CN115590861B - 雷公藤氯内酯醇的用途 - Google Patents

雷公藤氯内酯醇的用途 Download PDF

Info

Publication number
CN115590861B
CN115590861B CN202211104517.6A CN202211104517A CN115590861B CN 115590861 B CN115590861 B CN 115590861B CN 202211104517 A CN202211104517 A CN 202211104517A CN 115590861 B CN115590861 B CN 115590861B
Authority
CN
China
Prior art keywords
cells
osi
cell
lung cancer
expression
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202211104517.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN115590861A (zh
Inventor
陈丽敏
陈毓清
宋天娇
林小红
吴艺林
田澜
吴佳宝
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Union Medical College Hospital of Fujian Medical University
Original Assignee
Union Medical College Hospital of Fujian Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Union Medical College Hospital of Fujian Medical University filed Critical Union Medical College Hospital of Fujian Medical University
Priority to CN202211104517.6A priority Critical patent/CN115590861B/zh
Publication of CN115590861A publication Critical patent/CN115590861A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN115590861B publication Critical patent/CN115590861B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/56—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids
    • A61K31/58—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids containing heterocyclic rings, e.g. danazol, stanozolol, pancuronium or digitogenin
    • A61K31/585—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids containing heterocyclic rings, e.g. danazol, stanozolol, pancuronium or digitogenin containing lactone rings, e.g. oxandrolone, bufalin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/506—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim not condensed and containing further heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J73/00—Steroids in which the cyclopenta[a]hydrophenanthrene skeleton has been modified by substitution of one or two carbon atoms by hetero atoms
    • C07J73/001—Steroids in which the cyclopenta[a]hydrophenanthrene skeleton has been modified by substitution of one or two carbon atoms by hetero atoms by one hetero atom
    • C07J73/003—Steroids in which the cyclopenta[a]hydrophenanthrene skeleton has been modified by substitution of one or two carbon atoms by hetero atoms by one hetero atom by oxygen as hetero atom

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明涉及肺癌药物领域，具体公开了雷公藤氯内酯醇的用途，雷公藤氯内酯醇在制备用于抑制人体肺癌细胞生长和延缓人体肺癌细胞对靶向药耐药性的药物中的应用。本发明能够通过多个途径对非小细胞肺癌进行治疗，并且能够延缓非小细胞肺癌对于靶向药的耐药性。

Description

雷公藤氯内酯醇的用途
技术领域
本发明涉及肺癌药物领域，尤其是指雷公藤氯内酯醇的用途。
背景技术
肺癌是目前全世界最常见的恶性肿瘤，其死亡率居恶性肿瘤之首，大部分肺癌患者确诊时已属中晚期，失去手术机会。其中非小细胞肺癌(英文名Non-small cell lungcancer，简称NSCLC)约占肺癌总体发病率80％以上，五年生存率仅为17％。以铂类为基础的联合化疗虽然可作为晚期NSCLC的标准治疗方案，但因副作用大、治疗效果有限，并不能明显改善晚期NSCLC患者的生活质量和生存期。近年来，分子靶向药物在NSCLC的治疗中取得突破性进展，其中酪氨酸激酶抑制剂(简称EGFR-TKI)因特异性高、不良反应小，治疗晚期的EGFR(表皮生长因子受体)敏感突变或晚期化疗不能耐受的NSCLC患者疗效显著，可以延长EGFR敏感突变NSCLC患者无疾病进展期，改善生活质量。
肺腺癌作为肺癌的其中一种，其治疗困境之一是对肿瘤靶向药物耐药性引起难治疗和易复发的问题。肺腺癌对EGFR-TKI等药物的耐药及敏感性降低也是限制药物应用的最主要原因。目前已经证实植物雷公藤的天然提取物具有很强的免疫抑制作用和抗炎活性且植物雷公藤的天然提取物对于癌症具有抑制作用；已广泛应用于我国风湿性疾病、肾脏疾病等自身免疫相关疾病的治疗。根据以往的研究，雷公藤内酯醇(T10)在癌症治疗中的体外表现为抑制癌细胞增殖，减少肿瘤在体内的生长和转移。但T10对胃肠道、皮肤黏膜、生殖、骨髓造血系统、肾、生殖等系统有较大毒性，导致其在临床应用中受到限制。
如中国专利文献雷公藤内酯醇衍生物及其应用(申请号为99111660.7)，其公开了一种雷公藤内酯醇衍生物，其结构式为：
