CN113584177A - 复发难治多发性骨髓瘤标志物的应用 - Google Patents

复发难治多发性骨髓瘤标志物的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了复发难治多发性骨髓瘤标志物的应用。本发明首次发现肠道中弗氏柠檬酸杆菌的相对丰度/绝对丰度和血清中NH4 +含量可以作为预测和诊断多发性骨髓瘤患者复发难治的标志物，以及呋塞米钠可以应用于MM的治疗。本发明发现弗氏柠檬酸杆菌和NH4 +可以促进MM对临床一线用药硼替佐米(Bortezomib，BTZ)的耐药，本发明还公开了呋塞米钠对MM的进展具有抑制作用，对于多发性骨髓瘤的基础研究和临床治疗具有重要意义。

Description

复发难治多发性骨髓瘤标志物的应用
技术领域
本发明涉及生物技术、疾病诊断和生物医药领域，具体涉及多发性骨髓瘤的肠道微生物标志物和血清标志物的应用，以及呋塞米钠在制备多发性骨髓瘤治疗药物中的用途，以及呋塞米钠治疗多发性骨髓瘤的机制。
背景技术
多发性骨髓瘤(Multiple Myeloma，MM)是一种常见于中老年人血液系统的克隆浆细胞异常增殖的恶性肿瘤，是血液系统恶性肿瘤的第二大肿瘤，其发病率约为2～3人/10万人。随着我国人口老龄化不断增长，MM发病率呈明显上升趋势。
近二十年随着蛋白酶体抑制剂、免疫调节剂等新药的不断问世及自体造血干细胞移植的广泛开展，MM的治疗得到不断改进和完善，大多数MM患者可获得较好的缓解，中位生存期可达到5-7年。尽管治疗手段不断发展，MM患者最终出现耐药和复发，严重威胁中老年人群的生命健康。目前的研究表明肠道微生态失衡与肿瘤发生发展及药物治疗有密切关系。因此，充分认识肠道微生物与MM耐药的关系，必将改善MM的药物耐受，为提高MM治疗疗效提供新策略，为阐明MM耐药新机制及研发临床预警的标志物提供全新的思路。
本发明前期利用宏基因组测序检测了21例健康对照、30例初诊MM患者和17例复发难治MM患者粪便样本，发现弗氏柠檬酸杆菌显著在复发难治MM患者样本中显著富集，利用qPCR验证也得出同样的结果，此外利用动物体内实验也证实弗氏柠檬酸杆菌可以促进MM对硼替佐米的耐药；前期研究结果表明弗氏柠檬酸杆菌属于氮源循环微生物，因此检测了43例初诊MM患者和30例复发难治MM患者血清中铵根正离子，发现在复发难治MM患者血清中铵根正离子含量显著增加，利用动物体内实验也证实铵根正离子可以促进MM对硼替佐米的耐药；本发明前期发现铵根正离子可被袢利尿药呋塞米钠排出体外，利用动物体内实验证实呋塞米钠可以抑制多发性骨髓瘤的增殖和耐药。因此，弗氏柠檬酸杆菌和NH4 +可以作为预测和诊断多发性骨髓瘤患者复发难治的标志物,并且呋塞米钠在MM动物体内的治疗效果对于多发性骨髓瘤的基础研究和临床治疗具有重要意义。
发明内容
本发明提供了特异性的针对复发难治MM的肠道微生物标志物和血清标志物的应用，为临床上预测和诊断MM复发难治奠定了基础，此外，本发明从肠道微生物角度为初诊多发性骨髓瘤和复发难治多发性骨髓瘤患者提供新的治疗方式，证实呋塞米钠对于多发性骨髓瘤治疗的有效性，完善目前多发性骨髓瘤的治疗方案。
本发明的第一方面的目的是提供检测弗氏柠檬酸杆菌的试剂在制备复发难治多发性骨髓瘤诊断制剂中的应用。
所述的弗氏柠檬酸杆菌隶属肠杆菌科(Enterobacteriaceae)枸橼酸杆菌属(Citrobacter)。
进一步地，弗氏柠檬酸杆菌的相对丰度/绝对丰度在复发难治多发性骨髓瘤患者的粪便样本或者肛拭子样本中富集量显著高于初诊患者和正常人。
具体是通过宏基因组测序或qPCR检测待测粪便样本中肠道微生物标志物的绝对丰度/相对丰度。
