CN103948575A - 肉桂醛在制备促血管新生药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及药物领域，具体涉及肉桂醛的新用途及其相关药物。本发明通过大量实验研究，首次发现了肉桂醛作为有效成分在制备血管新生促进剂中的新用途以及肉桂醛在制备通过促进血管新生产生治疗作用的药物中的新用途，能够创造良好的经济效益和广泛的社会效益。

Description

肉桂醛在制备促血管新生药物中的应用

技术领域

本发明涉及药物领域，具体涉及肉桂醛在制备促血管新生药物中的新用途及其相关药物。

背景技术

肉桂醛，英文名：Cinnamic aldehyde，分子式：C₆H₅CHCHCHO，分子量：132.16，CAS登录号：104-55-2，化学结构式为：

肉桂醛是一种醛类有机化合物，为黄色黏稠状液体，天然存在于肉桂油、桂皮油、藿香油、风信子油和玫瑰油等精油中。自然界中天然存在的肉桂醛均为反式结构，该分子为一个丙烯醛上连接上一个苯基，因此可被认为是一种丙烯醛衍生物。

最常用的肉桂醛合成方法是在近临界水中，以苯甲醛和乙醛为原料，在无外加任何催化剂的条件下，合成肉桂醛。天然肉桂醛可自肉桂油和桂皮油中，用亚硫酸氢钠生成加成物，再用碱分解分离，然后精制而得。

目前已公开的肉桂醛在医药方面的应用包括：1.杀菌防腐，特别是对真菌有显著疗效。对大肠杆菌、枯草杆菌及金黄色葡萄菌、白色葡萄球菌、志贺氏痢疾杆菌、伤寒和副伤寒甲杆菌、肺炎球菌、产气杆菌、变形杆菌、炭疽杆菌、肠炎沙门氏菌，霍乱弧菌等有抑制作用。且对革兰氏阳性菌杀菌效果显著，可用于治疗多种因细菌感染引起的疾病。最小抑制浓度(MIC)为0.02—0.07ul/ml，对深部致病真菌MIC为0.1—0.3ul/ml。2.抗溃疡，加强胃、肠道运动。其作用机制是由于溃疡活性因素(胃液与胃蛋白酶)的抑制与防御因素(胃粘膜血流速率)的加强，以及抑制胃粘膜电位降低和对粘膜保护作用所致。除此之外，肉桂醛能降低胰酶活性。肉桂醛系芳香性健胃驱风剂，对肠胃有缓和的刺激作用，可促进唾液及胃液分泌，增强消化功能，解除胃肠平滑肌痉挛，缓解肠道痉挛性疼痛，有显著的健胃、驱风效果。3.脂肪分解作用。肉桂醛具有抑制肾上腺素及ACTH对脂肪酸的游离，促进葡萄糖的脂肪合成作用，可用于血糖控制药中，加强胰岛素替换葡萄糖的性能，防治糖尿病。4.抗病毒作用。对流感病毒，SV10病毒引起的肿瘤抑制作用强大。5.抗癌作用。可抑制肿瘤的发生，并具抗诱变和抗辐射作用。6.降压作用。对肾上腺皮质性高血压有降压作用。7.壮阳作用。美国芝加哥治疗研究中心的一份研究表明，肉桂醛对男性壮阳有一定的功效。

但是，目前关于肉桂醛在促血管新生方面的作用还未见报道。

血管新生是指从原有的血管内皮细胞增殖、迁移、形成新的血管网的过程。血管新生是一个复杂的过程，受众多的正性与负性调节因子的控制，两者的平衡使血管新生维持在生理范围。当促血管新生因子增加和/或抑制血管新生因子减少时，将导致血管新生。血管新生不仅是机体正常发育、生殖或组织修复等生理过程的基础，也参与了多种病理过程。调节血管新生已成为某些疾病治疗的新策略并取得了令人瞩目的成就。肿瘤的生长与转移为血管依赖性，一些炎症与免疫性疾病如类风湿性关节炎与血管性视网膜病也有异常的血管新生。另一方面，在创伤愈合过程中需要促进血管新生；在动脉粥样硬化时，心脏与外周动脉狭窄导致局部供血不足，另外血栓形成也会使器官、组织陷于缺血状态，此时侧枝血管的形成被视为生理的血管新生，这也是一种在治疗上需要加以促进的血管新生。

