CN111840412A - 茶褐素在制备抗黑色素瘤药物中的应用 - Google Patents

Abstract

茶褐素在制备抗黑色素瘤药物中的应用，属于茶褐素的用途技术领域。该应用包括：茶褐素在制备诱导A375人黑色素瘤细胞凋亡药物中的作用；茶褐素在作为天然物质制备抑制黑色素瘤药物中的应用；茶褐素在作为天然物质制备DNA损伤剂中的应用。本发明证明了茶褐素对A375细胞具有抗增殖作用，茶褐素对A375细胞具有促凋亡作用，茶褐素引起A375细胞DNA损伤，茶褐素影响A375细胞的蛋白表达，茶褐素影响A375移植瘤斑马鱼的体内作用。本发明研究了茶褐素对A375人黑色素瘤细胞促凋亡作用及作用机制，可用于开发抗黑色素瘤药物。

Description

茶褐素在制备抗黑色素瘤药物中的应用

技术领域

本发明属于茶褐素的用途技术领域，涉及茶褐素在制备抗黑色素瘤药物中的应用，具体涉及茶褐素在诱导A375人黑色素瘤细胞凋亡中的作用。

背景技术

黑色素瘤（Melanoma）来源于表皮黑色素细胞，可发生在任何含有这些细胞的组织中，是一类恶化程度高、发病隐匿，侵袭性强的肿瘤。其临床特征差异很大，目前大多数黑色素瘤的临床特征主要表现为以下几点：不对称性；边缘不规则，参差不齐、有凹痕或模糊；颜色不均匀，呈不同程度的棕褐色、棕色或黑色；直径大于6mm；随着病情的演变会升高或扩大。虽然最常见的黑色素瘤形式是皮肤，但它也可能出现在任何非皮肤部位，包括眼、胃肠、泌尿生殖系统和鼻咽部位。虽然黑色素瘤在皮肤癌的病例中只占4%，但它的致死率极高，约占皮肤癌相关死亡病例的73%。此外，仅次于肺癌和乳腺癌的黑色素瘤还是脑转移的第三大最常见原因。作为一种潜在的致死性皮肤恶性肿瘤，黑色素瘤在世界范围内发病率持续上升。由于黑色素瘤高致死率、转移速度快、预后差的特点，极大增加了医疗资源的消耗，给社会及患者带来巨大的精神压力和沉重的经济负担。

目前，针对黑色素瘤的治疗方法包括手术治疗、放疗、化学治疗、靶向治疗和免疫治疗等。有研究发现，黑色素瘤具有放射抗拒性，是一种抗放射癌，且放射治疗对人体的正常细胞也会造成伤害。达卡巴嗪和替莫唑胺是抗黑素瘤化学疗法中的常用药物，但其对黑色素瘤治疗的有效率较低，预后性较差。BRAF是黑色素瘤中最常见的致癌基因，应运而生的BRAF抑制剂，如索拉菲尼、威罗菲尼、达拉菲尼等药物，可诱导黑色素瘤转移并迅速消退，但是，BRAF单一疗法的益处只是暂时的，6～7个月后，大多数患者表现出了耐药性。免疫疗法可改善黑色素瘤患者的免疫反应，但存在严重的毒副作用，使得其在临床上的应用仍然受到限制。因此，迫切需要开发低毒性的新型药物来治疗黑色素瘤患者。

黑色素瘤和非小细胞肺癌以及骨肉瘤有明显区别：1）黑色素瘤通常是指恶性黑色素瘤，是黑色素细胞来源的一种高度恶性的肿瘤，简称恶黑，多发生于皮肤，也可见于黏膜和内脏，约占全部肿瘤的3%。恶性黑色素瘤可由先天性或获得性良性黑素细胞痣演变而成，或由发育不良性痣恶变而来，也可以是新发生。恶性黑色素瘤除早期手术切除外，缺乏特效治疗，预后差。2）非小细胞型肺癌包括鳞状细胞癌（鳞癌）、腺癌、大细胞癌，与小细胞癌相比其癌细胞生长分裂较慢,扩散转移相对较晚。目前认为吸烟是肺癌的最重要的高危因素，烟草中有超过3000种化学物质，其中多链芳香烃类化合物（如：苯并芘）和亚硝胺均有很强的致癌活性。多链芳香烃类化合物和亚硝胺可通过多种机制导致支气管上皮细胞DNA损伤，使得癌基因（如Ras基因）激活和抑癌基因（如p53，FHIT基因等）失活，进而引起细胞的转化，最终癌变。3）骨肉瘤也叫成骨肉瘤，骨肉瘤是骨恶性肿瘤中最多见的一种，是从间质细胞系发展而来，肿瘤迅速生长是由于肿瘤经软骨阶段直接或间接形成肿瘤骨样组织和骨组织。下肢负重骨在外界因素（如病毒）的作用下，使细胞突变，可能与骨肉瘤形成有关。典型的骨肉瘤源于骨内，另一与此完全不同类型的是与骨皮质并列的骨肉瘤，源于骨外膜和附近的结缔组织。后者较少见，预后稍好。由上可知，三种肿瘤从来源、发病机制、发生范围及预后都有所不同，其干预方法必然不同，即对非小细胞肺癌以及骨肉瘤有效的手段，不一定全部适用于黑色素瘤。因此，本研究首次发现茶褐素对黑色素瘤有显著干预作用，具有独创性。