其中，R1是H，含有1-4个碳原子的烷基，-Ac-C(＝O)(CH2)nCO2H，或者是氨基酸基，其中，n为1-4的整数；R2是-SCN，-NCS。由于分子内重排，-SCN和-NCS之间可能会发生转换。该衍生物所制成的药物对于癌细胞具有抑制作用。但是其所制成的药物仍具有一定的毒性，将会限制其临床应用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供雷公藤氯内酯醇的用途，克服现有的雷公藤提取物对人体具有毒性而限制其应用于在肺癌治疗上的缺陷。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
雷公藤氯内酯醇的用途，雷公藤氯内酯醇在制备用于抑制人体肺癌细胞生长和延缓人体肺癌细胞对靶向药耐药性的药物中的应用。
本发明的有益效果在于：本发明选择雷公藤氯内酯醇制备药物来治疗肺癌，由于雷公藤氯内酯醇对人体的毒性低，同时能够在多个途径上抑制人体肺癌细胞生长，并延缓人体肺癌细胞对靶向药的耐药性，进而改善酪氨酸激酶抑制剂对于肺癌的治疗效果，由于雷公藤氯内酯醇的低毒性，能够进一步推动雷公藤氯内酯醇所制成的药物在临床治疗中的使用。
附图说明
图1中A为各组裸鼠皮下移植瘤生长曲线；B为杀死裸鼠所剥离的移植瘤体重量与雷公藤氯内酯醇的作用时间关系曲线图；
图2为A549细胞和A549/DDP细胞的皮下移植瘤病理形态图；
图3中为雷公藤氯内酯醇对A549细胞和A549/DDP细胞的皮下移植瘤Ki-67的表达情况图；
图4中A为不同浓度的奥希替尼OSI与H1975细胞活力的关系曲线图；
图5为不同浓度的奥希替尼OSI与H1975细胞活力的关系曲线图；
图6为OSI、T4及740YP预处理对H1975细胞膜表面PD-L1表达的影响关系图；
图7为凋亡抑制剂对OSI和T4对H1975细胞促凋亡作用的影响关系图一；
图8为凋亡抑制剂预处理对OSI和T4作用的H1975细胞染色的柱状图；
图9为凋亡抑制剂预处理对OSI和T4诱导的H1975细胞凋亡染色后的显微镜视图；
图10为凋亡抑制剂预处理对OSI和T4诱导H1975细胞形态改变的影响情况图；
图11为凋亡抑制剂预处理对OSI和T4诱导的H1975细胞凋亡的作用情况图；
图12中为740YP预处理后OSI浓度和T4浓度与对OSI和T4诱导的H1975细胞的关系图；
图13为740YP预处理后不同浓度的OSI和T4对OSI和T4作用的H1975细胞染色图；
图14为OSI和T4对凋亡相关蛋白和PI3K/AKT信号通路蛋白表达的影响图；
图15为不同浓度T4和OSI对H1975细胞迁移的影响图；
图16为不同浓度T4和OSI与H1975细胞迁移的关系柱状图；C为OSI和T4与EMT相关蛋白表达的关系图；
图17为OSI、T4及740YP预处理对H1975细胞膜表面PD-L1表达的影响；
图18为OSI、T4及740YP预处理对H1975细胞膜表面PD-L1表达的关系柱状图；
图19中A为AEG-1和MDR-1在m RNA水平的表达情况图；B为AEG-1和MDR-1在蛋白水平的表达情况图；C为AEG-1D在A549和A549/DDP细胞的蛋白表达情况图；D为AEG-1DMDR-1在A549细胞和A549/DDP细胞的蛋白表达情况图；E为MDR-1在A549和A549/DDP细胞的蛋白表达情况图；
图20中A为A549细胞过表达AEG-1的表达图；B为A549/DDP细胞过表达AEG-1的表达图；C为A549细胞抑制AEG-1、AEG-1和MDR-1的表达图；D为A549/DDP细胞分别抑制AEG-1、AEG-1和MDR-1的表达图；E为A549细胞和A549/DDP细胞过表达AEG-1的表达图；F为A549细胞和A549/DDP细胞抑制AEG-1的表达图；G为顺铂对A549与细胞存活率的关系图；H为顺铂对A549/DDP与细胞存活率的关系图；
图21中A为T4的浓度与A549细胞中AEG-1表达能力关系图一；B为T4的浓度与A549/DDP细胞中AEG-1表达能力关系图一；C为T4浓度与AEG-1和MDR-1在A549细胞中的蛋白表达能力关系图；D为T4浓度与AEG-1和MDR-1在A549/DDP细胞中的蛋白表达能力关系图；E为T4的浓度与A549细胞中AEG-1表达能力关系图二；F为T4的浓度与A549/DDP细胞中AEG-1表达能力关系图二；
图22中T4可通过影响AEG-1的表达而影响肺癌细胞的耐药性。200nMT4处理过表达A549/DDP细胞和AEG-1的A549/DDP细胞后，与对照组细胞相比，加入T4后，AEG-1蛋白表达显著降低，MDR-1蛋白表达也相应降低。A为AEG-1、MDR-1和GAPDH蛋白在A549/DDP细胞中的表达关系图；B为AEG-1在A549/DDP细胞中的表达关系图；C为MDR-1在A549/DDP细胞中的表达关系图；D为顺铂添加量与A549/DDP细胞存活率的折线图。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。
请参照图1-图22，雷公藤氯内酯醇的用途，雷公藤氯内酯醇在制备用于抑制人体肺癌细胞生长和延缓人体肺癌细胞对靶向药耐药性的药物中的应用。
本发明的工作原理在于：
利用雷公藤氯内酯醇的低毒性、能够抑制人体肺癌细胞生长和延缓人体肺癌细胞对靶向药物耐药性的特性，将其制成药物来治疗肺癌，改善肺癌治疗效果并降低药物毒性。
从上述描述可知，本发明的有益效果在于：本发明选择雷公藤氯内酯醇制备药物来治疗肺癌，由于雷公藤氯内酯醇对人体的毒性低，同时能够在多个途径上抑制人体肺癌细胞生长，并延缓人体肺癌细胞对靶向药的耐药性，进而改善酪氨酸激酶抑制剂对于肺癌的治疗效果，由于雷公藤氯内酯醇的低毒性，能够进一步推动雷公藤氯内酯醇所制成的药物在临床治疗中的使用。
进一步地，抑制人体肺癌细胞生长的途径包括降低肿瘤细胞表面PD-L1的表达和通过PI3K/AKT通路诱导肺癌细胞自噬或凋亡。
由上述描述可知，上述PD-L1位于免疫细胞和肿瘤细胞的表面，并与T细胞受体PD-1相互作用，用于帮助肿瘤细胞逃避免疫破坏，因此，通过降低肿瘤细胞表面PD-L1的表达能够改善治疗效果。
进一步地，肺癌细胞指的是肺腺癌H1975细胞。
进一步地，人体肺癌细胞对靶向药物耐药性指的是肺腺癌细胞使用原代、第一代或第二代酪氨酸激酶抑制剂后T790M和L858R基因突变而对靶向药物产生耐药。
进一步地，雷公藤氯内酯醇从雷公藤植物中提取得到。
进一步地，雷公藤氯内酯醇由雷公藤内酯醇经羟基酰化并氯化修饰后得到。
由上述描述可知，以雷公藤内酯醇作为先导化合物进行羟基酰化和氯化修饰后得到减毒单体，不仅提高了先导化合物的溶解性，也使毒性大幅降低，同时免疫抑制活性得到提高。
进一步地，雷公藤氯内酯醇与奥希替尼联合诱导肺癌细胞凋亡。
由上述描述可知，雷公藤氯内酯醇与奥希替尼联合能够抑制肿瘤细胞发生EMT作用，并且抑制肺腺癌H1975细胞膜表面PD-L1的表达，达到诱导肺癌细胞凋亡的作用。
进一步地，药物的剂型包括口服剂或注射剂。
进一步地，口服剂的类型包括片剂、胶囊、粉剂、颗粒和锭剂。
通过以下实验来验证本发明中雷公藤氯内酯醇的各项特性。
实施例一：雷公藤氯内酯醇T4对裸鼠存活的影响以及对顺铂耐药的皮下移植瘤的生长的影响
本实施例的实验步骤为：
1.动物饲养
动物实验BALB/C鼠购于福州市闽侯县吴氏实验动物中心，均为4周龄-6周龄，雌性，重量18-20g，全程饲养于福州军区总医院实验动物中心，置于无特定病原体(specificpathogen free,SPF)级空气层流架内(室温恒定于20℃-22℃,空气湿度30％-50％)，予以专用灭菌饲料喂养，所有动物预先适应环境1周。
2.动物模型构建
(1)取对数生长期的A549和A549/DDP细胞(人肺腺癌顺铂耐药性细胞)，用0.25％胰酶消化，用不含血清的培养基制备成细胞悬液，调整细胞浓度至1×107个/ml,于每只裸鼠右侧腋窝无菌注射0.1ml细胞悬液。
(2)将各组裸鼠标记编号，观察并记录裸鼠皮下移植瘤的生长情况，待肿瘤平均体积生长至80mm3时，将裸鼠随机分为对照组和实验组。