发明内容

本发明的目的在于公开肉桂醛作为促进血管新生有效成分在制备血管新生促进剂中的新用途，并基于肉桂醛新用途的发现，提供了通过促进血管新生产生治疗作用的药物。

本发明第一方面公开了肉桂醛作为促进血管新生有效成分在制备血管新生促进剂中的新用途。

进一步的，所述血管新生促进剂起到下列作用中的一种或多种：

a)促进内皮细胞增殖；

b)促进内皮细胞损伤愈合；

c)促进内皮细胞迁移；

d)促进内皮细胞管腔形成；

e)诱导VEGF表达和分泌；

f)激活PI3K/AKT信号通路；

g)激活c-Raf/MEK/Erk1/2信号通路，和/或

h)促进伤口组织血管数目增加。

本发明第二方面公开了肉桂醛在制备通过促进血管新生产生治疗作用的药物中的用途。

进一步的，所述药物为促进伤口愈合和/或创伤愈合和/或创面愈合的药物。

优选的，所述药物为治疗皮肤急性伤口、皮肤慢性创伤或皮肤溃疡的药物。

更优选的，所述药物为预防和/或治疗糖尿病引起的皮肤损伤的药物。

进一步的，所述药物为促进侧枝血管形成的药物。

优选的，所述药物为预防和/或治疗冠心病心肌缺血的药物。

本发明第三方面还公开了通过促进血管新生产生治疗作用的药物组合物，所述药物的有效成分中含有肉桂醛。

优选的，上述药物组合物中，肉桂醛为该药物组合物的唯一有效成分。

优选的，上述药物组合物中还包含药学上可接受的载体。

“药学上可接受的”成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)即有合理的效益/风险比的物质。“药学上可接受的载体”是用于将本发明的肉桂醛传送给动物或人的药学上或食品上可接受的溶剂、悬浮剂或赋形剂。载体可以是液体或固体。

药学上可接受的载体为各种药学上常用的辅料和/或赋形剂，包括(但不限于)糖类(如乳糖、葡萄糖和蔗糖)，淀粉(如玉米淀粉和土豆淀粉)，纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素)，黄蓍胶粉末，麦芽，明胶，滑石，固体润滑剂(如硬脂酸和硬脂酸镁)，硫酸钙，植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油，多元醇(如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇)，海藻酸，乳化剂(如Tween、聚氧乙烯蓖麻油)，润湿剂(如月桂基硫酸钠)，着色剂，调味剂，压片剂、稳定剂，抗氧化剂，防腐剂，无热原水，等渗盐溶液和磷酸盐缓冲液等；该载体可根据需要提高配方的稳定性、活性及生物有效性等。

本发明药物组合物使用时，所述肉桂醛作为唯一有效成分，或者所述肉桂醛作为有效成分之一，可与一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂混合制成不同给药途径的药物剂型。

优选的，所述药物组合物的制剂形式为片剂、胶囊、散剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂、口服液、醑剂、酊剂、气雾剂、粉雾剂、注射剂、注射用无菌粉末，或者栓剂。上述制剂类型可以按照药剂学(第六版，人民卫生出版社，崔福德)中的相关定义理解，上述制剂的制备可以按照药剂学(第六版，人民卫生出版社，崔福德)中的相关制剂的方法配制。

优选的，所述药物组合物的制剂形式为片剂或口服液。

优选的，本发明所述药物组合物可经过口服、静脉内、肌内或皮下途径给药。

优选的，本发明的药物组合物生产时可以通过滤膜过滤除菌，或者进行高压灭菌。

肉桂醛作为活性成分的有效剂量可随给药模式和疾病的严重程度而变化。对大部分大型哺乳动物而言，每天有效成分肉桂醛的服用剂量约为0.01～1000mg。优选的，成人临床给药量的范围为0.01-200mg/日，更优选为0.05-100mg/日。

本发明的药物具有明显的促进血管新生的作用，可用于多种原因引起的血管损伤的治疗。

本发明的有益效果为：本发明通过大量实验研究，首次发现了肉桂醛作为有效成分在制备血管新生促进剂中的新用途以及肉桂醛在制备通过促进血管新生产生治疗作用的药物中的新用途。肉桂醛原料丰富，价格低廉，毒副作用小，剂型易于选择，制剂成分明确、制备工艺及其质量标准便于控制，具有良好的市场顺应性和应用前景，能够创造良好的经济效益和广泛的社会效益。

附图标记

图1：肉桂醛对HUVECs增殖的影响，**P<0.01，***P<0.001vs control。

图2：肉桂醛对HUVECs损伤愈合的影响，(A)(B)为划痕实验结果，(C)为爬片实验结果，**P<0.01，***P<0.001vs control。

图3：肉桂醛对HUVECs迁移的影响，a.control，b.0.1μM，c.1μM，d.5μM，e.10μM，***P<0.001vs control。

图4：肉桂醛对HUVECs管腔形成的影响，a.control，b.0.1μM，c.1μM，d.5μM，e.10μM，***P<0.001vs control。

图5：肉桂醛对HUVECs分泌VEGF的影响，***P<0.001vs control。

图6：肉桂醛促进AKT、eNOS蛋白磷酸化，**P<0.05，**P<0.01，***P<0.001vscontrol。

图7：肉桂醛促进c-Raf、Erk1/2、p38蛋白磷酸化。

图8：抑制剂对肉桂醛诱导的HUVECs增殖、VEGF分泌及AKT和Erk1/2蛋白磷酸化的影响，***P<0.001vs control，###P<0.001vs CA。

