CN111481534B - 3,4断裂的环阿尔廷型三萜类化合物在制备自噬抑制剂及抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents
3,4断裂的环阿尔廷型三萜类化合物在制备自噬抑制剂及抗肿瘤药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了3,4断裂的环阿尔廷型三萜类化合物的新用途,所述化合物为黑五味子酸或南五味子酸,包括用于制备自噬抑制剂、制备用于增加抗肿瘤药物治疗敏感性的药物,所述化合物可以抑制自噬受体p62的泛素化修饰,阻止p62自噬受体功能的激活,可以抑制抗肿瘤药物诱导的肿瘤细胞的保护性自噬,本发明还提供了一种抗肿瘤药物组合物,包括3,4断裂的环阿尔廷型三萜类化合物和易引起肿瘤细胞保护性自噬的抗肿瘤药物,可以抑制肿瘤细胞生长,促进肿瘤细胞死亡,可用于乳腺癌等癌症的治疗。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域;具体涉及一种3,4断裂的环阿尔廷型三萜类化合物在制备自噬抑制剂及抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
自噬是细胞中高度保守的分解代谢过程,主要分为四个阶段:自噬泡前体的形成,自噬体膜的形成和延伸,溶酶体封闭融合和囊内降解,其功能是通过降解受损蛋白或细胞器维持细胞稳态。根据细胞内底物运送到溶酶体腔方式的不同,哺乳动物细胞自噬可分为巨自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬等3种主要方式,但目前研究最为广泛的是巨自噬。自噬可以帮助肿瘤细胞应对饥饿、缺氧及药物干预等不利环境下引起的氧化压力和DNA损伤,因为自噬不仅清除了受损蛋白或细胞器,而且为肿瘤细胞提供了营养物质,有利于肿瘤细胞在药物治疗等不利条件下存活,是肿瘤耐药的重要原因之一,因此研究开发自噬抑制剂对肿瘤的治疗具有重要意义。
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤,位居女性恶性肿瘤首位,其发病率和死亡率呈逐年升高的趋势。乳腺癌是一类高度异质性的疾病,根据分子分型,乳腺癌可以分为三种。雌激素受体和孕激素受体均为阳性(Luminal A/B型);人类表皮生长因子受体2过表达型;ER、PR、HER2均为阴性,也称为三阴性乳腺癌。基于精准医疗的理念,不同类型的乳腺癌治疗策略不同,Luminal A/B型以内分泌治疗为主,治疗药物如他莫昔芬、芳香化酶抑制剂、CDK4/6抑制剂、PI3K 抑制剂等;HER2过表达型主要通过靶向HER2治疗,包括赫赛汀、帕妥珠单抗、拉帕替尼、吡咯替尼等;三阴性乳腺癌缺乏有效的靶向药物,同时三阴性乳腺癌具有转移性和致命性更高等特点,临床上一般以放化疗为主,治疗药物如顺铂、紫杉醇及多柔比星等,虽然BRCA1/2突变的病人可以采用PARP抑制剂,但病人比例低,而且不能延长病人总生存时间。然而无论是采用内分泌治疗,靶向治疗还是放化疗,随着治疗的推进,患者容易出现耐药,导致治疗失败。因此,解析乳腺癌耐药的机制并开发增敏的药物对改善乳腺癌治疗是非常重要的。以往的研究发现,在乳腺癌治疗中,他莫昔芬能诱导保护性自噬,表阿霉素通过诱导自噬保护MCF7细胞免于凋亡,曲妥珠单抗和拉帕替尼可诱导HER2阳性乳腺癌细胞发生保护性自噬,顺铂和紫杉醇等可诱导三阴性乳腺癌细胞自噬从而产生耐药。利用自噬抑制剂氯喹(或者羟氯喹)与乳腺癌治疗药物联用可以部分恢复抗肿瘤药物的治疗敏感性,据clinicalTrial.org官网检索临床数据显示,自噬抑制剂氯喹(或者羟氯喹)与乳腺癌治疗药物联用可治疗转移性乳腺癌,目前处于二期临床阶段。综上所述,抑制自噬促进乳腺癌治疗,研发抑制自噬的小分子化合物将为改善乳腺癌的治疗提供新策略。
