CN113244230A - Gl-v9在制备抗黑色素瘤药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了黄酮类衍生物GL‑V9在制备抗黑色素瘤药物中的应用。进一步的研究发现GL‑V9能显著抑制人黑色素瘤A375细胞的生长活力,在合适的浓度条件下,其抑制率可以接近100%。而且,GL‑V9能显著促进A375细胞发生早期及晚期凋亡,具有开发抗黑色素瘤药物的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于抗肿瘤药物领域,具体涉及一种GL-V9化合物在制备抗黑色素瘤药物中的应用。
背景技术
黑色素瘤,是黑色素细胞来源的一种高度恶性的肿瘤,简称恶黑,多发生于皮肤,也可见于黏膜和内脏,约占全部肿瘤的3%。皮肤恶性黑色素瘤占皮肤恶性肿瘤的第三位(约占6.8%~20%)。好发于成人,皮肤白皙的白种人发病率高,而深色皮肤的亚洲人和非洲人发病率较低,极少见于儿童。部分患者有家族性多发现象。恶性黑色素瘤可由先天性或获得性良性黑素细胞痣演变而成,或由发育不良性痣恶变而来,也可以是新发生。近年来,恶性黑色素瘤的发生率和死亡率逐年升高,与其他实体瘤相比,其致死年龄更低。
目前,针对黑色素瘤的治疗方法包括手术治疗、放疗、化学治疗、靶向治疗和免疫治疗等。有研究发现,黑色素瘤具有放射抗拒性,是一种抗放射癌,且放射治疗对人体的正常细胞也会造成伤害。替莫唑胺和达卡巴嗪是抗黑素瘤化学疗法中的常用药物,但其治疗的有效率较低,预后性较差。黑色素瘤中最常见的致癌基因是BRAF基因,相关的BRAF抑制剂,如索拉菲尼、威罗菲尼、达拉菲尼等药物,可诱导黑色素瘤转移并迅速消退,但是,通常大多数患者在BRAF单一疗法在6个月后表现出耐药性。免疫疗法可改善黑色素瘤患者的免疫反应,但存在严重的毒副作用,使得其在临床上的应用仍然受到限制。因此,有效的恶性黑色素瘤治疗方法较为有限,除早期手术切除外,对于一般的放射线治疗和化学治疗的效果不佳,又伴随着高度的转移性,缺乏特效治疗,预后差,因此能寻找到有助黑色素瘤治疗的天然药材,是当前重要的课题。
发明内容
为改善上述技术问题,本发明提供了一种黄酮类衍生物GL-V9在制备抗黑色素瘤药物中的应用。
根据本发明的实施方案,所述黑色素瘤为人黑色素瘤A375细胞;
根据本发明的实施方案,所述GL-V9可以抑制黑色素瘤细胞的生长活力;
根据本发明的实施方案,所述GL-V9可以促进黑色素瘤细胞发生早期和/或晚期凋亡。
有益效果
本发明研究意外发现黄酮类衍生物GL-V9能显著抑制人黑色素瘤A375细胞的生长活力,在合适的浓度条件下,其抑制率可以接近100%。进一步通过细胞凋亡实验发现,GL-V9能显著促进A375细胞发生早期及晚期凋亡,表明GL-V9可用于黑色素瘤的治疗,具有开发抗黑色素瘤药物的应用前景。
附图说明
图1不同浓度GL-V9对人黑色素瘤细胞株抑制率折线图。
图2不同浓度GL-V9对人黑色素瘤细胞的凋亡实验图。
具体实施方式
下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解,下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明,而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
除非另有说明,以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品,或者可以通过已知方法制备。
实验材料
1.1试剂
(1)GL-V9(C24H27O5N,分子量:409.47)由中国药科大学提供,淡黄色粉末,纯度大于99%,使用前用二甲亚砜(DMSO)将药物粉末配制为0.02M浓度的母液,置于-20℃保存。临用前用含10%胎牛血清的DMEM培养液配成所需浓度。
(2)细胞培养试剂
①培养液:DMEM培养基,购自美国GIBCO公司。取DMEM粉末10.39g溶于1000ml灭菌三蒸水中,并加入2.0g NaHCO3,用1M盐酸调pH值至7.0,圆筒式过滤器过滤除菌、分装,4℃冰箱保存。使用前加入100U/ml的青霉素和100U/ml的链霉素。
②胎牛血清:美国GIBCO公司产品。经56℃水浴灭活30min,分装并保存于-20℃低温冰箱中。
