CN112336768B - 一种中药提取物组合物、抑制黑色素瘤的药物及制备方法和应用 - Google Patents

一种中药提取物组合物、抑制黑色素瘤的药物及制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于中药抗癌技术领域，特别是涉及一种中药提取物组合物、抑制黑色素瘤的药物及制备方法和应用。该中药提取物组合物包括生药比例为0.5～1.5：1的女贞子醇提物和墨旱莲醇提物。该中药提取物组合物通过抑制细胞周期G2/M期时相、细胞增殖以及细胞克隆而发挥抑制黑色素瘤细胞活性的作用，从而促进黑色素瘤细胞凋亡，为中药治疗恶性黑色素瘤等肿瘤奠定了良好的实验基础，开拓了新的视野。用该中药提取物组合物可制备成抑制黑色素瘤的药物，用于黑色素瘤的治疗或深入研究。

Description

一种中药提取物组合物、抑制黑色素瘤的药物及制备方法和 应用
技术领域
本发明属于中药抗癌技术领域，特别是涉及一种中药提取物组合物、抑制黑色素瘤的药物及制备方法和应用。
背景技术
恶性黑色素瘤(malignant melanoma,MM)，简称恶黑或者黑色素瘤，是一种多发于皮肤或黏膜的黑色素细胞来源的肿瘤，其恶性程度极高，具有侵袭性浸润、易发生转移等特性，是最常见的皮肤致死性肿瘤之一。针对晚期黑色素瘤的治疗方法包括手术切除、放射治疗及化疗、免疫抑制治疗等综合治疗方法，但疗效均不确切，整体五年生存率未见明显的增高。且化疗药物(如氮烯咪胺)客观有效率低，总生存期短，IL-2药物毒性大，低剂量有效性低，靶向制剂和免疫调节剂价格昂贵。因此，寻找新的有效的治疗方法是提高患者生存率及降低发病率的重要方式。
细胞信号通路在机体中发挥着重要的作用。正常细胞的增殖、分化和程序性凋亡等过程都受细胞信号通路的调制。在肿瘤的演进过程中，常常表现为细胞的信号通路中相关信号转导途径的过度激活或者不可逆转的沉默，从而不可对细胞进行正确的调控，引起细胞增殖、分化和凋亡的异常，从而引起肿瘤发生。针对恶性黑色素瘤细胞的治疗措施之一就是促进细胞凋亡。细胞凋亡是一种程序性的死亡，是在多种基因综合调控的水平下自主的死亡方式，是受多种凋亡信号通路影响的结果。然而许多研究表明恶性黑色素瘤细胞的自我凋亡水平和其他肿瘤相比较低，对于常规的促凋亡治疗手段和方法不敏感。
发明内容
如上所述，目前治疗黑色素瘤的治疗方法存在疗效均不确切、有效率低、总生存期短、药物毒性大、价格昂贵等问题，且常规的促凋亡治疗手段和方法对黑色素瘤细胞不敏感，因此，本发明提供一种中药提取物组合物、抑制黑色素瘤的药物及制备方法和应用。
为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：
一方面，本发明实施例提供一种中药提取物组合物，包括生药比例为0.5～1.5：1的女贞子醇提物和墨旱莲醇提物。
与手术切除、放射治疗及化疗、免疫抑制治疗等治疗方法相比，中药治疗肿瘤多途径、多靶点、不良反应少、毒副作用小、耐药性低的优势。本发明从NF-kB信号通路因子、细胞周期相关因子以及细胞凋亡因子的角度考察作用机制，通过试验研究发现，女贞子醇提物和墨旱莲醇提物可通过抑制细胞周期G2/M期时相、细胞增殖以及细胞克隆而发挥抑制黑色素瘤细胞活性的作用，从而促进黑色素瘤细胞凋亡。其促凋亡机制与该中药提取物组合物调节NF-kB p65，Caspase 3，Bcl-xL，BCL-2和Bax蛋白表达有关。本发明为中药治疗恶性黑色素瘤等肿瘤奠定了良好的实验基础，开拓了新的视野。
优选地，所述女贞子醇提物和墨旱莲醇提物的生药比例为0.8～1.2:1。
优选地，所述女贞子醇提物和墨旱莲醇提物的生药比例为1:1。
优选地，所述女贞子醇提物是以75～85％v/v乙醇水溶液提取制得，所述墨旱莲醇提物是以65～75％乙醇水溶液提取制得。经上述乙醇水溶液提取制得的女贞子醇提物和墨旱莲醇提物具有显著的促进黑色素瘤细胞凋亡的作用。