茶褐素（theabrownin，TB）是从茶叶中提取出的一类能溶于水，而不溶于乙酸乙酯、正丁醇的复杂天然高聚物，由茶黄素和茶红素等多酚类物质进一步氧化衍生而成，天然存在于红茶、绿茶和黑茶中。茶褐素对改善人体的综合代谢平衡大有裨益，具有降血糖、血脂、血压、尿酸等效果，同时也是一种很有前途的抗癌候选物质。

目前，许多抗癌药可以通过多种途径诱导癌细胞凋亡。肿瘤蛋白p53是与人类肿瘤最广泛相关的抑癌基因。在正常情况下，p53在DNA修复和复制中起作用，在DNA损伤后阻止细胞增殖，从而抑制了肿瘤的生长。研究显示，p53在黑色素瘤的发生和发展中也起重要作用。NF-κB是在真核细胞中广泛分布的转录因子，在肿瘤细胞的增殖，凋亡中也起着关键的作用。实验证明，NF-κB途径是黑色素瘤主要的肿瘤促进途径之一。

早前我们的研究已发现，茶褐素能通过激活P53信号通路，从而抑制人骨肉瘤细胞U2OS和非小细胞肺癌细胞A549增殖，并诱导其发生凋亡。然而其对黑色素瘤等皮肤癌的影响尚不清楚，也未有相关的研究报道。

发明内容

针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于设计提供茶褐素在制备抗黑色素瘤药物中的应用。本发明为了评估茶褐素抗A375人黑色素瘤的体内外作用和机制，采用MTT法检测茶褐素对A375细胞活性与形态的影响；采用DAPI染色与流式细胞术检测茶褐素对A375细胞凋亡的影响；通过彗星实验和TUNEL试验检测茶褐素对A375细胞的DNA损伤程度；通过蛋白质免疫印迹法检测A375细胞中靶向蛋白表达和磷酸化水平；采用斑马鱼显微注射A375细胞建立斑马鱼异种移植瘤模型，通过对该黑色素瘤模型动物的干预作用来评价茶褐素的体内抗肿瘤效果。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

茶褐素在制备诱导A375人黑色素瘤细胞凋亡药物中的作用。

所述的茶褐素在制备诱导A375人黑色素瘤细胞凋亡药物中的作用，其特征在于所述茶褐素通过P53和NF-κB通路引起DNA损伤，从而诱导A375人黑色素瘤细胞凋亡。

所述的茶褐素在制备诱导A375人黑色素瘤细胞凋亡药物中的作用，其特征在于所述茶褐素以剂量依赖的方式触发DNA损伤。

茶褐素在作为天然物质制备抑制黑色素瘤药物中的应用。

所述的茶褐素在作为天然物质制备抑制黑色素瘤药物中的应用，其特征在于所述黑色素瘤为A375人黑色素瘤。

茶褐素在作为天然物质制备DNA损伤剂中的应用。

本发明具有以下有益效果：

本发明是关于茶褐素对A375人黑色素瘤细胞促凋亡作用和作用机制的首次报道，使茶褐素成为开发抗A375人黑色素瘤药物的天然产物的有希望的候选对象。研究证明茶褐素对A375人黑色素瘤细胞有促凋亡作用。并阐明其作用机理与DNA损伤激活途径有关，包括P53和NF-κB通路。因此，茶褐素可被视为DNA损伤的诱导剂，激活下游促凋亡基因和蛋白，导致A375人黑色素瘤细胞凋亡，最终抑制黑色素瘤的发生和发展。这项研究为茶褐素抗黑色素瘤的功效提供了证据，并有助于天然产物的开发，即DNA损伤因子，用于黑色素瘤的治疗。

