CN113230251A - 阿苯达唑和多发性骨髓瘤临床药物的组合物及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了阿苯达唑和多发性骨髓瘤临床药物的组合物及用途，通过用阿苯达唑处理多发性骨髓瘤耐药细胞，发现阿苯达唑对ANBL6‑BR细胞有显著的抑制作用，并且能在体外抑制ANBL6‑BR细胞的克隆数目。本发明通过系列实验，证明了阿苯达唑对硼替佐米耐药细胞具有较强的抑制作用，并且在多发性骨髓瘤硼替佐米耐药细胞中能实现对硼替佐米的增敏，阿苯达唑与硼替佐米组合物对多发性骨髓瘤细胞以及多发性骨髓瘤干细胞样细胞有更强的抑制作用。阿苯达唑有望作为硼替佐米的辅助药物在耐药难治疗的多发性骨髓瘤中发挥作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种多发性骨髓瘤治疗药物，具体涉及阿苯达唑和多发性骨髓瘤临床药物的组合物及用途。属于医药技术领域。
背景技术
多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是一种恶性浆细胞，其发病率在所有血液系统肿瘤中排第二，其特点是克隆性浆细胞恶性增生，可导致一系列临床症状，包括贫血，高钙血症，肾衰竭和骨病变。在过去的几年中，蛋白酶体抑制剂和免疫调节药物在MM的治疗中取得了显著进展，然而，几乎所有患者仍然保持抵抗力并最终复发，MM仍然是无法治愈的。
可以抑制26S蛋白酶体的硼替佐米(bortizomib，BTZ)是目前MM主要的化疗药物，BTZ可对多条通路和多个分子发挥作用，如：BTZ可以激活Caspase信号通路，进而诱导肿瘤细胞的凋亡；可以上调p53的表达，抑制肿瘤细胞的周期；BTZ还可以对多种细胞因子发挥作用，影响肿瘤微环境和肿瘤血管生成。BTZ在临床上使用剂量小，初治效果好，但是骨髓瘤细胞对BTZ耐药的情况在临床上常常出现。癌症干细胞(CSC)具有自我更新的能力，并分化为多种类型的细胞，这些类型的细胞会促进肿瘤的生长和复发，进而赋予细胞对化学治疗药物的抗性。近年来肿瘤干细胞的研究是肿瘤领域的一个研究热点。乙醛脱氢酶(ALDHs)是在各种癌症中都高表达的排毒酶，ALDH的高表达与干性，耐药和不良的预后相关。
阿苯达唑(Albendazole，ABZ)是一种临床上广泛使用的抗寄生虫药物，价格低廉，作为临床老药安全性较好。目前阿苯达唑在MM及BTZ耐药中的作用尚未报道过。
发明内容
本发明的目的是为克服上述现有技术的不足，提供阿苯达唑和多发性骨髓瘤临床药物的组合物及用途。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
1、阿苯达唑在制备耐药性多发性骨髓瘤药物中的应用。
2、一种治疗耐药性多发性骨髓瘤的药物，其有效成分为阿苯达唑。
3、阿苯达唑作为治疗多发性骨髓瘤临床药物的增敏剂的用途。
优选的，所述多发性骨髓瘤临床药物为硼替佐米。
4、阿苯达唑和多发性骨髓瘤临床药物的组合物。
优选的，所述多发性骨髓瘤临床药物为硼替佐米，阿苯达唑与硼替佐米的纳摩尔比为50～200：10～40。
5、阿苯达唑和多发性骨髓瘤临床药物的组合物在制备治疗多发性骨髓瘤药物中的用途。
优选的，阿苯达唑和多发性骨髓瘤临床药物的组合物在制备治疗耐药性多发性骨髓瘤药物中的用途。
优选的，所述多发性骨髓瘤临床药物为硼替佐米，阿苯达唑与硼替佐米的纳摩尔比为50～200：10～40。
6、一种治疗多发性骨髓瘤的药物，其有效成分为所述的阿苯达唑和多发性骨髓瘤临床药物的组合物。
优选的，所述多发性骨髓瘤临床药物为硼替佐米。
7、一种治疗耐药性多发性骨髓瘤的药物制剂，其有效成分为所述的阿苯达唑和多发性骨髓瘤临床药物的组合物。
