CN109260197B - 靛玉红类化合物和硼替佐米在制备治疗多发性骨髓瘤的药物中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了靛玉红类化合物和硼替佐米在制备治疗多发性骨髓瘤的药物中的用途，属于医学和制药领域。本发明的优点是：本发明首次发现了靛玉红类化合物对硼替佐米耐药的患者有效。靛玉红类化合物与硼替佐米联用药物毒性小，显著降低了硼替佐米的用量，显著降低患者的治疗费用。

Description

靛玉红类化合物和硼替佐米在制备治疗多发性骨髓瘤的药物 中的用途
技术领域
本发明涉及靛玉红类化合物和硼替佐米在制备治疗多发性骨髓瘤的药物中的用途， 属于医疗和药学领域。
背景技术
多发性骨髓瘤(Multiple Myeloma，MM)是一种常见于中老年人群的血液系统恶性肿瘤，约占血液系统恶性肿瘤的10％。近年来随着蛋白酶体抑制剂(硼替佐米)、免疫 调节剂(沙利度胺、来那度胺)等新药的应用，以及自体造血干细胞移植的广泛开展， 大多数MM患者可获得较好的缓解，其中位总生存期由原来的不足3年延长至5～7年。 然而目前临床应用的蛋白酶体抑制剂及免疫调节剂等抗骨髓瘤药物多为国外医药公司 专利产品，其价格昂贵，以其为基础的化疗方案使患者显著获益的同时也带来了巨额医 疗费用；医疗负担过重严重影响了患者的治疗进程。第一代蛋白酶体抑制剂硼替佐米是 目前国内MM治疗的骨架药物之一，可特异性抑制蛋白酶体的活性，抑制与MM细胞增殖 相关基因的表达，减少白细胞介素6(IL-6)等MM细胞生长因子的分泌和黏附因子的表 达，最终导致肿瘤细胞凋亡。但硼替佐米价格昂贵，一支国外进口的硼替佐米(3.5毫 克)的价格7千元左右，即便是国产的硼替佐米(3.5毫克)也要5千元左右，一般一 个疗程使用4支，6-8个疗程为一个治疗周期，每个治疗周期仅硼替佐米的药品费用就 需要十几万元，给患者造成很大的经济压力。此外由于进口药品在国内上市流程滞后的 原因，许多新药目前在国内市场不可及，例如第二、第三代蛋白酶体抑制剂。随着我国 人口的快速老龄化，MM发病率呈明显上升趋势。这种依赖国外进口药品的现状急需改变， 研发具有自主知识产权的抗MM药物具有重要的现实意义。
此外，随着硼替佐米在临床的广泛应用以及给药时间的延长，几乎所有的患者均会 出现对现有治疗药物耐药而复发难治，复发难治患者疾病进展迅速、生存期短、预后极差，复发/难治到无治仍是几乎所有MM的最终结局，因此，MM的治疗仍面临巨大挑战， 阐明硼替佐米等抗MM药物的耐药机制并寻求新的药物及干预策略对提高、改善复发难 治MM疗效有重要的理论及现实意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供靛玉红类化合物和硼替佐米在制备治疗多发性骨 髓瘤的药物中的用途，尤其是指在制备对硼替佐米耐药的多发性骨髓瘤的药物中的用途。
本发明要解决的另一个技术问题是，提供一种治疗对硼替佐米耐药的多发性骨髓瘤 的药物。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
靛玉红类化合物和硼替佐米在制备治疗多发性骨髓瘤的药物中的用途。
所述靛玉红类化合物为靛玉红和/或靛玉红-3’-单肟(Indirubin-3’oxime，ID3)。
靛玉红(Indirubin)是我国从中草药青黛中发现的一种对慢性粒细胞白血病(慢粒) 有治疗作用的新型双吲哚类抗肿瘤药物，为我国首创的新型结构的抗白血病药物。靛玉 红的CAS号为479-41-4，结构式如下：
Figure BDA0001821277950000021
所述靛玉红-3’-单肟(Indirubin-3’oxime，ID3)，结构式如下：
Figure BDA0001821277950000022