附图说明

图1为经茶褐素处理的A375细胞在24、48、72h时的细胞抑制率曲线图（A）和细胞形态图（B），数据表示为X±SD，P<0.01表示与正常水平(0μg/ml TB)相比有显著性差异，比例尺= 20μm；

图2为不同浓度的茶褐素处理A375细胞后的DAPI染色显微观察图（A）和流式细胞术观察（B），不同小写字母的数据（X±SD）在LSD多次比较时存在显著差异，比例尺= 50μm；

图3为不同浓度的茶褐素处理A375细胞后的彗星实验观察图（A）和TUNEL分析图（B），比例尺= 50μm；

图4为茶褐素干预A375细胞24h后，细胞中相关靶向蛋白的表达和磷酸化水平，不同小写字母的数据（X±SD）在LSD多次比较时存在显著差异；

图5为A375异种移植的斑马鱼幼鱼在经茶褐素或顺铂处理后的死亡率和不良事件曲线图（A），以及斑马鱼显微观察图、荧光强度和抑制率（B），红色荧光区为A375肿瘤团块，不同小写字母的数据（X±SD）在LSD多次比较时存在显著差异。

具体实施方式

以下将通过具体实施例和附图对本发明作进一步说明。

鉴于茶多酚成分的复杂性，本课题组同时考察了茶黄素对黑色素瘤的作用，通过MTT检测发现，药物作用24h后，茶褐素的半数抑制浓度（IC₅₀）为102.302.半数，茶黄素的IC₅₀为223.823.半数，可见茶褐素对黑色素瘤的作用可能更显著，因此，为了进一步评价茶褐素对黑色素瘤的药效作用和相关机制，本研究选用了A375人恶性黑色素瘤细胞和斑马鱼动物模型进行研究，通过体内、体外和细胞分子实验，全面探究茶褐素抗黑色素瘤的作用和机制，为茶褐素治疗黑色素瘤的临床应用奠定基础。

实施例1：茶褐素（TB）对A375细胞的抗增殖作用

通过MTT检测和形态学观察评估TB对A375细胞增殖能力的影响。取对数生长期A375细胞，以6×10³个/孔的密度接种于96孔板内，每孔200μl培养基。待细胞完全贴壁后，给予不同浓度的TB，处理24、48和72h。TB给药浓度分别为0、40、80、120、160、200、240和280μg/ml。药物干预完成后，显微镜下观察活细胞形态。每孔加入20μl的MTT试剂（5.0mg/ml），避光37℃孵育4h。孵育结束后，每孔加入150μl DMSO，室温避光振荡10min。使用酶标仪，490nm波长下检测光密度值（OD值），计算抑制率。24h、48h、72h的半数致死浓度（IC₅₀）用回归分析法进行计算。抑制率计算公式：

结果如图1A所示，TB抑制了A375细胞的生长，其抑制率随着TB浓度的升高和处理时间的延长而增加，说明TB对A375细胞具有剂量依赖性和时间依赖性的抗增殖作用。经24、48和72h处理后，40~280μg/ml浓度下TB的抑制率与正常水平相比具有显著性差异（均P< 0.01）。经计算，TB干预24、48和72 h的IC₅₀分别为102.3 ± 19.2，116.3± 15.7和157.5 ± 9.9μg/ml。据此，选用50、100和150μg/ml作为低、中、高浓度进一步研究TB对A375细胞的影响。如图1B所示，随着TB浓度的增加，A375细胞数量明显减少，细胞收缩塌陷现象越来越多。

实施例2：茶褐素（TB）对A375细胞的促凋亡作用

采用DAPI染色和流式细胞术评价低、中、高浓度TB对A375细胞24h后的促凋亡作用的影响。将A375细胞接种于铺有细胞爬片的24孔板内，用低、中、高浓度的TB进行处理。干预24h后，PBS清洗3次，4%多聚甲醛固定1h。用PBS清洗细胞爬片后，用含有0.1% Triton X-100的0.1%枸橼酸钠溶液在4℃环境下通透2min。PBS清洗2次，用DAPI试剂室温避光封片。爬片晾干后，置于荧光显微镜下观察细胞，采集图像数据。

