CN115844863B - 3-羟基巴戟醌在制备抗宫颈癌药物中的应用 - Google Patents
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- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
Abstract
本发明公开了3‑羟基巴戟醌在制备抗宫颈癌药物中的应用。本发明首次提供了3‑羟基巴戟醌在制备抗宫颈癌药物方面的良好应用，体外实验表明浓度为10‑80μM/L的3‑羟基巴戟醌可明显抑制宫颈癌HeLa细胞增殖，促进凋亡；细胞活力试验表明3‑羟基巴戟醌对正常细胞的毒性低，表明3‑羟基巴戟醌有良好的药物前景，可以开发成治疗宫颈癌的药物，为临床宫颈癌提供了一种新思路。另外，本发明通过研究发现3‑羟基巴戟醌还能够通过PI3K/AKT/NF‑κB信号通路抑制宫颈癌细胞的增殖，这对了解宫颈癌的发病机制，制定新的治疗策略具有十分重要的意义，为宫颈癌提供一个潜在的治疗方案。
Description
技术领域
本发明属于细胞生物学技术领域，具体涉及3-羟基巴戟醌在制备抗宫颈癌药物中的应用。
背景技术
癌症负担和癌症死亡率正在增加，其中宫颈癌是全世界妇女中第四常见的癌症。宫颈癌的治疗主要包括手术，放疗，化疗和靶向治疗。尽管最近取得了突破，但由于有限的治疗选择，在复发性转移性宫颈癌的病例中的存活率仍然很低，因此迫切需要更有效的治疗。在过去30年中，大约61%的生物活性天然化合物已用于癌症治疗。基于天然的化合物构成癌症药物发现的重要研究领域，基于其安全性和有效性，许多化合物在许多癌症中显示出治疗潜力。例如，姜黄素、白藜芦醇、紫杉醇是治疗癌症的有效的天然抗癌剂。因此，天然药物化学需要进行深入研究，以找到更安全，更有效的治疗疾病的化合物。
肿瘤的治疗原理基于传统中药中的“扶正祛邪”。“祛邪”即消除侵袭机体的致病因素，如诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞增殖，抑制血管生成，诱导肿瘤细胞分化。红大戟(Knoxia roxburghii (Spreng.) M. A. Rau)为茜草科多年生草本植物，在中国西部和西南部的高海拔地区，云南和广西很普遍。2020年版《中国药典》记载红大戟具有泻水逐饮，消肿散结的功效，主要用于治疗胸腹积水、痈肿疮毒、瘰疬痰核等病症。
其中，3-羟基巴戟醌是质量控制的标志，是红大戟的有效成分。目前已有报道从红大戟中分离出的熊果酸、2α，3α，24-三羟基-12-烯-28-熊果酸、damnacanthal及Bergapten等具有抗肿瘤作用。3-羟基巴戟醌对癌细胞的作用尚未见报道。
本发明旨在提供3-羟基巴戟醌在制备抗宫颈癌药物中的应用。
发明内容
本发明的第一目的是提供3-羟基巴戟醌在制备抗宫颈癌药物中的应用，本发明的另一目的是提供一种抗宫颈癌药物。
本发明的第一目的是这样实现的，3-羟基巴戟醌的应用为在制备抗宫颈癌药物中的应用，其结构式如下：
。
本发明的第二目的是这样实现的，一种抗宫颈癌药物，所述药物以3-羟基巴戟醌为主要活性成分或活性成分之一。
本发明的有益效果为：
本发明首次提供了3-羟基巴戟醌在制备抗宫颈癌药物方面的良好应用，体外实验表明浓度为10-80μM/L 的3-羟基巴戟醌可明显抑制宫颈癌HeLa细胞增殖，促进凋亡；且细胞活力试验表明3-羟基巴戟醌对正常细胞无毒性，表明3-羟基巴戟醌有良好的药物前景，可以开发成治疗宫颈癌的药物，为临床宫颈癌提供了一种新思路。
另外，本发明通过研究发现3-羟基巴戟醌还能够通过PI3K/AKT/NF-κB信号通路抑制宫颈癌细胞的增殖，这对了解宫颈癌的发病机制，制定新的治疗策略具有十分重要的意义，为宫颈癌提供一个潜在的治疗方案。
附图说明
图1为用3-羟基巴戟醌处理24小时的HeLa细胞活力图；
图2为用3-羟基巴戟醌处理24小时的L02细胞（人正常肝细胞）活力图；
图3为用3-羟基巴戟醌处理24小时的HeLa细胞的群落形成实验图；
图4为3-羟基巴戟醌处理对癌细胞迁移能力影响的伤口愈合实验；其中，A为3-羟基巴戟醌处理24小时后，在倒置显微镜下观察伤口面积；B为伤口面积（μm2），数据代表三个独立实验的平均值±SD（注：与对照组相比，“*”p< 0.05，“**”表示p< 0.01，“***”表示p<0.001）；
