JP2006131622A

JP2006131622A - 薬剤

Info

Publication number: JP2006131622A
Application number: JP2005292587A
Authority: JP
Inventors: Kunio Takiguchi; 邦雄瀧口; Hiroyuki Inagawa; 裕之稲川; Chie Kawachi; 千恵河内; Takashi Nishizawa; 孝志西澤; Genichiro Soma; 源一郎杣
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2004-10-05
Filing date: 2005-10-05
Publication date: 2006-05-25

Abstract

【課題】ポステリザンは感染防御作用や創傷治癒作用が臨床的に認められ汎用されている痔疾治療薬である。本製剤の有効成分は大腸菌、黄色ブドウ球菌、レンサ球菌及び緑膿菌の死菌の単独または混合液である。しかし、本成分の詳細な薬理作用機序や有効物質の分子レベルの解析はほとんどなされていないために、至適量不明なままに臨床使用されている。
【解決手段】そこで、今回、我々は本大腸菌死菌浮遊液の薬理作用発現の基礎にあると考えられる、マクロファージが産生する重要なサイトカインであるＴＮＦ誘導活性について、大腸菌死菌浮遊液または混合液を皮膚に投与し、生物活性としてプライミング作用の測定または、ＴＮＦのメッセンジャーＲＮＡで測定出来ることを明らかにし、至適投与量を明らかにした。
【選択図】図１

Description

本発明は、薬剤に関する。

大腸菌死菌は感染防御作用や創傷治癒作用が臨床的に認められ、これを有効成分として配合した薬剤は痔疾治療薬として認可され臨床現場で汎用されている（例．ポステリザン（登録商標）（非特許文献１））。また、大腸菌、ブドウ球菌、レンサ球菌及び緑膿菌の死菌混合液は皮膚炎、湿疹、熱傷、術創及び膿皮症に有効性が認められるとして、これを有効成分として配合した薬剤は皮膚疾患治療薬として認可され臨床現場で用いられている（例．エキザルベ（登録商標）（非特許文献２、３））。これらは臨床的に極めて有用性の高い薬剤として定評がある。しかしながら、有効成分である大腸菌死菌やブドウ球菌、レンサ球菌、緑膿菌の死菌による該疾患に対する効果発現機構は不明である。しかも、一般に微生物菌体は、複数のたんぱく質、脂質、糖質を始め種々の成分から構成されている。従ってその死菌も複数成分から構成されている。一方薬剤を製造する場合には、単位重量あたりの有効成分量を定め、然る後に用量を定めることが必要となる。本来であれば、大腸菌死菌やブドウ球菌、レンサ球菌、緑膿菌の死菌に含まれる該疾患に有効な成分は同定されているはずであるが、効果発現機構が不明であることに見られるように有効成分は未だに確定していない。そこで、大腸菌死菌やブドウ球菌、レンサ球菌、緑膿菌の死菌を薬剤として用いる場合には、経験的に単位薬剤重量当りの菌体数を定める方法で、薬剤の規格が構成されている。このことは、大腸菌死菌やブドウ球菌、レンサ球菌、緑膿菌の死菌の薬効最適化あるいは副作用防止の観点から好ましいことではない。

本発明者らは、死菌体が示す生物活性として、腫瘍壊死因子誘導などのサイトカイン産生能を指標にとることに注目することで、死菌体数の最適化が計れることに着目した。その結果、現在用いられている死菌体数に比べはるかに少ない用量によって、また、規格として定められている死菌体数に比べ、はるかに少ない菌体数を含む薬剤によって、所定の薬効が発現することを発見し、本発明を完成したものである。
「医薬品インタビューフォーム」、２００４年９月、改訂第３版、日本標準商品分類番号８７２５５９高橋耕一ら、「薬物療法」、１０（８・９）、１２０５頁、１９７７年高橋耕一ら、「エキザルベの薬理作用、薬理と治療」、５（２）、３９７−４０６頁、１９７７年 AkiraS, Takeda K., "Toll-like receptor signaling. Nature Reviews immunology",４：４９９−５１１頁、２００４年杣源一郎、「低分子量型リポ多糖（Pantoea agglomerans）の皮内投与により誘導される抗腫瘍効果に寄与するサイトカインネットワークの動的解析」、薬学研究の進歩、研究成果報告書１６：７−２２頁、２０００年 Yamamoto,A., Nagamuta, M., Usami, H., Sugawara, Y., Watanabe, N., Niitsu, Y., Urushizaki,I. " Release of tumor necrosis factor (TNF) into mouse peritoneal fluidsby OK-432, a streptococcal preparation " Immunopharmacology, 11: 頁79-86 (1986年). Soma,G-I., Mizuno, D. "Exogenous and endogenous tumour necrosisfactor therapy" Cancer Surveys, 8: 頁837-852 (1989年). Yamasu,K., Shimada, Y., Sakaizumi, M., Soma, G-I., Mizuno, D. "Activation of thesystemic production of tumor necrosis factor after exposure to acute stress"European Cytokine Network, 3: 頁391-398 (1992年). Inagawa,H., Oshima, H., Soma, G-I., Mizuno, D. "TNF induces endogenous TNF invivo: The basis of EET therapy as a combination of rTNF together withendogenous TNF" Journal of Biological Response Modifiers.（Journal of Immunotherapyに誌名変更）7: 頁596-607 (1988年). Nishizawa, T., Inagawa, H., Oshima, H., Okutomi, T., Tsukioka, D.,Iguchi, M., Soma,G-I., Mizuno, D. "Homeostasis as regulated by activatedmacrophage. I., Lipopolysaccharide (LPS) from wheat flour: isolation,purification and some biological activities" Chemical & PharmaceuticalBulletin, 40: 頁479-483 (1992年). Ruff, M.R., Gifford, G. E. "Purification and physicochemicalcharacterization on rabbit tumor necrosis factor" J. Immunol, 125, 頁1671-1677 (1980年).