结果如图2A所示，DAPI染色后，正常对照组细胞核形态完整，染色质均匀，细胞核呈现明亮的蓝色荧光，经50、100、150μg/ml的TB处理后，出现典型的凋亡细胞形态学改变：细胞核边缘不规则，染色质凝集，着色较重，核固缩，核小体碎片增加，并能观察到凋亡小体，且细胞凋亡率随TB浓度的增加而显著增加（P<0.01），呈剂量依赖性。如图2B，流式细胞术检测结果显示，与正常对照组相比，A375细胞的早凋率随着TB浓度的升高而增加，低、中、高浓度TB组细胞的早凋率与正常组相比均有显著性差异（P<0.01）。然而，经TB处理24h后，低、中浓度TB组细胞的晚凋率与正常水平相比无显著性差异，高浓度TB组细胞的晚凋率显著增加（P<0.01）。结果表明，TB对A375细胞具有剂量依赖性的促凋亡作用。

实施例3：茶褐素（TB）对A375细胞DNA损伤的影响

采用彗星实验检测TB对A375细胞DNA链的损伤程度的影响。将A375接种于6孔板内，用低、中、高浓度的TB进行处理。离心收集细胞至预冷后的PBS中，调整细胞浓度为1×10⁵个/ml。事先在磨砂载玻片上制备好1%正常熔点琼脂糖凝胶，再将25μl细胞悬液和75μl 0.75%的低熔点单琼脂糖37℃预热混匀后，迅速平铺于第一层胶上。置于4℃环境中，使其固化30min以上。然后在4℃预冷的碱性电泳缓冲液中，避光静置30min。接下来在4℃预冷的裂解液中裂解过夜。电泳条件1.0V/cm，时间为30min。电泳后，取出载玻片置于玻璃皿内，加入70%乙醇溶液浸泡。37℃环境下，干燥15min，然后用EB水溶液避光染色20min。最后用荧光显微镜观察细胞状态，并采集照片。

结果如图3A所示，与未经处理的细胞相比，经不同浓度的TB处理后A375细胞形态发生明显改变，出现典型的彗星托尾现象，且彗星细胞的比例也随着TB浓度的升高而增加，表明TB可以剂量依赖的方式引起A375细胞DNA损伤，即DNA双链断裂。

采用TUNEL法检测TB对A375细胞核染色质中DNA链断裂和片段的影响。取对数生长期A375细胞，接种于铺有细胞爬片的24孔板内，接种的细胞密度为4×10⁴个/孔。经低、中、高浓度TB干预24h后的A375细胞，用PBS清洗3次，4%多聚甲醛室温固定1h。细胞爬片用含有0.1% Triton X-100的0.1%枸橼酸钠溶液在4℃环境下通透2min。PBS清洗2遍，吸干周围水分，在爬片上加入50μl TUNEL反应混合物，置于37℃烘箱内，避光孵育1h。PBS清洗3次，用DAPI避光封片。过夜晾干后，将细胞爬片置于荧光显微镜下观察，并采集图像数据。

结果如图3B所示，随着TB浓度的升高，阳性细胞数量增多，即细胞发生DNA断裂，凋亡细胞数量增多，提示TB促DNA损伤呈现出剂量依赖性。

实施例4：茶褐素（TB）对A375细胞蛋白表达的分子作用

采用蛋白质免疫印迹法检测TB处理A375细胞24 h后，细胞中靶向蛋白的表达及磷酸化情况。将生长良好的A375细胞以1×10⁶个/皿的密度接种于10cm培养皿内，待细胞贴壁完全后，进行给药处理。取TB处理24h的A375细胞，PBS清洗2遍后，用细胞刮刀将细胞刮下，置于1.5ml EP管中，4℃离心收集细胞团块备用。样本总蛋白通过RIPA细胞裂解液裂解获得，冰上裂解30min，期间涡旋振荡数次。4℃，12000g，离心15min收集上清，即所需样本总蛋白。各取2μl样本进行BCA蛋白定量检测，向剩余蛋白样本中加入5×蛋白示踪上样缓冲液，涡旋混匀后，99℃变性10min，获得最终蛋白样本。

用变性十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（8~12% SDS-PAGE）分离目标蛋白，然后转移到PVDF膜上。所得膜用5%脱脂奶或5%BSA封闭2h。TBS清洗3遍，将膜进行裁剪，置于稀释后抗体中，4℃环境下孵育过夜。抗体分别为：β-Actin、ATM、p-ATM、p-ATR、BAX、c-CASP3、c-CASP8、Chk1、Chk2、p-Chk1、p-Chk2、γ-H2A.X、p-IKKα/β、c-PARP、p-P53、p-P65。一抗孵育完成后，使用对应二抗继续孵育2h。膜用TBST清洗3遍，然后用ECL化学发光试剂盒对目标条带进行发光显色，所得目标条带用Image J进行灰度分析。