图5为3-羟基巴戟醌诱导HeLa细胞凋亡；其中，A为用3-羟基巴戟醌处理24小时的HeLa细胞的凋亡图；B为凋亡细胞的百分比。数据代表三个独立实验的平均值±SD（注：与对照组相比，“*”p< 0.05，“**”表示p< 0.01，“***”表示p< 0.001）；
图6为在Hoechst 33258染色后，通过荧光显微镜观察到的细胞核；
图7为3-羟基巴戟醌诱导HeLa细胞的ΔΨm塌陷，其中，A为HeLa细胞的Rh123荧光强度的流式细胞仪分析；B为ΔΨm数据显示图；C为通过荧光显微镜评估Rh123的荧光强度。数据代表三个独立实验的平均值±SD（注：与对照组相比，“*”p< 0.05，“**”表示p< 0.01，“***”表示p< 0.001）；
图8为3-羟基巴戟醌诱导HeLa细胞的细胞内ROS生成；其中，A为通过DCFH-DA荧光的流式细胞仪分析来评估ROS的产生；B为ROS生成数据图，数据代表三个独立实验的平均值±SD（注：与对照组相比，“*”p< 0.05，“**”表示p< 0.01，“***”表示p< 0.001）；
图9为Western blot（蛋白质印记分析法）分析3-羟基巴戟醌对HeLa细胞中凋亡相关蛋白水平的影响；其中，A为3-羟基巴戟醌对HeLa细胞中PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、EGFR、MCL-1、NF-κB、p-NF-κB、Caspase 3、P53、细胞色素C和CEA疾病标志物表达水平的影响；B为p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、EGFR和MCL-1的密度定量；C为CEA的密度定量；D为P-NF-κB/NF-κB、Caspase 3、P53和细胞色素C的密度定量。数据代表三个独立实验的平均值±SD（注：与对照组相比，“*”p< 0.05，“**”表示p< 0.01，“***”表示p< 0.001）。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明作进一步说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或改进，均落入本发明的保护范围。
本发明提供了3-羟基巴戟醌在制备抗宫颈癌药物中的应用，其结构式如下：
。
所述宫颈癌细胞株为HeLa细胞。
3-羟基巴戟醌的使用浓度为10-80μM/L。
本发明还提供了一种抗宫颈癌药物，所述药物以3-羟基巴戟醌为主要活性成分或活性成分之一。
所述抗宫颈癌药物还含有一种或至少两种药学上可以接受的载体。
所述载体为缓释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂或润滑剂。
以下通过体外细胞试验检测3-羟基巴戟醌对宫颈癌HeLa细胞的抑制效果。
检测例1 细胞活力实验
方法：采用CCK-8法检测实施例1得到的3-羟基巴戟醌对人体HeLa细胞（人宫颈癌下拨啊）和L02细胞（人体正常肝细胞）的毒性。
将实施例1制备的3-羟基巴戟醌溶解在二甲亚砜(DMSO)中，用培养基分别配置0、10、20、40、80、160 μmol/L的药物浓度。将HeLa和L02细胞系(1×104个细胞/孔)均在96孔板中进行培养。24 h后去除培养基，用无菌PBS清洗细胞。在37℃下，用0、10、20、40、80、160 μmol/L的3-羟基巴戟醌处理细胞24 h。移除混合物后，孵化2 h，用100 μL无菌PBS清洗细胞两次。接着，每个孔中加入100 μL含有10% CCK-8的培养液，在37℃下培养2 h。测量450 nm下的吸光值。并计算细胞活力，同时以求得半数抑制浓度(IC50)。细胞存活率(%)＝(OD450实验组/OD450对照组)×100％。
试验结果：由图1和图2可知，3-羟基巴戟醌对HeLa细胞有明显的生长抑制效果，对于实验中的正常细胞L02则没有表现出毒性，说明3-羟基巴戟醌具有良好的肿瘤细胞选择性和相对的安全性。
检测例2 细胞集落形成实验
