CN112535732B - 一种细胞周期蛋白及其抑制剂在制备增强胰腺癌放疗效果的药物中的应用 - Google Patents

一种细胞周期蛋白及其抑制剂在制备增强胰腺癌放疗效果的药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种细胞周期蛋白及其抑制剂在制备增强肿瘤放疗效果的药物中的应用。本发明试验结果说明，Craiobioside A具有提高胰腺癌细胞X射线疗效的活性，Craiobioside A可能是通过抑制胰腺癌细胞中CDK7蛋白的表达增强X射线的放疗效果。因此，Craiobioside A可以用于制备提高胰腺癌对X射线放疗效果的药物，可以用于制备胰腺癌进行X射线放疗的辅助药物。

Description

一种细胞周期蛋白及其抑制剂在制备增强胰腺癌放疗效果的 药物中的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种细胞周期蛋白及其抑制剂在制备增强胰腺癌放疗效果的药物中的应用。
背景技术
胰腺癌是“癌中之王”，具有“三高四低”的特点：高发病率、高复发转移率、高死亡率；低早期诊断率、低切除率、低药物有效率、低长期生存率。目前胰腺癌在全世界范围内位列癌症发病率的第14位，肿瘤相关死亡率的第7位。在美国，胰腺癌的发病率和死亡率在所有恶性肿瘤中占第4位，预计在2030年将成为第二大恶性肿瘤杀手。全球每年有超过20万人死于胰腺癌，总体发病率和死亡率逐年上升。虽然胰腺癌在中国的发病率不及欧美，但2017年在中国的发病率最高的10种恶性肿瘤中名列第6位。胰腺癌的死亡率在上海和其他经济发达地区位列男性的第6位，女性的第7位，且处于快速上升中。
胰腺癌恶性程度较高，且症状隐匿，就诊时常非早期，需接受综合治疗，在综合治疗中，放射治疗占有重要地位。
但是，胰腺癌对放射线的敏感性相对较弱，如果想提高放射治疗的效果，只有提高放射剂量或增加胰腺癌对放射线的敏感性。一味地提高放射剂量显然不现实，会导致正常细胞也受损，体质稍微弱一些的病人都难以承受。
因此，增加胰腺癌对放射线的敏感性是提高胰腺癌放疗效果的择优办法。目前已经有一些药物可以发挥这样的效果，但是依然不能满足临床需求。
化合物Craiobioside A是最早由Hua-Ping Zhang等制备(Grayananediterpenoids from the leaves ofCraiobiodendron yunnanense.Bioorganic&Medicinal Chemistry.2005)，Yong Li等后来发现该化合物具有镇痛作用(Antinociceptive Grayanoids from the Roots ofRhododendron molle.JournalofNatural Products.2015)。目前没有其它活性报道。
细胞周期蛋白依赖性激酶(Cyclin-dependent kinases,CDKs)是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其单体本身并不具有活性，必须与相应的细胞周期蛋白(Cyclins)结合形成有活性的异二聚体复合物发挥调节作用，可催化相应底物磷酸化，驱动细胞周期各项进程，依序完成DNA合成和有丝分裂，引起细胞的生长和增殖。CDK作为细胞周期的关键性激酶，其生理活性通过与细胞周期蛋白、CDK激活激酶和CDK抑制蛋白的相互作用进行调节。虽然各种细胞周期蛋白的水平在细胞周期处于不同阶段时会发生波动变化，但由于体内相应蛋白质的合成与蛋白酶体的降解维持相对平衡，总体来看正常细胞内的细胞周期依赖性激酶水平在整个细胞周期中保持相对稳定，以确保细胞周期依赖性激酶在需要的时候能够被激活从而发挥作用。大量研究表明，多数恶性肿瘤的发生和发展均与细胞周期调控功能紊乱有关，而CDK的过度活化是其中的重要原因之一。由于CDK在调节肿瘤细胞的增殖与凋亡中起关键作用，通过选择性抑制肿瘤组织中的CDKs活性，可以对肿瘤治疗起到积极的作用，所以对CDK抑制剂的研究已成为肿瘤治疗和开发新型靶向药物的热点领域。越来越多的研究表明，CDK中的CDK7与白血病、三阴性乳腺癌、小细胞肺癌、胃癌和神经母细胞瘤等肿瘤的发生密切相关，因此，CDK7被认为是治疗恶性肿瘤的一个潜在药物靶点(抗肿瘤新靶标CDK7及其抑制剂的研究进展，广东化工，2018年)。
发明内容
本发明是为了克服现有技术的不足，提供一种细胞周期蛋白及其抑制剂在制备增强胰腺癌放疗效果的药物中的应用，以制备胰腺癌放疗辅助药物。