复发难治多发性骨髓瘤患者的标准按照《中国多发性骨髓瘤诊治指南》(2020年修订)诊断。
本发明的第二方面的目的是提供检测铵根正离子的试剂在制备复发难治多发性骨髓瘤诊断制剂中的应用，所述的铵根正离子化学式:NH4 +。
进一步地，复发难治多发性多发性骨髓瘤患者外周血中NH4 +含量显著高于初诊患者。
具体是通过Berthelot颜色法检测待测血清样本中NH4 +的含量。
复发难治多发性骨髓瘤患者的标准是按照《中国多发性骨髓瘤诊治指南》(2020年修订)诊断。
本发明的第三方面的目的是提供减少多发性骨髓瘤或者复发难治多发性骨髓瘤患者体内弗氏柠檬酸杆菌和/或NH4 +含量的试剂在制备治疗多发性骨髓瘤或者复发难治多发性骨髓瘤的制剂中的应用。
所述的减少多发性骨髓瘤或者复发难治多发性骨髓瘤患者体内弗氏柠檬酸杆菌和/或NH4 +含量的试剂为呋塞米钠。
呋塞米钠有效抑制多发性骨髓瘤疾病进程的方式，是持续有规律地将呋塞米钠灌胃到多发性骨髓瘤小鼠模型体内。
实验结果显示，通过灌胃呋塞米钠的方式，可以有效抑制多发性骨髓瘤的进程，减轻小鼠肿瘤负荷。
本发明的第四方面的目的是提供减少多发性骨髓瘤或者复发难治多发性骨髓瘤患者体内弗氏柠檬酸杆菌和/或NH4 +含量的试剂在制备降低硼替佐米治疗多发性骨髓瘤或者复发难治多发性骨髓瘤患者耐药性制剂中的应用。
所述的减少多发性骨髓瘤或者复发难治多发性骨髓瘤患者体内弗氏柠檬酸杆菌和/或NH4 +含量的试剂为呋塞米钠。
本发明的第五方面的目的是提供减少多发性骨髓瘤或者复发难治多发性骨髓瘤患者体内弗氏柠檬酸杆菌和/或NH4 +含量的试剂在制备抑制多发性骨髓瘤细胞增殖药物中的应用。
所述的减少多发性骨髓瘤或者复发难治多发性骨髓瘤患者体内弗氏柠檬酸杆菌和/或NH4 +含量的试剂为呋塞米钠。
所述呋塞米钠(Furosemide sodium,Fus)化学名称为2-[(2-呋喃甲基)氨基]-5-(氨磺酰基)-4-氯苯甲酸钠，分子式：C12H10ClN2NaO5S。
本发明第六方面的目的是提供呋塞米钠在制备抑制多发性骨髓瘤细胞摄取外源性铵根正离子的制剂中的应用。
本发明第七方面的目的是提供呋塞米钠在制备将体内铵根正离子排出体外和抑制肠道内铵根正离子进入血液的制剂中的应用。
本发明实验结果显示，弗氏柠檬酸杆菌可以产生铵根正离子，进一步铵根正离子进入体内被多发性骨髓瘤细胞利用，从而促进多发性骨髓瘤细胞的增殖和耐药，呋塞米钠通过抑制多发性骨髓瘤细胞对外源性铵根正离子的摄取，并将铵根正离子排出体外，从而抑制多发性骨髓瘤细胞的增殖和耐药，进而进一步用于治疗多发性骨髓瘤。本发明的研究结果具有很好的应用前景。
本发明优势：
(1)本发明中预测和诊断多发性骨髓瘤患者复发难治标志物的筛选经过大量实验验证，能够准确预测和诊断多发性骨髓瘤患者是否会出现复发难治；
(2)本发明中使用肠道微生物和血清标志物联合预测和诊断多发性骨髓瘤患者复发难治，使结果能够更加准确；
(3)本发明为临床上预测和诊断多发性骨髓瘤复发难治提供了一种新的策略；
(4)本发明中发现呋塞米钠能作为治疗多发性骨髓瘤的制剂；
(5)本发明中呋塞米钠的应用经过动物体内实验验证，能够准确反映呋塞米钠的治疗效果；
(6)本发明中呋塞米钠的作用机制具有实验支持，为呋塞米钠的临床应用提供了科学依据；
(7)本发明为临床上治疗多发性骨髓瘤提供了一种新的策略，丰富现有的治疗方案。