优选地，所述女贞子醇提物的制备方法包括：将女贞子以8～12倍量75～85％v/v乙醇水溶液提取2～3次，每次1.5～2h，合并提取液，干燥。进一步优选的制备方法为：将女贞子以10倍量80％v/v乙醇水溶液提取2次，每次2h，合并提取液，干燥。干燥前可通过常规浓缩方式(如减压浓缩)对提取液进行浓缩，以提高干燥效率。
优选地，所述墨旱莲醇提物的制备方法为：将墨旱莲以8～12倍量65～75％v/v乙醇水溶液提取2～3次，每次1.5～2h，合并提取液，干燥。进一步优选的制备方法为：将墨旱莲以10倍量70％v/v乙醇水溶液提取2次，每次2h，合并提取液，干燥。干燥前可通过常规浓缩方式(如减压浓缩)对提取液进行浓缩，以提高干燥效率。
第二方面，本发明实施例还提供了上述中药提取物组合物在制备抑制黑色素瘤药物中的应用。
第三方面，本发明实施例还提供了上述中药提取物组合物在体外抑制黑色素瘤中的应用。
优选地，所述中药提取物组合物的浓度为6.25～1.56μg/mL。
第四方面，本发明实施例还提供了一种抑制黑色素瘤的药物，所述药物包括上述中药提取物组合物。
优选地，所述药物为口服制剂和注射制剂。
将本发明所提供的组合物制成口服制剂和注射制剂后，通过口服、注射的给药方式，即可发挥治疗黑色素瘤的作用。
附图说明
图1为实施例14中给药24、48、72h后试验样品对A375和B16-F10细胞活性的影响；
图2为实施例14中给药48h后试验样品对A375细胞凋亡蛋白表达的影响；
图3为实施例14中给药48h后试验样品对B16-F10细胞凋亡蛋白表达的影响；
图4为实施例14中给药48h后试验样品对A375细胞周期的影响；
图5为实施例14中给药48h后试验样品对A375细胞平板克隆形成的影响；
图6为实施例14中给药48h后试验样品对B16-F10细胞平板克隆形成的影响。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步举例说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
以下实施例中所使用的女贞子和墨旱莲均符合《中国药典》(2015年版)一部正文各药材项下的有关规定。
以下实施例中所采用的原料、试剂等，如无特殊说明，均从商业途径获得。
实施例1
本发明实施例提供了一种中药提取物组合物，由生药比例为1：1的女贞子醇提物和墨旱莲醇提物组成。其中女贞子醇提物的制备方法为：将女贞子以10倍量80％v/v乙醇水溶液提取2次，每次2h，合并提取液，浓缩至浓溶液后真空50℃干燥，得女贞子浸膏，即女贞子醇提物。墨旱莲醇提物的制备方法为：将墨旱莲以10倍量75％v/v乙醇水溶液提取2次，每次2h，合并提取液，浓缩至浓溶液后真空50℃干燥，得墨旱莲浸膏，即墨旱莲醇提物。
实施例2
本发明实施例提供了一种中药提取物组合物，由生药比例为0.8：1的女贞子醇提物和墨旱莲醇提物组成。其中女贞子醇提物的制备方法为：将女贞子以10倍量80％v/v乙醇水溶液提取2次，每次2h，合并提取液，浓缩至浓溶液后真空50℃干燥，得女贞子浸膏，即女贞子醇提物。墨旱莲醇提物的制备方法为：将墨旱莲以10倍量75％v/v乙醇水溶液提取2次，每次2h，合并提取液，浓缩至浓溶液后真空50℃干燥，得墨旱莲浸膏，即墨旱莲醇提物。
实施例3
本发明实施例提供了一种中药提取物组合物，由生药比例为1.2：1的女贞子醇提物和墨旱莲醇提物组成。其中女贞子醇提物的制备方法为：将女贞子以10倍量80％v/v乙醇水溶液提取2次，每次2h，合并提取液，浓缩至浓溶液后真空50℃干燥，得女贞子浸膏，即女贞子醇提物。墨旱莲醇提物的制备方法为：将墨旱莲以10倍量75％v/v乙醇水溶液提取2次，每次2h，合并提取液，浓缩至浓溶液后真空50℃干燥，得墨旱莲浸膏，即墨旱莲醇提物。