大腸菌死菌やブドウ球菌、レンサ球菌、緑膿菌の死菌によるサイトカイン産生能を指標とすることで、菌体数を現在使用されている菌体数よりも少なく設定し、薬剤用量の最適化をはかる。このことにより、より安全な薬剤を提供する。

大腸菌死菌やブドウ球菌、レンサ球菌、緑膿菌の死菌体には種々の物質が含まれる。この物質の幾つかは、特異的な受容体を介して細胞からサイトカイン誘導を初めとする細胞応答を誘導することが報告されている（非特許文献４）。これらの受容体のなかで特に注目されるものはトールライク受容体（ＴＬＲ）である。トールライク受容体は病原体に特異的な構成成分の認識に必須の受容体であり、現在ヒトでは、11種類が報告されている。これらのそれぞれは、認識する構成成分が異なり、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）はＴＬＲ４に認識され、ペプチドグリカンはＴＬＲ２に認識される。また、細菌の核酸はＴＬＲ９に認識される。

ところで、マクロファージは生体に侵入してきた菌体を最初に異物として識別し、これを除去するために機能する細胞である。この場合、マクロファージは例えば菌体の膜成分、ＬＰＳ、ペプチドグリカン等、例えば核酸などを異物として認識する。この識別に際して機能を果たす受容体がＴＬＲである。その結果、マクロファージ細胞内に情報が伝達される結果、ＮＦ−ｋＢやＡＰ−１等の転写因子が活性化され、サイトカイン群の誘導産生・分泌（（腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターロイキン（ＩＬ）−１β、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、Ｃ−Ｃケモカイン、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン、インターフェロン−α、グラニュロサイトコロニー刺激因子、マクロファージコロニー刺激因子、ファスリガンド、トランスフォーミング増殖因子、神経細胞増殖因子、繊維芽細胞増殖因子等）に至る。本願発明者は、このような所謂異物に対して誘導される生理活性物質のうち、とりわけ腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の特殊性に着目してきた。マクロファージによる異物の識別時には、誘導されるサイトカインの種類によって、誘導される時間経過が異なることが知られている（非特許文献５）。ＴＮＦは、主としてマクロファージが産生するが、異物識別反応において最も初期に誘導産生されるサイトカインでもある。ところでＴＮＦは、その存在状態によって少なくとも、構造の異なる２種類の存在が報告されている。第１は、完全に細胞外に分泌される可溶性タンパク質である。この場合の分子量は１７Ｋｄである。第２は、細胞膜に結合した膜結合型タンパク質である。この場合の分子量は２６Ｋｄである。通常ＴＮＦといえば、第１の状態、即ち可溶性タンパク質、分子量１７Ｋｄの物質を言う。第１、第２のＴＮＦとも生物活性（生物学的応答一般の意味）を持っているが、生物活性は同一ではなく、作用機作も異なる。第２のＴＮＦは第１のＴＮＦと区別するために、通常は膜結合型ＴＮＦ、あるいはプロＴＮＦとも呼ばれる。可溶性ＴＮＦはマクロファージ等の細胞が細菌成分等により強い刺激を受けることで、プロＴＮＦに特異的なメタロプロテアーゼが活性化され、膜に結合しているプロＴＮＦが特定部位で切断されて産生する。

生物個体では、プロＴＮＦがマクロファージ細胞表面に発現することが、感染防除等の生体恒常性維持に重要な意義を持つと考えられる（非特許文献５）。即ち、細胞表面にプロＴＮＦの発現を誘導することができる物質は、生体恒常性維持を図る観点から有効物質である可能性がある。以下、プロＴＮＦが細胞膜上に発現している細胞の状態をプライムド状態と呼び、このように細胞の状態を変化させる作用をプライミング作用、このような作用を持つ物質をプライミング物質と呼ぶことにする。言うまでもないことであるが、プロＴＮＦは異物識別の初期段階に発現する。この性格ゆえに、プロＴＮＦの発現は、サイトカイン等のカスケードを形成するうえで極めて本質的である。そしてサイトカイン等により形成されるカスケードは、創傷治癒に留まらず、胃潰瘍、ウイルス感染、急性疼痛、トキソプラズマ感染症、高脂血症、糖尿病、腫瘍に有効であることが報告されている（非特許文献５）。

以上より、特定の物質による、プロＴＮＦ誘導に関して、用量活性相関が求められれば、ある物質をプロＴＮＦ誘導を指標にして規格化できることにもなる。

例えば、プロＴＮＦはマクロファージ、ナチュラルキラー細胞、好中球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、繊維芽細胞、マスト細胞、血管内皮細胞等に作用し、炎症性エフェクター細胞を集積させ、活性酸素や蛋白分解酵素類による殺菌作用を活性化する他、血管内皮細胞や繊維芽細胞を増殖させることによって、創傷治癒を促進することが知られている（非特許文献５）。そこで、大腸菌死菌やブドウ球菌、レンサ球菌、緑膿菌死菌の規格を、これまでの単なる菌体数によるだけではなく、生物活性としてプロＴＮＦの誘導活性として示すことにより、用量最適化が可能であると着想した。