下面将结合辅图和实施例对本发明的实施方案进行详细说明。除另外定义，本文中所用的科技术语均为本发明领域普通技术人员通常所理解的含义。本文中所用的命名和实验方法是公知的，且在所属领域中常规使用。使用标准技术进行的所用操作通常是根据仪器耗材生产商的产品说明书和常规技术要求及本文中提供的参考资料进行的。需要注意的是，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围限定。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为本发明的保护范围。
附图说明
图1.三组样本中显著差异的肠道微生物。
图2.复发难治多发性骨髓瘤患者粪便中富集的3种差异微生物经qPCR验证结果。
图3.铵根正离子在复发难治多发性骨髓瘤血清中显著升高结果。
图4.弗氏柠檬酸杆菌促进多发性骨髓瘤对硼替佐米的耐药结果。
图5.铵根正离子促进多发性骨髓瘤细胞对硼替佐米的耐药结果。
图6.铵根正离子促进多发性骨髓瘤对硼替佐米的耐药结果。
图7.弗氏柠檬酸杆菌产生铵根正离子结果。
图8.复发难治多发性骨髓瘤患者粪便中弗氏柠檬酸杆菌的相对丰度与血清中铵根正离子呈正相关结果。
图9.呋塞米钠抑制多发性骨髓瘤的增殖和耐药结果。
图10.呋塞米钠将铵根正离子排出体外结果。
图11.呋塞米钠抑制肠道内铵根正离子进入血液结果。
具体实施方式
实施例1：健康对照、初诊多发性骨髓瘤患者和复发难治多发性骨髓瘤患者粪便样本的收集保存与DNA提取
在实施例中，遵守相关伦理要求共获取了21例健康供者(Health control,HC)、30例初诊多发性骨髓瘤患者(At diagnosed,AD)和17例复发难治多发性骨髓患者(Relapsedmultiple myeloma,RM)的粪便样本，所有标本来自于中南大学附属湘雅医院、中南大学附属湘雅三医院、湖南省人民医院和中国医学科学院天津血液病医院。所有多发性骨髓瘤患者均经检测血清单克隆免疫球蛋白类型和骨髓浆细胞比例确诊为多发性骨髓瘤患者。复发难治多发性骨髓瘤患者的诊断标准按照《中国多发性骨髓瘤诊治指南》(2020年修订)诊断，患者初诊时的治疗方案皆以硼替佐米为基础治疗药物。健康供者的年龄、性别和体重指数与多发性骨髓瘤患者相匹配，以排除年龄、性别和体重指数导致的微生物差异。
获取三组新鲜的待测粪便标本后，在超净工作台中立即用无菌棉签蘸取中间部位的粪便，放入无菌冻存管中，并于液氮中立即速冻后放入-80℃冰箱长期保存，对于肛拭子样本直接放入无菌冻存管中，并于液氮中立即速冻后放入-80℃冰箱长期保存。
使用美基(Magen)公司的粪便微生物DNA提取试剂盒(HiPure Stool DNA Kits，D3141-02)参照说明书提取粪便样本中总微生物DNA，并于-20℃保存待用。为了检测所提取的总微生物DNA的质量，使用Nanodrop测定DNA的浓度以及OD 260/280和OD 260/230数值，并配制1％琼脂糖凝胶，点样500ng DNA，于DNA电泳槽中100V电压下跑胶20min，在蓝光灯下观察DNA是否降解。
实施例2：健康对照、初诊多发性骨髓瘤患者和复发难治多发性骨髓瘤患者粪便样本宏基因组测序及差异微生物分析
利用华大测序公司测序平台Illumina HiSeq 2500对所提取DNA样品完成宏基因组双端测序。首先对测序数据进行筛选过滤，通过软件Trimmomatic将原始序列中的低质量序列去除，随后利用Bowtie2参照hg38基因组去除原始序列中的人类基因组序列，以保留高质量的微生物序列读段。然后将筛选后的序列进行物种注释，利用Kraken软件和Kraken标准数据库可对筛选后的序列进行物种分类注释，得到每个样本中种水平的丰度矩阵(利用Kraken软件比对得到各菌种的读段数量被认为是绝对丰度)。最后，利用R包DESeq2和vegan分别对三组样本的物种多样性进行分析比较，最终筛选识别三组样本中显著差异的微生物。