实现本发明目的的技术方案为：
一种细胞周期蛋白CDK7或其抑制剂在制备增强胰腺癌放疗效果的药物中的应用。
进一步地，所述放疗为X射线放疗。
进一步地，所述抑制剂为Craiobioside A。
Craiobioside A用于制备胰腺癌X射线放疗辅助药物的医药用途。
在具体实施例中，与放疗组相比，低浓度给药组、高浓度给药组的细胞相对克隆率显著降低，且Craiobioside A浓度越高细胞相对克隆率越低，说明化合物Craiobioside A具有提高胰腺癌PANC-1、BxPC-3细胞X射线疗效的活性。
有益技术效果：
本发明试验说明，Craiobioside A具有提高胰腺癌细胞X射线疗效的活性，Craiobioside A可能是通过抑制胰腺癌细胞中CDK7蛋白的表达增强X射线的放疗效果。因此，Craiobioside A可以用于制备提高胰腺癌对X射线放疗效果的药物，可以用于制备X射线放疗辅助药物。
附图说明
图1为各组胰腺癌PANC-1细胞相对克隆率(A)和各组胰腺癌PANC-1细胞中细胞周期蛋白CDK7的表达水平(B)；
图2为各组胰腺癌BxPC-3细胞相对克隆率(A)和各组胰腺癌BxPC-3细胞中细胞周期蛋白CDK7的表达水平(B)。
具体实施方式
下面通过具体实施例阐述本发明的实质性内容，但不能以此限定本发明的保护范围。
实施例1
一、试验材料
胰腺癌PANC-1细胞购自武汉普诺赛生命科技有限公司；胎牛血清、DMEM培养基购自美国Gibco公司；青链霉素购自北京索莱宝科技有限公司；Craiobioside A的纯度为98.6％。
二、试验方法
1、细胞培养
将胰腺癌PANC-1细胞复苏后用含10％FBS和1％青链霉素的DMEM培养基于37℃、5％CO2恒温培养箱中培养，取对数生长期细胞用于试验。
2、分组、给药、放疗和细胞生长活性评价
取对数生长期的胰腺癌PANC-1细胞，用完全培养基制成细胞悬液，以1000个细胞/孔的密度接种于6孔板中，对照组、放疗组、低浓度给药组、高浓度给药组各一块6孔板，平行操作，于37℃、5％CO2恒温培养箱中培养过夜。次日，更换培养基继续培养，低浓度给药组和高浓度给药组分别使用含有200nM、500nM Craiobioside A的完全培养基培养，对照组和放疗组使用含有等量溶媒DMSO的完全培养基继续培养。继续培养1d后，将放疗组、低浓度给药组、高浓度给药组的培养板置于6MV X射线下照射(吸收剂量率400cGy/min，SSD100cm)，照射剂量为4Gy。照射完成后，各组均更换为不含药和溶媒的安全培养基继续培养10d，每2d更换一次完全培养基。培养结束后，弃去培养基，PBS洗涤3～5次，用无水甲醇固定10min，再用GIMSA染液染色10min，弃去染液，PBS洗涤3～5次，自然干燥后用倒置显微镜观察各组细胞克隆数量，＞50个细胞的集落计为1个克隆，以放疗组、低浓度给药组、高浓度给药组细胞克隆数量与对照组细胞克隆数量的比值计算放疗组、低浓度给药组、高浓度给药组的细胞相对克隆率，作为评价放疗组、低浓度给药组、高浓度给药组胰腺癌PANC-1细胞生长活性的指标。
3、Western blot法测定细胞周期蛋白CDK7的表达水平
取对数生长期的胰腺癌PANC-1细胞，用完全培养基制成细胞悬液，以1×105个细胞/孔的密度接种于24孔板中，对照组、低浓度给药组、高浓度给药组各5个复孔，于37℃、5％CO2恒温培养箱中培养过夜。次日，更换培养基继续培养，低浓度给药组和高浓度给药组分别使用含有200nM、500nM Craiobioside A的完全培养基培养，对照组使用含有等量溶媒DMSO的完全培养基继续培养。继续培养2d后，收集细胞，PBS洗涤，裂解细胞，收集细胞总蛋白，各组取等量总蛋白用Western blot法测定比较给药组组和对照组PANC-1细胞中CDK7蛋白的表达水平，内参为β-Actin，拍照、软件分析。
4、数据处理
采用SPSS17.0进行统计学分析，数据以均值±标准差表示，采用单因素方差分析One-wayANOVA检验方差齐性，并用Student’s-t test进行分析，p<0.05表示具有显著性差异。
三、试验结果
各组细胞相对克隆率如表1和图1中(A)所示，与放疗组相比，低浓度给药组、高浓度给药组的细胞相对克隆率显著降低，且Craiobioside A浓度越高细胞相对克隆率越低，说明化合物Craiobioside A具有提高胰腺癌PANC-1细胞X射线疗效的活性。
表1细胞克隆率
Figure BDA0002829258900000041