靛玉红-3’-单肟，CAS号：160807-49-8。ID3及其衍生物是一类双吲哚杂环平面 结构的化合物。国外学者近年来对ID3及其衍生物抗癌机理的研究表明，ID3及其衍生 物对细胞内广泛存在的细胞周期依赖性蛋白激酶(CDK)具有抑制作用，导致癌细胞的细 胞周期停滞，从而抑制肿瘤细胞增殖。
所述多发性骨髓瘤是指普通的多发性骨髓瘤和/或对硼替佐米产生耐药性的多发性 骨髓瘤。
所述治疗是指抑制多发性骨髓瘤瘤体积生长和/或抑制瘤体重量的生长。
本发明首次发现：
1.靛玉红类化合物ID3单药或小剂量联合硼替佐米(BTZ)可显著抑制MM细胞增殖，促进MM细胞凋亡。在降低BTZ剂量的同时，可达到与BTZ相当的疗效，并显著降 低了患者用药的经济成本。
2.靛玉红类化合物ID3可通过抑制内质网应激反应克服硼替佐米耐药。并可显著抑制BTZ耐药的MM细胞增殖，促进其凋亡。
一种治疗多发性骨髓瘤的药物组合物，活性成分为靛玉红类化合物和硼替佐米。
所述靛玉红类化合物为靛玉红(Indirubin，CAS号479-41-4)和/或靛玉红-3’-单肟 (Indirubin-3′-oxime，ID3，CAS号：160807-49-8)。
所述多发性骨髓瘤是指普通的多发性骨髓瘤和/或对硼替佐米产生耐药性的多发性 骨髓瘤。
所述治疗是指抑制多发性骨髓瘤瘤体积生长和/或抑制瘤体重量的生长。
本发明药物组合物具有良好的抑制骨髓瘤生长的效果，可以解决多发性骨髓瘤对现 有药物具有耐药性的问题。
本发明药物组合物可以以任何途径给药，例如以液体或固体的形式采用口服、经鼻、 非肠胃、静脉、皮内注射、皮下注射或者局部给药。
为了非肠胃给药的目的，可以将活性成分置于溶液或混悬液中。溶液和混悬液还可 以包含下面的成分：用于注射的无菌稀释剂，例如，注射用水：脂质体颗粒混悬物，其 中在颗粒的中心包含稳定的活性药，该颗粒具有预定的pH值和受保护的内环境；脂质 体颗粒混悬物，其中活性药外挂在颗粒的外表或是双膜的任何一膜；盐水溶液、不挥 发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或者其他合成溶剂；抗菌剂，例如苄醇；抗氧化剂，例 如抗坏血酸或者亚硫酸氢钠；螯合剂，例如乙二胺四乙缓冲剂，例如乙酸(盐)、柠 檬酸(盐)以及用于调节张力的物质，例如氯化钠或者葡萄糖。非肠胃给药的制剂可以 装在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或者多次剂量的小瓶中。
本发明的优点是：本发明首次发现了靛玉红类化合物ID3单药对硼替佐米耐药的患 者有效。ID3与硼替佐米联用药物毒性小，显著降低了硼替佐米的用量，可显著降低患者的治疗费用。
附图说明
图1A为ANBL6细胞经2.5μM、5μM、10μM ID3联合2.5nM BTZ处理24h后，两 药联用对MM细胞增殖的抑制率结果。
图1B为应用CompuSyn软件得出的图1A中两种药物不同浓度组合的协同指数(CI))图。
图1C为U266细胞经1.25μM、2.5μM、5μM ID3联合2.5nM或10nM BTZ处理48h 后，两药联用对MM细胞增殖的抑制率结果。
图1D为应用CompuSyn软件得出的图1C中两种药物不同浓度组合的协同指数(CI))图。
图1E为ARP1细胞经1.25μM、2.5μM、5μM ID3联合5nM BTZ处理24h后，两药 联用对MM细胞增殖的抑制率结果。
图1F为应用CompuSyn软件得出的图1F中两种药物不同浓度组合的协同指数(CI))图。
图2A为ID3联合BTZ可协同促进MM细胞(ANBL6)凋亡试验结果。
图2B为ID3联合BTZ可协同促进MM细胞(U266)凋亡试验结果。
图2C为ID3联合BTZ可协同促进MM细胞(ARP1)凋亡试验结果。
图3A为ID3与BTZ联用可显著抑制小鼠体内肿瘤细胞的生长试验结果。
图3B为低剂量ID3与BTZ联合应用对小鼠体内肿瘤生长的抑制作用与高剂量ID3和高 剂量BTZ单药应用及对照组的比较。
