CN105079776A - 一种石蒜碱和硼替佐米组合物的药物新用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种石蒜碱和硼替佐米组合物的药物新用途，是以石蒜碱和硼替佐米组合物用于制备治疗多发性骨髓瘤的药物制剂。本发明采用石蒜碱和硼替佐米两者联用比两者单用具有更好的抑制细胞增殖作用，且联用能抑制细胞自噬。该组合物大大提高了多发性骨髓瘤对硼替佐米的敏感性，适用于耐药难治疗的多发性骨髓瘤。
Description
技术领域
本发明涉及石蒜碱和硼替佐米组合物技术领域，更具体的说，特别涉及一种石蒜碱和硼替佐米组合物的药物新用途。
背景技术
多发性骨髓瘤（multiplemyeloma,MM）是来源于终末分化的B淋巴细胞的恶性肿瘤，以骨髓中大量浆细胞的克隆性增生为显著特征，MM目前仍然不可治愈。骨髓微环境与MM的增殖、迁移、存活、耐药及骨病的发生有着密切的关系，核因子NF-κB信号途径是MM发病过程中起着重要作用的转录调节因子。骨髓基质细胞HS-5细胞可产生GM-CSF、M-CSF、LIF等多种细胞因子，促进MM的增殖和耐药，因此HS-5细胞能很好地体外模拟MM的骨髓微环境。
细胞自噬是指细胞在面临饥饿，低氧等多项应激时通过自我降解细胞内部某些蛋白或特定的细胞器来维持细胞存活的一种生命活动。近年来细胞自噬的两面性使自噬与肿瘤治疗的研究成为热点。一方面由于细胞自噬能清除细胞内过多的损伤细胞器和蛋白等，自噬能使肿瘤细胞逃避死亡；另一方面若自噬过度发生则会导致细胞死亡。研究表明自噬与MM发生关系紧密，自噬通过清除MM细胞分泌的大量胞内折叠蛋白促进肿瘤发展。自噬还能保护MM细胞在营养缺乏环境中或药物干预过程中免于凋亡。可见，在MM治疗过程中，抑制自噬是一个有潜力的新策略。研究发现通过Beclinl-siRNA或氯喹抑制自噬，能导致MM细胞死亡。
硼替佐米（bortezomib,商品名：Velcade）是哺乳动物细胞中26S蛋白酶体的二肽硼酸类可逆抑制剂，目前主要应用于治疗MM的药物。它通过NF-κB信号通路，抑制肿瘤细胞内蛋白抑制因子I-κBα的泛素化，增加其胞内浓度，从而降低NF-κB活性，抑制肿瘤细胞的生长；其次，硼替佐米还可通过上调抑癌基因p53的表达，从而抑制细胞周期；并上调细胞内前凋亡因子NOXA的表达，同时激活Caspase信号通路，诱导细胞凋亡。硼替佐米还通过阻止细胞因子循环和细胞黏附影响骨髓微环境，抑制MM患者骨髓的内皮细胞生长，从而减少肿瘤血管新生。硼替佐米作为治疗MM的一种新药，其有效性在临床上已得到了广泛的认可。然而随着硼替佐米的广泛应用，临床上出现骨髓瘤细胞对硼替佐米耐药的情况。
石蒜碱是一种从石蒜科植物中分离出来的生物碱，不溶于水，在生物体内主要以盐酸石蒜碱的形式存在。石蒜碱具有抗炎、杀菌、解热、镇静、催吐、抗病毒、抗疟疾和抗肿瘤等多种作用。石蒜碱广泛存在于石蒜科植物中，这种天然药物由于资源丰富，药理作用机制多样，在抗肿瘤研究中存在巨大的开发利用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种石蒜碱和硼替佐米组合物的药物新用途。
为了解决以上提出的问题，本发明采用的技术方案为：一种石蒜碱和硼替佐米组合物的药物新用途，以石蒜碱和硼替佐米组合物用于制备治疗多发性骨髓瘤的药物制剂。
所述石蒜碱为盐酸石蒜碱。
所述石蒜碱的浓度范围为2.5μM-10μM，所述硼替佐米的浓度范围为10nM-15nM。