より具体的には、プロＴＮＦ誘導量は、プロＴＮＦ量が可溶性のＴＮＦ誘導量と相関するこに基づいて、可溶性ＴＮＦをＬ９２９細胞傷害試験で測定した。さらに、プロＴＮＦ誘導量をＴＮＦのｍＲＮＡの相対的誘導量として遺伝子レベルで解析した。その結果、大腸菌死菌やブドウ球菌、レンサ球菌、緑膿菌の死菌の生物活性としてプロＴＮＦ誘導活性（プライミング活性）で評価可能な事が見出された。そして、大腸菌死菌やブドウ球菌、レンサ球菌、緑膿菌の死菌体の菌対数を用いる現在の薬剤規格とは異なって、プライミング活性による大腸菌死菌やブドウ球菌、レンサ球菌、緑膿菌の死菌体の規格化を行って、薬効は同程度に発現するが、単位重量に含まれる大腸菌死菌やブドウ球菌、レンサ球菌、緑膿菌の死菌体数は、より少数でよいことを発見して本発明を完成したものである。

さらに、以上の発見から、大腸菌死菌やブドウ球菌、レンサ球菌、緑膿菌の１回投与あたりの死菌体数はこれまでの薬剤に比べ大幅に少なくても所定の薬効が発現することが明らかである。

本発明の薬剤は１回当たりの投与量として２０００万個から４億個の大腸菌死菌を有効成分として含有することを特徴とする。

好ましくは、１回当たりの投与量として５０００万個から２億個の大腸菌死菌を有効成分として含有することを特徴とする。

また、本発明の薬剤は、製品１グラムあたり、合計２６０万個から２億個の大腸菌死菌、ブドウ球菌死菌、レンサ球菌及び／又は緑膿菌死菌を有効成分として含有することを特徴とする。

好ましくは、製品１グラムあたり、合計２６００万個から２億個の大腸菌死菌、ブドウ球菌死菌、レンサ球菌及び／又は緑膿菌死菌を有効成分として含有することを特徴とする。

また、薬剤形状が軟膏、クリーム、液、ムース、スプレー、ゲル又は固形剤であることが望ましい。

また、使用形態が皮内投与剤、経皮投与剤、浴用剤、坐薬、うがい薬、トローチ、点鼻薬、貼布剤、経肺投与剤又はヘルスケアー剤であることが望ましい。

また、効果又は効能が、痔核若しくは裂肛の症状（出血、疼痛、腫脹及び痒感を含む）の緩解、肛門部手術創、肛門周囲の湿疹若しくは皮膚炎、若しくは軽度な直腸炎の症状の緩解、又は湿潤、びらん、結果を伴うか若しくは二次感染を併発している、湿疹若しくは皮膚炎群（進行性指掌角皮症、ビダール苔癬、放射線皮膚炎及び日光皮膚炎を含む）、熱傷、術創、若しくは湿疹様変化を伴う膿皮症（感染性湿疹様皮膚炎及び湿疹様膿か疹を含む）の緩解であることが望ましい。

本研究により効果発現の至適投与量がわかり、投与量がこれまでの菌数よりも少量で有効なことが明らかとなった。そのために、副作用発現は低減出来る。ポステリザンの副作用としては、掻痒感、便意及び局所不快感などが知られている。エキザルベの副作用としては、皮膚刺激症状、発赤、皮疹憎悪及び湿潤などが知られている。また、投与量が少なくできるので、これまでよりも安価に薬剤を製造することが可能である。

以下、本発明を実施するための最良の形態について詳細に説明する。

ポステリザンやエキザルベに含まれる有効性を示唆する菌体構成成分は生体内でこれらを認識するレセプター群を介して、マクロファージ等に取り込まれ、サイトカインの産生が誘導される。サイトカインはナチュラルキラー細胞、好中球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、繊維芽細胞、マスト細胞、血管内皮細胞等の免疫系細胞に働き生物活性を誘起し、ついで、更にサイトカインの産生が誘導される。これらのいわゆる、サイトカインネットワークを介して生体の免疫系の活性化に働くと考えられる。菌体成分として免疫系を活性化するものとしては糖脂質、多糖、リポ多糖、糖ペプチド、核酸成分が知られている。有効成分は複数より構成された成分よりなるポステリザンやエキザルベを単独の成分の定量化（例えば、特定される糖の含量や、特定の構造を有する脂質の含量）で評価する事は不可能である。そこで、複合的菌体を認識する生体システムを統合的に生物活性として評価する方法として、結果として誘導される生体応答を定量化できる方法を選択すべきであり、ポステリザンやエキザルベによる生体への効果を感染防御、創傷治癒促進が得られる生体応答に着目することが望ましい。

そこで、ポステリザン及びエキザルベに含まれる各種死菌浮遊液の生物活性を評価する方法を実現させるための工夫として、各死菌浮遊液の生物活性をマウスの皮内に投与し、ＴＮＦ誘導能としてプライミング作用を生物活性として測定することとした。実際に医薬品として常用されている菌体数をマウスに投与した場合に示される菌体のプライミング作用はヒトに投与した場合に得られるプラミング作用と相関性があるので、マウスで得られる菌体数とプライミング作用の用量活性相関はそのままヒトに当てはめることができる（非特許文献６，７）。