图9：野生型小鼠和糖尿病小鼠皮肤损伤后的伤口面积，P<0.05vs control。

图10：小鼠皮肤组织病理学切片(H&E染色)，4×10放大倍数。

图11：小鼠皮肤组织的CD-31免疫荧光切片，10×20放大倍数，***P<0.001vscontrol。

图12：VEGF在野生型小鼠(A)和糖尿病小鼠(B)皮肤组织中的表达，***P<0.001vs control。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应理解，实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分比和份数均按重量计。

实施例1肉桂醛促进血管新生体外实验

(一)实验方法

原代人脐静脉内皮细胞(HUVECs)购自美国ALLCELLs公司，每批细胞的纯度均95％以上，并采用流式细胞仪检测内皮细胞相关标志物(CD31,vWF,CD54)的表达，阳性率均达到99％以上，鉴定为原代细胞。

1.肉桂醛促进HUVECs增殖实验

取指数生长期的原代人脐静脉内皮细胞(HUVECs)，用MCDB13完全培养基制成5×104个/ml细胞悬液，以5×103个/孔细胞密度接种到96孔板，置于37℃、5％CO2培养箱中；待细胞贴壁良好以后，弃原培养基，换含1％FBS和不同浓度肉桂醛(购于中国药品生物制品检定所公司，纯度为98％以上)的基础培养基；对照组为含等量DMSO的不含药培养基，阳性对照组为加入VEGF(20ng/ml)的不含药培养基；24小时后，加入CCK-8溶液(10μl/孔)，在培养箱中反应3小时，选取450nm波长在酶标仪上检测各孔吸光度值(OD值)；增殖率％＝(OD给药/OD对照-1)×100％。

2.肉桂醛促进HUVECs损伤愈合实验

在24孔板中加入0.5％明胶(400μl/孔)，置于37℃、5％CO2培养箱中孵育至少2小时后，弃明胶，晾干备用；取指数生长期的原代人脐静脉内皮细胞(HUVECs)，用MCDB131完全培养基制成1×105个/ml细胞悬液，以3×104个/孔细胞密度接种到明胶包被的24孔板，置于37℃、5％CO2培养箱中；待细胞贴壁良好以后，用200μl枪头在每孔中间位置垂直划一道直线，弃原培养基，PBS洗掉漂浮的细胞(洗2次即可)，换含1％FBS和不同浓度肉桂醛的基础培养基；分别T0和T24时间点在同一位置于100倍显微镜下拍照，记录划痕距离；愈合率％＝(1-T24划痕距离/T0划痕距离)×100％。

3.爬片实验评价肉桂醛促进HUVECs损伤愈合的能力

在12孔板中每孔放入一片直径为13mm的圆形塑料盖玻片，加入0.5％明胶(800μl/孔)，置于37℃、5％CO2培养箱中孵育至少2小时后，弃明胶，晾干备用；取指数生长期的原代人脐静脉内皮细胞(HUVECs)，用MCDB131完全培养基制成1×105个/ml细胞悬液，以3×104个/孔细胞密度接种到明胶包被的24孔板，置于37℃、5％CO2培养箱中；24小时后，用无菌镊子把每孔中的盖玻片轻轻夹出来，弃原培养基，换含1％FBS和不同浓度肉桂醛的基础培养基；24小时后，按照细胞消化的方法将每孔细胞消化下来分别移至1.5ml离心管中，轻轻混匀，用血细胞计数仪记录每孔细胞数；用细胞数的多少来评价肉桂醛促进HUVECs损伤愈合的能力。

4.肉桂醛促进HUVECs迁移实验

24孔板中每孔加入600μl下室培养基(MCDB131基础培养基+50ng/mlVEGF+10％FBS)，将Transwell小室放入24孔板中；取指数生长期的原代人脐静脉内皮细胞(HUVECs)，用MCDB131基础培养基制成5×105个/ml细胞悬液，以5×104个/孔细胞密度接种Transwell小室中，加入不同浓度的肉桂醛，置于37℃、5％CO2培养箱中；24小时后，在一块干净的24孔板中加入PBS600μl/孔，将小室转移至新24孔板中，用小棉球轻轻擦拭小室上表面(注：力度要轻以免膜表面不平)；用10μMHochest33258染色10分钟(室温，避光)；再取出另一块干净的24孔板，加入4％多聚甲醛600μl/孔，细胞固定15分钟；于40倍荧光显微镜下每孔随机5个视野拍照；利用IPP图像分析软件计算每张图片的细胞数并进行统计分析。