对实施例1中三组样本(HC,AD,RM)进行宏基因组测序，对测序结果进行处理和分析，分析结果显示，在菌种水平上，利用R包DESeq2共识别了57个丰度显著差异的菌种，其中3个在RM样本中显著富集，分别是弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii，CFr)、解鸟氨酸拉乌尔菌(Raoultella ornithinolytica,ROr)和产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca,KOx)(图1)，这些显著差异的菌种均可作为复发难治MM的潜在微生物标志物。
实施例3：荧光定量PCR(qPCR)检测初诊和复发难治多发性骨髓瘤患者粪便样本中差异微生物的相对丰度
为排除由宏基因组测序和生信分析过程中所导致的偏差，进一步收取26例AD患者和21例RM患者粪便样本，通过qPCR对实施例2中识别的3个在复发难治多发性骨髓瘤患者粪便样本中显著富集的菌种进行进一步验证。首先，在NCBI数据库中找到差异菌种的16SrDNA基因序列，对细菌16S rDNA可变区进行引物设计，所设计完成的引物利用TestPrime工具(https://www.arb-silva.de)查看该引物的细菌覆盖率，覆盖率越低，代表引物的特异性越高，最终选取覆盖率最低的引物进行合成。由于只研究与HC和AD相比，在RM中富集的差异微生物，因此本例中只对3个菌种进行了验证(表1)。此外，本例中除了需要差异菌种引物外，还需要一对通用引物，该引物可实现对尽可能多的菌种的16S rDNA扩增(Maeda H,etal.Quantitative real-time PCR using TaqMan and SYBR Green for Actinobacillusactinomycetemcomitans,Porphyromonas gingivalis,Prevotella intermedia,tetQgene and total bacteria.FEMS Immunology&Medical Microbiology.2003,39:81-86)。其次，按照实施例1提取粪便样本中的总微生物DNA，通过qPCR进一步检测扩大样本中3种差异微生物的相对丰度。结果显示，仅有1个菌种呈现显著差异(Unpaired T-test，P<0.05)，弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)在RM组显著富集(图2)。实验结果表明，将这1个差异微生物作为复发难治MM的微生物标志物可能会更加准确。
qPCR检测粪便样本中差异微生物的相对丰度的实验方法及步骤：首先通过梯度退火温度PCR，确定各菌种引物的最佳退火温度；然后以每个样本所提DNA作为模板，分别用每个差异菌种的特异引物进行qPCR，并记录每个菌种对应引物的循环数(Ct值)；最后计算每个样本中各差异菌种的相对丰度，任意菌种i的相对丰度(Relative abundance,Ra)可公式表示为：Ra(i)＝(1/2)^(Cti－Ctc)，其中Cti表示菌种i的循环数，Ctc表示通用引物的循环数。
梯度退火温度PCR反应体系如下：
Figure BDA0003263540900000071
共计20μL。在Biorad PCR仪上按下述反应条件完成PCR扩增：94℃预变性3min；94℃变性30s，梯度退火温度(50℃-60℃)15s，72℃延伸20s，32个循环；72℃再延伸3min。配制1％的琼脂糖凝胶，PCR扩增产物点样10μL，于DNA电泳槽中100V电压下跑胶20min，在蓝光灯下观察各个退火温度的条带特异性及亮度，确定各细菌引物的退火温度。