如图4所示，与正常组比较，低、中、高浓度TB组的ATM、p-ATM、p-ATR、p-Chk1、p-Chk2、BAX、γ-H2A.X、P53、p-P53、p-IKKβ、p-IKKα、P65和p-P65的蛋白表达量均显著升高（P<0.01）。中、高浓度TB组的c-PARP、P21和c-CASP3显著上调（P<0.01），然而低浓度TB组无显著性差异。高浓度的PARP和CASP8显著上升（P<0.01），然而低、中浓度TB组无显著性差异。此结果显示经TB处理后，A375细胞中大部分的蛋白表达显现出剂量依赖性的改变。

实施例5：茶褐素（TB）对A375移植瘤斑马鱼的体内作用

选用受精后3天（3dpf）的斑马鱼幼鱼270条，随机分成9组，每组30条鱼，置于6孔培养板内培养，将TB分别以0、15.625、31.25、62.5、125、250、500、1000、2000μg/ml的浓度溶解于各孔中处理24h，处理结束后，在立体显微镜下观察各组鱼的死亡情况和不良反应，计算死亡率，使用GraphPad Prism 8数据处理软件生成最佳的浓度-死亡率/不良反应曲线，并确定TB的未观察到有害作用水平（NOAEL）。据此，将1/10 NOAEL、1/3 NOAEL和NOAEL作为TB的低、中、高剂量用于后续实验。

建立斑马鱼异种移植瘤模型，用CM-Dil（红色荧光染剂）对A375细胞进行1:1000稀释染色，并以200个/条鱼的细胞量通过显微注射仪注射入斑马鱼幼鱼的卵黄囊中。肿瘤生长24h后，在荧光显微镜下观察，将注射不成功或死亡的斑马鱼移除，转入35℃生化培养箱进行培养。

将已造模成功的斑马鱼随机分为5组，每组30条，置于6孔培养板内培养。分别给予0μg/ml、1/10 NOAEL、1/3 NOAEL、NOAEL的TB和15μg/ml顺铂，培养24h。24h后，在荧光显微镜下拍照。通过图像处理软件计算斑马鱼体内A375细胞团荧光强度（FI），用荧光强度作为评价肿瘤大小的指标，计算其抑制率。

结果如图5A所示，通过TB诱导的斑马鱼死亡率和不良事件曲线可以观察到，TB浓度达到500μg/ml时，有斑马鱼死亡；当TB浓度达到1000μg/ml时，斑马鱼全部死亡。斑马鱼异常翻滚的不良事件发生在TB浓度31.25μg/ml及以上。其次，TB浓度到500μg/ml时，斑马鱼出现发育迟缓的现象。经过低于31.25μg/ml的浓度梯度的几次初步测试后，确定了TB的NOAEL为20μg/ml。因此，将2.2、6.7、和20μg/ml浓度作为低、中、高剂量进行TB后续实验。

如图5B所示，实验成功地在斑马鱼体内建立了A375细胞异种移植模型，并通过细胞的荧光强度来评估肿瘤的大小。药物处理24h后，随着TB浓度的上升，A375肿瘤的抑制率从2.75%上升到了40.0%，提示TB对A375肿瘤生长有明显的抑制作用。与模型组相比，1/3NOAEL（6.7μg/ml）、NOAEL（20μg/ml）剂量下TB的抑制作用均具有显著性差异（P< 0.01）。此外，TB在NOAEL（20μg/ml）剂量下的抑制作用比阳性药物顺铂在其NOAEL（15μg/ml）剂量下的抑制作用显著。

Claims (6)

1.茶褐素在制备诱导A375人黑色素瘤细胞凋亡药物中的作用。

2.如权利要求1所述的茶褐素在制备诱导A375人黑色素瘤细胞凋亡药物中的作用，其特征在于所述茶褐素通过P53和NF-κB通路引起DNA损伤，从而诱导A375人黑色素瘤细胞凋亡。

3.如权利要求1所述的茶褐素在制备诱导A375人黑色素瘤细胞凋亡药物中的作用，其特征在于所述茶褐素以剂量依赖的方式触发DNA损伤。

4.茶褐素在作为天然物质制备抑制黑色素瘤药物中的应用。

5.如权利要求4所述的茶褐素在作为天然物质制备抑制黑色素瘤药物中的应用，其特征在于所述黑色素瘤为A375人黑色素瘤。

6.茶褐素在作为天然物质制备DNA损伤剂中的应用。

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