)，而DR5表达无明显变化(P＞0.05)。

表4.12裸鼠体内肝癌移植瘤中Bcl-2和Bax蛋白的表达

空白组：多肽组P＜0.05

表4.13裸鼠体内肝癌移植瘤中Caspase-8和Caspase-9蛋白的表达

空白组：多肽组P＜0.05

表4.14裸鼠体内肝癌移植瘤中Survivin和DR5蛋白的表达

*：与空白组相比P＜0.05

细胞凋亡的机制复杂多样，牵涉到许多因子的激活与失活，构成一个互相反馈调节的网络信号通路。一般来讲，细胞凋亡的经典通路可分为三种：分别是线粒体凋亡途径或内在途径(mitochondrial pathway或intrinsic pathway)、死亡受体介导的凋亡途径或外在途径(death receptor-mediated pathway或extrinsic path-way)及近年发现的内质网途径。以上三种途径虽然上游事件(up-stream activation)不同，但最后都汇聚到同一通路，即活化的caspase-8、caspase-9、caspase-12均切割激活caspase-3，最终致细胞凋亡。

蟾蜍多肽处理(100μg/ml)HepG2细胞24小时后，与对照组相比，细胞中Bcl-2表达量下降，而Bax表达量有所上升，Bcl-2/Bax的比率发生了逆转，意味着细胞凋亡现象的发生。同时，Western blot和裸鼠的移植瘤模型中免疫组织化学的结果也印证了这一点。可见，蟾蜍多肽在促进肝癌细胞的凋亡过程中，至少部分是影响了Bcl-2家族蛋白，直接或间接的诱导了Bax的高表达与Bcl-2的低表达，启动线粒体凋亡通路。

本发明检测了在蟾蜍多肽处理前后，肝癌HepG2细胞中死亡受体DR5以及死亡受体通路关键因子Caspase-8的表达。免疫细胞化学结果显示，蟾蜍多肽作用后，肝癌HepG2细胞中死亡受体DR5的表达与对照组相比，无明显变化，裸鼠移植瘤组织的免疫组化和Western blot的结果也验证了这一点说明，蟾蜍多肽在诱导细胞凋亡中，并未上调DR5蛋白的表达，但这并不影响其促凋亡作用，与之相对应的是，肝癌HepG2细胞和组织中，procaspase-8蛋白表达下降，提示procaspase-8被激活后活性caspase-8形成，凋亡已经发生。因为caspase-8的活化，是外源性凋亡通路的关键环节，所以蟾蜍多肽很可能也通过了死亡受体途径促进细胞的凋亡。

本发明对Survivin蛋白检查发现，在蟾蜍多肽作用后，肝癌HepG2细胞和移植瘤组织中，Survivin蛋白的表达与对照组相比，明显下降；提示蟾蜍多肽参与了下调Survivin的活动，此过程也应是其发挥促凋亡作用的一个环节。值得注意的是，实验结果可以看出，Survivin和Bcl-2/Bax、caspase8，9的表达是成相关性的，Survivin的低表达也伴随着Bcl-2的低表达与Bax的高表达，并有活性caspase8，9的升高。Survivin作用途径之一是通过与caspase家族蛋白的结合而抑制凋亡的发生，不难理解，Survivin的低表达势必会伴有活性caspase8，9表达程度的升高。

以上结果表明，蟾蜍多肽可能是通过了内源性的线粒体途径和外源性的死亡受体途径两种通路促进了肝癌HepG2细胞的凋亡，在此过程中，诱导了Bcl-2/Bax蛋白表达比率的改变，激活Caspase依赖性的凋亡途径，Survivin蛋白的表达下调。

5、对蟾蜍多肽抗肿瘤活性的总结：

1、蟾蜍多肽是一种对正常细胞温和，对肿瘤细胞的特异性的抑制和杀伤的肿瘤抑制分子；

2、与常规化疗药对肿瘤的抑制效果相比，在相同的质量浓度下，蟾蜍多肽对肿瘤的杀伤作用无明显差异；但在相同摩尔浓度下，却表现出比常规化疗药更强的药效作用；

3、蟾蜍多肽在10～60mg/kg的用量是安全的，其抑瘤率为51.7％；对重要脏器未发现损伤或其他异常改变；

4、蟾蜍多肽诱导肿瘤细胞凋亡实现生长抑制及促杀伤作用，其可能通过线粒体途径和死亡受体途径两种途径促进细胞凋亡。

氨基酸序列表

<110>西安交通大学

<120>一种抗肿瘤的蟾蜍多肽及其制备方法和用途

<160>1

<210>1

<211>18

<212>PRT

<213>中华蟾蜍(Bufo bufogargarizans)

<400>1

Gly Met Leu Val Gly Gly Lys Val Gly Gly Lys Gly Phe Ile Arg Pro Trp Leu

1 5 10 15

Claims

1.一种抗肿瘤的蟾蜍多肽，其特征在于：该多肽的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

2.权利要求1所述的抗肿瘤的蟾蜍多肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2)将蟾蜍多肽粗提液在反相色谱柱上，在30～70min内进行100％A液到100％B液的线性梯度洗脱，反相色谱柱上的压力为40～70×10⁵Pa，洗脱液的流速为1～1.5ml/min；280nm波长检测，于19.01～19.89min收集包含分子量为1872.30Da的单一多肽的洗脱液；分离得到氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示的具有抗肿瘤活性的蟾蜍多肽；

以体积比计，所述的A液为水∶三氟乙酸＝10∶1；

以体积比计，所述的B液为乙腈∶三氟乙酸＝10∶1。

3.如权利要求2所述的抗肿瘤多肽的制备方法，其特征在于：将破碎后的中华蟾蜍卵子细胞，用2～3倍体积的提取液于0℃条件下浸提2～3h，分离出上清液；

4.如权利要求2所述的抗肿瘤多肽的制备方法，其特征在于：所述的反相色谱柱为C18填充的色谱柱。

5.如权利要求2所述的抗肿瘤多肽的制备方法，其特征在于，所述的蟾蜍多肽在反相色谱柱的洗脱分离为：

6.权利要求1所述抗肿瘤多肽应用于抗肿瘤药物的制备。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于：所述的抗肿瘤药物是抗消化系统肿瘤的药物。

8.如权利要求6所述的应用，其特征在于：所述的抗肿瘤药物是抗肝癌、胃癌和/或大肠癌的药物。

9.如权利要求6所述的应用，其特征在于：所述的抗肿瘤药物包含的蟾蜍多肽用量为10～60mg/kg。