实施例4
本发明实施例提供了一种中药提取物组合物，由生药比例为0.5：1的女贞子醇提物和墨旱莲醇提物组成。其中女贞子醇提物的制备方法为：将女贞子以8倍量85％v/v乙醇水溶液提取2次，每次2h，合并提取液，浓缩至浓溶液后真空50℃干燥，得女贞子浸膏，即女贞子醇提物。墨旱莲醇提物的制备方法为：将墨旱莲以8倍量75％v/v乙醇水溶液提取2次，每次2h，合并提取液，浓缩至浓溶液后真空50℃干燥，得墨旱莲浸膏，即墨旱莲醇提物。
实施例5
本发明实施例提供了一种中药提取物组合物，由生药比例为1.5：1的女贞子醇提物和墨旱莲醇提物组成。其中女贞子醇提物的制备方法为：将女贞子以12倍量75％v/v乙醇水溶液提取3次，每次1.5h，合并提取液，浓缩至浓溶液后真空50℃干燥，得女贞子浸膏，即女贞子醇提物。墨旱莲醇提物的制备方法为：将墨旱莲以12倍量65％v/v乙醇水溶液提取3次，每次1.5h，合并提取液，浓缩至浓溶液后真空50℃干燥，得墨旱莲浸膏，即墨旱莲醇提物。
实施例6
本发明实施例提供了实施例1所得中药提取物组合物在制备抑制黑色素瘤口服药物中的应用，具体方法为：将实施例1所得组合物粉碎，按所需剂型加入药学上可接受的相应剂型的辅料，按该剂型的常规方法进行制备，即得。
该方法也可用于实施例2～5所得中药提取物组合物。
实施例7
本发明实施例提供了实施例1所得中药提取物组合物在制备抑制黑色素瘤的注射用微乳中的应用，具体方法为：将实施例1所得组合物粉碎，与注射用微乳所需辅料按注射用微乳的常规方法进行制备，即得。
该方法也可用于实施例2～5所得中药提取物组合物。
实施例8
本发明实施例提供了一种抑制黑色素瘤的片剂，包括实施例1所得中药提取物组合物以及药学可接受的片剂辅料。
实施例9
本发明实施例提供了一种抑制黑色素瘤的注射用微乳，包括实施例1所得中药提取物组合物以及药学可接受的注射用微乳辅料。
实施例10
本发明实施例提供了一种抑制黑色素瘤的硬胶囊剂，包括实施例2所得中药提取物组合物以及药学可接受的硬胶囊剂辅料。
实施例11
本发明实施例提供了一种抑制黑色素瘤的软胶囊剂，包括实施例3所得中药提取物组合物以及药学可接受的软胶囊剂辅料。
实施例12
本发明实施例提供了一种抑制黑色素瘤的颗粒剂，包括实施例4所得中药提取物组合物以及药学可接受的颗粒剂辅料。
实施例13
本发明实施例提供了一种抑制黑色素瘤的散剂，包括实施例5所得中药提取物组合物以及药学可接受的散剂辅料。
实施例14
本发明实施例提供了实施例1所得中药提取物组合物对黑色素瘤细胞的影响。
1、试验样品
以下试验样品培养基溶液和DMSO培养基溶液的溶剂均为10％PBS、100U/m青霉素、100mg/L链霉素的DMEM培养基。其中试验样品培养基溶液的溶质为实施例1所得中药提取物组合物和DMSO，终浓度为0.001、0.01、0.1、1μg/mL的试验样品培养基溶液中含0.01％(v/v)DMSO，终浓度为1.56、3.125、6.25、12.5、25、50、100μg/mL的试验样品培养基溶液中含1％(v/v)DMSO，终浓度为200μg/mL的试验样品培养基溶液中含2％(v/v)DMSO。
以下试验中的抗体来源：
抗体名 厂家 货号 来源 分子量KDa
GAPDH Proteintech 60004-1-Ig 鼠 36kDa
Bax CST 2772S 兔 20kDa
BCL-2 Proteintech 12789-1-AP 兔 26kDa
Bcl-xL CST #2764 兔 30kDa
Caspase3 Proteintech 19677-1-AP 兔 17,19,35kDa
NF-κB p65 CST #8242 兔 65KDa
以下试验中的二抗来源：
二抗 厂家 货号 来源
山羊抗小鼠 中杉金桥 ZB-2305 山羊