(3)对照组:含有10％DMSO(二甲基亚砜)的生理盐水0.1ml/只,每日1次,腹腔注射,连续28天；实验组:T4低剂量组的浓度0.05mg/kg/只，T4中剂量组的浓度0.2mg/kg/只，T4高剂量组的浓度0.4mg/kg/只，每日1次，腹腔注射，连续28天。
(4)每天观察裸鼠精神状态、活动力、反应、饮食、体重及移植瘤的生长情况,接种后一周，每2天用游标卡尺分别测量裸鼠皮下移植瘤的最长径(a)和最短径(b)，以公式V＝05ab2计算移植瘤体积，绘制皮下移植瘤的生长曲线。
(5)末次给药24h后，处死全部裸鼠，剥离皮下移植瘤，并对移植瘤进行称重和体积测量，并根据以下公式算出抑瘤率:抑瘤率(％)＝[(对照组重量-实验组重量)/对照组重量]x100％。
3.HE染色实验
(1)取移植瘤组织左右大小，经4％多聚甲醛固定后，包埋后切片；
(2)常规二甲苯脱腊:二甲苯I、II各5min，然后再进行各级乙醇逐级脱水最后至水洗:无水乙醇2min,95％乙醇2min,80％乙醇2min,70％乙醇2min，PBS水洗三次，2min/次；
(3)苏木素染色5min，用水冲洗后吸干水分；
(4)盐酸乙醇分化30s；
(5)PBS(磷酸二氢钾(KH2PO4)0.2g、磷酸二氢钠(Na2HPO4.12H2O)2.9g、氯化钠(NaCl)8.0g、氯化钾(KCI)0.2，加水定容到1000mL)浸泡15min，然后吸干水分；
(6)伊红液染色2min；
(7)常规脱水、透明、封片：将组织切片进行各级乙醇逐级脱水:无水乙醇2min、95％乙醇2min、80％乙醇2min、70％乙醇2min，脱水后的组织样本切片使用二甲苯浸泡透明2次，每次持续5min，然后将组织样本切片风干。
(8)中性树脂封固。
4.免疫组化实验
(1)烤片:在65℃烘烤2h；
(2)脱蜡:依次在二甲苯I、II中浸泡10min；
(3)酒精:无水乙醇、95％酒精、80％酒精、70％酒精各2min；
(4)蒸馏水洗三次，2min/次；
(5)抗原修复EDTA:适量pH9.0的Tris/EDTA(氨基丁三醇/乙二胺四乙酸二钠)缓冲液在70℃下隔水保温20min。然后把上述缓冲液和石蜡切片放入压力锅中，液面没过组织，盖上锅盖，扣上压力阀。继续加热至喷汽，再加热2min，关掉压力锅。
(6)待压力锅蒸汽排完后打开高压锅，自然冷却至60℃左右，取出玻片；
(7)用3％的过氧化氢(H2O2)处理10min,去除内源性的过氧化氢酶，TBS漂洗三次，每次10min；
(8)室温下封闭1h，封闭液成分包括0.3％ Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)、0.25％ BSA和5％n正常山羊血清/TBS(Tris等渗缓冲盐溶液)，对玻片内的组织滴加稀释好的封闭液，封闭液中的血清使用与二抗同一来源；
(9)孵育一抗，在4℃的温度下放置16h，一抗稀释液为0.3％ Triton X-100、0.25％ BSA和2％GS/TBS；
(10)用TBST(0.05％ Triton X-100)漂洗三次，每次10min；
(11)孵育生物素(Biotin)标记的二抗(vector公司，以1:600的比例稀释),室温，90min；
(12)用TBST漂洗，漂洗三次每次10min；
(13)孵育Vector Elite Avidin(卵白素，也叫抗生物素蛋白)-peroxidase(过氧化物酶)(ABC)(Vector公司，以1:200的比例稀释)，提前30min钟配制，在室温下孵育60min；
(14)TBST漂洗三次，每次5min，乙酸钠漂洗三次，每次5min；
(15)DAB显色，时间5-20min。显色剂配方:10ml乙酸钠中加入2％ DAB 100μL、3％H2O2 8.3μL，混匀即可，新鲜配制；
(16)苏木素核染15s，自来水反蓝(用自来水浸泡、冲洗)时间大于30min；
(17)将玻片贴于多聚赖氨酸包被的载玻片，风干16h；
(18)双蒸水水化5min，梯度酒精脱水，二甲苯透明，用中性树胶(NeutralBalsam，Solarbio公司)封片。
结果1：
1.1T4对裸鼠没有产生明显毒副作用
各组实验动物饮食正常，活动良好，精神尚可。为了检测T4在整个实验过程中是否对裸鼠产生明显毒副作用，实验结束后检测裸鼠的白蛋白(albumin,ALB)、谷丙转氨酶(glutamic-pyruvic transaminase，ALT)、谷草转氨酶(glutamicoxalacetictransaminase，AST)、尿素氮(urea nitrogen，UREA)、肌酐(creatinine，CREA)和血葡萄糖(Glucose,GLU)等生化指标，结果显示如表1所示:各实验组与对照组相比，裸鼠的ALB、ALT、AST、UREA、CREA和GLU之间差别并无统计学意义，p>0.05，提示T4并未对裸鼠的肝功能和肾功能产生影响，证明T4并未对裸鼠产生明显的毒副作用。
表1
表1中，T4的浓度单位为mg/kg，ALB的浓度单位为g/L，ALT和AST的浓度单位为IU/L，UREA的浓度单位为mmol/L，CREA的浓度单位为umol/L，GLU的浓度单位为mmol/L。
1.2T4抑制裸鼠非小细胞肺癌对顺铂耐药的皮下移植瘤的生长
为了观察皮下移植瘤的生长状况，我们每隔2天用游标卡尺分别记录皮下移植瘤的长径(a)和短径(b),以公式V＝0.5ab2计算裸鼠肺癌皮下移植瘤的体积，绘制非小细胞肺癌裸鼠皮下移植瘤的生长曲线图。结果表明(图1A)，A549/DDP细胞皮下移植瘤的生长速率比A549细胞皮下移植瘤的生长速率更快，p<0.05；在A549细胞皮下移植瘤组中，T4高剂量组的皮下移植瘤生长速度与对照组相比显著下降，p<0.05；在A549/DDP细胞皮下移植瘤组中，T4高剂量组的皮下移植瘤生长速率与对照组相比显著降低，p<0.05。以上结果提示，T4可以降低非小细胞肺癌裸鼠皮下移植瘤的生长速率。
实验结束后杀死裸鼠，剥离非小细胞肺癌裸鼠皮下的移植瘤组织并称取体重如表2所示，利用公式抗癌药物抑瘤率(％)＝(对照组重量-实验组重量)/对照组重量x100％计算出各实验组的抑瘤率。结果显示(图1)：在A549细胞的皮下移植瘤中，T4浓度为0.05mg/kg、0.2mgkg和0.4mg/kg的组别的抑瘤率分别为23.80％、56.40％、74.01％；在A549/DDP细胞的皮下移植瘤中，T4浓度为0.05mg/kg、0.2mg/kg和0.4mg/kg的组别的抑瘤率分别为33.11％、59.12％、73.33％。但与其他实验组相比，只有T4作用浓度达到0.4mg/kg时，抑瘤率之间的差别才具有统计学意义。因此，该实验的结论为浓度达到0.4mg/kg的T4可以抑制非小细胞肺癌裸鼠皮下移植瘤的生长。
表2
表2:T4抑制肺癌皮下移植瘤的生长:T4浓度单位mg/kg，weight(重量)单位为g，**p<0.01，*p<0.05。
1.3T4能降低裸鼠非小细胞肺癌在对顺铂耐药的皮下移植瘤Ki-67的表达
观察肺癌裸鼠皮下移植瘤的病理形态：在实验过程中，肉眼观察裸鼠肺癌移植瘤生长，移植瘤瘤体呈球形或不规则块状，边界尚清，活动度尚可；实验结束后HE染色在显微镜下进行观察(图2)，肿瘤细胞呈腺管样排列，细胞排列密集，大小形态不一，细胞包浆少，核大，深染，轻度异性。Ki-67是一种核抗原，与细胞增殖密切相关，其表达水平能可靠、快速地体现肿瘤细胞的增殖活性，是目前反应肿瘤细胞增殖活性最具有代表性的指标，有研究表明Ki-67可以间接反映非小细胞肺癌的过度增殖，有助于明确NSCLC患者的恶性程度和临床预后。在本发明中用免疫组织化学法检测各组Ki-67的表达，观察T4对非小细胞肺癌裸鼠皮下移植瘤中肺癌细胞增殖活性的影响。染色结果发现(图3)，T4高剂量组干预过的裸鼠，其皮下移植瘤中Ki-67表达显著减少。以上结果提示T4可以减少裸鼠皮移植瘤Ki-67的表达，降低肺癌细胞的增殖活性。
实施例二：雷公藤氯内酯醇T4联合奥希替尼OSI对肺腺癌H1975细胞(T790M/L858R突变)存活的影响