5.肉桂醛促进HUVECs管腔形成实验

将96孔板和200μl无菌枪头在-20℃条件下预冷2小时，Matrigel胶4℃解冻。在无菌条件下，吸取Matrigel胶于96孔板中(50μl/孔，避免产生气泡)，置于37℃、5％CO2培养箱中1小时，待胶凝固后备用；取指数生长期的原代人脐静脉内皮细胞(HUVECs)，用MCDB131基础培养基制成5×105个/ml细胞悬液，以5×104个/孔细胞密度接种于Matrigel胶包被的96孔板中，加入不同浓度的肉桂醛，置于37℃、5％CO2培养箱中；4小时后，每孔随机选取5个视野于40倍显微镜下拍照，利用Imagepro-plus(IPP)图像分析软件计算每张图片的管腔数目并进行统计分析。

6.酶联免疫吸附法(ELISA)检测肉桂醛诱导VEGF释放

取指数生长期的原代人脐静脉内皮细胞(HUVECs)，用MCDB131完全培养基制成1×105个/ml细胞悬液，以3×104个/孔细胞密度接种到24孔板，置于37℃、5％CO2培养箱中；待细胞贴壁良好后，弃原培养基，换含1％FBS和不同浓度肉桂醛的基础培养基，对照组为含等量DMSO的不含药培养基，分别在0、24、36、48、72小时收集细胞上清，4℃，1500rpm离心15分钟，取上清于-20℃保存待测。检测方法参考试剂盒操作说明，所述试剂盒为Human VEGF ELISA试剂盒(eBioscience公司)。

7.Western-Blot方法检测肉桂醛诱导HUVECs各蛋白表达

取对数生长期的原代人脐静脉内皮细胞(HUVECs)，用MCDB131完全培养基制成1.5×105个/ml细胞悬液，以3×105个/孔细胞密度接种到6孔板，置于37℃、5％CO2培养箱中；待细胞贴壁良好后，弃原培养基，换含1％FBS的基础培养基饥饿两个小时，再加入不同浓度药物，分别作用不同时间后提取蛋白；弃原培养基，马上用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后将残液完全吸净，加入裂解液(90μl/孔)，冰上放置15分钟(每隔5分钟震摇培养板一次以便细胞裂解完全)；将裂解匀浆收集于1.5ml EP管中，4℃，12000rpm离心10分钟，取上清；取少量蛋白用于蛋白浓度测定，其余大部分蛋白加入上样缓冲液，煮沸5分钟变性，于-20℃保存待测。以每孔等量蛋白上样于10％SDS-PAGE，电泳分离后将蛋白转至PVDF膜，用相应的单克隆抗体检测，以β-actin作为内参。实验结果以目标蛋白与β-actin蛋白表达量比值表示。

(二)实验结果

1.肉桂醛对HUVECs增殖的影响结果

肉桂醛能够显著地诱导HUVECs增殖，加药处理24小时后，采用CCK-8法检测细胞增殖情况并计算细胞增殖率。结果如图1A显示，肉桂醛可呈浓度依赖性地促进HUVECs增殖，在10μM时增殖率达到33％。继而进一步观察肉桂醛是否呈时间依赖性地促进HUVECs增殖，结果如图1B，活细胞数目可随时间(6～24小时)依次增加。以上实验结果如图显示，肉桂醛呈现时间和浓度依赖性的促进内皮细胞增殖。

2.肉桂醛对HUVECs损伤愈合的影响结果

细胞划痕结果如图2A和图2B显示，加药处理受损细胞24小时后，肉桂醛在0.1μM时能够显著地促进细胞损伤愈合，愈合率达到54.1％，而此时对照组则仅为40.4％；当10μM浓度时，损伤细胞已经完全愈合。细胞爬片实验进一步证明肉桂醛的这一能力，如图2C所示，肉桂醛于1μM可显著提高细胞数量，为对照组的1.15倍。提示，肉桂醛能够诱导内皮细胞损伤愈合且呈浓度依赖性。

3.肉桂醛对HUVECs迁移的影响结果

内皮细胞迁移是促进血管形成因子和抑制血管形成因子相互作用的复杂的过程，其表现了细胞的运动能力。结果如图3所示，与对照组相比，肉桂醛可显著地诱导HUVECs迁移，在浓度为0.1,1,5和10μM时，迁移到膜下的细胞数分别为22,28,35,33个/视野。提示肉桂醛能够诱导内皮细胞迁移。