图3C为低剂量ID3与BTZ联合应用对小鼠体内肿瘤生长的抑制作用与低剂量ID3和低 剂量BTZ单药应用及对照组的比较。
图4为ID3联合BTZ可协同抑制内质网应激反应试验结果。
图5为ANBL6和ANBL6-BR两种MM细胞系对BTZ敏感性不同的试验结果。
图6为ID3可通过减少ANBL6-BR细胞的S期比例促进MM细胞凋亡试验结果。
图7为ANBL6和ANBL6-BR对ID3的敏感性试验结果。
图8A为ID3可逆转MM细胞BTZ耐药试验结果。
图8B为应用CompuSyn软件得出的图8A中两种药物不同浓度组合的协同指数(CI)图；图中居中的横线代表CI值＝1，线下的点代表两药联用CI＜1。
图9为ID3联合BTZ可协同促进BTZ耐药的MM细胞(ANBL6-BR)凋亡试验结果图。
图10为ID3可抑制BTZ耐药的ANBL6-BR细胞内质网应激反应结果图。
具体实施方式
实施例1：ID3联合BTZ可协同抑制MM细胞增殖
一、材料：
ANBL6细胞株：美国哈佛大学医学院
U266细胞株：购于ATCC
ARP1细胞株：美国爱荷华大学
CCK8试剂盒：日本同仁化学研究所(Dojindo)CK04CCK-8WST-8
靛玉红-3’-单肟(ID3)：购于Med Chem express(MCE)公司
硼替佐米(BTZ)：西安杨森制药有限公司
二、方法：MM细胞增殖实验采用CCK8法。
CCK8法是一种运用比色法测量细胞数量的测定方法。CCK8试剂盒中含有WST-8【2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】。它 在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS)的作用下被细胞中的 脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物(Formazan dye)。生成的甲瓒物的数量 与活细胞的数量成正比。因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。
96孔板中接入MM细胞系2×104/100ul/孔的ANBL6、U266和ARP1。设置对照组和 加样组。对照组不加药物，加样组加入含有不同浓度ID3或/和BTZ的1640培养基 (HyCloneRPMI-1640)。ANBL6、U266、ARP1细胞系分别经1.25μM、2.5μM、5μM、 10μM ID3单药或(和)2.5nM、5nM、10nM BTZ处理24h或48h，每个浓度重复三个孔， CCK8检测细胞增殖，并应用CompuSyn软件计算两药协同指数CI(Combination Index)， (CI＜1为两药协同)。不同浓度药物组合，CI值不同，协同指数越小，代表两药协同作 用越强。
三、结果与评价：
ANBL6、U266、ARP1细胞系中ID3和BTZ联用，CI＜1的浓度组合结果如下：
ANBL6细胞经2.5μM、5μM、10μM ID3联合2.5nM BTZ处理24h后，两药联用对 MM细胞增殖的抑制率明显高于两药单用(CI＜1)(图1A)。
U266细胞经1.25μM、2.5μM、5μM ID3联合2.5nM、10nM BTZ处理48h后，两 药联用对MM细胞增殖的抑制率明显高于两药单用(CI＜1)(图1C)。
ARP1细胞经1.25μM、2.5μM、5μM ID3联合5nM BTZ处理24h后，两药联用对MM 细胞增殖的抑制率明显高于两药单用(CI＜1)。(图1F)。
与ID3和BTZ单用组相比，两药联用可明显抑制MM细胞的增殖。
图1B、图1D和图1F是应用CompuSyn软件得出的两种药物不同浓度组合的协同指数(CI))图。图中居中的横线代表CI值＝1，线下的点代表两药联用CI＜1。
实施例2：ID3联合BTZ可协同促进MM细胞凋亡。
一、材料
ANBL6细胞株：同实施例1
U266细胞株：同实施例1