本实施例的实验方法为：
通过CCK8细胞增殖-毒性检测，具体步骤为：
(1)人肺腺癌H1975细胞(T790M/L858R突变，购自于北京鼎国昌盛生物科技有限公司)接种于96孔培养板中，每孔接种100μl(7x 103个细胞/孔)，细胞贴壁24小时后可供药物干预；
(2)不同浓度(0、6.25、12.5、25、50、75、100nM)的雷公藤氯内酯醇T4和奥希替尼OSI分别作用48h后，每孔加入CCK8溶液10μl，37℃孵育2h；
(3)不同浓度(0、25、50、75、100)奥希替尼OSI加入不同浓度T4(0、3.125、6.25nM)处理过的H1975细胞，处理方法同上；
(4)以450nm波长用酶标仪器测定各孔0D450值，计算细胞存活率。
(5)细胞存活率＝(各个组样本OD/对照组OD)x 100％；各个组样本OD＝各个组样本实际OD读数-空白孔OD读数；对照组OD＝对照组实际OD读数-空白孔OD读数。
结果2：雷公藤氯内酯醇T4和奥希替尼OSI能够诱导肺腺癌H1975细胞(T790M/L858R突变)死亡，且两药联合效果更显著。
人体肺腺癌H1975细胞经不同浓度的T4(0-100nM)和OSI(0-100nM)处理48小时后，如图4(A、B)所示，随着T4和OSI浓度的增高，细胞生存活性呈浓度依赖性下降。在T4作用浓度为19.18±1.85nM，OSI作用浓度为56.11±3.93nM时，细胞的生存活性降至50％，即细胞的半数致死量(IC50)。为了观察OSI和T4的联合使用效果，检测OSI对T4处理过的H1975细胞的杀伤作用，图5实验结果显示：在不同浓度T4的作用下，OSI对H1975细胞的杀伤作用更明显，提示OSI和T4联用能够发挥协同效应。OSI和3.125nM的T4联用，OSI的IC50值为47.0±2.3nM(浓度)，OSI和6.25nM的T4联用，OSI的IC50值为38.5±1.77nM(浓度)，说明在T4的作用下，杀伤一半的肺腺癌细胞所需作用的OSI浓度更低，能够减少OSI的用量。为方便药物浓度的配置，取两者IC50和1/2IC50的相近数值(OSI取60nM和30nM，T4取20nM和10nM)进行下一步实验。
实施例三：T4和OSI诱导H1975细胞(T790M/L858R突变)的死亡途径是否是通过激活细胞凋亡来实现
本实施例的实验步骤为：
1.Annexin V-APC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡
(1)用PBS将10×Binding Buffer稀释成1×Binding Buffer；
(2)细胞收集：贴壁细胞(H1975细胞)用不含EDTA的0.25％胰酶消化并收集入离心管中(注意过度消化可损伤细胞，胰酶消化时间不宜过长，控制在3-5min，5min为宜)，于室温2000rpm离心5～10分钟，弃去上清液，收集细胞；
(3)细胞洗涤：用4℃预冷PBS重悬细胞，2000rpm离心5～10分钟，弃去上清液，再用1×Binding Buffer重悬细胞，2000rpm离心5～10分钟，弃去上清液；
(4)加入500μL的1×Binding Buffer悬浮细胞；
(5)Annexin V-APC/PI标记：在每个样品管加入5μL的Annexin V-APC和5μL PI混匀，避光，室温孵育15分钟；
(6)上机操作：将样品在BD Accuri C6 Plus分析型流式细胞仪上分析，细胞染色后在1h内操作完毕。
2.结晶紫染色
(1)洗涤：弃去孔板中的RPMI1640培养基(购自于Gibco公司)，用PBS冲洗孔板2-3次；
(2)固定：加入4％多聚甲醛固定30min；
(3)洗涤：用PBS冲洗2-3次；
(4)孔中加入1ml 0.1％结晶紫水溶液染色30min以上；
(5)洗涤：用双蒸水将结晶紫水溶液冲洗干净；
(6)烘干：烘箱中烘干，即可在显微镜下观察并拍照。
3.Hoechst33342/PI染色
(1)细胞洗涤：弃去培养基中的上清液，用PBS冲洗2-3次；
(2)染色：在孔板中加入Hoechst33342染液和PI染液，37℃避光孵育20min；
(3)洗涤：染色完毕后，弃去染液，用PBS冲洗3次，每次5min；
(4)观察并拍照：用荧光显微镜进行观察并拍照。注意在染色当天观察完毕，避免荧光淬灭。
结果3：雷公藤氯内酯醇T4和奥希替尼OSI能够通过凋亡的方式诱导肺腺癌H1975细胞(T790M/L858R突变)死亡,且这种凋亡作用是通过激活Caspase途径实现的。
采用流式细胞术检测细胞凋亡的水平，通过Annexin V-APC/PI(细胞凋亡检测试剂盒)双染细胞后上机检测，图6和图7观察到随着T4和OSI药物浓度的增高，细胞凋亡率也增高，当用Caspase(天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白水解酶)抑制剂Z-VAD-FMK(一种凋亡抑制剂，图6和图7中用CAS表示)20uM预处理H1975细胞20分钟后，再加入T4和OSI作用于H1975细胞，细胞的凋亡水平明显降低，表明T4和OSI都能通过促进H1975细胞凋亡从而诱导细胞死亡，且这种细胞凋亡是由Caspase激活所导致的，当细胞凋亡被抑制时T4和OSI对细胞的杀伤作用则被明显减弱。
通过结晶紫染色初步观察T4、OSI、T4+OSI处理下的H1975细胞染色情况，图8可以看到经T4、OSI、T4+OSI处理过的H1975细胞染色明显浅于对照组，而经Z-VAD-FMK预处理后的H1975细胞，则细胞染色明显深于相应的T4、OSI、T4+OSI处理组，说明凋亡抑制剂明显抑制了T4和OSI所诱导的H1975细胞死亡，所以结晶紫染色加深。将H1975细胞放在显微镜下,图9可以观察到，与对照组相比，经T4、OSI、T4+OSI处理过的H1975细胞形态发生明显的改变，细胞缩小，细胞膜皱缩，而经Z-VAD-FMK预处理后的细胞明显抑制了这种形态的变化，其细胞形态饱满。Hoechest33342是一种活细胞染色剂，能够透过活细胞的细胞膜将细胞核染成蓝色，碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)不能透过完整的细胞膜，但死细胞和凋亡中晚期细胞由于细胞膜的通透性大大增加，PI就能够透过细胞膜而使细胞核染红。将药物处理过的细胞经Hoechest33342/PI染色后在荧光显微镜下观察，图10发现T4、OSI、T4+OSI处理过的细胞有大量细胞核被PI染色发出红色荧光，提示这些细胞已经死亡或处于凋亡中晚期,而且高浓度处理组被染红的细胞数目明显多于低浓度组，OSI+T4联合组染红细胞数明显多于单独使用。而用Z-VAD-FMK预处理过的细胞，不论是OSI或T4单药处理组，还是OSI+T4联合处理组，PI染色的细胞核数目都大大减少，说明凋亡抑制剂拮抗了部分T4和OSI对H1975细胞凋亡的诱导作用。通过上述试验，证实了T4和OSI都能够通过凋亡的方式诱导H1975细胞死亡，且这种凋亡作用是通过激活Caspase途径实现的。
实施例四：雷公藤氯内酯醇T4和奥希替尼OSI是否通过PI3K/AKT通路诱导肺腺癌H1975细胞(T790M/L858R突变)凋亡
本实施例的实验步骤1和步骤2参照实施例三的步骤1和步骤2。
3.Western-blot检测凋亡相关蛋白蛋白水平。
(1)细胞总蛋白提取：
将H1975细胞接种于六孔板中培养，并加入相应的药物(不同浓度的PI3K活化物、奥希替尼及雷公藤氯内酯醇)进行处理。吸弃培养基，用4℃预冷的PBS缓慢冲洗2遍，于六孔板中每孔加入100μL的RIPA细胞裂解液，于冰上裂解30分钟；用细胞刮刀将细胞刮下来，收集于1.5ml EP管中，置于4℃预冷低温超速离心机中以12000g、4℃离心10分钟，小心吸取上清液装入EP管中，冻存于-80℃备用。