山羊抗兔 中杉金桥 ZB-2301 山羊
2、细胞
A375人源肿瘤细胞株、B16-F10鼠源肿瘤细胞株(购自上海中乔新舟生物科技有限公司)用含10％PBS、100U/m青霉素、100mg/L链霉素的DMEM培养基，置37℃、5％CO2的恒温密闭式培养箱中培养，取对数生长期细胞用于实验。
3、本发明中药提取物组合物对黑色素瘤细胞活性评价
取对数生长期的A357和B16-F10细胞，调整细胞密度为1x104/孔，接种于96孔培养板，孵育24h，弃上清，加入终浓度为200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.56、1、0.1、0.01、0.001μg/mL(最大设置浓度取决于试验样品的溶解性)的试验样品培养基溶液以及体积百分浓度为0.01％，1％和2％的DMSO培养基溶液，处理24、48、72h后，倒置显微镜下观察细胞形态的变化。采用MTT法检测试验样品对肿瘤细胞活力的影响。
实验结果显示，给药24h后，与对照组相比，终浓度为1.56、3.125、6.25μg/mL的试验样品培养基溶液能明显抑制B16-F10细胞的活性(P＜0.01)，终浓度为12.5、25、50、100μg/mL的试验样品培养基溶液能明显促进B16-F10细胞的活性(P＜0.01)，细胞活性随着药物的浓度增加而改变，作用强度呈剂量依赖性关系；结果显示，与1％DMSO培养基溶液相比，2％DMSO培养基溶液能明显抑制B16-F10细胞的活性(P＜0.01)，提示2％DMSO培养基溶液对B16-F10细胞有毒性作用。该结果提示本发明中药提取物组合物低剂量具有抑制恶性黑色素瘤细胞活性的作用，高剂量促进黑色素瘤细胞活性的作用。
试验样品对A375、B16-F10细胞活性的影响的实验结果见图1(x±s，n＝10)，给药24、48、72h后，与对照组相比，终浓度为0.001、0.01、0.1、1μg/mL的试验样品培养基溶液能明显抑制A375细胞的活性(P＜0.01)，细胞活性随着药物的浓度增加而下降，作用强度呈剂量依赖性关系；与对照组相比，终浓度为0.001、0.01、0.1、1μg/mL的试验样品培养基溶液能明显抑制B16-F10细胞的活性(P＜0.01)；细胞活性随着药物的浓度增加而下降，作用强度呈剂量依赖性关系。提示本发明中药提取物组合物具有抑制恶性黑色素瘤细胞的作用。
4.本发明中药提取物组合物对黑色素瘤细胞凋亡蛋白表达的影响
检测NFκB p65信号通路激活情况(核转录因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)p65蛋白表达水平)及下游靶分子Cleaved-caspase 3、Bax、BCL-2、Bcl-xL的表达。
操作过程：
(1)细胞样本准备：取对数生长期的A375、B16-F10细胞，调整细胞密度为3～5×105/孔，接种于6孔培养板，孵育24h，去上清液，加入终浓度为1μg/mL的试验样品培养基溶液。
(2)总蛋白提取：药物作用48h后，培养板置于冰上，弃培养基，用预冷的PBS洗细胞三次。每孔加入100μL预冷的含PMSF细胞裂解液，冰上静置5min，使用细胞刮反复刮磨细胞30min，使其充分裂解，收集细胞裂解液至预冷的EP管中，4℃，12000r离心15min。收集上清液至另一预冷的EP管中，即为细胞总蛋白。
(3)蛋白定量：使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定样品蛋白浓度。
(4)蛋白变性：根据蛋白体积加入相应的5×loading buffer，100℃煮样5min，冷却后，分装保存于-20℃，避免反复冻融。
(5)SDS-PAGE电泳:
a)清洗、嘹干玻璃板、梳子及电泳槽，按要求安装；