③PBS缓冲液:称取NaCl 8.0g、KCl 0.20g、Na2HPO4·H2O 1.56g、KH2PO4.2.0g,溶于1000ml三蒸水中,高压灭菌,4℃冰箱保存。
(3)细胞生长活力抑制检测相关试剂
MTT粉末购自Sigma-Aldrich公司。
(4)细胞凋亡检测相关试剂
Annexin V-PI双染试剂盒购自凯基公司。
1.2实验仪器
(1)YJ-875型医用净化工作台:苏州净化设备厂生产。
(2)3111型水套式CO2培养箱:美国Thermo electron公司产品。
(3)电子天平:北京赛多利斯仪器系统有限公司产品。
(4)QIUJING血细胞计数版:中国上海。
(5)LD4-2普通离心机:北京医用离心机厂产品。
(6)YG-2000型圆筒式过滤器:绍兴市卫星医疗设备制造公司产品。
(7)KY-111型微型空气压缩机:绍兴市卫星医疗设备制造公司产品。
(8)5417R型台式冷冻高速离心机:德国Eppendorf公司产品。
(9)WP型pH袖珍测试笔:美国优特仪器公司产品。
(10)Research型单道可调移液器:德国Eppendorf公司产品。
(11)THZ-312型台式恒温振荡器:上海精宏试验设备有限公司产品。
(12)Varioskan全波长酶标仪:美国Thermo公司。
(13)流式细胞仪:美国Becton Dickinson公司。
1.3细胞株
人黑色素瘤细胞株A375购自上海中国科学院细胞所。所有细胞均用含100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素和10%胎牛血清的DMEM培养液培养。
实施例1 MTT实验
MTT溶液能够被活细胞内的线粒体脱氢酶还原为蓝紫色的结晶甲臜,DMSO可溶解甲臜,形成的溶液颜色深浅与细胞活力成正比,据此可以检测细胞的活力。将细胞按照合适的细胞密度培养在96孔酶标板内,每孔内的细胞体积为100μl,同时在其中加入100μl指定浓度的GL-V9;将给过药物的细胞继续置于孵箱培养24h后,每孔加入20μl MTT溶液;继续孵育4h后将上清液移除,每孔加入100μl DMSO,置于微型振荡器振荡,待结晶完全溶解后,使用570nm波长检测其吸光度。将检测后的吸光值整理后按下面的公式计算药物对细胞的生长抑制率:
通过MTT实验检测24h内天然产物衍生物GL-V9对人黑色素瘤细胞株A375生长活力的影响。实验结果显示(图1),GL-V9能显著抑制A375细胞的生长活力。该结果初步证实了GL-V9抗人黑色素瘤的作用。
实施例2 Annexin V/PI凋亡双染实验
药物作用指定时间后,以2000rpm转速离心5min,收集细胞悬液,弃培养基,用预冷过的PBS溶液洗涤细胞两次,加入400μL 1×Binding Buffer悬浮细胞,细胞密度大约为1×106个/mL。每组的细胞悬液中加入5μL Annexin V,轻轻混匀后于2~8℃避光条件下孵育15min,再加入5μL PI后轻轻混匀于2~8℃避光条件下孵育5min,1h内用流式细胞仪检测。
通过流式细胞术测定24h时间点不同剂量天然产物衍生物GL-V9对人黑色素瘤细胞株A375凋亡的影响。Annexin V/PI双染实验结果显示(图2),GL-V9能显著促进A375细胞发生早期及晚期凋亡。该结果初步证实了GL-V9可诱导细胞发生凋亡从而发挥抗人黑色素瘤细胞的作用。
以上,对本发明的实施方式进行了说明。但是,本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内,所做的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
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CN114306327A (zh) * | 2022-01-11 | 2022-04-12 | 中国药科大学 | 化合物gl-v9联合蒽环类抗生素在制备抗肿瘤药物中的应用 |
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CN108354932A (zh) * | 2018-04-24 | 2018-08-03 | 中国药科大学 | 黄酮类化合物gl-v9在制备抗白血病药物中的应用 |
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