ARP1细胞株：同实施例1
ID3：同实施例1
流式细胞仪：BD公司CantoII，7AAD/PE Annexin V Apoptosis DetectionKit： BD公司559763
二、方法
1.目的和原理：细胞在晚期凋亡或死亡后细胞膜结构破坏，此时Annexin V染色呈阳性。而在细胞早期凋亡时，细胞膜完整性尚未破坏，此时非浸透性荧光染料如7-AAD 或PI无法进入细胞，染色呈阴性。因此结合Annexin V和7-AAD/PI染色，通过流式细 胞仪检测用药前后AnnexinV/7AAD细胞比例的变化，来评价药物对MM细胞促凋亡的作 用。
2.方法：6孔板中接入MM细胞系2×105/1ml/孔，加入不同浓度ID3或(和)BTZ， 于5％CO2，37度培养箱中，药物作用24h或48h后，加入PE Annexin V Apoptosis DetectionKit对细胞进行孵育。流式细胞仪检测AnnexinV/7AAD细胞比例的变化。 三、结果与评价：
图2为试验结果。
MM细胞系ANBL6、U266和ARP1应用CI指数最小的ID3和BTZ浓度组合处理24h 或48h后，采用流式细胞术检测凋亡(AnnexinV/7AAD)MM细胞比例的变化。
图2A显示两药联用组(5μM ID3，2.5nM BTZ)处理ANBL6细胞系24h后，AnnexinV 阳性细胞的比例明显高于两药分别单用。其中联用组AnnexinV阳性细胞的比例为 22.6％；而5μM ID3、2.5nM BTZ，对照组分别为17.9％、16.2％和6.4％。
图2B显示1.25μM ID3和2.5nM BTZ联合处理U266细胞系48h后，AnnexinV阳性 细胞的比例为29.6％；而1.25μMID3，2.5nM BTZ、对照组分别为18.1％、23.8％和10.7％。
图2C显示两药联用组(5μM ID3，5nM BTZ)处理ARP1细胞系24h后，AnnexinV 阳性细胞的比例亦明显高于两药分别单用。其中联用组AnnexinV阳性细胞的比例为 34.7％；而5μM ID3、5nM BTZ、对照组分别为28.1％、25.1％和7.6％。
实施例3：体内动物模型证实ID3与BTZ联用的抗MM活性
一、材料：
NOD-SCID小鼠(购于北京华阜康生物科技股份有限公司)
ID3：同实施例1
硼替佐米(BTZ)：购于西安杨森制药有限公司
二、方法
1.目的和原理：使用体外培养的肿瘤细胞和免疫缺陷小鼠建立实验动物肿瘤实验模 型，观察药物对肿瘤细胞的杀伤作用或增殖抑制作用。
2.方法：
(1)制备动物成瘤模型：将体外培养生长良好的ARP1细胞经皮下注射于5-6周龄，20g左右雌性NOD-SCID小鼠左下腹皮下，制备异种移植MM小鼠模型，每只注射 106/100ul。注射10天以后，小鼠皮下肿瘤组织可见。
(2)分组：将动物随机分成不同的治疗组，并根据文献确定BTZ和ID3的给药剂 量及方式(对照组，硼替佐米1mg/kg组，ID36mg/kg组，硼替佐米0.5mg/kg组，ID3 1.25mg/kg组和硼替佐米(0.5mg/kg)ID3(1.25mg/kg)联合用药组，每组5只小鼠。
(3)给药：
对照组：每周两次皮下注射PBS。
硼替佐米组：每周两次皮下注射不同浓度BTZ。
ID3组：隔天一次腹腔注射不同浓度的ID3。
治疗后，每天观察小鼠的一般情况，每3-4天用游标卡尺测量肿瘤直径。肿瘤体积计算公式如下：V＝0.5×a×b2(a和b分别为肿瘤的长径和短径)，绘制肿瘤生长曲线。 三、结果与评价：
图3A为ID3与BTZ联用可显著抑制小鼠体内肿瘤细胞的生长实验结果。
图3B为低剂量ID3与BTZ联合应用对小鼠体内肿瘤生长的抑制作用与高剂量ID3和高剂量BTZ单药应用及对照组的比较，说明ID3与BTZ联用，可以显著降低硼替佐米 的用量。
图3C为低剂量ID3与BTZ联合应用对小鼠体内肿瘤生长的抑制作用与低剂量ID3和低剂量BTZ单药应用及对照组的比较