4.肉桂醛对HUVECs管腔形成的影响结果

体外血管新生主要通过内皮细胞增殖、迁移及管腔形成等几个步骤，管腔形成是其中最为关键的一步。如图4所示，与对照组相比，肉桂醛可显著地诱导HUVECs管腔形成，于10μM时，管腔结构数目比对照组增加35％(P<0.001)。提示肉桂醛能够促进内皮细胞管腔结构形成并呈现浓度依赖关系。

5.肉桂醛诱导HUVECs分泌VEGF

VEGF是重要的促血管生成因子，在血管新生过程中发挥了关键的调控作用。ELISA检测结果显示(如图5)，肉桂醛呈现时间和浓度依赖性的诱导内皮细胞分泌VEGF。

6.肉桂醛对PI3K/AKT信号通路的影响结果

PI3K/AKT是血管新生过程中一条重要的信号通路，主要维持内皮细胞生存与增殖。肉桂醛对HUVECs胞内PI3K/AKT信号通路的影响结果显示，肉桂醛诱导AKT及其下游蛋白eNOS磷酸化呈现时间和浓度依赖关系。如图6B所示，肉桂醛于5分钟时诱导AKT磷酸化直至120分钟。同时其可诱导AKT下游信号分子eNOS于5分钟时磷酸化直至60分钟(图6D)。如图6A和图6C所示，随着肉桂醛浓度的增加(1～10μM)，AKT、eNOS的磷酸化水平依次提高。提示肉桂醛能够显著性地激活PI3K/AKT信号通路。

7.肉桂醛对MAPK信号通路的影响结果

血管新生的另一条主要通路为MAPK信号通路，其包括：Erk1/2信号通路、p38信号通路和JNK/SPAK信号通路。如图7B和图7D所示，肉桂醛于5分钟显著诱导c-Raf磷酸化直至120分钟，而微弱诱导c-Raf下游信号分子Erk1/2直至120分钟。同时，随着肉桂醛浓度的增加(1～10μM)，c-Raf、Erk1/2的磷酸化水平依次提高(图7A和图7C)。如图8F所示，肉桂醛于5分钟显著诱导p38磷酸化直至120分钟。然而其磷酸化水平并未因浓度的增加而改变(图7E)。对于JNK/SAPK信号通路，肉桂醛对其没有任何影响。提示肉桂醛能够显著性地激活c-Raf/MEK/Erk1/2信号通路。

8.PI3K/AKT和Raf/MEK/Erk1/2信号通路参与肉桂醛调节体外血管新生过程

为进一步证明PI3K/AKT和Raf/MEK/Erk1/2信号通路与肉桂醛调节体外血管新生过程相关，我们采用PI3K抑制剂LY294002和MEK抑制剂U0126，观察其对肉桂醛诱导体外血管新生的影响。如图8A和图8B所示，LY294002和U0126能够明显抑制HUVECs增殖和分泌VEGF。同时，图8C和图8D显示，LY294002和U0126可抑制HUVECs管腔形成。此外，如图8E所示，LY294002可阻断肉桂醛诱导AKT磷酸化而对肉桂醛诱导Erk1/2磷酸化没有影响。如图8F所示，U0126可阻断肉桂醛诱导Erk1/2磷酸化而对肉桂醛诱导AKT磷酸化没有影响。由以上结果得出，PI3K/AKT和Raf/MEK/Erk1/2信号通路与肉桂醛调节体外血管新生过程相关，但两条通路之间并没有直接的相互介导作用。

实施例2肉桂醛促进血管新生体内实验

(一)实验方法

1.实验动物

野生型(C57BL/6)小鼠，雄性，体重18-22g；糖尿病型(BSK.Cg-m+/+Leprdb；db/db)小鼠，雄性，体重55-60g，血糖值27.3±0.6mmol/L，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。

2.动物模型建立

小鼠经戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，用宠物剃毛器逆毛方向背部剃毛，大约露出4cm见方大小的皮肤(尽量把毛剃到最短，但不能伤及皮肤)，随后均匀涂抹脱毛膏在空白皮肤处，2分钟后，用酒精棉球擦拭，以便除净小鼠背部的毛；利用消毒后的角膜环钻在小鼠背部打一圆孔，切取8mm直径大小的圆形皮肤，即形成皮肤损伤模型。

3.动物分组及给药

分别将造模后的64只C57小鼠和64只db/db小鼠均随机分为4组，每组16只，分别为100mg/kg肉桂醛给药组(高剂量组)、50mg/kg肉桂醛给药组(中剂量组)、25mg/kg肉桂醛给药组(低剂量组)、生理盐水组(对照组)；将小鼠分笼喂养(4只/笼)，每天腹腔注射给药。