(2)蛋白浓度测定：
BCA法进行蛋白浓度测定：将标准品稀释至0.5μg/μl，按0μl、1μl、2μl、4μl、8μl、12μl、16μl、20μl的顺序加到标准品孔中，每孔均用PBS补足到20μl，配制成浓度梯度为0μg/μl、0.025μg/μl、0.05μg/μl、0.1μg/μl、0.2μg/μl、0.3μg/μl、0.4μg/μl、0.5μg/μl的标准蛋白孔复2孔(复2孔即以相同条件进行复制以制备另外的两孔)，蛋白孔每孔加入2μl，加PBS补足到20μl，复2孔。每孔加入200μl BCA工作液(A液：B液＝50:1)混匀，在37℃烤箱内孵育30分钟，用多功能酶标仪测OD值，根据标准品绘制标准曲线，并根据标准曲线计算各样品蛋白浓度。
(3)蛋白配平
(4)Westernblot溶液配制
1)1mol/LTris.HCL溶液(pH8.8)：称取Tris9.08g，溶于30ml双蒸水，浓盐酸调pH至8.8，然后加双蒸水定容至50ml,4℃保存；
2)1mol/LTris.HCL溶液(pH6.8)：称取Tris6.06g，溶于30ml双蒸水，浓盐酸调pH至6.8，然后加双蒸水定容至50ml,4℃保存；
3)10％SDS溶液：称取SDS10g，溶于100ml双蒸水，50℃水浴助溶；
4)10％过硫酸胺(AP)溶液：称取过硫酸胺0.1g，溶于1ml双蒸水，4℃保存，1周内使用；
5)4x洗液：称取氯化钠16g和Tris 4.846g，溶于500ml双蒸水，再加入2ml Tween-20，搅拌混匀。待用时用双蒸水稀释成1x洗液；
6)5x电泳液(pH8.3)：称取Tris 15.15g、甘氨酸93.85g、SDS 5.0g，溶于600ml双蒸水，然后加双蒸水定容至1000ml，最后用浓盐酸调pH至8.3。待用时用双蒸水稀释成1x电泳液；
7)电转液：称取Tris3.03g、甘氨酸14.4g，加入甲醇200ml，双蒸水定容至1000ml；
8)6xSDS凝胶加样缓冲液：称取DTT 462.75mg、SDS 0.6g、溴酚蓝0.03g，加入1MTris-Hcl(pH6.8)1.5ml，加入甘油3.0ml，加入双蒸水0.5ml，搅拌混匀，4℃静置过夜，第二天分装，保存于-20℃。
(5)SDS-PAGE电泳
1)SDS-PAGE凝胶配制见下表：
各种组分名称 6％ 8％ 12％
双蒸水 2.6 2.3 1.6
30％Acrylamide 1.0 1.3 2.0
1.5M Tris-HCl(pH 8.8) 1.3 1.3 1.3
10％过硫酸铵(AP) 0.05 0.05 0.05
10％SDS(最后加) 0.05 0.05 0.05
TEMED(最后加) 0.004 0.003 0.002
2)电泳步骤如下：
a.将玻璃板洗干净烘干后，装好玻璃板灌胶至离梳子下缘1cm左右，上覆无水乙醇1000μL，平稳30min聚合。
b.用滤纸吸去水，配浓缩胶，灌入，插入梳子，注意赶净气泡，约30min聚合。
c.待浓缩胶聚合后，将灌有胶的玻璃板按照内短外长的方向垂直放入电泳装置中，灌入电泳液没过内部的短玻璃板，拔去梳子。
d.上样，两侧加蛋白marker约5μL；标本每孔12μL；平衡每孔，余孔加入2μL 5x SDS凝胶加样缓冲液+10μL的TBS。
e.当上样蛋白液在浓缩胶位置的时候采用80V电压电泳，当蛋白跑至分离胶位置后改为120V电压电泳，至蓝色线(溴酚蓝指示剂)与底线重合。
3)电转步骤如下：
a.安装电转装置：根据胶的大小裁下PVDF膜及滤纸；将PVDF膜用甲醇泡5min；按滤纸、胶、PVDF膜、滤纸的顺序依次层叠构成三明治结构，排出空气，注意在膜上做好标记以便定位。
b.电转：接通电源，加入配置好的电转液至刻度线，恒流300 mA进行转移，根据检测蛋白的分子量大小相应的时间完成转膜。转膜须将整个装置置于冰水浴中进行，以避免严重的发热现象。
c.封闭：转膜完毕后，立即把转膜后的PVDF膜取出，然后根据Marker在PVDF膜上的定位裁剪出自己所需分子量的条带。然后将PVDF膜放入封闭液中封闭(封闭液：5％ BSA+0.3％Tween-20/TBS)。置于水平摇床上缓慢摇动，室温封闭2h。注意：从转膜完毕后所有的步骤，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。
e.洗膜：封闭完后，将PVDF膜从封闭液中取出，加入TBST洗液，在摇床上缓慢摇动洗涤10min，共漂洗3遍。
f.一抗孵育：PVDF膜置于一抗(根据一抗产品说明书用一抗稀释液去稀释抗体)中，4℃摇床孵育过夜。
g.洗膜：第二天，将PVDF膜从一抗中取出，加入TBST洗液，在摇床上缓慢摇动洗涤10min，共漂洗3遍。
h.二抗孵育：将PVDF膜置于辣根过氧化物酶耦联的IgG二抗(用5％BSA+0.3％Tween-20/TBST根据二抗产品说明书稀释二抗)中，室温摇床孵育1小时。
i.洗膜：二抗孵育完毕后，将PVDF膜从二抗中取出，加入TBST洗液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤10min，共漂洗3遍。
j.曝光：用化学发光法显色(LumiGLO Chemiluminescent Substrate System,KPL)，X射线底片曝光(Kodax X-Omat BT Film)，兔来源单克隆抗体β—actin作为内参照。
结果：
4.T4和OSI能够通过抑制PI3K/AKT信号通路来诱导肺腺癌H1975细胞(T790M/L858R突变)凋亡。
PI3K/AKT信号转导通路是细胞凋亡最重要的通路之一，在肿瘤的发生、发展中过程中发挥重要的作用，许多研究表明通过抑制PI3K/AKT通路能有促进细胞的凋亡。因此，可推测T4和OSI诱导细胞凋亡的潜在分子机制可能通过介导PI3K/AKT信号通路来实现。用740YP(一种PI3K/AKT通路激动剂)30uM预处理细胞30min，再添加OSI 60nM、OSI 30nM、T420nM和T4 10nM处理细胞，然后用流式细胞术检测细胞凋亡。对比图11中OSI 60nM组、OSI30nM组、T420nM组和T4 10nM组的细胞凋亡率发现，经过740YP预处理的细胞凋亡率明显低于未经740YP预处理的细胞，提示当PI3K/AKT通路被激活时，能够抑制T4和OSI诱导的细胞凋亡。我们又通过结晶紫染色肉眼观察到图12经OSI、T4以及OSI+T4处理过的细胞染色明显浅于对照组。而经740YP 30uM预处理细胞30min，再添加OSI、T4以及OSI+T4处理细胞,，则细胞染色明显深于相应的不添加740YP的组，说明740YP部分抑制了细胞的死亡，使得细胞死亡数量减少，染色加深。接着采用Western Blotting方法从蛋白质水平检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Caspase3和PI3K/AKT信号通路蛋白PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT等蛋白表达水平的变化。图13观察到用OSI 60nM,T4 20nM和OSI 60nM+T4 20nM作用细胞2天，促凋亡蛋白Bax和Caspase3表达增多，抗凋亡蛋白Blc-2表达减少，PI3K/AKT信号通路蛋白PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT表达均减少。若用740YP预处理细胞再添加OSI 60nM,T4 20nM和OSI 60nM+T420nM,则能够部分逆转740YP的作用。通过上述实验证实了前面的假设，即T4和OSI能够通过抑制PI3K/AKT信号通路来诱导H1975凋亡。
实施例五：雷公藤氯内酯醇T4联合奥希替尼OSI对肺腺癌H1975细胞(T790M/L858R突变)上皮间质转化的影响。