ID3(6mg/kg)可显著抑制小鼠体内肿瘤细胞的生长，与对照组相比有显著性差异(p＜0.001)，与硼替佐米1mg/kg组没有明显差异。硼替佐米(0.5mg/kg)组和ID3(1.25 mg/kg组)，与对照组相比没有显著性差异。硼替佐米(0.5mg/kg)ID3(1.25mg/kg) 联合用药组的肿瘤体积与对照组和硼替佐米(1mg/kg组)相比均有显著性差异，p值分 别为p＜0.001，p＜0.05。
实施例4：ID3与BTZ联用可通过抑制内质网应激反应，活化JNK凋亡途径，导致 MM细胞凋亡
一、材料
ARP1细胞株：同实施例1
ID3：同实施例1
硼替佐米(BTZ)：购于西安杨森制药有限公司
RIPA蛋白裂解液：购于碧云天生物技术研究所
PierceTM BCA Protein Assay Kit：Thermo scientific公司23225
10％Mini-PROTEIN TGX预制胶：Biorad公司4561033
Biorad湿转膜仪：Biorad公司
PVDF膜：密理博公司(Millipore)
anti-CHOP：Cell Signaling 5554s
anti-p-iRE1a：Abcam ab124945
anti-iRE1a：Cell Signaling 3294s
anti-XBP-1s：Cell Signaling 12782s
anti-p-SAPK/JNK：Cell Signaling 9255s
anti-GAPDH：Cell Signaling 5174s
二抗：Anti-rabbitIgG，HRP-linked Antibody Cell Signaling 7074
ECL化学发光混合液：Thermo scientific，pierceTMECL Western BlottingSubstrate 32106
ImageQuant LAS-4010荧光/化学发光成像分析仪：通用电气医疗集团
二、方法：
1.目的和原理：
免疫印迹法(western blot)通过电泳区分不同的组分，并转移至固相支持物，通过抗体作为探针，对靶蛋白进行检测。
2.方法：
6孔板中接入MM细胞系ARP1，加入不同浓度ID3或(和)BTZ，同时设空白对照组， 于5％CO2，37度培养箱中，药物作用24h后，收集细胞，制备蛋白裂解液(106/100ul RIPA)， 应用pierceTM BCA Protein Assay Kit，按说明书操作对蛋白进行定量。应用10％ Mini-PROTEIN TGX预制胶，电压80V进行蛋白电泳至溴酚蓝到达凝胶底部为止。应用 Biorad湿转膜仪，电流250mA，60min将蛋白转移至PVDF膜。5％(w/v)脱脂奶粉，溶 于PH 7.4的TBST中，室温60min孵育PVDF膜。随后进行抗体与靶蛋白的结合反应。
①一抗与PVDF膜的共温育
a.在10cm培养皿中加入10ml第一抗体(anti-CHOP；anti-p-iRE1a；anti-iRE1a；anti-XBP-1s；anti-p-JNK；anti-GAPDH，抗体均为1∶1000稀释)，水平摇床 上4℃过夜；
b.用TBST漂洗3，每次10min。
②二抗与PVDF膜温育
a.经TBST最后一次洗涤后，把膜转移至一个新的10cm培养皿，加入1：1000 稀释辣根过氧化物酶标记的二抗10ml，37℃摇床平缓摇动，温育1h；
b.用TBS洗涤3次，每次5min。
将PVDF膜置于ECL化学发光混合液(1∶1)中于室温下振荡温育1min，置于ImageQuant LAS-4010荧光/化学发光成像分析仪中按仪器操作步骤显影。
三、结果与评价：
图4为ID3联合BTZ可协同抑制内质网应激反应结果。
2.5nM BTZ与2.5μM ID3联用可活化CHOP的表达，促进JNK的磷酸化，并显著抑 制iRE1a的表达及其磷酸化水平，同时上调剪切型XBP-1的表达。