4.取材

分别于给药后第6天和第12天，每组随机挑选四只小鼠脱颈处死，切取伤口组织，将其平均分配成两个部分：一部分用于免疫组织学实验，置于4％多聚甲醛中固定；另一部分用于免疫印迹实验，-80℃保存。

5.指标检测

(1)伤口直径

隔天给小鼠背部伤口拍照，利用Image J图像分析软件测量伤口直径大小并计算损伤愈合率。愈合率(％)＝(1-第n天伤口直径大小/第0天伤口直径大小)×100％(n为拍照当天)。

(2)免疫印迹法测损伤组织VEGF蛋白表达

称取-80℃冻存的皮肤组织，尽可能剪成小碎块，装入1.5mlEP管中，按比例加入组织蛋白裂解液(含有蛋白酶抑制剂)，用电动组织匀浆仪将其研碎(冰上操作，以防蛋白变性)；4℃，12000rpm离心10分钟，吸取上清，取少量蛋白用于蛋白浓度测定，其余大部分蛋白加入上样缓冲液，煮沸5分钟变性，于-20℃保存待测。以每孔等量蛋白上样于10％SDS-PAGE，电泳分离后将蛋白转至PVDF膜，用相应的单克隆抗体检测，以β-actin作为内参。实验结果以目标蛋白与β-actin蛋白表达量比值表示。

(二)实验结果

1.肉桂醛加速小鼠皮肤伤口愈合实验

血管新生是伤口愈合过程中一个关键的环节，而伤口愈合不良是糖尿病的严重并发症之一，其根本原因是由于血管新生不充足。本实验分别对肉桂醛是否能够促进野生型小鼠和糖尿病小鼠皮肤损伤愈合进行考察。结果显示，野生型小鼠皮肤伤口愈合速度(12天)明显高于糖尿病小鼠(22天)。当腹腔注射肉桂醛后，小鼠皮肤伤口愈合速度显著提高。野生型小鼠皮肤伤口在给药10天后达到完全愈合，而糖尿病小鼠则需要16天。对于野生型小鼠，在给药第4天，加药组的伤口面积明显比对照组小。如图9A所示，低剂量组伤口愈合率(47％)与对照组(36％)相比(P<0.01)，中剂量组(58％)与对照组(36％)相比(P<0.001)，高剂量组(59％)与对照组(36％)相比(P<0.001)。而对于糖尿病小鼠(图9B)，在第4天，低剂量组与对照组伤口愈合率无显著性差异，中剂量组(49％)与对照组(18％)相比(P<0.001)，高剂量组(50％)与对照组(18％)相比(P<0.001)。

2.组织学观察小鼠皮肤伤口愈合情况

为更好的证明肉桂醛加速小鼠皮肤伤口愈合的活性，本实验采用H&E染色观察小鼠皮肤伤口愈合的组织学效应。如图10，第10天病理组织切片显示，糖尿病对照组小鼠皮肤缺损面积仍然很大，仅有少量表皮覆盖且连续性较差，有大量的肉芽组织存在；而野生型对照组小鼠皮肤缺损面积很小，大量表皮覆盖，可见瘢痕组织，有少量的肉芽组织。给予肉桂醛以后，糖尿病小鼠伤口表皮基本覆盖但较薄，仍有肉芽组织存在；而野生型小鼠伤口完全修复，肉芽组织消失。结果显示，肉桂醛能够良好地修复小鼠皮肤伤口愈合过程。

3.肉桂醛对小鼠皮肤伤口组织血管新生的影响

为观察肉桂醛是否能够促进小鼠皮肤伤口组织血管新生，本实验采用免疫荧光的方法检测血管壁上CD31抗原，从而显示伤口组织的血管新生。如图11所示，在第10天，野生型小鼠伤口组织血管数目(56个/视野)明显多于糖尿病小鼠(33个/视野)(P<0.05)。而给予肉桂醛以后伤口组织血管数目明显增多，野生型小鼠和糖尿病小鼠伤口组织血管数目分别为166个/视野和156个/视野。以上结果显示，肉桂醛可促进野生型小鼠和糖尿病小鼠皮肤伤口组织血管新生。

4.肉桂醛对小鼠皮肤伤口组织VEGF蛋白表达的影响

体外实验结果表明肉桂醛可促进HUVECs分泌VEGF，继而采用动物模型观察肉桂醛是否能够诱导小鼠皮肤伤口组织VEGF蛋白的表达。如图12所示，生理盐水对照组小鼠皮肤伤口组织VEGF表达量高于未受损皮肤组织，提示创伤后的皮肤组织本身会分泌VEGF。当给予肉桂醛后，小鼠伤口组织VEGF表达量均明显升高。结果显示，肉桂醛促进小鼠皮肤伤口愈合与其诱导VEGF蛋白的表达上调相关。