ポステリザンに含まれる大腸菌死菌浮遊液のプライミング作用評価に基づく、生物活性の検討
マウス皮内投与を用いたＴＮＦプライミング作用による大腸菌浮遊液の生物活性の用量依存性の評価

ポステリザンは軟膏である。そこで、マウスを用いた実験でポステリザンの菌数に伴う生物活性の発現の測定に一定量の軟膏を塗布することになる。しかし、マウスは体中をなめる性質があり、塗布した軟膏を嘗め取ってしまう。それを回避するためには首を固定する等の器具を使わなくてはならないが、それは、マウスにとってストレスである。本実験はストレスに大きく影響を受けるので、マウスを拘束することは好ましくない（非特許文献８）。そこで、我々は、塗布と同等の量を皮内投与法で代替することとした。ポステリザン軟膏には、２．５９×１０^８個／グラムの大腸菌死菌が含まれ、一回の使用量が２グラムとされているので、一回あたりの大腸菌死菌の使用量は２．５９×１０^８個／グラム×２グラム＝５．１８×１０^８個となる。以上に基づき、マウスに皮内投与する大腸菌死菌の菌体数（細胞数）を変化させて、ＴＮＦの産生を調べた。

［実験材料］
大腸菌死菌浮游液の調製：
大腸菌は通常の細菌培養用の寒天培地に塗り広げ、３７℃で培養を行う。寒天培地としては例えば、標準寒天培地やブレインハートインフュージョン寒天培地等を用いることが出来る。出現した一つのコロニーをとり、通常の液体培地、例えばトリプトソーヤブロスややニュートリエントブロス（ベクトンディキンソン）を適当な培養フラスコ、例えば３リットル坂口フラスコなどを用いて行うことが可能である。３７℃にて一晩、振盪培養を行った。培養液にフェノールの終濃度が１−３％になるようにフェノールを加えて大腸菌死菌浮游液を調製した。菌数測定は、例えば、ペトローフ−ハウザーの計算盤や濁度計を用いることが出来る。ペトローフ−ハウザーの計算盤では、培養した一区画に５〜１０個の菌が見えるように希釈した試料を計算盤上にとり、カバーグラスを横からすべらせるようにかける。すなわち、死菌浮遊液を10倍に蒸留水で希釈し、計算盤上にとり、カバーグラスをかけ、数分間静置後、５０区画を数えた。一区画当たりの平均値を求め、1区画５×１０^−５ｍｍ^３なので、２×１０^４を乗じ、さらに希釈倍率を乗じて1ml当たりの死菌数に換算した。

その他試薬：
燐酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ＲＰＭＩ１６４０培地（日研医科学）、牛胎児血清（ギブコ）

装置及び器具：
２４穴培養プレート（住友）、炭酸ガス細胞培養器、プレート分光光度計（バイオラッド）

［方法］
雄性のＢＡＬＢ／ｃマウスの６週齢を静岡実験動物より購入し、２週間の予備飼育を行った後、８週齢で実験に供した。動物は温度、湿度及び照明（明：８時から２０時、暗：２０時から８時、の１２時間の明暗サイクル）が一定に調節された環境の飼育施設で飼育し、飼料としてＣＥ−２（日本クレア）を、飲料水として水道水をオートクレーブ滅菌したものをそれぞれ自由に摂取させた。マウス皮内投与によるＴＮＦ産生におけるプライミング活性の誘導及びその用量依存性についての実験方法は我々が確立した方法を用いた（非特許文献７，９，１０）。大腸菌死菌浮遊液の均一な懸濁液１ｍｌを１．５ｍｌのプラスチックチューブに移し、遠心分離（約６，０００ｇ、１０分間）した。その後、遠心上清０．９ｍｌを分離し試験液原液とし、必要に応じ生理食塩水（生食液）にて希釈し試験液とした。検体として用いる各試験液及びコントロール群の生理食塩水は腹部皮内に投与した。投与後３時間放置し、遊離ＴＮＦを誘導する菌体として用いたピシバニール（ＯＫ−４３２；中外製薬；グラム陽性死菌体）はマウスあたり１ＫＥを尾静脈投与した。その２時間後にマウスを固定後、大腿部動脈より全採血し、３７℃で３０分加温の後遠心分離による血清を得、Ｌ９２９細胞傷害性試験用検体とした。細胞傷害試験は従来の方法（非特許文献１１）に従い実施した。すなわち、トリプシン処理したＬ９２９細胞を８×１０^５細胞／ｍｌの濃度になるように新鮮なイーグルＭＥＭ培地に懸濁し、その１００μｌずつを平底の９６穴プレートの各穴に播いた。その後、６時間炭酸ガス培養器内にて前培養し、その後、５０μｌ／穴の割合で４μグラム／ｍｌの希釈アクチノマイシンＤを添加し、終濃度１μグラム／ｍｌとなるようにした。さらに即座に、検体の血清をＭＥＭ培地で希釈したものを５０μｌ／ｍｌの割合で加え、液量を２００μｌとした。更に、Ｌ９２９細胞を上記条件にて１８時間培養した。細胞傷害活性を測定するために、全培地を除去し、ついで、０．１％クリスタルバイオレットを含む１％メチルアルコールＰＢＳ溶液を加えて１５分間固定染色を行った（クリスタルバイオレットは全有核細胞を染色するが、死細胞は染色後にプレート底面より水洗で除去されるので、生存細胞の結果から細胞傷害性を直接測定できる）。この染色度を５９０ｎｍの吸光度を指標として測定し、対照群に対する染色度と比較することで細胞傷害活性を測定した。活性の定義は以下のように行った。Ｌ９２９細胞が５０％生存（ＥＤ_５０）できる陽性対照のＴＮＦ（ＰＡＣ−４Ｄ；旭化成；蛋白質１ｍグラムあたりの２．４×１０^６単位）の希釈倍率（Ｃ）を求めた。次に、検体のＥＤ_５０を与える希釈倍率（Ｎ）を求めた。これらのデータを元に、以下の式で計算した。
検体活性（Ｕ／ｍｌ）＝Ｎ／Ｃ×２．４×１０^６Ｕ