优选的，所述多发性骨髓瘤临床药物为硼替佐米。
本发明的有益效果：本发明通过用阿苯达唑处理多发性骨髓瘤耐药细胞(ANBL6-BR)，发现阿苯达唑对ANBL6-BR细胞有显著的抑制作用，并且能在体外抑制ANBL6-BR细胞的克隆数目。本发明通过系列实验，证明了阿苯达唑对BTZ耐药细胞具有较强的抑制作用，并且在多发性骨髓瘤BTZ耐药细胞中能实现对BTZ的增敏，阿苯达唑与BTZ组合物对多发性骨髓瘤细胞以及多发性骨髓瘤干细胞样细胞有更强的抑制作用。阿苯达唑有望作为BTZ的辅助药物在耐药难治疗的多发性骨髓瘤中发挥作用。
附图说明
图1：不同浓度阿苯达唑对ANBL6-BR细胞增殖的影响；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；A.用不同浓度的阿苯达唑处理48h后，手工计数，检测阿苯达唑对ANBL6-BR细胞增殖的影响；B.不同浓度阿苯达唑对ANBL6-BR细胞软琼脂克隆形成能力的影响。
图2：采用手工计数方法检测阿苯达唑与BTZ组合物对ANBL6-BR细胞增殖的影响。
图3：A.采用流式细胞术检测阿苯达唑和BTZ单独或联合处理ANBL6-BR细胞后ALDH1+细胞比例的变化情况；B.将MM耐药复发病人的CD138+细胞分选出来，再用流式细胞术检测阿苯达唑和BTZ单独或联合处理后ALDH1+细胞比例的变化情况。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进行进一步的阐述，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
实施例1：
本实施例采用不同浓度的阿苯达唑处理ANBL6-BR细胞，用手工计数的方法检测存活率，将ANBL6-BR细胞铺在软琼脂里，用阿苯达唑处理后检测阿苯达唑对ANBL6-BR细胞克隆形成能力的影响，实验步骤如下：
1.ANBL6-BR来自于中国医学科学院血液学研究所，是对BTZ具有耐药性的MM细胞。手工计数法检测ANBL6-BR细胞对BTZ的敏感程度；再用不同浓度阿苯达唑处理ANBL6-BR细胞，手工计数法计算阿苯达唑对ANBL6-BR细胞存活率的影响；
①收集对数生长期的ANBL6-BR细胞，重悬于四季青含质量浓度20％FBS(胎牛血清，四季青)的1640培养基(Gibco)中，加入96孔板，使每孔1×104个细胞，每孔体积为100μL；
②共设置8个组，分别是加药物溶剂(含体积浓度0.1％DMSO的1640培基作为药物溶剂)的对照组、BTZ 10μM、BTZ 20μM、BTZ 40μM、BTZ 80μM、ABZ 0.25μM、ABZ0.5μM、ABZ 1μM，每组3-5个平行孔；置于体积百分数5％CO2，37℃细胞培养箱中孵育48h；
③将孔板中细胞混匀，并将细胞悬液与质量浓度0.4％台盼蓝溶液按照体积比9：1混合混匀，在显微镜下直接计算不被台盼蓝染色的活细胞数量，计算相对存活率，结果见图1中A。
2.用不同浓度阿苯达唑在软琼脂中处理ANBL6-BR细胞，通过计算克隆数来评估不同浓度阿苯达唑对ANBL6-BR细胞克隆形成能力的影响，软琼脂粉末购自Thermo FisherScientific；
①收集对数生长期的ANBL6-BR细胞，用含质量浓度20％FBS(胎牛血清，四季青)的1640培养基制成细胞悬液；
②用双蒸水制备质量浓度3.5％、1.6％浓度的琼脂糖，高温灭菌，置于42℃水浴锅备用；
③将质量浓度3.5％浓度的琼脂糖与5倍体积的细胞培养基混合加入12孔板，每孔1mL，室温放置10min后凝固，此为下层胶；