qPCR反应体系如下：
Figure BDA0003263540900000072
共计20μL。qPCR反应条件为：1)50℃孵育2min；2)95℃预变性2min；3)95℃变性15s、56℃退火15s、72℃延伸1min，并重复40个循环；4)熔解曲线分析，默认程序。
表1.实施例3中涉及的3个差异菌种16S rDNA的引物
Figure BDA0003263540900000081
注:“覆盖率”是指该引物匹配的菌种占所有菌种的比例，占比越低说明该引物的特异性越高；Total Bacteria表示可用作代表所有细菌16S rDNA的引物，即通用引物。
实施例4：初诊多发性骨髓瘤患者和复发难治多发性骨髓瘤患者血清中铵根正离子的含量
在实施例中，遵守相关伦理要求共获取了43例初诊多发性骨髓瘤患者(Atdiagnosed,AD)和30例复发难治多发性骨髓患者(Relapsed multiple myeloma,RM)的血清样本，所有标本来自于中南大学附属湘雅医院、中南大学附属湘雅三医院、中国医学科学院天津血液病医院。所有多发性骨髓瘤患者均经检测血清单克隆免疫球蛋白类型和骨髓浆细胞比例确诊为多发性骨髓瘤患者。复发难治多发性骨髓瘤患者初诊时的治疗方案皆以硼替佐米为基础治疗药物。患者均为清晨空腹状态采血。所有样品均保存在-80℃待用。
使用南京建成生物工程研究所的血氨测定试剂盒(A086-1-1)参照说明书检测血清样本中铵根正离子的含量。
检测结果显示，铵根正离子在复发难治MM患者血清中显著升高(图3)，统计方法采用Unpaired T-test。这一结果表明铵根正离子可作为复发难治MM的潜在血清标志物。
实施例5：弗氏柠檬酸杆菌在小鼠肠道中对硼替佐米疗效的影响
为了模拟多发性骨髓瘤肿瘤进展，采用C57BL/KaLwRij小鼠构建多发性骨髓瘤动物模型(5TGM1小鼠MM模型)。将20只小鼠随机分为4组，每组5只，分别为PBS组、CFr组、硼替佐米组(BTZ组)和CFr+BTZ组。PBS组：使用四联抗生素(氨苄青霉素0.2g/L，新霉素0.2g/L，甲硝唑0.2g/L，万古霉素0.1g/L)水饲小鼠2周，随后换为正常饮用水并灌胃PBS，频率为1周3次，灌胃1周后通过尾静脉注射1×106个带荧光素酶报告基因的5TGM1细胞(5TGM1-Luc)，1周后腹腔注射PBS，频率为1周3次；CFr组：使用四联抗生素(氨苄青霉素0.2g/L，新霉素0.2g/L，甲硝唑0.2g/L，万古霉素0.1g/L)水饲小鼠2周，随后换为正常饮用水并灌胃弗氏柠檬酸杆菌(2×108/200μL)，频率为1周3次，灌胃1周后通过尾静脉注射1×106个带荧光素酶报告基因的5TGM1细胞(5TGM1-Luc)，1周后腹腔注射PBS，频率为1周3次；BTZ组：使用四联抗生素(氨苄青霉素0.2g/L，新霉素0.2g/L，甲硝唑0.2g/L，万古霉素0.1g/L)水饲小鼠2周，随后换为正常饮用水并灌胃PBS，频率为1周3次，灌胃1周后通过尾静脉注射1×106个带荧光素酶报告基因的5TGM1细胞(5TGM1-Luc)，1周后腹腔注射硼替佐米(0.75mg/kg)，频率为1周3次；CFr+BTZ组：使用四联抗生素(氨苄青霉素0.2g/L，新霉素0.2g/L，甲硝唑0.2g/L，万古霉素0.1g/L)水饲小鼠2周，随后换为正常饮用水并灌胃弗氏柠檬酸杆菌(2×108/200μL)，频率为1周3次，灌胃1周后通过尾静脉注射1×106个带荧光素酶报告基因的5TGM1细胞(5TGM1-Luc)，1周后腹腔注射硼替佐米(0.75mg/kg)，频率为1周3次。水饲抗生素前和细胞注射前收集小鼠粪便标本，注射细胞后第6周进行活体成像和面颊采血。