b)按比例分别灌制10％分离胶和5％浓缩胶，插入样品梳；
c)浓缩胶充分凝固后放入电泳槽中，加满电泳缓冲液，以微量进样器缓慢加样，每孔加入相同蛋白量，上样体积差用上样缓冲液配平；
d)电泳，样品在浓缩胶时电压设为50V，样品至分离胶时电压调至90V，溴酚兰刚出胶外即终止电泳。
(6)转印及封闭
a)配置转膜缓冲液；
b)以100％甲醇润湿PVDF膜5min后置于转移缓冲液中；
c)按由负极到正极的顺序依次在夹子上放置黑色塑料孔板-海绵-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-海绵-透明塑料孔板，小心去各层之间的气泡，夹紧夹子，以膜为正极胶为负极的方向插入转移槽；
d)恒流300A，转膜1.5h，以冰块降温；
e)转膜后，小心取出膜，TBST洗膜10min×3次；
f)置于封闭液中室温摇床上封闭2h。
(7)抗体杂交
a)将膜自封闭液中取出，TBST洗10min×3次，滤纸吸去残留液；
b)膜置于孵育盒中，以适宜比例稀释一抗(GAPDH按1:20000的配比稀释，NF-kBp65、Caspase 3、Cleaved-Caspase 3、Bcl-xL、Bax按1:1000的配比稀释)，用快速封闭液(Beyotime；P0252)封闭，4℃孵育过夜，TBST洗10min×3次；
c)按1:10000的配比稀释二抗(山羊抗小鼠，山羊抗兔)，室温孵育2h，TBST洗10min×3次。
(8)ECL化学发光，显影及定影：等体积混合ECL试剂盒中A、B试剂，将混合液均匀铺在PVDF膜蛋白面，室温作用5min，置于曝光盒中转入暗室曝光，显影、定影。
结果：
实验结果如图2、3所示(
Figure BDA0002793810020000101
n＝3)，图2为给药48h后，试验样品(1μg/mL)对A375细胞中NF-kB p65，Caspase 3，Cleaved-Caspase 3，Bcl-xL，Bax蛋白表达的影响；图3为给药48h后，试验样品(1μg/mL)对B16-F10细胞中Caspase 3，Cleaved-Caspase 3，Bcl-xL，BCL-2，Bax蛋白表达的影响；GAPDH为内参。由图可见，给药48h后，与空白对照组相比，试验样品(1μg/mL)显著上调A375细胞中NF-kB p65,Cleaved-Caspase 3蛋白水平，显著下调Bcl-xL蛋白水平；给药48h后，与空白对照组相比，试验样品(1μg/mL)显著上调B16-F10细胞中Cleaved-Caspase 3,Bax蛋白水平，显著下调Bcl-xL，BCL-2蛋白水平；结果提示本发明中药提取物组合物通过调节NF-kB p65，Caspase 3，Bcl-xL，BCL-2，Bax蛋白的表达促进恶性黑色素瘤细胞凋亡。
5.本发明中药提取物组合物对黑色素瘤细胞周期的影响
操作过程：
(1)细胞样本准备：取对数生长期的A357和B16-F10细胞，调整细胞密度为3～5×105/孔，接种于6孔培养板，孵育24h，弃上清，分别加入0.01％(v/v)DMSO(对照组)、终浓度为1μg/mL的试验样品培养基溶液处理48h后，收集悬浮和贴壁细胞于15mL离心管中，1000r离心5min，用预冷的PBS洗涤2次；
(2)细胞固定：加入1mL冰浴预冷的70％乙醇，轻轻吹打混匀，4度固定过夜；
(3)细胞收集：1000r离心5min，弃上清，用预冷的PBS洗涤2次；
(4)碘化丙啶染色液配置：根据1个样品需要0.5mL染色缓冲液、25μL碘化丙啶染色液、10μL RNsae A，配置适量碘化丙啶染色液；
(5)染色：每管细胞样品加入0.5mL碘化丙啶染色液，缓慢并充分重悬细胞，37℃避光温浴30min；
(6)流式检测和分析：流式细胞仪在激发波长488nm波长处检测红色荧光，每份标本分析至少10000个细胞，运用细胞周期拟合软件分析检测细胞周期分布情况，绘出细胞周期分布直方图。