④将质量浓度1.6％浓度的琼脂糖与5倍体积的细胞培养基混合，并加入细胞悬液，使细胞的终浓度为6000个/mL，共设置3组，分别是加药物溶剂(含体积浓度0.1％DMSO的1640培基作为药物溶剂)的对照组、ABZ 0.25μM、ABZ 0.5μM，每组3-5个平行孔；以每孔500μL加入到下层胶上，室温放置10min后凝固，此为上层胶；
⑤置于体积百分数5％CO2，37℃细胞培养箱中孵育7至10天，待单个细胞长成约50个细胞左右的单克隆时，加入MTT(Thermo Fisher Scientific)染色2h后拍照并计算细胞集落，结果见图1中B。
实验结果如图1所示。结果表明，阿苯达唑显著抑制ANBL6-BR细胞的存活率，并显著抑制ANBL6-BR细胞的克隆形成。
实施例2：
本实施例采用细胞计数的方法检测不同浓度比例阿苯达唑和BTZ联用后对ANBL6-BR细胞的协同效应。实验步骤如下：
1.收集对数生长期的ANBL6-BR细胞，调整细胞悬液浓度，加入96孔板，每孔100μL，1×104个细胞；
2.设置加药物溶剂(含体积浓度0.1％DMSO的1640培基作为药物溶剂)的对照组，实验组分别加入单独的ABZ(0.05μM、0.1μM、0.2μM)、单独的BTZ(10nM、20nM、40nM)和ABZ联合BTZ(浓度为0.05μM+20nM、0.05μM+40nM、0.1μM+10nM、0.1μM+20nM、0.1μM+40nM、0.2μM+10nM、0.2μM+20nM、0.2μM+40nM)，共15组，每个浓度设置3-5个重复孔，置于细胞培养箱中孵育48h；
3.将孔板里的细胞混匀，将细胞悬液与质量浓度0.4％台盼蓝溶液按照体积比9：1混合混匀，在显微镜下直接计算不被台盼蓝染色的活细胞数量，计算相对存活率。
实验结果如图2所示。结果表明，阿苯达唑与BTZ组合物在纳摩尔比为50～200：10～40时有很好的协同作用。
实施例3：
本实施例采用流式细胞术检测阿苯达唑和BTZ单独或联合处理对BTZ耐药的MM细胞后ALDH1+细胞比例的变化情况。乙醛脱氢酶(ALDHs)是在包括多发性骨髓瘤干细胞样细胞(MMSCs)在内的各种肿瘤干细胞(CSCs)中高度表达的解毒酶。ALDH1+MM细胞代表MMSCs的一部分，或者从某种角度看代表了分化更为广泛的增殖祖细胞群体，该群体具有干细胞特征。检测ALDH1+细胞数量比例的ALDEFLUOR试剂盒购自Stem Cell Technologies，按标准步骤进行对ALDH1+细胞的检测，PI是碘化丙啶，是一种核酸染料。
1.流式细胞术检测阿苯达唑和BTZ单独或联合处理ANBL6-BR细胞后ALDH1+细胞比例的变化情况；
①收集对数生长期的ANBL6-BR细胞，调整细胞悬液浓度，加入六孔板，每孔2mL，3×105个细胞；
②设置对照组加入药物溶剂(含体积浓度0.1％DMSO的1640培基作为药物溶剂)，实验组加入0.5μM浓度的ABZ，20nM的BTZ，以及二者联合使用，置于5％CO2，37℃细胞培养箱中孵育48h；
③收集细胞，并用1mL ALDH分析液重悬；
④每组再设置对照管和实验管，在对照空EP管中加入5μL ALDEFLUOR的抑制剂DEAB试剂；实验空EP管中加入5μL活化的ALDH试剂；
⑤将1mL细胞悬液加入实验管，快速混合均匀，并吸取500μL到对照管，混合均匀；
⑥所有EP管置于37℃水浴锅孵育50min；
⑦800rpm，离心5min，弃上清，将细胞重悬于500μL的ALDH分析液，置冰上；
⑧加入PI试剂(终浓度为2μg/mL)，染色5min，通过流式细胞仪检测ALDH1+细胞比例，分析阿苯达唑和BTZ单独或联合处理对ANBL6-BR细胞ALDH1+群的影响，结果如图3中A。