实施例5：验证ANBL6和ANBL6-BR对BTZ的敏感性
一、材料
BTZ敏感的MM细胞系ANBL6和BTZ耐药的MM细胞系ANBL6-BR：美国哈佛大学
硼替佐米(BTZ)：购于西安杨森制药有限公司
CCK8试剂盒：日本同仁化学研究所(Dojindo)CK04CCK-8WST-8
二、方法
分别单用BTZ系列浓度(1.25nM、2.5nM、5nM、10nM)处理细胞ANBL6和ANBL6-BR，72h后(同时设空白不加药对照组)，CCK8法检测细胞增殖。
三、结果与评价：
图5显示，ANBL6和ANBL6-BR两种MM细胞系对BTZ敏感性不同。
实施例6：ID3可通过减少BTZ耐药的MM细胞系ANBL6-BR的S期比例促进MM细胞 凋亡。
一、材料
BTZ耐药的MM细胞系ANBL6-BR：美国哈佛大学
PI/RNase Staining Buffer：碧云天生物技术研究所
ID3：同实施例1
硼替佐米(BTZ)：购于西安杨森制药有限公司
二、方法
1.目的和原理：PI可以与细胞内DNA和RNA结合，采用RNA抑制剂将RNA消化后， 通过流式细胞术检测到的与DNA结合的PI的荧光强度直接反映了细胞内DNA含量的多 少。细胞周期各时相的DNA含量不同，正常细胞的G1/G0期具有二倍体细胞的DNA含量(2N)，而G2/M期具有四倍体细胞的DNA含量(4N)，而S期的DNA含量介于二倍体和 四倍体之间。因此，通过流式细胞术PI染色法对细胞内DNA含量进行检测，可以区分 G1/G0期、S期以及G2/M期细胞。
2.方法：6孔板中接入MM细胞系，加入不同浓度ID3，于5％CO2，37度培养箱中， 药物作用24h后，加入PI/RNase Staining Buffer，用流式细胞仪检测，并计算得到药 物作用前后细胞各个时期的分布的变化。
三、结果与评价：
与对照组相比，加入ID3的实验组，随ID3浓度增加，ANBL6-BR的S期逐渐减少， G2/M期增多，说明ID3可通过调节细胞周期促进硼替佐米耐药的MM细胞凋亡。图6显 示，ID3可通过减少BTZ耐药的MM细胞系ANBL6-BR的S期比例促进MM细胞凋亡。
实施例7：ID3对BTZ耐药细胞系ANBL6-BR的杀伤作用呈浓度依赖
一、材料
BTZ敏感的MM细胞系ANBL6和BTZ耐药的MM细胞系ANBL6-BR：美国哈佛大学
ID3：同实施例1
硼替佐米(BTZ)：西安杨森制药有限公司
7AAD/PE Annexin V Apoptosis Detection Kit：BD公司559763
二、方法
1.目的和原理：细胞在晚期凋亡或死亡后细胞膜结构破坏，此时Annexin V染色呈阳性。而在细胞早期凋亡时，细胞膜完整性尚未破坏，此时非浸透性荧光染料如7-AAD 或PI无法进入细胞，染色呈阴性。因此结合Annexin V和7-AAD/PI染色，通过流式细 胞仪检测用药前后AnnexinV/7AAD细胞比例的变化，来评价药物对MM细胞促凋亡的作 用。
2.方法：6孔板中接入MM细胞系，加入不同浓度ID3，于5％CO2，37度培养箱中， 药物作用24h后，加入PE Annexin V Apoptosis DetectionKit对细胞进行孵育。流 式细胞仪检测AnnexinV/7AAD细胞比例的变化。
三、结果和评价：
图7显示，两种细胞系对ID3的敏感性有显著差异，且ID3对BTZ耐药细胞系ANBL6-BR的杀伤作用呈浓度依赖。
实施例8：ID3联合BTZ可协同抑制BTZ耐药的MM细胞增殖。
一、材料
BTZ耐药的MM细胞系ANBL6-BR：美国哈佛大学
CCK8检测试剂盒：日本同仁化学研究所(Dojindo)CK04CCK-8WST-8
ID3：同实施例1
硼替佐米(BTZ)：购于西安杨森制药有限公司
二、方法
1.目的和原理：应用CCK8法检测对照组和用药组的细胞增殖活性。