动物实验结果显示，每周3次单独注射硼替佐米(0.75mg/kg)可以有效延缓多发性骨髓的疾病进展，但每周3次注射硼替佐米(0.75mg/kg)辅以弗氏柠檬酸杆菌灌胃(2×108/200μL)未能延缓多发性骨髓的疾病进展，表明弗氏柠檬酸杆菌促进MM对硼替佐米的耐药(图4)。这一结果为弗氏柠檬酸杆菌作为预测和诊断多发性骨髓患者复发难治的肠道微生物标志物提供有力证据。
实施例6：铵根正离子对多发性骨髓瘤细胞耐药的影响
目前，硼替佐米(Bortezomib，BTZ)仍是临床上治疗多发性骨髓瘤的一线用药，它的面世将多发性骨髓瘤患者的中位生存期由3-5年提高到5-7年。然而，绝大部分患者最终都会复发，并且由于耐药而导致治疗失败；硼替佐米是一种蛋白酶体抑制剂，其主要通过引起MM细胞的凋亡来达到治疗的目的。
使用氯化铵(CAS:A9434-500G,Sigma)来代替铵根正离子，生理盐水配制氯化铵溶液。首先使用不同浓度的氯化铵(0,0.5mM，1mM，2mM)处理人源多发性骨髓瘤细胞ARP1(购自全球生物资源中心The Global Bioresource Center，ATCC)12h，随后分别加入不同浓度的硼替佐米(0,1.5nM，3nM)处理36h；收集细胞，使用翊圣生物科技有限公司Annexin V-AlexaFluor 647/PI凋亡检测试剂盒(40304ES20)参照说明书检测细胞凋亡。
体外实验结果表明，氯化铵可以减少硼替佐米引起的MM细胞凋亡的比例(图5)。这一结果说明，铵根正离子可以促进MM对硼替佐米的耐药。
实施例7：铵根正离子在小鼠体内对硼替佐米疗效的影响
采用5TGM1小鼠MM模型。将16只小鼠随机分为4组，每组4只，分别为生理盐水组(NaCl组)、BTZ组、NH4Cl组和NH4Cl+BTZ组。NaCl组：灌胃生理盐水，频率为每周每天灌胃，灌胃1周后通过尾静脉注射1×106个带荧光素酶报告基因的5TGM1细胞(5TGM1-Luc)，1周后腹腔注射生理盐水，频率为1周三次；BTZ组：灌胃生理盐水，频率为每周每天灌胃，灌胃1周后通过尾静脉注射1×106个带荧光素酶报告基因的5TGM1细胞(5TGM1-Luc)，1周后腹腔注射硼替佐米(0.75mg/kg)，频率为1周三次；NH4Cl组：灌胃氯化铵(53.5mg/kg)，频率为每周每天灌胃，灌胃1周后通过尾静脉注射1×106个带荧光素酶报告基因的5TGM1细胞(5TGM1-Luc)，1周后腹腔注射生理盐水，频率为1周三次；NH4Cl+BTZ组：灌胃氯化铵(53.5mg/kg)，频率为每周每天灌胃，灌胃1周后通过尾静脉注射1×106个带荧光素酶报告基因的5TGM1细胞(5TGM1-Luc)，1周后腹腔注射硼替佐米(0.75mg/kg)，频率为1周三次。注射细胞后第6周进行活体成像和面颊采血。
动物实验实验结果表明，每周3次单独注射硼替佐米(0.75mg/kg)可以有效延缓多发性骨髓的疾病进展，但每周3次注射硼替佐米(0.75mg/kg)辅以每天灌胃氯化铵(53.5mg/kg)未能延缓多发性骨髓的疾病进展，表明氯化铵在体内促进MM对硼替佐米的耐药(图6)。这一结果说明，铵根正离子促进MM对硼替佐米的耐药。
实施例8：弗氏柠檬酸杆菌与铵根正离子的相关性分析
为证明弗氏柠檬酸杆菌与铵根正离子的关系，本实施例检测弗氏柠檬酸杆菌培养液中铵根正离子含量以及复发难治MM患者粪便中弗氏柠檬酸杆菌的相对丰度与血清中铵根正离子的相关性。