结果：
如图4所示(
Figure BDA0002793810020000111
n＝3)，图4为给药48h后，流式检测试验样品(1μg/mL)对A375细胞周期分布的影响的G2/M期时相百分比的量化结果。由图可见，给药处理A375细胞48h后，与对照组相比，试验样品组(1μg/mL)组的G2/M期时相百分比显著下调，P＜0.05，差异有统计学意义。
6.通过克隆形成实验来测定本发明中药提取物组合物对黑素瘤细胞增殖的影响
将细胞(1×103/孔)接种到6孔板中，在新鲜培养基中培养一周，然后用终浓度为0.001、0.01、0.1、1μg/mL的试验样品培养基溶液处理24小时。随后，用4％多聚甲醛固定30分钟后并用0.1％结晶紫染色，每个孔拍照，并使用ImageJ软件对染色部分进行统计。
结果如图5、6所示(
Figure BDA0002793810020000112
n＝3)，图5为给药48h后，结晶紫染色检测各浓度试验样品培养基溶液对A375细胞平板克隆形成的影响；图6为给药48h后，结晶紫染色检测各浓度试验样品培养基溶液对B16-F10细胞平板克隆形成的影响。由图可见，与对照组相比，试验样品培养基溶液能抑制A375和B16-F10细胞平板克隆形成，随着药物的浓度作用强度呈剂量依赖性关系。提示本发明中药提取物组合物可抑制A375、B16-F10细胞系平板克隆形成。
由以上试验结果可见，本发明中药提取物组合物在低浓度下可通过抑制A375，B16-F10细胞周期G2/M期时相、细胞增殖以及细胞克隆而发挥抑制黑色素瘤细胞活性的作用，从而促进A375，B16-F10细胞凋亡。其促凋亡机制与该中药提取物组合物调节NF-kBp65，Caspase 3，Bcl-xL，BCL-2和Bax蛋白表达有关。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种中药提取物组合物作为唯一活性成分在制备抑制黑色素瘤药物中的应用，其特征在于，所述中药提取物组合物由生药比例为0.5~1.5：1的女贞子醇提物和墨旱莲醇提物组成；所述女贞子醇提物是以75~85%v/v乙醇水溶液提取制得，所述墨旱莲醇提物是以65~75%v/v乙醇水溶液提取制得。
2.根据权利要求1所述的中药提取物组合物在制备抑制黑色素瘤药物中的应用，其特征在于，所述女贞子醇提物和墨旱莲醇提物的生药比例为0.8~1.2:1。
3.根据权利要求2所述的中药提取物组合物在制备抑制黑色素瘤药物中的应用，其特征在于，所述女贞子醇提物和墨旱莲醇提物的生药比例为1:1。
4.根据权利要求1所述的中药提取物组合物在制备抑制黑色素瘤药物中的应用，其特征在于，所述女贞子醇提物的制备方法包括：将女贞子以8~12倍量75~85%v/v乙醇水溶液提取2~3次，每次1.5~2h，合并提取液，干燥；和/或
所述墨旱莲醇提物的制备方法为：将墨旱莲以8~12倍量65~75%v/v乙醇水溶液提取2~3次，每次1.5~2h，合并提取液，干燥。
5.根据权利要求4所述的中药提取物组合物在制备抑制黑色素瘤药物中的应用，其特征在于，所述女贞子醇提物的制备方法包括：将女贞子以10倍量80%v/v乙醇水溶液提取2次，每次2h，合并提取液，干燥；和/或
所述墨旱莲醇提物的制备方法为：将墨旱莲以10倍量70%v/v乙醇水溶液提取2次，每次2h，合并提取液，干燥。
6.权利要求1~5任一项所述中药提取物组合物在制备体外抑制黑色素瘤的药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述中药提取物组合物的浓度为6.25~1.56μg/mL。
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