2.方法：96孔板中接入BTZ耐药的MM细胞系ANBL6-BR。设置对照组和加样组。 对照组不加药物，加样组加入含有不同浓度ID3或/和BTZ的培养基培养，每个浓度重 复三个孔，作用24h或48h后，CCK8检测细胞增殖，并计算两药协同指数CI(CI＜1为两 药协同)。不同浓度药物组合，CI值不同，协同指数越小，代表两药协同作用越强。
三、结果与评价：
图8显示，ANBL6-BR细胞经1.25μM、2.5μM、5μM ID3联合10nM BTZ处理24h 后，两药联用对MM细胞增殖的抑制率明显高于两药单用(CI＜1)，说明ID3能克服硼替 佐米的耐药。
实施例9：ID3联合BTZ可协同促进BTZ耐药的MM细胞(ANBL6-BR)凋亡
一、材料
BTZ耐药的MM细胞系ANBL6-BR：美国哈佛大学
ID3：同实施例1
流式细胞仪：BD公司CantoII
7AAD/PE Annexin V Apoptosis Detection Kit：BD公司559763
二、方法
1.目的和原理：细胞在晚期凋亡或死亡后细胞膜结构破坏，此时Annexin V染色呈阳 性。而在细胞早期凋亡时，细胞膜完整性尚未破坏，此时非浸透性荧光染料如7-AAD或PI无法进入细胞，染色呈阴性。因此结合Annexin V和7-AAD/PI染色，通过流式细胞仪检测 用药前后AnnexinV/7AAD细胞比例的变化，来评价药物对MM细胞促凋亡的作用。
2.方法：6孔板中接入MM细胞系2×102/1ml/孔，加入不同浓度ID3或(和)BTZ， 于5％CO2，37度培养箱中，药物作用24h后，加入PE Annexin V Apoptosis Detection Kit对细胞进行孵育。流式细胞仪检测AnnexinV/7AAD细胞比例的变化。
三、结果与评价：
图9为试验结果。
MM细胞系ANBL6-BR应用CI指数最小的ID3和BTZ浓度组合处理24h后，采用流式 细胞术检测凋亡(AnnexinV/7AAD)MM细胞比例的变化。
图9显示两药联用组(1.25μMID3，10nM BTZ)处理ANBL6-BR细胞系24h后，AnnexinV阳性细胞的比例明显高于两药分别单用。其中联用组AnnexinV阳性细胞的比例为 16.6％；而1.25μM ID3、10nM BTZ，对照组分别为7.4％、7.8％和4.8％。
实施例10：ID3可通过活化P53，抑制检查点1(checkpoint1)的磷酸化，抑制 内质网应激反应，活化JNK介导的细胞凋亡途径等多条信号通路，促进BTZ耐药的MM 细胞凋亡，并克服硼替佐米耐药。
一、材料
ANBL6-BR细胞系(BTZ耐药)：美国哈佛大学
ANBL6细胞系(BTZ敏感)：美国哈佛大学
ID3：同实施例1
硼替佐米(BTZ)：购于西安杨森制药有限公司
RIPA蛋白裂解液：购于碧云天生物技术研究所
PierceTM BCA Protein Assay Kit：Thermo scientific公司23225
10％Mini-PROTEIN TGX预制胶：Biorad公司4561033
Biorad湿转膜仪：Biorad公司
PVDF膜：密理博公司(Millipore)
anti-P53：Cell Signaling 2527s
anti-p-iRE1a：Abcam ab124945
anti-iRE1a：Cell Signaling 3294s
anti-p-Chk1：Cell Signaling 12302s
anti-BCL2：Cell Signaling 2872s
anti-p-SAPK/JNK：Cell Signaling 9255s
anti-GAPDH：Cell Signaling 5174s
二抗：Anti-rabbit IgG，HRP-linked Antibody Cell Signaling 7074
ECL化学发光混合液：Thermo scientific，PierceTMECL Western RlottingSubstrate 32106