上皮细胞-间充质转化(Epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)，是指上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞的生物学过程。通过EMT，上皮细胞失去了细胞极性，失去了与基底膜和其他上皮表型的联系，并获得了较高的间质表型，如迁移和侵袭、抗凋亡和细胞外基质降解。其在慢性炎症、组织重建、胚胎发育、癌症转移和各种纤维化疾病中发挥重要作用。EMT主要的特征有E-钙黏蛋白(E-cadheren)表达的减少，N-钙粘蛋白(N-cadheren)、波形蛋白(Vimentin)、α-平滑肌肌动蛋白(Alpha smooth muscle actin,α-SMA)表达增多等。E-钙粘蛋白和N-钙粘蛋白主要参与分子间的连接，E-钙粘蛋白是影响肿瘤转移侵袭较重要的一种分子，同时是EMT的关键分子，在上皮细胞发生EMT及癌症发生过程中，经常会发生E-钙粘蛋白的下调，与E-钙粘蛋白的作用相反，N-钙粘蛋白、波形蛋白、α-SMA具有促进肿瘤侵袭和转移的作用。多项研究表明，在肿瘤细胞中，可以通过激活PI3K/AKT通路，诱导细胞发生EMT，从而促进肿瘤细胞的迁移和侵袭。
本实施例的实验方法为：
1.迁移实验(Cell Migration Assay)
(1)制备细胞悬液：制备细胞悬液前可先撤去血清以使H1975细胞饥饿12h－24h，进一步去除血清的影响。消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，无血清培养基重悬。调整细胞密度至2×105/ml；
(2)接种细胞：取细胞悬液100μL加入Transwell小室(插入式细胞培养皿)，在24孔板下室加入800μL的10％FBS(胎牛血清)培养基；
(3)培养细胞：将24孔板置入培养箱中培养24h；
(4)固定：培养24h后，将培养基弃去，并用PBS冲洗2-3次，然后每孔加入4％多聚甲醛1ml，在室温下固定30min；
(5)染色：固定30min后，将多聚甲醛弃去，用PBS冲洗2-3次，然后每孔加入0.1％结晶紫染色30min，30min后用清水将结晶紫染料冲洗干净，用棉签擦掉小室上层未迁移细胞，并将小室烘干；
(6)结果统计：显微镜下随即三个视野观察记数细胞。
2.具体步骤同实施例四所述Western-blot检测。
结果5：
T4联合奥希替尼具有抑制肺腺癌H1975细胞(T790M/L858R突变)发生EMT的作用；
在癌症发生过程中，上皮细胞经常会发生EMT，主要特征有E-cadherin(E-钙黏蛋白)的下调，Vimentin(波形蛋白)，α-SMA(α-平滑肌肌动蛋白)上调等，发生EMT的细胞具有促进肿瘤侵袭和转移的作用；基于上述实验中证实了T4和OSI能够抑制H1975细胞中PI3K/AKT通路的表达，故在本实施例中探究T4和OSI能否抑制H1975细胞发生EMT。为了减少药物对细胞的杀伤作用，减少药物作用时间至24h，通过Transwell(细胞迁移实验)发现(参照图14和图15)对比对照组的细胞数，经OSI 60nM、OSI 30nM、T4 20nM、T4 10n和OSI 30nM+T410nM处理过的细胞穿过Transwell小室生物膜的细胞数目明显减少，且OSI 30nM+T4 10nM的组别比单独使用T4 10nM的组别减少的细胞数目更明显，与单独使用OSI 30nM的组别相比细胞数目略减少；Western Blotting检测(图16)E-cadherin、Vimentin和α-SMA蛋白的表达水平，发现经T4 20nM或OSI 60nM处理过后的E-cadherin表达增多，Vimentin和α-SMA表达均减少，20nM T4+OSI 60nM组上述作用最明显。因此，本实施例中的实验结果表明T4和奥希替尼具有抑制H1975细胞发生EMT的作用。
实施例六：雷公藤氯内酯醇T4联合奥希替尼OSI对肺腺癌H1975细胞(T790M/L858R突变)膜表面PD-L1的表达的作用。
本实施例的实验步骤为：
1.溶液和试剂的配置
(1)使用反渗透去离子水(RODI)或同等级别的水制备溶液。
(2)1×磷酸盐缓冲液(PBS)：要制备1L 1×PBS：添加100ml 10×PBS到900ml水中混合。
(3)抗体稀释缓冲液：购买即用型流式细胞术抗体稀释缓冲液，或在100ml 1×PBS中溶解0.5g牛血清白蛋白(BSA)来制备0.5％BSA-PBS(磷酸盐缓冲液)缓冲液，并在4℃环境中储存。
2.免疫染色
(1)将所需数量的H1975细胞分装进试管或加样孔中。(通常，每次实验5x 105至1x106个细胞。)
(2)进行离心(5分钟，300g)使细胞沉淀，并去除上清液。
(3)在100μL稀释的一抗中重悬细胞，稀释的一抗按一抗说明书建议的稀释度加入抗体稀释缓冲液制备。
(4)在冰上孵育30分钟至1小时，避光保存。
(5)用抗体稀释缓冲液进行离心洗涤，丢弃上清液，重复操作。
(6)在200-500μL抗体稀释缓冲液中重悬细胞后用流式细胞分析仪进行分析。
结果6：
T4联合OSI能够降低H1975细胞膜表面PD-L1的表达，而且下调H1975细胞膜表面PD-L1的作用能够被PI3K/AKT激动剂所抑制。
PD-L1位于免疫细胞和H1975细胞的表面，并与T细胞受体PD-1相互作用，帮助H1975细胞逃避免疫破坏。在本实施例中通过PE荧光直接偶联的抗PD-L1抗体对H1975细胞进行染色并通过流式细胞仪处理细胞，结果(参照图18)表明，与对照组相比，经OSI、T4以及OSI+T4处理过后的细胞膜表面的PD-L1表达降低。
与此同时，采用740YP 30μM预处理H1975细胞30min，加入OSI、T4、OSI+T4处理H1975细胞，发现若加入740YP预处理H1975细胞，则能够引起的PD-L1升高，部分H1975细胞会逆转OSI、T4、OSI+T4引起的PD-L1下调。上述结果表明T4和OSI能够降低H1975细胞膜表面PD-L1的表达，而且这种下调H1975细胞膜表面PD-L1的作用能够被PI3K/AKT激动剂所抑制。
实施例七：AEG-1基因的表达与A549和A549/DDP肺癌细胞(对顺铂耐药的肺癌细胞株)对顺铂的耐药性的相关性及T4与AEG-1基因表达相关性的影响。
本实施例的实验方法为：
细胞培养
(1)A549和A549/DDP肺癌细胞(对顺铂耐药的肺癌细胞株)购自中国科学院细胞库。
(2)用含10％胎牛血清(FBS)和100μg/mL青霉素/链霉素的DMEM高糖培养基培养A549细胞，并置于温度为37℃、含5％CO2的湿化培养箱中培养。
(3)用含10％胎牛血清和100μg/mL青霉素/链霉素的RPMI-1640培养液在含5％CO2的湿式培养箱中以37℃的温度培养A549/DDP细胞。
(4)每隔两天更换一次新鲜培养基。
2：药物治疗
(1)将A549和A549/DDP肺癌细胞以每皿4×105个细胞的密度接种于6孔板中，每种细胞用其中一种培养基培养六个孔，随机分为以下5组：i)对照组，不予药物处理；ii)-v)T4实验组，分别用25、50、100和200nM系列浓度的T4处理A549和A549/DDP细胞；
(2)药物作用24h后收集A549和A549/DDP细胞；
(3)每个实验重复进行3次；
(4)挑选最佳的T4浓度。
3.沉默和过表达
(1)A549和A549/DDP细胞接种到六孔板中，24h后更换培养液为无血清培养基。
(2)将AEG-1cDNA序列导入pcDNA3.1表达载体中，获得质粒互补DNA AEG-1cDNA(pcDNA-AEG-1)。
(3)AEG-1的shRNA和siRNA及其对照由上海吉玛公司合成。
(4)采用脂质体2000进行寡核苷酸及质粒转染。
4.CCk-8检测
(1)将约1×105个细胞均匀接种于96孔板中，培养24h。