群構成
コントロール群（生理食塩水−ＯＫ−４３２投与群）、試験検体投与量群（試験検体−ＯＫ−４３２投与群）として投与用量の異なる６群とした。各群は無作為に群分けした各３匹を一群として、マウス一匹あたりに大腸菌死菌を０個、２×１０^６個、２×１０^７個、１×１０^８個、２×１０^８個、４×１０^８個、１×１０^９個を皮内投与した。

［結果］
結果を図１に示した。ポステリザンの主成分である大腸菌死菌浮遊液の生物活性としてＴＮＦ誘導を指標にして、菌数を調べたところ、大腸菌数がマウスあたり２×１０^６個以上でＴＮＦの産生が認められ、２×１０^８個まで増加したが、２×１０^８個から低下する傾向が始まり、１×１０^９個では、効果が低下した。

現在医薬品に使用されているポステリザン軟膏の一回に使用される菌数は５．１８×１０^８個なので、図１で明らかなように、充分プライミング作用が認められるが、低下が始まる範囲の菌数が使用されている事が明らかとなった。本結果からはマウスあたり２×１０^７個から４×１０^８個が含まれていれば市販ポステリザンと同等の生物活性を有する。これは１回の用量が２グラムである薬剤のグラムあたりにすると１×１０^７から２×１０^８個含まれることになる。

実際に医薬品として常用されている菌体数をマウスに投与した場合に示される菌体のプライミング作用はヒトに投与した場合に得られるプラミング作用と相関性があるので、マウスで得られる菌体数とプライミング作用の用量活性相関はそのままヒトに当てはめることができる。

［結論］
本発明者らの方法によれば、プライミング活性を指標にとることにより、マウスあたり大腸菌死菌２×１０^７から４×１０^８個の範囲では、誘導される生物活性は市販のポステリザンと同等であることが明らかとなった。なお、好ましくはマウスあたり、５×１０^７から２×１０^８個である。また、実際に医薬品として常用されている菌体数をマウスに投与した場合に示される菌体のプライミング作用はヒトに投与した場合に得られるプラミング作用と相関性があるので、マウスで得られる菌体数とプライミング作用の用量活性相関はそのままヒトに当てはめることができる。

エキザルベに含まれる死菌体による皮膚局所での効果
エキザルベに含まれる混合死菌浮遊液について、マウスの皮内に投与し、皮膚局所での創傷治癒・感染防御作用を示すＴＮＦ遺伝子が誘導されることを指標に有効菌数を調べた。

マウスを用いた混合死菌浮遊液投与後３時間目の投与部位におけるＴＮＦ誘導の用量依存性

［実験材料］
実験動物：実施例１と同じ。

混合死菌浮游液の調製：まず、以下の各死菌浮遊液を調整した。
大腸菌は通常の細菌培養用の寒天培地に塗り広げ、３７℃で培養を行う。寒天培地としては例えば、標準寒天培地やブレインハートインフュージョン寒天培地等を用いることが出来る。出現した一つのコロニーをとり、通常の液体培地、例えばトリプトソーヤブロスやニュートリエントブロス（ベクトンディキンソン）を適当な培養フラスコ、例えば３リットル坂口フラスコなどを用いて行うことが可能である。３７℃にて一晩、振盪培養を行った。培養液にフェノールの終濃度が１〜３％になるようにフェノールを加えて大腸菌死菌浮游液を調製した。菌数は、ペトローフ−ハウザーの計算盤で測定した。

緑膿菌は通常の細菌培養用の寒天培地に塗り広げ、３７℃で培養を行う。寒天培地としては例えば、標準寒天培地やブレインハートインフュージョン寒天培地等を用いることが出来る。出現した一つのコロニーをとり、通常の液体培地、例えば、市販のトリプトソーヤブロス、ブレインハートインフュージョン培地やニュートリエントブロスを適当な培養フラスコ、例えば３リットル坂口フラスコなどを用いて行うことが可能である。３７℃にて一晩、振盪培養を行った。培養液にフェノールの終濃度が１〜３％になるようにフェノールを加えて緑膿菌死菌浮游液を調製した。菌数は、ペトローフ−ハウザーの計算盤で測定した。（同前）。例えば、ペトローフ−ハウザーの計算盤を用いることが出来る。