天然产物因具有结构新颖性和丰富的药理活性,是新药或其先导化合物的重要来源。五味子科(Schisandraceae)植物为双子叶藤本,包括五味子属(Schisandra) 和南五味子属(Kadsura),全球约有50种,主要分布在东亚和东南亚。我国是世界上五味子科植物分布最为丰富的国家,大约有29个种(13个特有种),分布在除宁夏、青海和新疆等省外的全国大部分地区。合蕊五味子(Schisandra propinqua(Wall.)Baill.var.propinqua)是合蕊五味子(Schisandra propinqua(Wall.) Baill.)的原变种,多产自云南西北部、西藏西部,生长在海拔2000-2200m的河谷、山坡常绿阔叶林中。它的根、茎、叶和果实都可以入药,可以治疗风湿骨痛、跌打损伤、神经衰弱等症。合蕊五味子中含有大量的3,4断裂的环阿尔廷型三萜类化合物,目前未见其在自噬抑制方面的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供3,4断裂的环阿尔廷型三萜类化合物在制备自噬抑制剂中的应用,本发明的另一目的在于提供3,4断裂的环阿尔廷型三萜类化合物在制备用于增加抗肿瘤药物治疗肿瘤的敏感性的药物中的用途,本发明还提供一种抗肿瘤药物组合物,其包含3,4断裂的环阿尔廷型三萜类化合物和易引起肿瘤细胞保护性自噬的抗肿瘤药物。
为实现上述目的,本发明通过以下技术方案实现:
一方面,本发明提供3,4断裂的环阿尔廷型三萜类化合物在制备自噬抑制剂中的应用;
优选地,所述3,4断裂的环阿尔廷型三萜类化合物为黑五味子酸或南五味子酸;
所述黑五味子酸,英文名为:Nigranoic acid,分子式为:C30H46O4。具有如下化学结构式:
所述南五味子酸,英文名为:Kadsuric acid,分子式为:C30H46O4,具有如下化学结构式:
本发明意外地发现,3,4断裂的环阿尔廷型三萜类化合物,可以抑制自噬受体p62的泛素化修饰,阻止p62自噬受体功能的激活,进而抑制自噬。
优选地,所述自噬为抗肿瘤药物诱导的肿瘤细胞的保护性自噬;
优先地,本发明中所述自噬抑制剂还包括药学上可接受的载体,所述化合物可负载于常用药物载体上,以实现更好的生物相容性、靶向性、生物安全性和给药效果。
本发明另一方面还提供了3,4断裂的环阿尔廷型三萜类化合物在制备用于增加抗肿瘤药物治疗肿瘤的敏感性的药物中的用途,所述3,4断裂的环阿尔廷型三萜类化合物为黑五味子酸或南五味子酸。
优选地所述抗肿瘤药物易引起肿瘤细胞的保护性自噬,如拉帕替尼、顺铂、曲妥珠单抗、硼替佐米、雷帕霉素、他莫昔芬、伊马替尼、替莫唑胺、紫杉醇、环磷酰胺、依托泊苷等。
本发明另一方面,还提供了一种抗肿瘤药物组合物,包括3,4断裂的环阿尔廷型三萜类化合物和易引起肿瘤细胞保护性自噬的抗肿瘤药物。
优先地,所述3,4断裂的环阿尔廷型三萜类化合物为黑五味子酸或南五味子酸,所述易引起肿瘤细胞保护性自噬的抗肿瘤药物为拉帕替尼、顺铂、曲妥珠单抗、他莫昔芬、硼替佐米、雷帕霉素、伊马替尼、替莫唑胺、紫杉醇、环磷酰胺、依托泊苷等。
优选地,所述抗肿瘤药物组合物,可抑制肿瘤细胞生长、促进肿瘤细胞死亡;所述肿瘤优先为乳腺癌、胰腺癌、肝癌、肺癌、结肠癌、前列腺癌、恶性胶质瘤、淋巴瘤等。
优先地,所述抗肿瘤药物组合物还包含适于制备抗肿瘤药物的药用载体。所述药物组合物可负载于常用药物载体上,以实现更好的生物相容性、靶向性、生物安全性和给药效果。
相对于现有技术,本发明具有以下有益效果:
本发明意外地发现可以将3,4断裂的环阿尔廷型三萜类化合物,尤其是黑五味子酸或南五味子酸用于制备自噬抑制剂,本发明通过体外和细胞内实验发现黑五味子酸可以抑制自噬受体p62的泛素化修饰,阻止p62自噬受体功能的激活,进而抑制自噬。通过细胞实验,发现3,4断裂的环阿尔廷型三萜类化合物黑五味子酸能够有效抑制抗肿瘤药物诱导的肿瘤细胞的保护性自噬,增加抗肿瘤药物治疗肿瘤的敏感性,其可以与拉帕替尼、顺铂等易引起肿瘤细胞保护性自噬的抗肿瘤药物联合应用,促进肿瘤细胞死亡,抑制肿瘤细胞生生长,提高疗效。且所述 3,4断裂的环阿尔廷型三萜类化合物是天然产物,其剂型和给药方式多样化,具有广泛的临床应用前景。
附图说明
图1A为黑五味子酸体外抑制自噬受体p62的泛素化结果;
图1B为黑五味子酸抑制细胞内p62的泛素化结果;
图2A为黑五味子酸抑制拉帕替尼诱导的自噬结果(荧光显微镜下观察 GFP-LC3、DAPI、Merge);
图2B黑五味子酸抑制拉帕替尼诱导的自噬结果(为图2A结果中GFP-LC3 的定量统计学分析结果图);
图2C为黑五味子酸抑制拉帕替尼诱导的自噬结果(Western Blot检测LC3II 的表达);
图3A为黑五味子酸抑制顺铂诱导的自噬结果(荧光显微镜下观察GFP-LC3、 DAPI、Merge);
图3B为黑五味子酸抑制顺铂诱导的自噬结果(为图3A结果中GFP-LC3的定量统计学分析结果);
图3C为黑五味子酸抑制顺铂诱导的自噬结果(Western Blot检测LC3II的表达);
图4A为流式细胞仪检测黑五味子酸与拉帕替尼联用后对乳腺癌细胞凋亡作用的结果图;
图4B为黑五味子酸与拉帕替尼联用后对乳腺癌细胞凋亡作用的结果图(为图4A结果的统计学分析结果);
图4C为Western Blot检测黑五味子酸与拉帕替尼联用后细胞凋亡相关蛋白 PRAP的表达;
图4D为SRB检测黑五味子酸与拉帕替尼联用后乳腺癌细胞的存活率;
图5A为黑五味子酸与拉帕替尼联用后对裸鼠移植瘤大小影响结果;
图5B为黑五味子酸与拉帕替尼联用后对裸鼠移植瘤重量影响结果;
图5C为黑五味子酸与拉帕替尼联用给药次数和肿瘤大小变化关系图;
图6A为黑五味子酸与顺铂联用后对乳腺癌细胞凋亡作用的结果图;
图6B为黑五味子酸与顺铂联用后对乳腺癌细胞凋亡作用的结果图(为6A 结果的统计学分析结果);
图6C为Western Blot检测黑五味子酸与顺铂联用后细胞凋亡相关蛋白 PRAP和cl-caspases3的表达;
图6D为SRB检测黑五味子酸与顺铂联用后乳腺癌细胞的存活率;
具体实施例
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了,所述实施例仅仅是帮助理解本发明,不应视为对本发明的具体限制。
实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等,除以下专门提及的内容之外,均为本领域的普遍知识和公知常识,本发明没有特别限制内容。各实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另有说明,本说明书中使用的全部专业术语和科学用语的含义均与本发明所属技术领域的技术人员一般理解的含义相同。但如有冲突,以包含定义的本说明书为准。
1、实验主要试剂及其来源
表1实验主要试剂及其来源
2、实验所用药物的配置
实验所用黑五味子酸(Nigranoic acid)来自昆明植物研究所普诺白玛丹增课题组,体外工作溶液配置:称取2.35mg黑五味子酸(分子量470)白色粉末,与250μL DMSO混合,混匀至完全溶解可得到20mM的化合物母液,然后根据实验需要稀释到所需浓度,本研究所用的DMSO浓度均为0.1%(v/v)。体内实验中使用的黑五味子酸工作液浓度50mg/kg,使用10%DMSO和5%羧甲基纤维素钠(HY-Y0703)溶解,现用现配。
3、实验所需的细胞及其培养方法
所使用的细胞株为人肾胚细胞HEK293T和乳腺癌细胞MDA-MB-468,公众可从中国科学院昆明动物研究所获得;以上细胞经过STR鉴定。HEK293T细胞和MDA-MB-468细胞均使用DMEM培养基(Gibco,美国)培养,其中添加5%的胎牛血清(Gibco);细胞培养箱条件为37℃恒温,湿度恒定,CO2浓度维持在 5%。
