CN101307038B - 4-苄基哌连乙亚胺酰(亚胺甲基苯)肼类化合物、其制备方法、药物组合物和用途 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及4-苄基哌连乙亚胺酰(亚胺甲基苯)肼类化合物、其制备方法、药物组合物和用途。本发明的化合物具有下式所示的结构：其中，X可以是羧酸酯基(ROCO)；并且R1、R2、R3和R4各自独立地可以是氢原子、羟基、卤素、烯基、烷基或羧基。动物体内和体外细胞实验证明，本发明的化合物可用于治疗癌症。
Description
技术领域
本发明属于有机化学技术领域，涉及一系列具有抗癌活性的新化合物及其合成方法，特别涉及用于合成4-苄基哌连乙亚胺酰(亚胺甲基苯)肼和4-苄基哌连乙酰(亚胺甲基苯)肼类化合物的简单“一锅煮法”方法。本发明还涉及包含4-苄基哌连乙亚胺酰(亚胺甲基苯)肼类化合物的药物组合物及该化合物的用途。
背景技术
癌症是严重影响人类健康的一大类疾病。世界各国的制药公司投入大量的财力研制新药去攻克高死亡率的癌症。对晚期癌症的治疗，目前临床主要是采用化学疗法。然而，目前临床上所用的化学药物都是具有细胞毒性的化合物，它们对许多器官都具有毒性作用，并能杀死非癌细胞。
分子靶向治疗是近年内治疗肿瘤的一个新途径。肿瘤的发生、发展与细胞增殖、凋亡等信号传导通路中某一个环节密切相关。在信号传导途径中，近年来人们在活细胞内发现了一类重要的蛋白质叫做前半胱天冬酶，当这种蛋白质被活化为半胱天冬酶后，就能导致程序性的细胞死亡。但在癌细胞内从前半胱天冬酶到半胱天冬酶的信号传导途径被打断了，结果癌细胞就不会被破坏死亡从而增长为肿瘤细胞。如果用一个化学合成的小分子化合物直接激活前半胱天冬酶转变到半胱天冬酶，就能够诱使癌细胞死亡。这种化合物就可以作为分子靶向药物，通过细胞自身的机制来破坏细胞，而不是直接损伤细胞，从而减少药物副作用的发生。
因此，需要合成并筛选出能够活化前半胱天冬酶、具有抗肿瘤活性的活性化合物。含有哌嗪环的化合物大多是具有生物活性的一类杂环化合物，特别是很多抗癌的药物都含有含氮的杂环。因此，设计、筛选、合成含有哌嗪的杂环是寻找抗癌药物的一个热点。
发明内容
本发明的一个目的是提供新的4-苄基哌连乙亚胺酰(亚胺甲基苯)肼类化合物。
本发明的再一个目的是提供一种包含本发明4-苄基哌连乙亚胺酰(亚胺甲基苯)肼类化合物的药物组合物。
本发明的另一个目的是提供一种制备本发明4-苄基哌连乙亚胺酰(亚胺甲基苯)肼类化合物的方法。
本发明的再一个目的是提供本发明4-苄基哌连乙亚胺酰(亚胺甲基苯)肼类化合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
本发明的最后一个目的是利用本发明提供的新方法合成已知的杂环化合物4-苄基哌连乙酰(亚胺甲基苯)肼。
根据本发明的一方面，提供具有下式所示结构的化合物，或其药学上可接受的盐，
其中，
R1、R2、R3和R4各自独立地是氢原子、羟基、卤素、烯基(如烯丙基、2-丁烯基等)、烷基(如甲基、乙基、丙基等)。优选，其中R1和R2为氢原子，R3为羟基，并且R4为烯丙基。
根据本发明的另一方面，提供一种药物组合物，它包含本发明4-苄基哌连乙亚胺酰(亚胺甲基苯)肼类化合物，或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的赋形剂。
根据本发明的再一方面，提供一种制备本发明4-苄基哌连乙亚胺酰(亚胺甲基苯)肼类化合物的方法，它包括如下步骤：
(1)在无水条件下，使氯乙腈、乙醇和氯化氢在有机溶剂中反应，生成2-氯乙酰亚胺乙酯盐酸盐；
(2)在碱的存在下，使所得到的2-氯乙酰亚胺乙酯盐酸盐与下式的化合物
其中，R1和R2各自独立地是氢原子、羟基、卤素、烯基、烷基或羧基，在适合的有机溶剂中反应，生成下式的化合物，
其中，R1和R2各自独立地是氢原子、羟基、卤素、烯基、烷基；
(3)在无水条件下，使步骤(2)中得到的产物、肼与下式的化合物
其中，R3和R4各自独立地是氢原子、羟基、卤素、烯基、烷基，在适合的有机溶剂中进行“一锅煮法”反应，生成下式的化合物，
其中，R1、R2、R3和R4各自独立地是氢原子、羟基、卤素、烯基、烷基或羧基；并且
根据本发明的方法，其中步骤(1)中所述的有机溶剂可以为乙醚；步骤(2)中所述的有机溶剂可以为丙酮并且所述碱可以为三乙胺；步骤(3)中所述的有机溶剂可以为乙醇。
本发明“一锅煮法”合成4-苄基哌连乙亚胺酰(亚胺甲基苯)肼的合成路线是：
根据本发明的再一方面，提供本发明的4-苄基哌连乙亚胺酰(亚胺甲基苯)肼类化合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。其中，所述癌症例如为肝癌或肺癌。
根据本发明的最后一个目的可以用本发明的“一锅煮法”成功合成了另一类具有生物活性的杂环化合物4-苄基哌连乙酰(亚胺甲基苯)肼。其合成路线如下：
对4-苄基哌连乙亚胺酰(亚胺甲基苯)肼衍生物的活性研究结果表明，化合物4-苄基哌连乙亚胺酰(N-胺基亚氨甲基-3-烯丙基-2-羟基苯)肼能够选择性地杀死某些癌细胞，具有很强的抗癌活性，并且能够抑制肿瘤的生长，与其它的抗癌药物相比，显示出具有高效、选择性和副作用较小等优点。
附图说明
图1显示了GS-1A对Hepa G2细胞生长的影响。
图2显示了GS-1A对A549细胞生长的影响。
图3显示了GS-1A诱导Hepa G2细胞的凋亡。
图4显示了GS-1A能够激活细胞内半胱天冬酶-3的活性。
图5显示了GS-1A能够抑制体内肿瘤的生长。
具体实施方式
下面结合说明书附图，以4-苄基哌连乙亚胺酰(N-胺基亚氨甲基-3-烯丙基-2-羟基苯)肼和4-苄基哌连乙酰(N-胺基亚氨甲基-3-烯丙基-2-羟基苯)肼为例，详细说明本发明的实施方式。
实施例1. 4-苄基哌连乙亚胺酰(N-胺基亚氨甲基-3-
烯丙基-2-羟基苯)肼的合成
步骤1. 在冰水冷却、电磁搅拌的条件下，将10克(130毫摩尔)的氯乙腈和6.1克(130毫摩尔)无水乙醇溶于100毫升的无水乙醚中。向反应液中通入干燥的氯化氢气体，约40分钟后有大量白色固体析出，过滤出固体，固体用无水乙醚洗涤三次，抽干，得到16克2-氯乙酰亚胺乙酯盐酸盐，产率98％。氢谱(400MHz，D2O)：4.24(q，2H)；4.04(s，2H)；1.30(t，3H)。
步骤2. 在室愠、电磁搅拌的条件下，向装有10.58克(60毫摩尔)的1-苄基哌嗪和9.50克(60毫摩尔)的2-氯乙酰亚胺乙酯盐酸盐和100毫升丙酮溶液反应瓶中，滴加9.11克(90毫摩尔)的三乙胺。反应液加热回流48小时后，停止反应，蒸去溶剂。产物溶在100毫升的乙酸乙酯中，各用20毫升水洗两次。有机相经硫酸镁干燥，蒸去溶剂，得到的产物用柱色谱法分离，得到8.8克红色液体4-苄基哌连亚胺酰乙酯，产率59％。氢谱(400MHz，CDCl3)：7.34-7.56(m，5H)；4.95(s，1H)；4.13-4.25(q，2H)；4.08(s，2H)；3.26(s，2H)；2.95-3.07(m，7H)；1.25(t，3H)。
步骤3. 在300毫升的圆底烧瓶中加入2.61克(10毫摩尔)的4-苄基哌连乙亚胺酰乙酯、1.62克(10毫摩尔)的3-烯丙基-2-羟基苯甲醛和50毫升无水乙醇。搅拌条件下缓慢滴加0.48克(15毫摩尔)的无水肼。反应加热回流48小时(TLC检测)，停止反应，蒸去乙醇，得到的固体用乙醇、正己烷双相重结晶，得到3.2克标题产物4-苄基哌连乙亚胺酰(N-胺基亚氨甲基-3-烯丙基-2-羟基苯)肼，产率80％。氢谱(400MHz，D2O)：11.24(1H)；10.01(1H)；8.44(1H)；7.20-7.32(5H)；7.10(2H)；6.82(1H)；5.98-6.06(1H)；5.04-5.07(2H)；3.46(2H)；3.19(2H)；2.63(8H)。
实施例2. 4-苄基哌连乙酰(N-胺基亚氨甲基-3-
烯丙基-2-羟基苯)肼的“一锅煮法”合成
步骤1. 在室愠、电磁搅拌的条件下，向装有10.58克(60毫摩尔)的1-苄基哌嗪和7.35克(60毫摩尔)的2-氯乙酸乙酯和100毫升丙酮溶液反应瓶中，加入11.1克(80毫摩尔)的碳酸钾。反应液加热回流48小时后，停止反应，蒸去溶剂。产物溶在100毫升的乙酸乙酯中，各用20毫升水洗两次。有机相经硫酸镁干燥，蒸去溶剂，得到的产物用柱色谱法分离，得到12.5克液体4-苄基哌连乙酸乙酯，产率80％。
步骤2. 在300毫升的圆底烧瓶中加入2.62克(10毫摩尔)的4-苄基哌连乙亚胺酰乙酯、1.62克(10毫摩尔)的3-烯丙基-2-羟基苯甲醛和50毫升无水乙醇。搅拌条件下缓慢滴加0.48克(15毫摩尔)的无水肼。反应加热回流48小时(TLC检测)，停止反应，蒸去乙醇，得到的固体用乙醇、正己烷双相重结晶，得到3.4克标题产物4-苄基哌连乙酰(N-胺基亚氨甲基-3-烯丙基-2-羟基苯)肼，产率85％，熔点130-132℃与文献报导相同。
本发明中我们对4-苄基哌连乙亚胺酰(亚胺甲基苯)肼衍生物进行了活性研究，结果我们发现其中一个化合物4-苄基哌连乙亚胺酰(N-胺基亚氨甲基-3-烯丙基-2-羟基苯)肼能够选择性地杀死某些癌细胞，具有很强的抗癌活性，并且能够抑制肿瘤的生长，与其它的抗癌药物相比，显示出具有高效、选择性和副作用较小等优点。
细胞及动物实验
我们将4-苄基哌连乙亚胺酰(N-胺基亚氨甲基-3-烯丙基-2-羟基苯)肼称为GS-1A。为了证实其对肿瘤生长抑制的真实有效性和安全性，我们主要从肿瘤的体外、体内及其对小鼠的毒性等几个方面展开研究。
实施例3. GS-1A能够在体外抑制肿瘤细胞的增殖
通过MTT来检测GS-1A对肝癌细胞系Hepa G2和肺癌细胞系A549(中山大学实验动物中心细胞库)的增殖抑制效果。具体方法为：使用2×104接种96孔板，贴壁生长过夜后，分别加入终浓度为80、40、20、10和5μg/ml的GS-1A(溶于DMSO中)药物(DMSO 0.8％)处理细胞，设置3个复孔，以相同剂量的DMSO作为阴性对照，以80μg/ml的环磷酰胺(国药准字H32020857，江苏恒瑞医药股份有限公司)为阳性对照，并分别处理6、12、24和48小时后，每孔加入10μl MTT(5mg/ml，Sigma)，继续培养4小时，吸弃培养液，于每孔中加入100μl的DMSO，摇床上溶解10分钟，于核酸/蛋白分析仪上检测490nm的吸收值，计算GS-1A对细胞增殖抑制率。结果显示在图1和2中。
结果表明：GS-1A对Hepa G2和A549两种肿瘤细胞均有较强的抑制作用(参见图1和2)。此外，通过用环磷酰胺作阳性对照比较发现，在相同剂量下(80μg/ml)，GS-1A对细胞生长的抑制效果显著高于环磷酰氨处理组(t检验，P＜0.01)。
实施例4.GS-1A能够在体外促进肿瘤细胞的凋亡
通过DNA Ladder来检测GS-1A是否能够促进细胞凋亡。收集3×106用10、20、40和80μg/ml GS-1A处理24小时的人肝癌Hepa G2细胞，采用DNA Ladder提取试剂盒(北京普利莱基因技术有限公司)提取各组细胞的DNA，凝胶电泳检测是否有DNA Ladder的出现，照相并分析结果。结果显示在图3中。
核酸凝胶电泳分析表明：GS-1A在20、40和80μg/ml浓度下能够看见较为明显的DNA Ladder，这证实GS-1A能够促进细胞凋亡。
实施例5.GS-1A能够提高细胞内半胱天冬酶-3的酶学活性
通过检测GS-1A处理后细胞内半胱天冬酶-3的活性水平来判断其是否能够提高半胱天冬酶-3的活性。方法如下：收集3×106用10、20、40和80μg/ml处理24小时的Hepa G2细胞，采用半胱天冬酶-3活性检测试剂盒(江苏海门碧云天生物技术研究所)提取各组细胞的总蛋白，检测其中半胱天冬酶-3的活性，作图并分析结果。结果显示在图4中。
分析结果表明：20、40和80μg/ml浓度GS-1A处理后的Hepa G2细胞，其半胱天冬酶-3的活性分别比对照提高了1.67、3.89和7.76倍(t检验，P＜0.01)。
实施例6.GS-1A体内能够抑制肿瘤的生长
为了验证GS-1A是否能够在体内抑制肿瘤的生长，我们采用4-6周雌性BALB/cA裸鼠(中山大学实验动物中心)，每只接1×107HepaG2细胞，待肿瘤生长到100-150mm3(约一周)时，分别使用0、50、100mg/kg的GS-1A药物浓度给小鼠灌胃处理(用DMSO溶解药物并用玉米油包裹，DMSO∶玉米油＝1∶24)，以DMSO作为阴性对照，以易瑞沙(Irasa)(购于北京肿瘤医院AstraZeneca公司的产品，50mg/kg)作为阳性对照，对照每组7只小鼠，治疗组每组8只小鼠，每只小鼠每天灌胃一次，共治疗21天，每周测量2次肿瘤体积，统计各组肿瘤生长情况，作出肿瘤生长曲线。结果显示在图5中。
结果表明：GS-1A能够显著抑制Hepa G2肿瘤的生长，50、100mg/kg的GS-1A药物处理，其抑制率分别是17.86％和45.06％，而易瑞沙(50mg/kg)的疗效可达61％(F检验，P＜0.01)。
Claims (7)
1.具有下式所示结构的化合物，或其药学上可接受的盐，
其中，
R1和R2各自独立地是氢原子，
R3和R4各自独立地是氢原子、羟基和烯基。
2.根据权利要求1的化合物，其中R3为羟基，并且R4为烯丙基。
3.根据权利要求1或2的化合物，其为下式化合物或其药学上可接受的盐：
4.一种药物组合物，它包含权利要求1或2或3的化合物，或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的赋形剂。
5.制备下式化合物的方法，
它包括如下步骤：
(1)在无水条件下，使氯乙腈、乙醇和氯化氢在有机溶剂中反应，生成2-氯乙酰亚胺乙酯盐酸盐；
(2)在碱的存在下，使所得到的2-氯乙酰亚胺乙酯盐酸盐与下式的化合物
在适合的有机溶剂中反应，生成下式的化合物，
(3)在无水条件下，使步骤(2)中得到的产物、肼与下式的化合物
在适合的有机溶剂中反应，生成下式的化合物，
其中，R1、R2、R3和R4如权利要求1所述。
6.根据权利要求5的方法，其中步骤(1)中所述的有机溶剂为乙醚；步骤(2)中所述的有机溶剂为丙酮并且所述碱为三乙胺；步骤(3)中所述的有机溶剂为乙醇。
7.权利要求1或2或3的化合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途，其中所述癌症为肝癌或肺癌。
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| Karson S Putt et al..Small-molecule activation of procaspase-3 to caspase-3as apersonalized anticancer strategy.Nature Chemical Biology2 10.2006,2(10),543-550. |
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