ブドウ球菌は通常の細菌培養用の寒天培地に塗り広げ、３７℃で培養を行う。寒天培地としては例えば、標準寒天培地やブレインハートインフュージョン寒天培地等を用いることが出来る。出現した一つのコロニーをとり、通常の液体培地、例えば、市販のトリプトソーヤブロス、ブレインハートインフュージョン培地やニュートリエントブロスを適当な培養フラスコ、例えば３リットル坂口フラスコなどを用いて行うことが可能である。３７℃にて一晩、振盪培養を行った。培養液にフェノールの終濃度が１〜３％になるようにフェノールを加えてブドウ球菌死菌浮游液を調製した。菌数は、ペトローフ−ハウザーの計算盤で測定した。

レンサ球菌は通常の細菌培養用の寒天培地に塗り広げ、３７℃で培養を行う。寒天培地としては例えば、標準寒天培地やブレインハートインフュージョン寒天培地等等を用いることが出来る。出現した一つのコロニーをとり、通常の液体培地、例えば、市販のトリプトソーヤブロス、ブレインハートインフュージョン培地やニュートリエントブロスを適当な培養フラスコ、例えば３リットル坂口フラスコなどを用いて行うことが可能である。３７℃にて一晩、振盪培養を行った。培養液にフェノールの終濃度が１〜３％になるようにフェノールを加えてレンサ球菌死菌浮游液を調製した。菌数は、ペトローフ−ハウザーの計算盤で測定した。

各死菌浮游液を菌数の比率で、大腸菌死菌浮游液：ブドウ球菌死菌浮游液：緑膿菌死菌浮游液：レンサ球菌死菌浮游液が、１０：１０：１：１になるように混合した液を混合死菌浮游液とした。

競合ＤＮＡ：マウスＴＮＦ、β−アクチン
競合ＤＮＡは、それぞれの遺伝子のポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）用プライマーの配列を元に、競合ＤＮＡ調製用のプライマーを合成し（宝酒造）、ラムダＤＮＡをテンプレートとして用いＰＣＲ反応により増幅した。得られた産物を限外濾過精製し、吸光度値から競合ＤＮＡのコピー数を求めた。実際の競合的ＰＣＲには１反応液中に競合ＤＮＡが１０^１〜１０^７コピー含まれるように用いた。

ＰＣＲ用プライマー：ＴＮＦ及びβ−アクチンの各センス（Ｓ）とアンチセンス（Ａ）プライマーは下記に示す。

ＴＮＦプライマー
(PCR 産物 :422塩基対, 競合DNAのPCR産物: 340塩基対)
(S) 5’ AGCACAGAAAGCATGATCCG3’ 20塩基
(A) 5’ GGAGTAGACAAGGTACAACC3’ 20塩基
β-アクチン
プライマー(PCR 産物 :660塩基対, 競合DNAのPCR産物:540塩基対)
(S) 5’CCAACCGTGAAAAGATGACC 3’ 20塩基
(A) 5’ CAGGAGGAGCAATGATCTTG 3’ 20塩基

（５）．その他試薬：
燐酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ＲＰＭＩ１６４０培地（日研医科学）、牛胎児血清（ギブコ）トリゾール試薬（ギブコ）、リバトラエース（東洋紡）、オリゴｄＴ１２−１８（アマシャムファルマシア）、ｒＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造）、アガロースＭＥ（岩井化学）、エチジウムブロマイド（和光純薬）、大腸菌リポ多糖（リスト）

（６）．装置及び器具：
９６穴マルチプレート（住友ベークライト）、炭酸ガス培養器、サーマルサイクラー（システム９６００，パーキンエルマー）、電気泳動装置ミューピッド（コスモバイオ）、ゲル写真撮影装置（フォトダイン）

［方法］
混合死菌浮遊液の投与量の見積もり：
水や油に対する吸収性の低いパラフィン紙にエキザルベを指にて薄く均等に塗布し、パラフィン紙１平方センチの重量を測定した。対照にエキザルベを塗布しないものを測定した。各群１０サンプルを測定した。

死菌浮遊液の前処理：
混合死菌浮遊液中のフェノールを除くために、混合死菌浮遊液を透析した。混合死菌浮遊液２ｍｌを透析チューブに入れ、４０ｍｌのＰＢＳ（−）を外液として、氷冷下、一回につき３時間以上透析した。この操作を４回繰り返し、フェノール含量を１／１０００〜１／２０００（各透析外液のフェノール含量は吸光度測定によりモニター）にし、各検体中のフェノール濃度を０．００１％以下にした。さらにＲＰＭＩ１６４０培地（血清無添加）４０ｍｌで透析し、浮遊液をＰＢＳ（−）から培地に交換した。

マウスへの被検体の投与及び皮膚の摘出：
ＢＡＬＢ／ｃマウス（雄）の腹部の毛を予め投与部位はかみそりで剃り、傷のない皮膚の１０ｍｍ×１０ｍｍの領域をマジックインキで印を記した。透析済みの混合死菌浮遊液はＲＰＭＩ１６４０培地で希釈し、各量の菌数を含むサンプル液を作製し、皮内に皮内針（１／５）を用いて５０μｌの液量を注射した。コントロールでは、ＲＰＭＩ１６４０培地を注射した。投与後３時間目に注射部分を中心とする印を付けてある領域の皮膚を剥離した。直ちに４００μｌのトリゾール試薬中に浸けハサミで細かく切った。総ＲＮＡの抽出はトリゾール試薬添付のプロトコールに従って行い、総ＲＮＡを得た。