(2)将A549细胞、A549/DDP细胞于对数生长期酶切，用不含FBS的细胞悬液处理，每孔取200μL细胞悬液接种于96孔板,每孔各5×104个/mL，接种培养24h，直至完全贴壁。
(3)将T4溶于DMSO(二甲基亚砜)中，设实验组、对照组和空白组，实验组分为6个亚组，加入含0、25、50、100和200nM的无血清T4培养基，对照组细胞在无血清培养基中培养，仅加入DMSO，空白组仅含培养基和DMSO，无细胞。
(4)24小时后，每孔加入20μLCCK8，37℃再次孵育1-4小时，用酶标仪在595nm处分析吸光度值，计算细胞存活率。
(5)细胞存活率＝A595(实验组)/A595(对照组)×100％，存活率＝A595/DDP(实验组)/A595/DDP(对照组)×100％，每个实验重复进行3次。
5.免疫印迹法
使用含有1mM PMSF的RIPA裂解缓冲液分离细胞提取的总蛋白，冰上保存10min，以12 000r/min的转速、在4℃的温度下离心15min，BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度；取40ng蛋白经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，转移到PVDF膜上；用5％非脂乳封闭2h后，分别用抗AEG-1(1:1000,美国Abcam)、MDR-1(1:1000,美国Abcam)和GAPDH(1:2000,美国Abcam)的一抗孵育膜，在温度为4℃的摇床孵育16小时，分别用二抗室温孵育2h。用TBST洗液洗涤3次后，用电化学发光试剂显色，用Image Lab 3.0软件(Bio-Rad)定量印迹的强度。
6.用TRIzol试剂提取A549和A549/DDP细胞细胞总RNA。1000ng总RNA逆转录合成cDNA。实时定量PCR(q PCR)加入10μL反应物，包括2×SYBR Master Mix 5μl，正反引物各0.25μl，稀释cDNA 4.5μl。RT-PCR的参数为：在95℃反应10min，在95℃反应15s，在60℃反应1min，共40个循环。上述反应在CFX96实时荧光定量PCR系统(Bio-Rad)进行。获得循环阈值(Ct)值并将其标准化为GAPDH水平。采用2-△△Ct法计算各靶基因的相对mRNA水平。
引物序列如下：
AEG-1正义链：5'-TGTGTGTCCGTCTACAGATGTG-3'，反义链：5'-TCGGCAGGAAGTGTGATTGG-3'；
MDR-1正义链forward,5'-TTGCCAACCATAGATGAAGG-3',反义链,5'-CACCACTGGAGCATTGACTAC-3'；
GAPDH正义链：5'-GTGCCAGCC TCGTCTCATAG-3',反义链：5'-CTT TGTCACAAG AGAAGG CAG-3'；
每个反应重复3次，所有实验的效率在95％～105％之间，引物均显示正常的熔体曲线。
结果7：
7.1：AEG-1蛋白在A549和A549/DDP细胞(对顺铂耐药的肺癌细胞株)中的表达与顺铂耐药呈正相关。
本研究利用A549细胞系构建了对顺铂耐药的A549/DDP细胞，并将过表达的AEG-1质粒和sh-AEG-1分别转染A549和A549/DDP细胞。与对照组相比，转染细胞具有明显的AEG-1过表达和敲低效应。
结果表明：质粒转染成功。在A549和A549/DDP细胞中，A549/DDP细胞中AEG-1和MDR-1的表达水平均高于A549细胞(图19：A-D)。在A549细胞中，MDR-1的m RNA和蛋白水平随着AEG-1在A549细胞中的过表达而升高。当A549细胞中AEG-1表达下降时，MDR-1的mRNA和蛋白水平也下降(图20：A-F)。本实施例的实验结果显示，AEG-1与MDR-1的表达密切相关，也说明AEG-1的表达水平可能与肺癌细胞的耐药性有关。因此，通过CCK-8实验进一步观察AEG-1对肺癌细胞耐药性的影响。结果表明，当AEG-1在A549细胞中过表达时，顺铂对A549细胞的杀伤作用减弱。在A549/DDP细胞中敲除AEG-1后，与对照组(图21：G和H)相比，顺铂对A549/DDP细胞表现出明显增强的致死性。因此，该实验发现AEG-1与肺癌细胞的耐药基因MDR-1呈正相关，这也说明AEG-1与肺癌细胞对顺铂的耐药呈正相关。
7.2：T4可影响A549和A549/DDP细胞(顺铂耐药的肺癌细胞株)中AEG-1蛋白的表达。
在以往的研究中发现，T4与肺癌细胞的耐药性有关。首先，在A549和A549/DDP细胞中分别加入不同浓度的T4药物，检测AEG-1的表达水平。随着T4药物浓度的增加，AEG-1在A549和A549/DDP细胞中的表达水平逐渐降低(图11：A-f)。实验结果表明，T4可剂量依赖性调节A549和A549/DDP细胞中AEG-1蛋白的表达。对于两组细胞，T4的最佳浓度为200nM。
7.3T4可通过影响AEG-1的表达而影响A549和A549/DDP细胞(顺铂耐药的肺癌细胞株)的耐药性。
用200nM T4处理A549/DDP细胞和AEG-1过表达的A549/DDP细胞后，与对照组细胞相比，加入T4后，AEG-1蛋白表达显著降低，MDR-1蛋白表达也相应降低。与对照细胞相比，T4处理的A549/DDP细胞中AEG-1蛋白表达显著降低，MDR-1的表达也相应降低(参照图22A-图22C)，表明T4可通过影响AEG-1的表达来调节MDR-1的表达。CCK-8实验结果表明，T4可降低A549/DDP细胞对顺铂的耐药。通过质粒转染过表达AEG-1后，T4对顺铂耐药性的影响减弱(参照图22D)。
该实验表明，T4可通过影响AEG-1蛋白的表达而影响肺癌细胞对顺铂的耐药性。
综上所述，本发明提供的一种雷公藤氯内酯醇的用途，由于雷公藤氯内酯醇具有低毒性，且其对于耐顺铂的肺腺癌移植瘤具有抑制生长的效果，因此进一步探究雷公藤氯内酯醇在肺腺癌治疗中的作用。在本发明中已证实，雷公藤氯内酯醇能够延缓肺腺癌患者原发或使用第一代或第二代酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)后特定基因突变(T790M和L858R突变)驱动导致的肺腺癌细胞对靶向药物耐药；雷公藤氯内酯醇能够与奥希替尼联合能够降低H1975细胞膜表面PD-L1的表达，进而使H1975细胞受到免疫破坏；(4)抑制肺腺癌细胞增殖并通过PI3K/AKT通路诱导其自噬或凋亡；雷公藤氯内酯醇能够延缓H1975细胞对于靶向药物的耐药性，确保药物对于肺腺癌的有效性；此外，雷公藤氯内酯醇能抑制上皮间质转化，降低癌细胞发生转移的概率。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (7)

1.雷公藤氯内酯醇与奥希替尼联合用于制备诱导人体肺腺癌细胞凋亡的药物中的应用，所述肺腺癌细胞指的是肺腺癌细胞使用原代、第一代或第二代酪氨酸激酶抑制剂后T790M和L858R基因突变后的肺腺癌细胞。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，雷公藤氯内酯醇降低肿瘤细胞表面PD-L1的表达。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，雷公藤氯内酯醇通过PI3K/AKT通路诱导肺癌细胞自噬或凋亡。
4.根据权利要求1～3任一项所述的应用，其特征在于，所述肺腺癌细胞指的是肺腺癌H1975细胞。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述雷公藤氯内酯醇从雷公藤植物中提取得到。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述雷公藤氯内酯醇由雷公藤内酯醇经羟基酰化并氯化修饰后得到。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为口服剂，所述口服剂的类型包括片剂、胶囊、粉剂、颗粒和锭剂。