将HeLa细胞均匀地接种在6孔板中（1×102个细胞/孔），并在37℃、5%CO2的恒温无菌培养箱中培养过夜。用0、10、20、40和80 μmol/L的3-羟基巴戟醌处理24小时后，在无3-羟基巴戟醌条件下再培养2周。当出现群落时，用PBS洗涤细胞两次，用75%的乙醇固定15分钟。群落（>50个细胞）用结晶紫染色，然后在显微镜下计数。
试验结果如图3所示，3-羟基巴戟醌在10-80μmol/L浓度内以剂量依赖性方式抑制HeLa细胞集落形成，在80 μ mol/L时观察到的抑制作用最大。
检测例3 细胞伤口愈合实验
将HeLa细胞接种到6孔板中（2×105个细胞/孔）。在100%融合时，用1毫升的移液枪枪头划伤细胞单层，并用PBS清洗以去除细胞碎片。用0、10、20、40和80 μmol/L的3-羟基巴戟醌处理24小时后，用显微镜拍摄伤口的图像（图4A），并测量伤口的宽度（图4B）。
试验结果：从图4可知3-羟基巴戟醌对HeLa细胞迁移的抑制。孵育24 h后，对照组划痕处由于细胞团致密生长而逐渐开始闭合，而3-羟基巴戟醌处理的细胞生长受到明显抑制，呈剂量依赖性。3-羟基巴戟醌处理组和对照组的细胞形态也有明显差异。对照组细胞呈梭形、半透明，质地均匀，密度适中，分布均匀。3-羟基巴戟醌处理组细胞体积、密度下降，出现颗粒；这些结果表明3-羟基巴戟醌改变了HeLa细胞的形态并抑制了其生长。
检测例4 细胞凋亡检测试验
根据制造商的说明，使用Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒用流式细胞仪检测细胞凋亡。简而言之，将HeLa细胞接种到6孔板中（2×105个细胞/孔），用0、10、20、40和80 μmol/L的3-羟基巴戟醌处理24小时。随后，用不含EDTA的胰蛋白酶消化细胞，用预冷的PBS洗涤两次，100×g离心5分钟收集细胞。接下来，将细胞悬浮在1×结合缓冲液中，并与5毫升Annexin V-FITC试剂和5毫升PI溶液在室温下黑暗中孵育10分钟。使用BD FACSAria™III流式细胞仪检测染色的细胞，然后用FlowJo V10进行分析。
试验结果如图5所示，从图5A中可以看出，对照细胞的膜联蛋白V和PI均为阴性，表明细胞是存活的。给药3-羟基巴戟醌后，发生凋亡的细胞数量呈剂量依赖性显著增加(图5B)。HeLa细胞凋亡率分别从8.94%提高到55.25%、68.40%、70.56%和77.71%，说明3-羟基巴戟醌有效引发了HeLa细胞凋亡。
检测例5 Hoechst 33258染色
将HeLa细胞接种在6孔板中（2×105个细胞/孔），在37℃、5%CO2的恒温无菌培养箱中培养过夜。用0、10、20、40和80 μmol/L的3-羟基巴戟醌处理24小时后，用75%的乙醇固定细胞10分钟，然后用PBS洗两次。然后用Hoechst 33258在室温下黑暗中染色15分钟。用PBS清洗后，用荧光显微镜在激发波长为350nm，发射波长为460nm的条件下观察细胞核。
试验结果如图6所示，从图中可以看出，3-羟基巴戟醌诱导HeLa细胞核出现染色质浓缩、DNA断裂等典型的形态改变。此外，荧光强度随着3-羟基巴戟醌处理而增加，表明3-羟基巴戟醌诱导细胞死亡呈剂量依赖性。
检测例6 3-羟基巴戟醌诱导HeLa细胞的ΔΨm塌陷
将HeLa细胞接种在6孔板中（2×105个细胞/孔），并在37℃、5%CO2的恒温无菌培养箱中培养过夜。用0、10、20、40和80 μmol/L的3-羟基巴戟醌处理24小时后，在37℃下用Rh123对HeLa细胞染色30分钟，然后用PBS洗三次。使用BD FACSAria™ III流式细胞仪检测被染色的细胞，然后用FlowJo V10进行分析。3-羟基巴戟醌对ΔΨM的影响也通过荧光显微镜评估。
试验结果如图7所示，从图7C中可以看出，与对照组比较，3-羟基巴戟醌处理24h诱导HeLa细胞Rh123荧光强度逐渐降低，且呈浓度依赖性。流式细胞术检测给药0、10、20、40和80 μmol/L3-羟基巴戟醌的HeLa细胞中Rh123的平均荧光强度分别为4.83、4.05、3.385、2.25和2.20（图7B）。这些变化证实3-羟基巴戟醌降低了HeLa细胞的ΔΨm，表明线粒体凋亡途径参与了3-羟基巴戟醌诱导的细胞凋亡。
检测例7 3-羟基巴戟醌诱导HeLa细胞的细胞内ROS生成