所述石蒜碱和硼替佐米的浓度为2.5μM+10nM、2.5μM+15nM、5μM+10nM、5μM+15nM、10μM+10nM或10μM+15nM。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明采用石蒜碱和硼替佐米两者联用比两者单用具有更好的抑制细胞增殖作用，且联用能抑制细胞自噬。该组合物大大提高了多发性骨髓瘤对硼替佐米的敏感性，适用于耐药难治疗的多发性骨髓瘤。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明采用CCK-8方法检测盐酸石蒜碱和硼替佐米对MM细胞单用和联用后对MM细胞存活率的影响。ARH-77和ANBL-6为不同MM细胞系；**p<0.01。
图2为本发明采用CCK-8方法检测不同浓度比例盐酸石蒜碱和硼替佐米对MM细胞联用后对MM细胞的协同效应。LYC：盐酸石蒜碱；BTZ：硼替佐米。
图3为本发明采用WesternBlot方法检测盐酸石蒜碱和硼替佐米对ARH-77和ANBL-6细胞单用和联用后对自噬相关蛋白LC3B和Beclin1的影响。GAPDH为甘油醛-3-磷酸脱氢酶，作为内参。
图4为本发明采用CCK-8方法检测盐酸石蒜碱和硼替佐米对骨髓微环境中MM细胞的影响，**p<0.01。
具体实施方式
下面结合实施例，进一步对本发明作详细说明。
下述几个实施例中采用的盐酸石蒜碱纯度为98%。
实施例一：本实施例采用CCK-8方法检测盐酸石蒜碱和硼替佐米对MM细胞单用和联用后对MM细胞存活率的影响。
实验步骤：
（1）收集对数生长期的ARH-77和ANBL-6细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100μL，96孔板铺板，使待测细胞密度为2×105个/mL；
（2）设置不加细胞只有培基的调零组以及不加药物适当浓度的DMSO对照组，每个浓度设置3-5个平行孔；
（3）分别加入10μM盐酸石蒜碱、15nM硼替佐米以及10μM盐酸石蒜碱和15nM硼替佐米联合加入，置于5%CO2，37℃细胞培养箱中孵育24小时；
（4）每孔加入10μLCCK-8溶液，置于37℃条件下避光孵育2小时，用酶标仪在450nm波长测量各孔的OD值，进行统计学分析，计算细胞相对存活率。
实验结果如图1所示。结果表明，盐酸石蒜碱单用组对MM细胞ARH-77和ANBL-6的抑制增殖效果均较硼替佐米单用组强，而且盐酸石蒜碱更能增加硼替佐米的抑制增殖效果。
实施例二：本实施例采用CCK-8方法检测不同浓度比例盐酸石蒜碱和硼替佐米对MM细胞联用后对MM细胞的协同效应。
实验步骤：
（1）收集对数生长期的ARH-77和ANBL-6细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100μL，96孔板铺板，使待测细胞密度为2×105个/mL；
（2）设置不加细胞只有培基的调零组以及不加药物适当浓度的DMSO对照组，每个浓度设置3-5个平行孔；
（3）分别加入不同浓度比例的盐酸石蒜碱和硼替佐米（浓度为2.5μM+5nM、2.5μM+10nM、2.5μM+15nM、5μM+5nM、5μM+10nM、5μM+15nM、10μM+5nM、10μM+10nM或10μM+15nM），置于5%CO2，37℃细胞培养箱中孵育24小时；
（4）每孔加入10μLCCK-8溶液，置于37℃条件下避光孵育2小时，用酶标仪在450nm波长测量各孔的OD值，进行统计学分析，计算细胞相对存活率。
实验结果如图2所示。结果表明，硼替佐米低浓度时盐酸石蒜碱的协同作用不强，甚至是拮抗作用，硼替佐米较高浓度时盐酸石蒜碱的协同作用较强。在ANBL-6细胞中盐酸石蒜碱和硼替佐米的协同效应比在ARH-77细胞中的要好。