逆転写反応、及び競合的ＲＣＲ：
得られた総ＲＮＡの内、４〜５μグラムを用い、オリゴｄＴをプライマーとして、逆転写酵素によりｃＤＮＡを作製した。得られたｃＤＮＡをテンプレートとして各遺伝子について競合的ＰＣＲを行った。競合的ＰＣＲは、これまでの各サイトカインのＰＣＲの条件で、反応溶液に予め調製したコピー数既知の競合ＤＮＡを添加することで行った。ＰＣＲ反応には、テンプレートのｃＤＮＡを総ＲＮＡの２５ｎグラム分に相当する量を用い、１０μｌの反応系で、プライマー５ｐモルを加え、タックＤＮＡポリメラーゼ存在下９４℃、１分加熱の後、９４℃、１分、５５℃、１分、７２℃、１分を１サイクルとしてサーマルサイクラーを用いて、２５サイクル（β−アクチン）、３５サイクル（ＴＮＦ）繰り返し、遺伝子増幅を行った。得られたＰＣＲ産物は、２％の濃度のアガロース電気泳動により分離し、エチジウムブロマイド染色後、写真撮影を行った。対象遺伝子のｍＲＮＡのコピー数は、ｃＤＮＡ中に含まれる対象遺伝子のＰＣＲ産物のバンド強度と、同一のバンド強度を示す競合ＤＮＡのコピー数から推定した。

［結果］
混合死菌浮遊液の投与量の見積もり：
エキザルベは火傷や傷へ塗布剤として用いられるが、生物活性評価実験においては、投与量を正確に調整する必要があるため、皮内注射で行う。皮内注射による混合死菌浮遊液投与量を、塗布剤として使用されるエキザルベに含まれる菌量にあわせて設定するため、まずエキザルベを塗布した場合に塗布部位に存在する菌量を見積もった。測定値を表１に示した。平均増加重量は３．８３ｍグラム／平方センチであった。エキザルベに含まれる菌数が３．３×１０^８個／グラムなので、１平方センチ当たり、おおよそ１×１０^６個の菌が塗布されることになる。
表１エキザルベの塗布量の見積もり

混合死菌浮遊液投与後３時間目の投与部位におけるＴＮＦ誘導の用量依存性：
投与菌数を検討するために、混合死菌浮遊液の皮内投与によるＴＮＦメッセンジャーＲＮＡ誘導の用量依存性について検討を行った。投与液量は通常用いられる皮内投与量である５０μｌとする。皮膚内に投与された菌体・菌体成分は低分子でなければほとんどが５０μｌの皮内投与で出来る水疱部の収まる１０ｍｍ×１０ｍｍ以内の皮膚に限局されるので、投与部位を中心とする１０ｍｍ×１０ｍｍの皮膚を観察することにした。表２に皮膚局所のＴＮＦのメッセンジャーＲＮＡ量のコピー数を未処理の皮膚を１として相対的増加量を示した。混合死菌１×１０^４個の皮内投与で皮膚局所のＴＮＦ量が９倍に増加した。現在市販されているエキザルベは１平方センチあたりの塗布される菌数が１．２６×１０^６個であり、この菌数が本測定方法においても、５２倍のＴＮＦｍＲＮＡを誘導することから、十分な生物活性があることが認められた。また、混合死菌浮遊液１×１０^５個から１×１０^８個ではエキザルベと同等のＴＮＦｍＲＮＡ誘導量が認められた。

表１に示したように、エキザルベの塗布による１平方センチあたりの重量は３．８３ｍグラムであり、菌数は１．２６×１０^６個である。上述のＴＮＦ量が９倍に増加した混合死菌１×１０^４個でよいとすれば、有効菌数は１２６分の１で良いことになる。すなわち、エキザルベに含まれる混合死菌菌数が３．３×１０^８個／グラムなので、２．６×１０^６個／グラム以上含まれていればよい。一方、３．８３ｍｇに１×１０^８個、すなわち、グラムあたりは２．６×１０^１０個でも十分な活性が得られるので、従来技術を除外して本発明は、混合死菌菌数が２．０×１０^８個／グラム以下含まれていればよい。

本発明者らの方法によれば、皮膚局所のＴＮＦのｍＲＮＡ誘導を指標にとることにより、１グラムあたり混合死菌２．６×１０^６個以上２．６×１０^１０個以下含有された範囲で有効であった。このうち、本発明は混合死菌２．６×１０^６個以上２．０×１０^８個以下含有された範囲である。なお、好ましくは誘導される生物活性は市販のポステリザンと同等である１グラムあたり、２．６×１０^７個以上２．０×１０^８個以下である。

表２皮膚（10mm×10mm）内の相対的ＴＮＦメッセンジャーＲＮＡ量

ヒトマクロファージ系細胞株THP-1を用いた大腸菌死菌浮遊液、緑膿菌死菌浮遊液、ブドウ球菌死菌浮遊液、レンサ球菌死菌浮遊液及び混合死菌浮遊液のＴＮＦのｍＲＮＡ誘導効果

［実験材料］
（１）．細胞：THP-1細胞は10％牛胎児血清入りRPMI1640培地で培養（CO₂インキュベータ）した。試験に用いるおおよそ24時間前に培地交換を行った。THP-1細胞を、5×10⁵細胞/穴なるように96穴平底プレートに入れた。
混合死菌浮游液の調製：実施例２と同じ。