将HeLa细胞接种在6孔板中（2×105个细胞/孔），并在37℃、5%CO2的恒温无菌培养箱中培养过夜。用0、10、20、40和80 μmol/L的3-羟基巴戟醌处理24小时后，用DCFH-DA在37℃下对细胞进行染色30分钟。将细胞重新悬浮在PBS中，通过BD FACSAria™ III流式细胞仪测量细胞内的荧光强度来量化ROS的产生，然后用FlowJo V10进行分析（图8）。
试验结果如图8所示，从图中可以看出与对照组比较，HeLa细胞经3-H处理24 h后，DCF荧光强度显著升高。3-羟基巴戟醌的影响呈剂量依赖性。在给药0、10、20、40和80 μmol/L 3-H的HeLa细胞中，DCFH-DA的平均荧光强度分别为3.26、3.78、4.80、5.91和6.87。这些发现表明，3-羟基巴戟醌诱导HeLa细胞产生细胞内ROS。
检测例8 Western blot（蛋白质印记分析法）分析3-羟基巴戟醌对HeLa细胞中凋亡相关蛋白水平的影响
将HeLa细胞接种在6孔板中（2×105个细胞/孔），并在37℃、5%CO2的恒温无菌培养箱中培养过夜。用0、10、20、40和80 μmol/L的3-羟基巴戟醌处理24小时后，收集细胞，用PBS清洗，并用RIPA缓冲液裂解。使用BCA蛋白质测定试剂盒对蛋白质浓度进行测量。等量的蛋白质通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，并转移到聚丙烯二氟（PVDF）膜上（用5%的脱脂牛奶阻断2小时后，将膜在4℃的摇床中与p-PI3K（1：1000）、PI3K（1:1,000）、p-AKT（1：1000）、AKT（1:1,000）、EGFR（1:1,000）、MCL-1（1。 1:1,000）、CEA（1:1,000）、p- NF-κB（1:1,000）、NF-κB（1:1,000）、P53（1:1,000）、Caspase 3（1:1,000）和Cytochrome C（1:1,000）12-16小时（（β-actin用1:3,000）。加入TBST并放在摇床上，然后将膜洗三次，每次5分钟。在室温下与第二抗体（1:8,000）孵育1小时。使用化学发光凝胶成像系统检测目标蛋白，用ImageJ软件对印迹进行可视化。
实验结果：从图9中可知，在3-羟基巴戟醌处理的HeLa细胞中Caspase 3、P53和细胞色素C的水平上调，而p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、EGFR、MCL-1、P-NF-κ B/NF-κ B和癌胚抗原 (CEA) 疾病标志物下调，表明3-羟基巴戟醌对HeLa细胞的抗癌作用是通过PI3K/AKT/NF-κB信号通路介导的。
综上可知，3-羟基巴戟醌以剂量依赖性方式抑制HeLa细胞集落形成，在80 μ mol/L时观察到的抑制作用最大。3-羟基巴戟醌以剂量依赖性方式诱导细胞凋亡，降低了HeLa细胞的ΔΨm，诱导HeLa细胞中细胞内ROS的生成。在3-羟基巴戟醌处理的HeLa细胞中Caspase3、P53和细胞色素C的水平上调，而p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、EGFR、MCL-1、P-NF-κ B/NF-κ B和癌胚抗原 (CEA) 疾病标志物下调，表明3-羟基巴戟醌对HeLa细胞的抗癌作用是通过PI3K/AKT/ NF-κB信号通路介导的，为进一步了解3-羟基巴戟醌抗癌作用的分子机制提供了新的基础。
Claims (3)
1.一种以3-羟基巴戟醌作为唯一活性成分在制备抗宫颈癌药物中的应用，其结构式如下：
。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗宫颈癌药物还含有一种或至少两种药学上可以接受的载体。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述载体为缓释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂或润滑剂。
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