实施例1
3,4断裂的环阿尔廷型三萜类化合物黑五味子酸抑制自噬受体p62的泛素化。
(1)检测p62体外泛素化:向反应缓冲液(Reaction buffer)中依次加入ATP、 HA-Ub、E1泛素激活酶UbE1、E2泛素结合酶UbcH5b、E3泛素连接酶HECTD3 及其底物p62(带His标签),分别加入不同浓度(5μM,10μM,20μM)的黑五味子酸,加DMSO作为阳性对照,不加ATP的作为阴性对照,37℃反应40 分钟。之后与镍柱孵育过夜,充分洗脱后用Western Blot检测p62的泛素化情况。
结果如图1A所示,与阴性对照和阳性对照相比,20μM的黑五味子酸显著抑制了p62的泛素化。
(2)检测细胞内p62泛素化:将p62-Flag,HECTD3或者HECTD3C823A,以及HA-Ub共表达在HEK293T细胞中,24小时后分别加入不同浓度(10μM, 20μM)的黑五味子酸处理,加DMSO作为阳性对照,24小时后用含有SDS的变性裂解液收集蛋白。蛋白稀释以后和anti-Flag M2珠子孵育。BSA buffer清洗 3次后,用Western Blot检测p62泛素化修饰水平。
结果如图1B所示,由图1B可知:20μM的黑五味子酸在细胞水平上抑制了 p62的泛素化。
实施例2
3,4断裂的环阿尔廷型三萜类化合物黑五味子酸抑制拉帕替尼诱导的自噬。
(1)将MDA-MB-468细胞按照8000个/孔密度接种于预先放置有玻片的24 孔培养板,待细胞完全贴壁后转染GFP-LC3质粒,24小时后分别加入拉帕替尼(10μM)、黑五味子酸(20μM)及两者联用(10μM拉帕替尼和20μM黑五味子酸)处理4小时(另设DMSO作为对照组),用4%的多聚甲醛固定1小时,PBS 浸洗玻片3次,再用含DAPI的封闭液封片,最后在荧光显微镜下观察GFP-LC3 荧光斑点,并定量计算GFP-LC3荧光斑点数。
实验结果见图2A和2B,由图可知:拉帕替尼处理组荧光斑点数明显增加,说明自噬被诱导;拉帕替尼和黑五味子酸联用后,荧光斑点数明显减少,说明黑五味子酸抑制了拉帕替尼诱导的自噬。
(2)将MDA-MB-468细胞按照150000的密度接种于12孔板中,16小时后分别加拉帕替尼(0、5、10μM)及拉帕替尼(0、5、10μM)联合黑五味子酸 (20μM)处理8小时,每组均用0.1%DMSO补足相同体积,收集蛋白裂解液, Western Bolt检测LC3II的蛋白表达水平。
实验结果见图2C,由图可知:拉帕替尼处理组LC3II蛋白表达水平明显增加,说明自噬被诱导;拉帕替尼和黑五味子酸联用后,LC3II蛋白表达水平明显减少,说明黑五味子酸抑制了拉帕替尼诱导的自噬。
实施例3
所述3,4断裂的环阿尔廷型三萜类化合物黑五味子酸抑制顺铂诱导的自噬。
(1)将MDA-MB-468细胞按照8000个/孔密度接种于预先放置有玻片的24 孔培养板,待细胞完全贴壁后转染GFP-LC3质粒,16小时后分别加黑五味子酸 (20μM)、顺铂(5μM)及两者联用(20μM黑五味子酸和5μM顺铂)处理4小时(另设DMSO作为对照组),用4%的多聚甲醛固定1小时,PBS浸洗玻片3 次,再用含DAPI的封闭液封片,最后在荧光显微镜下观察GFP-LC3荧光斑点,并定量计算GFP-LC3荧光斑点数。
实验结果见图3A和3B,由结果可知,顺铂处理组荧光斑点数明显增加,说明自噬被诱导;顺铂和黑五味子酸联用后,荧光斑点数明显减少,说明黑五味子酸抑制了顺铂诱导的自噬。
(2)将MDA-MB-468细胞按照150000的密度接种于12孔板中,16小时后分别加顺铂(0、2.5、5μM)及顺铂(0、2.5、5μM)联合黑五味子酸(20μM) 处理8小时,每组均用0.1%DMSO补足相同体积,收集蛋白裂解液,Western Bolt 检测LC3II的蛋白表达水平。