实施例3实验总结

综上所述，本发明通过建立原代人脐静脉内皮细胞(HUVECs)体外培养体系评价了不同浓度的肉桂醛对内皮细胞增殖活性的影响。

1.分别采用CCK-8增殖实验、细胞划痕与爬片实验、Transwell迁移实验及体外成管实验检测肉桂醛诱导体外血管新生的活性。结果显示，肉桂醛于0.01～100μM浓度时可诱导HUVECs增殖、损伤愈合、迁移以及管腔形成，并呈现一定的量效关系。

2.利用酶联免疫吸附法(ELISA)测定HUVECs培养上清中分泌的血管内皮生长因子(VEGF)的含量，结果发现，肉桂醛能够于24～48小时诱导VEGF的分泌量显著增加。

3.蛋白免疫印迹法(Western-blot)检测结果显示，肉桂醛能够激活磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide3-kinase,PI3K)/AKT和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinases,MAPK)两条信号通路，可呈时间和浓度依赖性地上调其中的主要靶蛋白：AKT、内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)、胞外信号调节激酶(extracellular regulated protein kinases1/2,Erk1/2)、c-Raf、p38激酶(p38kinase,p38)；此外，PI3K和MEK特异性抑制剂LY294002和U0126能够阻断肉桂醛诱导AKT和Erk1/2的磷酸化，并且抑制内皮细胞增殖、管腔形成及VEGF的分泌。

4.本发明还采用野生型小鼠和糖尿病小鼠皮肤损伤模型，对肉桂醛促血管新生作用的药效进行了体内验证。结果发现，与对照组相比，每天分别腹腔注射肉桂醛10～100mg/kg后，小鼠皮肤伤口明显缩小(P<0.05)。此外，肉桂醛可通过升高伤口组织VEGF蛋白的表达量并诱导伤口周围组织新血管的形成，从而诱导皮肤损伤愈合，并证实其对小鼠本身没有毒副作用。同时对糖尿病小鼠血糖水平的监测结果表明，肉桂醛诱导糖尿病小鼠皮肤损伤愈合并不依赖于血糖值的变化。

由此可见，肉桂醛在0.01～100μM浓度范围内能够显著诱导体外血管新生，并于10～100mg/kg剂量时加速小鼠皮肤损伤愈合，其作用机制可能与激活PI3K/AKT和MAPK信号通路相关。

实施例4肉桂醛在制备药物中的新用途

本发明通过大量实验研究，发现肉桂醛可用于：

a)促进内皮细胞增殖，

b)促进内皮细胞损伤愈合，

c)促进内皮细胞迁移，

d)促进内皮细胞管腔形成，

e)诱导VEGF表达和分泌，

f)激活PI3K/AKT信号通路，

g)激活c-Raf/MEK/Erk1/2信号通路，和/或

h)促进伤口组织血管数目增加。

因此，肉桂醛在制备促血管新生相关药物中的新用途包括：

第一，制备伤口愈合/创伤愈合/创面愈合药物

创伤愈合包括细胞增殖、迁移及胞外基质沉积等复杂的生物学及分子学过程，其需要良好的动态循环系统、充足的营养，并尽可能避免机械外力的伤害，此过程的顺利完成通常需要3到14天，一般分为三个阶段：炎症阶段、增殖阶段、组织重构阶段。新血管的形成主要发生在增殖阶段，首先成纤维细胞产生胶原基质，随之新生成的血管入侵肉芽组织，最后表皮细胞迁移到损伤表面封闭裂痕组织。众所周知，血管新生是伤口愈合过程的关键阶段，新生的血管可为受损组织的生长传输足够的氧气与营养，同时排泄组织周围细胞代谢所产生的副产物。恢复受损区域的血流量有利于损伤组织的修复，并且皮肤损伤愈合过程易于控制与处理，因此它将是血管新生研究的最理想模型。

慢性创伤是世界上严重的临床疾病之一，其具有较高的发病率却往往缺乏较好的治疗手段。它是一种阻断皮肤连续性和组织完整性的疾病，达到完全愈合需要很长的一段时间(至少8周)，甚至不能愈合或者再次复发。创伤愈合受损将直接导致皮肤溃疡，是一种严重的糖尿病并发症，称之为“糖尿病足”，其原因可能是血管新生不足。据估计，多达两百万美国人都患有下肢伤口不愈疾病。根据疾病控制和预防中心报道，即使在创伤治疗方面已经有所进步，但顽固性创伤仍然导致每年有72000糖尿病人面临截肢。21世纪的今天，糖尿病足每年的增长率在1％到4.1％之间，而截肢增长率在0.21％到0.37％之间。因此，探究有效的治疗手段来攻克因血管新生不足而导致的慢性创伤是目前研究者们的首要任务。