加入6mL无菌营养肉汤至15mL带透气孔的离心管，接种1×106个弗氏柠檬酸杆菌至营养肉汤中，37℃摇床，200rpm，培养16h；常温离心3000rpm 5min，吸取上清-80℃保存待测。使用南京建成生物工程研究所的血氨测定试剂盒(A086-1-1)参照说明书检测培养液中铵根正离子的含量，未培养细菌的营养肉汤作为空白对照(Con)。结果表明，弗氏柠檬酸杆菌培养液中铵根正离子含量显著高于空白对照,说明弗氏柠檬酸杆菌可以产生铵根正离子(图7)。
使用实施例1和实施例3中部分复发难治MM患者外周血样本，收取上清待测。使用南京建成生物工程研究所的血氨测定试剂盒(A086-1-1)参照说明书检测血清中铵根正离子的含量。使用GraphPad Prism 7.0软件分析复发难治MM患者粪便中弗氏柠檬酸杆菌的相对丰度与血清中铵根正离子的相关性。实验结果表明，复发难治MM患者粪便中弗氏柠檬酸杆菌的相对丰度与血清中铵根正离子呈正相关(图8)，统计学方法采用Correlationanalysis。
以上结果说明，弗氏柠檬酸杆菌可以产生铵根正离子，血清中部分铵根正离子可能来源于弗氏柠檬酸杆菌。
实施例9：弗氏柠檬酸杆菌促进多发性骨髓瘤耐药的机制分析
从实施例3和实施例5的结果显示，弗氏柠檬酸杆菌在复发难治MM患者粪便中显著增加，并且其丰度的增加可以促进MM对硼替佐米的耐药，表明其可以作为预测和诊断MM患者复发难治的肠道微生物标志物；实施例4和实施例7的结果显示，铵根正离子在复发难治MM患者血清中显著增加，并且铵根正离子可以促进MM对硼替佐米的耐药，表明铵根正离子可以作为预测和诊断MM患者复发难治的血清标志物；实施例8中的结果显示，弗氏柠檬酸杆菌可以产生铵根正离子，血清中部分铵根正离子可能来源于弗氏柠檬酸杆菌；综上，弗氏柠檬酸杆菌通过产生铵根正离子，铵根正离子进入骨髓被MM细胞摄取，从而引起MM对硼替佐米的耐药。
实施例10：呋塞米钠在小鼠体内对多发性骨髓瘤疾病进展的影响
采用5TGM1小鼠MM模型。将16只小鼠随机分为4组，每组4只，分别为NaCl组、Fus组、NH4Cl组和NH4Cl+Fus组。NaCl组：灌胃生理盐水，频率为每周每天灌胃，灌胃1周后通过尾静脉注射1×106个带荧光素酶报告基因的5TGM1细胞(5TGM1-Luc)，1周后灌胃生理盐水，频率为每周每天灌胃；Fus组：灌胃生理盐水，频率为每周每天灌胃，灌胃1周后通过尾静脉注射1×106个带荧光素酶报告基因的5TGM1细胞(5TGM1-Luc)，1周后灌胃呋塞米钠(9mg/kg)，频率为每周每天灌胃；NH4Cl组：灌胃氯化铵(53.5mg/kg)，频率为每周每天灌胃，灌胃1周后通过尾静脉注射1×106个带荧光素酶报告基因的5TGM1细胞(5TGM1-Luc)，1周后灌胃生理盐水，频率为每周每天灌胃；NH4Cl+Fus组：灌胃氯化铵(53.5mg/kg)，频率为每周每天灌胃，灌胃1周后通过尾静脉注射1×106个带荧光素酶报告基因的5TGM1细胞(5TGM1-Luc)，1周后灌胃呋塞米钠(9mg/kg)，频率为每周每天灌胃。注射细胞后第6周进行活体成像、面颊采血和收集盲肠内容物。
动物实验结果显示，每天单独灌胃呋塞米钠(9mg/kg)可以有效延缓多发性骨髓的疾病进展，每天单独灌胃氯化铵(53.5mg/kg)明显可以促进多发性骨髓的疾病进展，但每天灌胃氯化铵(53.5mg/kg)辅以灌胃呋塞米钠(9mg/kg)可以明显延缓多发性骨髓的疾病进展，在实施例6和实施例7中已证明铵根正离子可以促进MM对硼替佐米的耐药，表明呋塞米钠既可以抑制MM的增殖也可以抑制MM对硼替佐米的耐药(图9)。这一结果为呋塞米钠应用于多发性骨髓瘤的临床治疗奠定了理论与实验基础。