各组细胞周期蛋白CDK7的表达水平如图1中(B)所示，与对照组相比，低浓度、高浓度给药组PANC-1细胞中细胞周期蛋白CDK7的表达水平显著被抑制，说明Craiobioside A是一种CDK7抑制剂，Craiobioside A可能是通过抑制PANC-1细胞中CDK7蛋白的表达增强X射线的放疗效果。
实施例2
一、试验材料
胰腺癌BxPC-3细胞购自ATCC；胎牛血清、RPMI 1640培养基购自美国Gibco公司；青链霉素购自北京索莱宝科技有限公司；Craiobioside A的纯度为98.6％。
二、试验方法
1、细胞培养
将胰腺癌BxPC-3细胞复苏后用含10％FBS和1％青链霉素的RPMI 1640培养基于37℃、5％CO2恒温培养箱中培养，取对数生长期细胞用于试验。
2、分组、给药、放疗和细胞生长活性评价
取对数生长期的胰腺癌BxPC-3细胞，用完全培养基制成细胞悬液，以1000个细胞/孔的密度接种于6孔板中，对照组、放疗组、低浓度给药组、高浓度给药组各一块6孔板，平行操作，于37℃、5％CO2恒温培养箱中培养过夜。次日，更换培养基继续培养，低浓度给药组和高浓度给药组分别使用含有200nM、500nM Craiobioside A的完全培养基培养，对照组和放疗组使用含有等量溶媒DMSO的完全培养基继续培养。继续培养1d后，将放疗组、低浓度给药组、高浓度给药组的培养板置于6MV X射线下照射(吸收剂量率400cGy/min，SSD100cm)，照射剂量为4Gy。照射完成后，各组均更换为不含药和溶媒的安全培养基继续培养10d，每2d更换一次完全培养基。培养结束后，弃去培养基，PBS洗涤3～5次，用无水甲醇固定10min，再用GIMSA染液染色10min，弃去染液，PBS洗涤3～5次，自然干燥后用倒置显微镜观察各组细胞克隆数量，＞50个细胞的集落计为1个克隆，以放疗组、低浓度给药组、高浓度给药组细胞克隆数量与对照组细胞克隆数量的比值计算放疗组、低浓度给药组、高浓度给药组的细胞相对克隆率，作为评价放疗组、低浓度给药组、高浓度给药组胰腺癌BxPC-3细胞生长活性的指标。
3、Western blot法测定细胞周期蛋白CDK7的表达水平
取对数生长期的胰腺癌BxPC-3细胞，用完全培养基制成细胞悬液，以1×105个细胞/孔的密度接种于24孔板中，对照组、低浓度给药组、高浓度给药组各5个复孔，于37℃、5％CO2恒温培养箱中培养过夜。次日，更换培养基继续培养，低浓度给药组和高浓度给药组分别使用含有200nM、500nM Craiobioside A的完全培养基培养，对照组使用含有等量溶媒DMSO的完全培养基继续培养。继续培养2d后，收集细胞，PBS洗涤，裂解细胞，收集细胞总蛋白，各组取等量总蛋白用Western blot法测定比较给药组组和对照组BxPC-3细胞中CDK7蛋白的表达水平，内参为β-Actin，拍照、软件分析。
4、数据处理
采用SPSS17.0进行统计学分析，数据以均值±标准差表示，采用单因素方差分析One-way ANOVA检验方差齐性，并用Student’s-t test进行分析，p<0.05表示具有显著性差异。
三、试验结果
各组细胞相对克隆率如表2和图2中(A)所示，与放疗组相比，低浓度给药组、高浓度给药组的细胞相对克隆率显著降低，且Craiobioside A浓度越高细胞相对克隆率越低，说明化合物Craiobioside A具有提高胰腺癌BxPC-3细胞X射线疗效的活性。
表2细胞克隆率
Figure BDA0002829258900000051
各组细胞周期蛋白CDK7的表达水平如图2中(B)所示，与对照组相比，低浓度、高浓度给药组BxPC-3细胞中细胞周期蛋白CDK7的表达水平显著被抑制，说明Craiobioside A是一种CDK7抑制剂，Craiobioside A可能是通过抑制BxPC-3细胞中CDK7蛋白的表达增强X射线的放疗效果。
实施例1、2的试验结果说明，Craiobioside A具有提高胰腺癌细胞X射线疗效的活性，Craiobioside A可能是通过抑制胰腺癌细胞中CDK7蛋白的表达增强X射线的放疗效果。因此，Craiobioside A可以用于制备提高胰腺癌对X射线放疗效果的药物，可以用于制备胰腺癌进行X射线放疗的辅助药物。

Claims (1)

1.一种细胞周期蛋白CDK7的抑制剂在制备增强胰腺癌放疗效果的药物中的应用；其中，所述放疗为X射线放疗，所述抑制剂为Craiobioside A。
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