競合ＤＮＡ：ヒトＴＮＦ、β−アクチンについて作製した。作成方法は実施例２と同じ。

ＰＣＲ用プライマー：ＴＮＦ及びβ−アクチンの各センス（Ｓ）とアンチセンス（Ａ）プライマーは下記に示す。
ＴＮＦプライマー(PCR
産物 :444塩基対, 競合DNAのPCR産物: 312塩基対)
(S) 5’ GAGTGACAAGCCTGTAGCCCATGTTGTAGCA 3’ 31塩基
(A) 5’ GCAATGATCCCAAAGTAGACCTGCCCAGACT 3’ 31塩基
β-アクチン
プライマー(PCR 産物 :642塩基対, 競合DNAのPCR産物:544塩基対)
(S) 5’GATGACCCAGATCATGTTTGAG 3’ 22塩基
(A) 5’GGAGCAATGATCTTGATCTTCA 3’ 22塩基

（５）．その他試薬：
燐酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ＲＰＭＩ１６４０培地（日研医科学）、牛胎児血清（ギブコ）トリゾール試薬（ギブコ）、リバトラエース（東洋紡）、オリゴｄＴ１２−１８（アマシャムファルマシア）、ｒＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造）、アガロースＭＥ（岩井化学）、エチジウムブロマイド（和光純薬）

（６）．装置及び器具：
２４穴プレート（住友ベークライト）、９６穴マルチプレート（住友ベークライト）、炭酸ガス培養器、サーマルサイクラー（システム９６００，パーキンエルマー）、電気泳動装置ミューピッド（コスモバイオ）、ゲル写真撮影装置（フォトダイン）

[実験方法]
各種死菌浮遊液の前処理：実施例２と同じ。

ＴＨＰ−１細胞の調製と各種死菌処理
THP-1細胞をＲＰＭＩ１６４０培地(培地)で洗浄し、さらに５％ＦＢＳ入り培地を用いて１×１０^６細胞／ｍｌに調製し、０．５ｍｌ（５×１０^５細胞／穴）を２４穴プレートに加え培養した。透析した大腸菌、ブドウ球菌、レンサ球菌及び緑膿菌死菌浮遊液、及び混合死菌浮遊液をTHP-1細胞の培地に添加し、３時間５％ＣＯ_２インキュベータ中で培養した。

各死菌浮遊液は１×１０^８個／ｍｌの濃度で使用した。培地のみを添加したものを無刺激コントロールとした。

添加３時間後に培地を除き、ＰＢＳで洗浄後、ＴＲＩｚｏｌ４００μｌを加え、添付の方法に従い総ＲＮＡを抽出した。

逆転写反応、及び競合的ＲＣＲ：実施例２と同じ。

[結果]
ＴＨＰ−１細胞を用いた各種死菌浮遊液及び混合死菌浮遊液のＴＮＦｍＲＮＡ誘導能を、無刺激コントロールを1とした場合の誘導倍率として表３に示した。

ＴＨＰ−１は、各死菌浮遊液及び混合死菌浮遊液共に、無刺激コントロールよりＴＮＦｍＲＮＡの誘導倍率が増加していることから各死菌浮遊液及び混合死菌浮遊液共に誘導効果があることがわかり、各死菌浮遊液も混合死菌浮遊液と同様に効果があることがわかった。

表３ＴＨＰ−１細胞の各種死菌浮遊液及び混合死菌浮遊液のＴＮＦｍＲＮＡの誘導作用

ＴＮＦプライミング作用による大腸菌浮遊液の生物活性の用量依存性を示す図である。

Claims

１回当たりの投与量として２０００万個から４億個の大腸菌死菌を有効成分として含有することを特徴とする薬剤。
１回当たりの投与量として５０００万個から２億個の大腸菌死菌を有効成分として含有することを特徴とする薬剤。
製品１グラムあたり、合計２６０万個から２億個の大腸菌死菌、ブドウ球菌死菌、レンサ球菌及び／又は緑膿菌死菌を有効成分として含有することを特徴とする薬剤。
製品１グラムあたり、合計２６００万個から２億個の大腸菌死菌、ブドウ球菌死菌、レンサ球菌及び／又は緑膿菌死菌を有効成分として含有することを特徴とする薬剤。
薬剤形状が軟膏、クリーム、液、ムース、スプレー、ゲル又は固形剤であることを特徴とする請求項１乃至４いずれかに記載の薬剤。
使用形態が皮内投与剤、経皮投与剤、浴用剤、坐薬、うがい薬、トローチ、点鼻薬、貼布剤、経肺投与剤又はヘルスケアー剤であることを特徴とする請求項１乃至５いずれかに記載の薬剤。
効果又は効能が、痔核若しくは裂肛の症状（出血、疼痛、腫脹及び痒感を含む）の緩解、肛門部手術創、肛門周囲の湿疹若しくは皮膚炎、若しくは軽度な直腸炎の症状の緩解、又は湿潤、びらん、結果を伴うか若しくは二次感染を併発している、湿疹若しくは皮膚炎群（進行性指掌角皮症、ビダール苔癬、放射線皮膚炎及び日光皮膚炎を含む）、熱傷、術創、若しくは湿疹様変化を伴う膿皮症（感染性湿疹様皮膚炎及び湿疹様膿か疹を含む）の緩解であることを特徴とする請求項１乃至６いずれかに記載の薬剤。