实施例11：呋塞米钠抑制多发性骨髓瘤耐药的机制分析
检测实施例10中收取的血清和盲肠内容物中铵根正离子的含量，使用电子天平称取0.1g盲肠内容物标本至1.5mL EP管中，加入0.9mL无菌PBS，接着加入0.2g玻璃珠(425-600μm)，盖上管盖，震荡仪3000rpm 6min，随后离心机离心5000rpm 6min，收取上清待测。使用南京建成生物工程研究所的血氨测定试剂盒(A086-1-1)参照说明书检测血清和盲肠内容物中铵根正离子的含量。
检测结果显示，在血清中，Fus组铵根正离子的含量显著低于NaCl组，NH4Cl组铵根正离子的含量显著高于NaCl组，NH4Cl+Fus组铵根正离子的含量显著低于NH4Cl组(图10)；在盲肠内容物中，Fus组、NH4Cl组和NH4Cl+Fus组铵根正离子的含量显著高于NaCl组(图11)。综上，呋塞米钠抑制多发性骨髓瘤细胞对铵根正离子的摄取，并将其排出体外或抑制肠道中铵根正离子进入血液，导致血清中铵根正离子含量的降低以及盲肠中铵根正离子含量的升高，最终抑制多发性骨髓瘤的增殖和耐药。

Claims (12)

1.检测弗氏柠檬酸杆菌的试剂在制备复发难治多发性骨髓瘤诊断制剂中的应用，其特征在于，所述的弗氏柠檬酸杆菌隶属肠杆菌科(Enterobacteriaceae)枸橼酸杆菌属(Citrobacter)。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，弗氏柠檬酸杆菌的相对丰度/绝对丰度在复发难治多发性骨髓瘤患者的粪便样本或者肛拭子样本中富集量显著高于初诊患者和正常人。
3.检测铵根正离子的试剂在制备复发难治多发性骨髓瘤诊断制剂中的应用，其特征在于，所述的铵根正离子化学式:NH4 +。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，复发难治多发性骨髓瘤患者外周血中NH4 +含量显著高于初诊患者。
5.减少多发性骨髓瘤或者复发难治多发性骨髓瘤患者体内弗氏柠檬酸杆菌和/或NH4 +含量的试剂在制备治疗多发性骨髓瘤或者复发难治多发性骨髓瘤的制剂中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的减少多发性骨髓瘤或者复发难治多发性骨髓瘤患者体内弗氏柠檬酸杆菌和/或NH4 +含量的试剂为呋塞米钠。
7.减少多发性骨髓瘤或者复发难治多发性骨髓瘤患者体内弗氏柠檬酸杆菌和/或NH4 +含量的试剂在制备降低硼替佐米治疗多发性骨髓瘤或者复发难治多发性骨髓瘤患者耐药性制剂中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的减少多发性骨髓瘤或者复发难治多发性骨髓瘤患者体内弗氏柠檬酸杆菌和/或NH4 +含量的试剂为呋塞米钠。
9.减少多发性骨髓瘤或者复发难治多发性骨髓瘤患者体内弗氏柠檬酸杆菌和/或NH4 +含量的试剂在制备抑制多发性骨髓瘤细胞增殖药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的减少多发性骨髓瘤或者复发难治多发性骨髓瘤患者体内弗氏柠檬酸杆菌和/或NH4 +含量的试剂为呋塞米钠。
11.呋塞米钠用于制备抑制多发性骨髓瘤细胞摄取外源性铵根正离子的制剂。
12.呋塞米钠用于制备将体内铵根正离子排出体外和/或抑制肠道内铵根正离子进入血液的制剂。
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