ImageQuant LAS-4010荧光/化学发光成像分析仪：通用电气医疗集团
二、方法
1.目的和原理：免疫印迹法(Western blot)通过电泳区分不同的组分，并转移至固相支持物，通过抗体作为探针，对靶蛋白进行检测。
2.方法：六孔板中接入MM细胞系ANBL6-BR及其对照细胞系ANBL6。分别设置对照组和加样组。对照组不加药物，加样组在培养基加入10μM ID3。药物作用24h后，收 集细胞，制备蛋白裂解液，应用Western blot法检测目的蛋白的表达情况。
三、结果与评价：
图10显示，与硼替佐米敏感的细胞系相比，硼替佐米耐药的细胞系在ID3处理24h以后，内质网应激相关的JNK凋亡途径被活化，内质网应激反应被抑制。BCL2及p-chk1 蛋白表达明显受抑，P53蛋白表达增加。表明ID3可通过作用多条信号通路，对硼替佐 米耐药的细胞进行杀伤。

Claims (11)

1.靛玉红类化合物和硼替佐米在制备治疗多发性骨髓瘤的药物中的用途；所述靛玉红类化合物通过持续诱导内质网应激反应，削弱未折叠蛋白应答反应克服硼替佐米耐药；所述靛玉红类化合物为靛玉红-3'-单肟（Indirubin-3'-oxime，ID3）。
2.根据权利要求1所述的靛玉红类化合物和硼替佐米在制备治疗多发性骨髓瘤的药物中的用途，其特征在于：所述多发性骨髓瘤是指普通的多发性骨髓瘤和/或对硼替佐米产生耐药性的多发性骨髓瘤。
3.根据权利要求2所述的靛玉红类化合物和硼替佐米在制备治疗多发性骨髓瘤的药物中的用途，其特征在于：所述治疗是指抑制多发性骨髓瘤瘤体积生长和/或抑制瘤体重量的生长。
4.一种治疗多发性骨髓瘤的药物组合物，其特征在于：活性成分为靛玉红类化合物和硼替佐米；所述靛玉红类化合物为靛玉红-3'-单肟（Indirubin-3'-oxime，ID3）。
5.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于：所述多发性骨髓瘤是指普通的多发性骨髓瘤和/或对硼替佐米产生耐药性的多发性骨髓瘤。
6.根据权利要求4或5所述的药物组合物，其特征在于：所述药物组合物为口服或非肠胃给药剂型。
7.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于：所述非肠胃给药剂型为经鼻、 静脉、皮内注射、 皮下注射或者局部给药剂型。
8.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于：所述药物组合物的活性成分置于溶液或混悬液中。
9.根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于：所述药物组合物的活性成分置于溶液或混悬液中。
10.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于所述溶液或混悬液还包含下述成分中的一种或多种：无菌稀释剂、脂质体颗粒混悬物、盐水溶液、不挥发油、抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂、缓冲剂、调节张力的物质。
11.根据权利要求9所述的药物组合物，其特征在于所述溶液或混悬液还包含下述成分中的一种或多种：无菌稀释剂、脂质体颗粒混悬物、盐水溶液、不挥发油、抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂、缓冲剂、调节张力的物质。
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"抗多发性骨髓瘤的STAT3 抑制剂及其研究策略";毛新良等;《中国生物药物杂志》;20161231;第36卷(第8期);参见第2页右栏第5段和第3页左栏第1 *

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