实验结果见图3C,顺铂和黑五味子酸联用后,LC3II蛋白表达水平明显减少,说明黑五味子酸抑制了顺铂诱导的自噬。
实施例4
所述3,4断裂的环阿尔廷型三萜类化合物黑五味子酸与拉帕替尼联用促进乳腺癌细胞死亡。
(1)细胞凋亡检测:将MDA-MB-468细胞200000个/孔接种于6孔板过夜,分别加入拉帕替尼(10μM)、黑五味子酸(20μM)及两者联用(10μM拉帕替尼和20μM黑五味子酸)处理细胞,24小时后收集细胞进行Annexin V染色,流式细胞仪测定凋亡细胞的比例。
(2)Westron Blot检测细胞凋亡标志物:将MDA-MB-468细胞按照150000 的密度接种于12孔板中,16小时后分别加不同浓度的拉帕替尼(0、5、10μM) 及拉帕替尼(0、5、10μM)联合黑五味子酸(20μM)处理12小时,每组均用 0.1%DMSO补足相同体积,收集蛋白裂解液,用Westron Blot检测细胞凋亡标志物,如PARP的切割等。
(3)SRB染色法测定细胞存活率:将MDA-MB-468细胞8000个/孔接种于 96孔板过夜,然后分别加入拉帕替尼(10μM)、黑五味子酸(20μM)及两者联用(10μM拉帕替尼和20μM黑五味子酸)处理;48小时后除去培养液,用10% TCA进行固定,以去离子水冲洗后晾干,加入SRB染液染色后,用1%的乙酸冲洗3次去除未结合的染料,室温晾干。加入Tris-base碱液(10mM,pH=10.5) 溶解与细胞蛋白结合的染料,测定530nm处吸光度值确定细胞的存活率。
实验结果见图4A-4D,图4A和图4B显示拉帕替尼(10μM)和黑五味子酸 (20μM)联合使用增加了AnnexinV-PI细胞的比例,说明联合使用促进了乳腺癌细胞的凋亡;图4C显示拉帕替尼(10μM)和黑五味子酸(20μM)联合使用增加了PRAP的切割;图4D说明拉帕替尼(10μM)和黑五味子酸(20μM)联合使用显著降低乳腺癌细胞的存活率;这些结果说明拉帕替尼(10μM)和黑五味子酸(20μM)联合使用促进肿瘤细胞的凋亡。
实施例5
所述3,4断裂的环阿尔廷型三萜类化合物黑五味子酸与拉帕替尼联用抑制裸鼠移植瘤生长。
用6周的BALB/c裸鼠(购买自湖南斯莱克景达实验动物有限公司),将乳腺癌细胞(MDA-MB-468)培养到良好状态,消化并离心收集细胞;用PBS清洗并重悬细胞,调整细胞密度为1×106/75μL,实验前将每个小鼠称重并且分组,分组及给药量为:药物组:拉帕替尼(50mg/kg)、黑五味子酸(50mg/kg)、联合用药(拉帕替尼(50mg/kg)和黑五味子酸(50mg/kg));对照组:0.1%DMSO。每组各5只;将准备好的1×106/50μL细胞原位注入乳腺,待肿瘤长至约50-100 mm3;按分组给予不同药物或0.1%DMSO进行治疗,每两天一次灌胃给药。每次给药前测量肿瘤的大小,4周后取出肿瘤,称量肿瘤重量。
实验结果见图5A-5C,结果可知,与单用拉帕替尼组相比,联合用药显著抑制了裸鼠移植瘤的生长,说明黑五味子酸可以提高拉帕替尼对肿瘤的敏感性,两者联用可以提高疗效。
实施例6
所述3,4断裂的环阿尔廷型三萜类化合物黑五味子酸与顺铂联用促进乳腺癌细胞死亡。
(1)细胞凋亡检测:将MDA-MB-468细胞200000个/孔接种于6孔板过夜,分别加顺铂(5μM)、黑五味子酸(20μM)及两者联用(5μM顺铂和20μM黑五味子酸)处理细胞,24小时后收集细胞进行Annexin V染色测定凋亡细胞的比例。
(2)Westron Blot检测细胞凋亡标志物:将MDA-MB-468细胞按照150000 的密度接种于12孔板中,16小时后分别加不同浓度的顺铂(0、2.5、5μM)及顺铂(0、2.5、5μM)联合黑五味子酸(20μM)处理12小时,每组均用0.1%DMSO 补足相同体积,收集蛋白裂解液,WesternBolt检测Caspase3以及PARP的切割等细胞凋亡标志物。