CN202211104517.6A 2022-09-09 2022-09-09 雷公藤氯内酯醇的用途 Active CN115590861B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211104517.6A CN115590861B (zh) 2022-09-09 2022-09-09 雷公藤氯内酯醇的用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211104517.6A CN115590861B (zh) 2022-09-09 2022-09-09 雷公藤氯内酯醇的用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN115590861A CN115590861A (zh) 2023-01-13
CN115590861B true CN115590861B (zh) 2023-09-19

Family

ID=84843150

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211104517.6A Active CN115590861B (zh) 2022-09-09 2022-09-09 雷公藤氯内酯醇的用途

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115590861B (zh)

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Combined Treatment with Triptolide and Tyrosine Kinase Inhibitors Synergistically Enhances Apoptosis in Non-small Cell Lung Cancer H1975 Cells but Not H1299 Cells through EGFR/Akt Pathway;Xiaopei Tong等;《Chem. Pharm. Bull.》;第67卷(第8期);第864-871页 *
T4 reduces cisplatin resistance by inhibiting AEG‑1 gene expression in lung cancer cells;Tian‑jiao Song等;《Nature portfolio》;第12卷;第1-7页 *
Tripchlorolide induces cell death in lung cancer cells by autophagy;Limin Chen等;《International Journal of Oncology》;第40卷;第1066-1070页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN115590861A (zh) 2023-01-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Bian et al. A pectin-like polysaccharide from Polygala tenuifolia inhibits pancreatic cancer cell growth in vitro and in vivo by inducing apoptosis and suppressing autophagy
CN107106580A (zh) 治疗癌症干细胞的组合物
CN108685921B (zh) 一种n电子等排体鸢尾苷的喹啉衍生物在抗肝癌药物中的应用
Xiao et al. Polygalacin D suppresses esophageal squamous cell carcinoma growth and metastasis through regulating miR-142-5p/Nrf2 axis
Liu et al. Low-dose naltrexone inhibits the epithelial-mesenchymal transition of cervical cancer cells in vitro and effects indirectly on tumor-associated macrophages in vivo
Chen et al. Limonin inhibits angiogenesis and metastasis of human breast cancer cells by suppressing the VEGFR2/IGFR1-mediated STAT3 signaling pathway
CN109745333B (zh) 一种用于膀胱癌治疗的药物组合物及其应用
CN115590861B (zh) 雷公藤氯内酯醇的用途
US9988403B2 (en) Compositions and methods for treating cancer with aberrant lipogenic signaling
KR101191958B1 (ko) Ｔｌｅ1 억제제를 유효성분으로 함유하는 활액막 육종 예방 및 치료용 약학적 조성물
CN109966479A (zh) Ezh2在制备预防或治疗多囊肾病药物中的应用
CN114917219A (zh) 异荭草素联合顺铂在制备逆转肺癌耐药的药物中的应用
US20230121867A1 (en) Compositions and methods for treating diseases and conditions by depletion of mitochondrial or genomic dna from circulation
CN111560433B (zh) 人nufip1的用途及相关产品
CN109260197B (zh) 靛玉红类化合物和硼替佐米在制备治疗多发性骨髓瘤的药物中的用途
WO2017091952A1 (zh) Akt2在诊断和治疗肿瘤中的用途
CN112439067A (zh) Sglt2抑制剂在制备改善抗肿瘤药物敏感性的产品中的应用
Anastasio et al. SGLT2 inhibitor promotes mitochondrial dysfunction and ER-phagy in colorectal cancer cells
JP2021516695A (ja) 腫瘍転移の薬物治療における標的、及びその使用
CN116421590B (zh) 二乙酸氯己定在制备预防或/和治疗肝癌的药物中的用途
Blair Investigating delta tocopherol as a novel dietary bladder cancer chemopreventive agent
KR101950386B1 (ko) 15-케토 프로스타글란딘 e2를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학 조성물
Xiao et al. A phenylpentane derivative from Sanghuangporus vaninii inhibits EMT mediated tumor progression of pancreatic cancer by targeting EGFR
CN118436656A (zh) 吴茱萸碱在调控结直肠癌中多胺代谢、yap蛋白磷酸化和核转位的应用
CN115475160A (zh) 香叶木素在食管鳞癌中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant