CN107793410B

CN107793410B - 苯并硒二唑的衍生物及其应用

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Publication number: CN107793410B
Application number: CN201711006386.7A
Authority: CN
Inventors: 陈填烽; 曾德龙; 邓树林
Original assignee: Jinan University
Current assignee: Jinan University
Priority date: 2017-10-24
Filing date: 2017-10-24
Publication date: 2021-04-02
Anticipated expiration: 2037-10-24
Also published as: CN107793410A

Abstract

本发明公开了苯并硒二唑衍生物结构及其应用。本发明基于正常细胞和肿瘤细胞之间的差异，对具有肿瘤活性的硒二唑进行修饰，提高抗肿瘤药物的利用度，降低毒副性。同时利用吲哚基团的荧光性质，有效地对肿瘤细胞和组织成像，实现诊断治疗的功效。对硒二唑的抗肿瘤作用进行探究，发现靶向硒二唑具有良好的抗肿瘤活性，并可显著地增加X射线放疗和NK免疫细胞杀伤肿瘤的能力，具有广阔的应用前景。本发明原料价廉易得，产物重复性和稳定性良好。

Description

苯并硒二唑的衍生物及其应用

技术领域

本发明属于化学合成药物领域，具体涉及了苯并硒二唑的衍生物结构及其应用。

背景技术

随着社会的发展，人类生活习惯，饮食方式，出行方式等各方面均发生了很大的改变。随之而来癌症、心血管疾病以及流行病等潜在的致死风险大大提高。人类癌症发病率和死亡率一直在上升。癌症成为了全人类除心血管疾病外的主要健康杀手。在大多数癌症治疗手段中，肿瘤诊段治疗是一种将治疗和诊断成像相结合的综合治疗策略，它能够大大提高肿瘤的治疗效率。[Lohr J G,et al.Cancer cell. 2014,25:91-101.]因此，开发具有肿瘤诊断治疗的癌症治疗策略具有十分重要的研究意义。

近年来，硒在预防和治疗抗肿瘤方面作用越来越受到重视和研究。通过硒摄入预防和治疗癌症临床研究证实，硒补充剂可有效减少乳腺癌，肺癌，结肠癌等疾病的发生[Clark L C,et al.JAMA. 1996；276:1957-63.]。硒对人体健康的作用越来越受到重视，但相关研究也表明硒摄入量过多，也可能增加患II型糖尿病的风险[Surai P F andFisinin V I,Asian-Australasian journal of animal sciences.2015, 28:730.]。这表明一方面硒的代谢在人体内的作用还有待进一步深入探索，另一方面，鉴于硒的生物学，药理学活性，特别是对癌症具有很好的控制作用。近几十年来，含硒抗肿瘤药物的合成与临床试验也是科学研究的热点[Wang J,et al.Carbohydrate Polymers.2016, 152:70-8.]。有机硒化合物作为生物相容性良好的化合物受到广泛关注和研究。

目前，化疗所用的抗肿瘤药物多种多样，但这些药物对肿瘤细胞和正常细胞选择性差，使其在治疗癌细胞的同时，也影响了正常机体功能。传统的化疗药物从其作用机制上可分为一些DNA修饰剂、DNA 合成抑制剂、拓扑异构酶抑制剂和微管抑制剂等等。它们主要通过引起DNA损伤、阻止DNA合成或干扰有丝分裂过程等作用，能选择性的杀死快速分裂的细胞。由于癌细胞在体内不受控制地分裂与增殖，因此容易被这类化疗药物杀死，但人体中一些细胞分裂较旺盛的组织，如造血组织、毛囊组织、消化道中的细胞和生殖细胞等同样受到严重的抑制，造成骨髓抑制、脱发、恶心、呕吐、生殖功能受影响等严重的毒副作用。此外，大多药物经过肝脏代谢及肾脏排出，药物对肝脏及肾脏均具有较强的毒性。传统化疗药物的靶向性低、毒副作用高的特点严重限制了它们的应用。

因此，提高药物化疗药物的特异性，减少化疗药物的毒性作用是肿瘤治疗迫切解决的问题。开发安全无毒、具有肿瘤特异性抗肿瘤药物势在必行。

发明内容

为解决现有技术的缺点和不足，本发明的首要目的在于提供苯并硒二唑的衍生物；另一目的在于提供上述苯并硒二唑的衍生物的应用。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

苯并硒二唑的衍生物，其化学结构式为：

其中化学式中R是肿瘤靶向基团，或含吲哚的荧光基团，或串联含吲哚的荧光基团与肿瘤靶向基团，其中荧光基团与衍生物本体连接。

其中肿瘤靶向基团为RGD多肽、生物素、叶酸、转铁蛋白、穿膜肽、MUC-1附膜蛋白、半乳糖胺、新生血管靶向肽、粒细胞巨噬细胞刺激因子中的一种。

其中荧光基团为含氨基、羧基、羟基和巯基的吲哚衍生物，所述荧光基团通过以上官能团与肿瘤靶向基团串联连接。

其中化学结构式为：

其中化学结构式为：

所述衍生物作为癌症治疗药物单独使用或联合其他化疗药物使用。

所述衍生物在细胞成像的应用，所述衍生物制成分子探针。

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

(1)本发明对具有抗肿瘤活性的硒二唑进行肿瘤靶向性修饰，减低了硒二唑在体内应用的毒副性。在体外抗肿瘤实验中，所合成的药物对肿瘤细胞的增殖具有明显的抑制效果，且对正常细胞毒副性相对较低。

(2)通过在苯并硒二唑上偶联苯并咪唑，以及荧光基团引入取代基，共价连接靶向基团对药物进行改性，该方法具有良好的可操作性和重现性。

(3)所合成苯并硒二唑衍生物具有良好的绿色荧光性质，可以用于在细胞成像。

(4)合成的化合物具有可增敏放疗、免疫治疗和化疗等其他药物或方法的抗肿瘤作用。

(5)本发明所得产物的原料廉价易得，合成和纯化步骤可操作性强，可通过优化工艺，适当扩大合成规模，实现药物的商业化和应用。

附图说明

图1为苯并硒二唑衍生物(SeD)的化学结构图；

图2为RGD靶向修饰后(RGD-SeD)的化学结构图；

图3中图(a)是SeD与RGD-SeD及联合X射线对HepG2细胞的IC₅₀，图(b)是SeD与RGD-SeD及联合X射线对L02细胞的IC₅₀；

图4为HepG2细胞对SeD与RGD-SeD的吸收；

图5为RGD-SeD在HepG2细胞中的荧光定位；

图6为RGD-SeD及X射线处理后用流式细胞仪检测的HepG2细胞周期分布图；

图7为图5结果的统计图；

图8为RGD-SeD及X射线对HepG2细胞内ROS的影响；

图9为RGD-SeD及X射线对HepG2细胞DNA损伤和凋亡相关蛋白表达的影响；图(a)是反应细胞内DNA损伤的标记，图(b)是反应细胞发生凋亡的标记；

图10为RGD-SeD对NK细胞杀伤MCF-7细胞能力的影响；

图11为苯并硒二唑的衍生物的化学结构通式图。

具体实施方式

本发明用下列实施例来进一步说明本发明，但本发明的实施方式并不限于以下实施例。

实施例1

5-(2-取代吲哚基苯并咪唑)苯并[1,2,5]硒二唑衍生物的合成与表征

(1)称取30mmol 3,3'-二氨基联苯胺于1L烧瓶中，用600ml 纯水(加入适量HCl)充分溶解。称取30mmol二氧化硒(SeO₂) 溶于30mL热水，溶解后转入恒压滴液漏斗，使其缓慢滴入烧瓶中。在常温下搅拌反应1.5h。有大量黄色固体析出，反应结束，抽滤，滤渣重溶用氢氧化钠溶液调至中性，再次抽滤得到目标产物，烘干，为红棕色固体粉末，产率95％。

(2)称取步骤(1)产物3mmol(4-(苯并[c][1,2,5]硒二唑-6-yl) 苯-1,2-二氨基)于100mL烧瓶中，加入30mL二甲基甲酰胺(DMF) 充分溶解。加入3mmol N-乙酸-3-吲哚甲醛，再加入适量对甲基苯磺酸作为催化剂。80℃，搅拌反应1h。反应结束后冷却至室温，倒入加有适量碳酸钠(Na₂CO₃)的溶液中搅拌10min，抽滤，滤液转入500mL氯化锂(2M)水溶液，析出大量黄色固体，抽滤，得到粗产物，烘干。将粗产物以管柱色谱分析法分离提纯(乙酸乙酯：石油醚＝5：1为洗脱液)得到深黄色固体即目标产物5-(2-取代吲哚基苯并咪唑)苯并[1,2,5]硒二唑衍生物(SeD)，产率60％。

RGD-5-(2-取代吲哚基苯并咪唑)苯并[1,2,5]硒二唑的合成与表征

称取(2)中SeD 1mmol溶于DMF中，加入1.2mmol 1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化2h，加入1mmol环状RGD多肽[c(RGDfK)]，加入适当三乙胺催化，继续反应24h。反应结束，6000r/min离心取上清加入到乙醚当中析出淡黄色固体，继续用乙醚洗2-3次，烘干，用乙腈-水作洗脱剂HPLC分离提纯，冷冻干燥，得到淡黄色纯品 RGD-5-(2-取代吲哚基苯并咪唑)苯并[1,2,5]硒二唑(RGD-SeD),产率 80％。

利用ESI-TOFMS、CHN元素分析进行表征

SeD:Yellow solid(60％)；elemental analysis calcd for C₂₃H₁₅N₅O₂Se(％):C,58.48；H,3.20；N,14.83；found(％):C,58.80； H,3.28；N,14.72；ESI-MS(in CH₃OH):m/zcalcd for C₂₃H₁₅N₅O₂Se (M+H)⁺473.9；found 474.9.

RGD-SeD:Yellow solid(80％)；elemental analysis calcd for C₅₀H₅₄N₁₄O₈Se(％):C,56.76；H,5.14；N,18.53；found(％):C,56.80； H,5.28；N,18.12；ESI-MS(inCH₃OH):m/z calcd for C₅₀H₅₄N₁₄O₈Se (M+H)⁺1059.9；found 1059.9.

SeD与RGD-SeD的结构如图1和图2所示。

实施例2

RGD-5-(2-取代吲哚基苯并咪唑)苯并[1,2,5]硒二唑RGD-SeD与SeD 的与抗肿瘤活性与放疗增敏活性

本例通过MTT(噻唑蓝)法评价实施例1中合成的SeD与 RGD-SeD的体外抗肿瘤活性与放疗增敏性。

实验用到的人肝癌细胞HepG2以及人体正常肝组织L02细胞分别购于美国ATCC和中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。用含10％FBS(Gibco，Life technology)的DMEM培养基(Gibco， Life technology)培养于含5％CO₂，37℃细胞培养箱中。

HepG2和L02细胞培养至对数生长期，经0.25％胰酶(含0.02％ EDTA)消化，计数后，以接种到96孔板中，每孔接种2000个细胞，培养基体积为100μL。置于培养箱中24h，待细胞贴壁。然后每孔加入用培养基稀释的不同浓度的药物各100μl，每个药物浓度均分三组平行。对照组加入100μL DMEM培养基。每个处理至少铺3个复孔，细胞置于37℃，5％CO₂培养24h。细胞经药物作用处理72h后，每孔加入30μl MTT孵育3.5h后抽去每个孔的上清，并再次向每个孔加入150μl DMSO，振荡摇匀10min，最后，在多功能酶标仪上测定读取570nm处的吸光值，并作图计算不同细胞不同药物处理组的存活率和半抑制率(IC₅₀，存活率为50％时的药物浓度)。

细胞的存活率按以下公式计算：存活率＝处理组吸光值/对照组吸光值×100％。

MTT法检测SeD与RGD-SeD的放疗增敏活性，细胞铺板与加药与以上步骤相同，仅在加药6h后，将细胞进行X射线辐照，辐照剂量为8Gy，余下处理步骤也相同。

经计算，SeD与RGD-SeD对HepG2与L02细胞的IC₅₀，以及 X射线共同处理之后的IC₅₀如图3所示。X射线处理的SeD与 RGD-SeD对肿瘤细胞HepG2的IC₅₀均小于对正常细胞L02的IC₅₀，可见硒二唑化合物对肿瘤细胞有选择毒性。此外，有靶向修饰的RGD-SeD对HepG2的IC₅₀显著小于SeD，表明靶向修饰可进一步提高化合物对肿瘤细胞的选择作用性；而RGD-SeD与SeD对L02 细胞的IC₅₀相差不大，表明靶向修饰不改变硒二唑化合物对正常细胞的作用。此外，从文献数据(He et al.Journal of Materials Chemistry B,2015:8383-8393)得到，传统化疗药物顺铂对HepG2 和L02的IC₅₀分别为13.6和10.3μM，说明顺铂对肿瘤细胞与正常细胞没有选择杀伤作用。

在联合X射线处理后，RGD-SeD或SeD对HepG2细胞的IC50 均显著降低，表明了RGD-SeD或SeD与X射线放疗具有良好的协同作用，有望进一步开发为放疗增敏剂。

实施例3

RGD-5-(2-取代吲哚基苯并咪唑)苯并[1,2,5]硒二唑的细胞吸收及在细胞中的定位

本例通过检测RGD-SeD是否通过增加其被肿瘤细胞的吸收来提高其对肿瘤细胞的选择杀伤作用。

HepG2和L02细胞培养至对数生长期，经0.25％胰酶(含0.02％ EDTA)消化，计数后，铺于10cm培养皿中，每皿铺1.5×10⁶个细胞。待细胞贴壁后，分别加入50μM(终浓度)SeD或RGD-SeD。于0、2、4、8h弃去培养基，并用PBS洗3次，0.25％胰酶消化，收集细胞；与5ml浓硝酸：高氯酸(体积比3：1)混合后，放入硝化炉中180℃硝化2h,加入6mol/L盐酸还原30min，最后用原子荧光光谱仪检测硒的含量。实验结果如图4所示，在不同时间点 HepG2细胞对RGD-SeD的吸收均显著高于L02细胞，进一步证明了RGD-SeD的肿瘤细胞靶向性特点。

此外，由于RGD-SeD中含有可发荧光的吲哚基团，因此 RGD-SeD可以在荧光显微镜下观察。为检测RGD-SeD进入细胞后在细胞内的分布，HepG2细胞2×10⁶/ml铺于6孔板中(每孔2ml)，经24h贴壁后，加入50nM(终浓度)溶酶体荧光染料

Red DND-99(molecular

life technologies^TM)孵育30min，再加入RGD-SeD(终浓度50μM)，孵育0、2、4、8h。孵育结束前 5min加入300nM(终浓度)DAPI，5min后弃掉培养基，PBS洗一次后换新鲜培养基，用荧光显微镜(EOVS FL AUTO,life technologies^TM)拍照。实验结果如图5所示，随着时间延长， RGD-SeD进入细胞越多。进入细胞后RGD-SeD主要定位在细胞质中。

实施例4

RGD-5-(2-取代吲哚基苯并咪唑)苯并[1,2,5]硒二唑对肿瘤细胞周期与凋亡的影响

为检测合成的硒二唑衍生物对肿瘤细胞周期和凋亡的影响，通过流式细胞术来检测细胞周期的变化。

在6cm培养皿中接种HepG2肿瘤细胞(细胞密度为2× 10⁴/ml)，培养24h，待细胞呈对数生长后，在药物处理组加入20μM RGD-SeD；放疗组用X射线照射，剂量为8Gy；联合处理组加入 20μM RGD-SeD 6h后用X射线照射(8Gy)；对照组只加入药物溶剂。24h后用0.25％胰酶(含0.02％(m/v)EDTA)将细胞消化，再用PBS洗涤培养皿3次，收集到全部细胞于15ml离心管。用离心机1500r/min离心5min收集细胞。每管用4ml冷冻的70％乙醇重悬，于4℃冰箱中放置固定过夜。第二天用离心机1500r/min 离心5min，倒掉上清并用PBS洗涤一次，再次离心收集细胞，最后每管加入500μl 50ug/ml PI(碘化丙啶，购于Sigma公司)染液同时将细胞轻轻吹打分散，然后避光孵育1小时，随后细胞经400 目网筛过滤，再Beckman流式细胞仪检测分析染色细胞。每个样品最少收集10000个细胞。最后用MultiCycle软件分析细胞周期各阶段的比例，以DNA含量来反映G0/G1、S、G2/M期细胞数量的比值，亚二倍体Sub-G1峰来表示凋亡细胞比例。

如图6和图7所示，当用RGD-SeD处理后，HepG2细胞G2/M 期比例增加，并出现subG1细胞，说明RGD-SeD可引起HepG2 细胞的G2/M期阻滞并进一步导致凋亡。8Gy的X射线可显著地引起HepG2细胞G2/M期阻滞，但24h细胞未发生凋亡。而联合 RGD-SeD与X射线处理，可显明增加G2/M期与凋亡细胞的比例，说明RGD-SeD不但本身具有抗肿瘤活性，还具有良好的放疗增敏作用。