实施例三：本实施例采用WesternBlot方法检测盐酸石蒜碱和硼替佐米对ARH-77和ANBL-6细胞单用和联用后对自噬相关蛋白LC3B和Beclin1的影响。
实验步骤：
（1）收集对数生长期的ARH-77和ANBL-6细胞，调整细胞悬液浓度为5×105个/mL于细胞培养瓶中，总体积为10mL，然后分别加入10μM盐酸石蒜碱、15nM硼替佐米以及10μM盐酸石蒜碱和15nM硼替佐米联合加入，以对应浓度DMSO处理组作为对照，置于细胞培养箱中孵育24小时；
（2）收集细胞，用5mLPBS洗2次，每管加入适量体积的RIPA细胞裂解液（含0.5%蛋白酶抑制剂cocktail）混匀后冰上裂解30分钟，冰上超声处理30秒，4℃离心15分钟，吸上清即得到细胞总蛋白；
（3）用BCA法测定蛋白质浓度；
（4）将蛋白样品煮沸变性5分钟，用10%SDS-PAGE分离后用NC膜转膜，再用封闭液（PBST溶液配制的5%的脱脂牛奶）室温封闭2小时。加入一抗孵育10-12小时，PBST洗3次，用封闭液稀释的二抗室温孵育2小时，PBST洗3次。使用ECL显影，凝胶成像系统检测自噬相关蛋白LC3B和Beclin1的变化。
实验结果如图3所示。结果表明，在ARH-77和ANBL-6细胞中，盐酸石蒜碱单用组LC3B和Beclin1蛋白水平均下降；而硼替佐米单用组LC3B和Beclin1蛋白水平却是升高的；在盐酸石蒜碱和硼替佐米联用后使LC3B和Beclin1蛋白水平均下降，说明盐酸石蒜碱和硼替佐米联用后能降低细胞自噬水平。
实施例四：本实施例采用CCK-8方法检测盐酸石蒜碱和硼替佐米对骨髓微环境中MM细胞的影响。
实验步骤：
（1）将ARH-77和ANBL-6细胞分别和骨髓基质细胞HS-5细胞进行共培养；
（2）收集对数生长期的上述共培养细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100μL，96孔板铺板，使待测细胞密度为2×105个/mL；
（3）设置不加细胞只有培基的调零组以及不加药物适当浓度的DMSO对照组，每个浓度设置3-5个平行孔；
（4）分别加入10μM盐酸石蒜碱、15nM硼替佐米以及10μM盐酸石蒜碱和15nM硼替佐米联合加入，置于5%CO2，37℃细胞培养箱中孵育24小时；
（5）每孔加入10μLCCK-8溶液，置于37℃条件下避光孵育2小时，用酶标仪在450nm波长测量各孔的OD值，进行统计学分析，计算细胞相对存活率。
实验结果如图4所示。结果表明，盐酸石蒜碱单用组对ARH-77和HS-5共培养细胞以及ANBL-6和HS-5共培养细胞的抑制增殖效果均较硼替佐米单用组强，且盐酸石蒜碱更能增加硼替佐米的抑制增殖效果，说明盐酸石蒜碱在骨髓微环境条件下能加强硼替佐米对骨髓微环境中的MM细胞的杀伤作用，从而更好发挥抑制骨髓瘤细胞的增殖效应。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种石蒜碱和硼替佐米组合物的药物新用途，其特征在于：以石蒜碱和硼替佐米组合物用于制备治疗多发性骨髓瘤的药物制剂。
2.根据权利要求1所述的石蒜碱和硼替佐米组合物的药物新用途，其特征在于：所述石蒜碱为盐酸石蒜碱。
3.根据权利要求1所述的石蒜碱和硼替佐米组合物的药物新用途，其特征在于：所述石蒜碱的浓度范围为2.5μM-10μM，所述硼替佐米的浓度范围为10nM-15nM。
4.根据权利要求1所述的石蒜碱和硼替佐米组合物的药物新用途，其特征在于：所述石蒜碱和硼替佐米的浓度为2.5μM+10nM、2.5μM+15nM、5μM+10nM、5μM+15nM、10μM+10nM或10μM+15nM。
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