第二，制备冠心病心肌缺血治疗药物

冠心病是在诸如高血压、高血脂症、吸烟、糖尿病、不良饮食习惯和缺乏运动等多种危险因素的作用下，冠状动脉发生并形成粥样硬化病灶，使得管状动脉腔径狭小或阻塞，而引起心肌缺血缺氧直至心肌细胞死亡的严重疾病。目前对冠心病心肌缺血的经典治疗包括：(1)药物治疗。扩张冠状动脉，增加冠脉血供，如硝酸酯类药物；减慢心率，降低血压以减少心肌氧旁路移植术耗，如β受体阻滞剂；抗血小板、抗凝治疗，稳定粥样硬化板块，如低分子肝素等。(2)介入治疗。(3)外科治疗。而促进缺血心肌区域侧枝循环的建立健全和动脉血管的新生，即治疗性血管生成(therapeutic angiogenesis)，是目前国际心血管病学界的研究热点。治疗性血管生成的定义是促进营养性侧枝循环血管的生成，在业已阻塞或狭窄的动脉周围组成内生的旁路循环。它包括血管生成：指心肌内侧枝循环血管(<200um)和毛细血管(<20um)增多；以及动脉新生：指已狭窄或阻塞的心外膜冠状动脉供血区域中新生成较大的动脉血管(>200um)。

心肌缺血或梗死的早期，毛细血管和毛细血管密度增加，内皮细胞或单核细胞活化，随后坏死的心肌细胞和浸润的炎症细胞释放成血管性生长因子(Bfgf、VECF)、细胞因子(MCP-1、IL-6、IL-8)，并且细胞间粘附因子(ICAM)表达的增加，导致内皮细胞和平滑肌细胞有丝分裂增加，最终形成正常肌性动脉。冠脉阻塞后酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)mRNA转录增加，aFGF有活化的单核细胞释放，是内皮、结缔组织和平滑肌细胞的强力有丝分裂原，并能刺激内皮细胞分泌尿纤溶酶原。冠状动脉内或静脉注射重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)亦可加速侧枝循环的建立。血管内皮生长因子(VEGF)是特异性血管内皮细胞有丝分裂原，其mRNA存在于邻近侧枝血管重建或心肌细胞。冠状动脉内注射VEGF可在渐进性冠状动脉阻塞4周后使侧枝循环血流量增加40％。

第三，制备糖尿病皮肤损伤预防/治疗药物

发明还采用野生型小鼠和糖尿病小鼠皮肤损伤模型，对肉桂醛促血管新生作用的药效进行了体内验证。结果发现，与对照组相比，每天分别腹腔注射肉桂醛10～100mg/kg后，小鼠皮肤伤口明显缩小(P<0.05)。此外，肉桂醛可通过升高伤口组织VEGF蛋白的表达量并诱导伤口周围组织新血管的形成，从而诱导皮肤损伤愈合，并证实其对小鼠本身没有毒副作用。同时对糖尿病小鼠血糖水平的监测结果表明，肉桂醛诱导糖尿病小鼠皮肤损伤愈合并不依赖于血糖值的变化。

基于本发明实施例1和2的研究内容，肉桂醛是具有促进血管新生作用的一种活性物质，本领域技术人员可知，对于通过血管新生手段能达到疾病康复或缓解的病理过程，如上述伤口愈合、冠心病心肌缺血或糖尿病皮肤损伤，肉桂醛作为有效成分，在制备促血管新生相关药物方面具有重要的意义。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims (10)

1.肉桂醛作为促进血管新生有效成分在制备血管新生促进剂中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述血管新生促进剂起到下列作用中的一种或多种：

a)促进内皮细胞增殖；

b)促进内皮细胞损伤愈合；

c)促进内皮细胞迁移；

d)促进内皮细胞管腔形成；

e)诱导VEGF表达和分泌；

f)激活PI3K/AKT信号通路；

g)激活c-Raf/MEK/Erk1/2信号通路，和/或

h)促进伤口组织血管数目增加。

3.肉桂醛在制备通过促进血管新生产生治疗作用的药物中的用途。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述药物为促进伤口愈合和/或创伤愈合和/或创面愈合的药物。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述药物为预防和/或治疗糖尿病皮肤损伤的药物。

6.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述药物为促进侧枝血管形成的药物。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述药物为预防和/或治疗冠心病心肌缺血的药物。

8.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述药物经过口服、静脉内、肌内或皮下途径给药。

9.一种通过促进血管新生产生治疗作用的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的有效成分中含有肉桂醛。

10.根据权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，肉桂醛为该药物组合物的唯一有效成分。