实施例5

RGD-5-(2-取代吲哚基苯并咪唑)苯并[1,2,5]硒二唑对肿瘤细胞活性氧(ROS)的影响

本例检测RGD-SeD处理对肿瘤细胞中ROS的影响。

HepG2细胞2×10⁴/ml密度接种于96孔板，每孔100μl。待细胞贴壁后，加入100μl用培养基稀释的RGD-SeD(终浓度10μM)， 6h后用X射线辐照，剂量8Gy。立即加入10μM DCFH-DA(2,7- 二氯二氢荧光素二乙酸酯)，于多功能酶标仪中以488nm波长激发，检测525nm波长的荧光强度。结果如图8所示，单独RGD-SeD 处理，细胞内ROS水平变化不明显。X射线单独处理可使细胞中的ROS显著上升，而RGD-SeD与X射线联合处理，细胞内ROS 增加更为显著。ROS过量产生导致细胞DNA损伤是射线杀死细胞的主要原因之一，本例的结果说明RGD-SeD极大地提高射线放疗的效果，可作为良好的放疗增敏剂。

实施例6

RGD-5-(2-取代吲哚基苯并咪唑)苯并[1,2,5]硒二唑联合X射线对 HepG2细胞DNA损伤与凋亡通路相关蛋白的影响

本例检测细胞内DNA损伤通路和凋亡相关蛋白的变化，阐明 RGD-SeD和X射线引起肿瘤细胞凋亡的机制。

将2×10⁶HepG2细胞铺于10cm培养皿中，培养过夜待其贴壁。加入20μM RGD-SeD，6h后用X射线辐照8Gy。24h后弃去培养基，用RIPA裂解液(50mM Tris-Cl pH 7.4,150mMNaCl,1％ NP-40,0.5％sodium deoxycholate,0.1％SDS)裂解细胞提取蛋白。利用Western blot检测与DNA损伤相关蛋白的磷酸化水平，凋亡相关蛋白的表达水平，以actin作为内参。实验结果如图9所示，反应DNA损伤的蛋白p53、p-p53(Ser15)、p-ATM(Ser1981)、p-ATR(Ser428)、p-H2A.X(Ser139)在RGD-SeD和X射线处理后表达均上升，反应了两者均可使细胞的DNA发生损伤。而RGD-SeD 和X射线共同处理则引起更强的变化，同样说明了RGD-SeD与放疗的协同作用。凋亡相关蛋白检测的结果与此类似，RGD-SeD与 X射线共同处理使PARP、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的切割形式较两者单独处理时显著增加，反应了凋亡的发生。

实施例7

RGD-5-(2-取代吲哚基苯并咪唑)苯并[1,2,5]硒二唑增强NK免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤作用

本实施例检测了RGD-SeD对NK免疫细胞杀伤肿瘤细胞的活性影响。

MCF-7肿瘤细胞密度2×10⁴个/ml接种于96孔板中，孵育24h，加入RGD-SeD，同时每组加入相对肿瘤细胞不同比例的NK细胞，肿瘤细胞与NK细胞相应比例为1：2.5、1：5、1：10。继续放回培养箱孵育24h，抽掉培养基以及免疫细胞，并用PBS洗两次，再次加入DMEM培养基，并加入30μl浓度为5mg/ml的MTT溶液，孵育3h后抽去每个孔的上清，并再次向每个孔加入150μl DMSO，振荡摇匀10min，最后，在多功能酶标仪上测定读取570nm处的吸光值，并计算不同细胞不同药物处理以及免疫细胞共同作用肿瘤细胞后肿瘤的存活率。实验结果如图10所示，测试的8个不同来源的NK细胞都能识别并杀伤MCF-7细胞，并且杀伤作用随NK细胞的比例增加而增加。在使用的浓度下RGD-SeD对MCF-7的抑制率为 25％左右(细胞存活率约75％)。而NK细胞与RGD-SeD同时作用 MCF-7，MCF-7的存活率显著低于NK细胞单独处理的结果，表明 RGD-SeD能极大的提高NK细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。

本发明的实施方式不限于此，按照本发明的上述内容，利用本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，本发明还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更，均落在本发明权利保护范围之内。

Claims

1.苯并硒二唑的衍生物，其特征在于，其化学结构式为：

或

。

2.一种癌症治疗药物，其特征在于，包括权利要求1所述的苯并硒二唑的衍生物。

3.一种分子探针，其特征在于，由权利要求1所述苯并硒二唑的衍生物制成，用于细胞成像。