(3)SRB染色法测定细胞存活率:将MDA-MB-468细胞8000个/孔接种于 96孔板过夜,然后分别加顺铂(5μM)及顺铂(5μM)联合黑五味子酸(20μM) 处理细胞;48小时后除去培养液,用10%TCA进行固定,以去离子水冲洗后晾干,加入SRB染液染色后,用1%的乙酸冲洗3次去除未结合的染料,室温晾干。加入Tris-base碱液(10mM,pH=10.5)溶解与细胞蛋白结合的染料,测定530nm 处吸光度值确定细胞的存活率。
实验结果见图6A-6D,图6A和图6B显示顺铂(5μM)和黑五味子酸(20μM) 联合使用增加了AnnexinV-PI细胞的比例,说明联合使用促进了乳腺癌细胞的凋亡;图6C显示顺铂(5μM)和黑五味子酸(20μM)联合使用增加了cl-caspase3 的切割;图6D说明顺铂(5μM)和黑五味子酸(20μM)联合使用显著降低了乳腺癌细胞的存活率;这些结果说明顺铂(10μM)和黑五味子酸(20μM)联合使用促进肿瘤细胞的凋亡。
申请人声明,以上所述,仅是本申请的几个实施例,并非对本申请做任何形式的限制,虽然本申请以较佳实施例揭示如上,然而并非用以限制本申请,任何熟悉本专业的技术人员,在不脱离本申请技术方案的范围内,利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例,均属于技术方案范围内。
Claims (4)
1.3,4断裂的环阿尔廷型三萜类化合物在制备用于增加抗肿瘤药物治疗肿瘤的敏感性的药物中的用途,所述3,4断裂的环阿尔廷型三萜类化合物为黑五味子酸,所述抗肿瘤药物为拉帕替尼或顺铂,所述肿瘤为乳腺癌。
2.一种抗肿瘤药物组合物,其特征在于,所述药物组合物包括3,4断裂的环阿尔廷型三萜类化合物和易引起肿瘤细胞保护性自噬的抗肿瘤药物,所述3,4断裂的环阿尔廷型三萜类化合物为黑五味子酸,所述易引起肿瘤细胞保护性自噬的抗肿瘤药物为拉帕替尼或顺铂,所述肿瘤为乳腺癌。
3.如权利要求2所述药物组合物,其特征在于,所述药物组合物抑制肿瘤细胞生长或促进肿瘤细胞死亡。
4.如权利要求2至3任一项所述药物组合物,其特征在于,所述组合物还包括适于制备抗肿瘤药物的药用载体。
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New triterpenoids from Kadsura heteroclita and their cytotoxic activity;Wei Wang等;《Planta Medica》;20060210;第72卷(第5期);第450-457页 * |
Triterpenoids from Schisandra propinqua var. propinqua;Miao Liu等;《Natural Product Communications》;20160701;第11卷(第7期);第925-929页 * |
瘤枝五味子和育亨宾的化学成分及生物活性研究;刘叶;《中国博士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》;20181015(第10期);全文,尤其是第72页 * |
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Publication number | Publication date |
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CN111481534A (zh) | 2020-08-04 |
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