2.流式细胞术检测阿苯达唑和BTZ单独或联合处理对BTZ耐药的MM病人的CD138+细胞后ALDH1+细胞比例的变化情况，MM病人骨髓样本来自中南大学附属医院，并根据中南大学湖南省肿瘤医院伦理委员会的道德标准进行了涉及人类患者样本的研究；
①将骨髓样本用缓冲液(500mL DPBS+2.5g BSA+2mL EDTA)(BSA购自阿拉丁，EDTA购自Sigma)稀释一倍；
②在空离心管中加入3mL人外周血淋巴细胞分离液(天津灏洋生物公司)，用巴氏管吸取稀释的样本缓慢加入到分离液的液面上；
③常温下300g慢升慢降的离心20min，离心后离心管内的液体分成4层，用巴氏管吸取从上往下第2层的单个核细胞层；
④向吸取出来的液体中加入2倍体积的缓冲液，300g离心10min；
⑤弃上清，向沉淀中加入70μL缓冲液和20μL的CD138磁珠(BD pharmingenTM)，避光下4度孵育30min；
⑥孵育结束后加入5mL缓冲液，1500rpm离心10min，弃上清，加入3mL缓冲液；
⑦将分离柱(Thermo Fisher Scientific)架在磁力架上，加入单个核细胞溶液，从分离柱下端流下的为CD138-细胞，待液体全部流尽后，将分离柱远离磁力架，再向柱子中加入2mL缓冲液，用分离柱自带的推子将液体推下来，即为CD138+细胞溶液；
⑧将CD138+细胞溶液1500rpm离心10min，用含质量浓度20％FBS(四季青胎牛血清)的1640培养基(Gibco)重悬细胞，并将细胞以1×106个/mL的密度铺于6孔板，对照组加入药物溶剂(含体积浓度0.1％DMSO的1640培基作为药物溶剂)，实验组加入0.25μM浓度的ABZ、10nM的BTZ或ABZ联合BTZ，共四组，于培养箱中孵育48h；
⑨孵育结束后与上述检测ALDH1+细胞比例的方法相同，用于检测ABZ联合BTZ处理BTZ耐药病人的CD138+细胞后ALDH1+细胞比例的变化情况，结果如图3中B。
实验结果如图3所示，控制加DEAB管的ALDH1+细胞数量比例在0.1％-0.2％，将每组对照组的门应用到各自的实验组，结果表明加入阿苯达唑后，对BTZ耐药的MM细胞中的ALDH1+细胞比例显著下降，而BTZ处理组，ALDH1+细胞比例被上调，阿苯达唑与BTZ的联合使用又能更加显著的抑制ALDH1+细胞比例，表明BTZ会升高耐药细胞中的ALDH1+细胞比例，从而在一定程度上使细胞表现出对BTZ的抗性，而阿苯达唑能抑制耐药细胞中的干细胞样细胞，并且在与BTZ联合使用时能协同抑制耐药细胞中的干细胞样细胞。
上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
Claims (7)
1.阿苯达唑在制备耐药性多发性骨髓瘤药物中的应用。
2.一种治疗耐药性多发性骨髓瘤的药物，其特征在于，其有效成分为阿苯达唑。
3.阿苯达唑作为治疗多发性骨髓瘤临床药物的增敏剂的用途。
4.阿苯达唑和多发性骨髓瘤临床药物的组合物。
5.阿苯达唑和多发性骨髓瘤临床药物的组合物在制备治疗多发性骨髓瘤药物中的用途。
6.一种治疗多发性骨髓瘤的药物，其特征在于，其有效成分为所述的阿苯达唑和多发性骨髓瘤临床药物的组合物。
7.一种治疗耐药性多发性骨髓瘤的药物制剂，其特征在于，其有效成分为所述的阿苯达唑和多发性骨髓瘤临床药物的组合物。
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| CN115227667B (zh) * | 2022-05-23 | 2024-01-05 | 苏州大学 | 负载硼替佐米的人单核细胞外泌体的制备方法及其在制备治疗多发性骨髓瘤药物中的应用 |
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