CN106866743A - 肿瘤靶向性金属配合物及合成方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种肿瘤靶向性金属配合物及合成方法与应用。其合成方法为:具有取代基团的配体通过连接具有靶向性的分子,配体与金属离子进行配位,合成肿瘤靶向性金属配合物;所述的配体为菲咯啉衍生物、联吡啶衍生物、苯并咪唑类衍生物、苯基‑吡啶类衍生物和噻吩‑吡啶类衍生物中的一种;所述的具有靶向性的分子为生物素、叶酸、整合素、转铁蛋白、穿膜肽、八聚精氨酸、MUC‑1附膜蛋白、半乳糖胺、新生血管靶向肽和粒细胞巨噬细胞刺激因子中的一种;所述的金属离子为钌、锇、铑或铱离子。通过本发明的方法得到的配合物可被肿瘤细胞选择性吸收,并诱导其凋亡。在裸鼠荷瘤模型,肿瘤靶向性配合物能对肿瘤的成像和治疗,降低对器官组织的毒副性。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域,特别涉及一种肿瘤靶向性金属配合物及合成方法与应用。
背景技术
中国的癌症发病率和死亡率一直在上升,从2010年开始已经成为主要的致死原因,成为了中国以及全球的一个主要公共卫生问题。据统计,预计2015年有4292000个新癌症病例和2814000个癌症死亡。在众多治疗的癌症的策略中,肿瘤诊疗是一种将治疗和诊断成像相结合的综合治疗策略,它可同时实现精确的医学诊断和药物治疗。[B Kumar,et al,Journal of the American Chemical Society,2014,136,17836-17843]在众多的材料和化合物中,具有磷光发光特性的金属配合物在诊疗剂的研究引起广泛的关注。因为金属配合物为药物设计提供了一个宽阔的平台,通过改变辅助的配体种类和数量,可以调节配合物的发光性质和抗肿瘤活性。
金属配合物是抗肿瘤药物重要的一员。顺铂是第一个临床应用抗肿瘤活性的,且铂类抗肿瘤药物得到广泛的应用。但临床上使用顺铂会产生严重的毒副作用,如肾毒性、神经毒性、恶心和呕吐等,因此寻找低毒高效的非铂类药物成为亟待解决的问题。钌(II/III)配合物被认为是代替铂类抗肿瘤药物最有潜力的一类药物。它们展示出新型的抗肿瘤机制,因此和铂类药物展现出交叉耐药性。当前,寻找作用机制明确抗肿瘤的金属配合物已成为研究的热点。
过渡金属配合物如钌(II)、铱(III)、铑(III)和铂(II)等具有独特的d电子构型,使之能发射出高强度的磷光。在过去十年,大量的具有发光特性的过渡金属配合物合成,并广泛应用在分子探针、生物成像和发光二极管研究中。相对于有机分子,金属配合物在分子探针和成像具有以下优势:(1)金属配合物具有较高的磷光效能;(2)其可调节的激发和发射波长能够涵盖整个可见光区域,甚至是近红外区域,使之能够容易辨认;(3)拥有较大的Stokes位移,使配合物具有易于区别的发射光谱和有效地避免自身荧光淬灭;(4)相对于有机荧光分子,配合物具有相对长的荧光寿命,一般达到100ns~100μs[Q Zhao,et al,Chemical.Society.Review.,2011,40,2508–2524.]。
尽管金属配合物在诊疗方面具有应用潜力,但小分子药物在体内应用中往往遇到对正常组织选择性差,生物利用低等缺点。基于肿瘤快速增殖和永生性的特点,其细胞膜会过度表 达某些蛋白受体,如整合素、叶酸和转铁蛋白受体。因此将小分子药物共价连接在靶向药物运输系统上,可以选择性地将小分子药物运输到肿瘤区域,并且在肿瘤特有的微环境进行释放。故此,通过构建肿瘤靶向性的药物系统,运输具有诊断治疗效果的金属配合物到达肿瘤组织,将成为具有创新性和应用前景药物开发领域。
目前,抗肿瘤药物已广泛应用于癌症的治疗,但这些药物对肿瘤细胞和正常细胞选择性,在治疗癌细胞的同时,也影响了正常机体功能。因此,提高药物生物利用度,减少全身毒性反应是肿瘤化学治疗迫切解决的问题。开发安全低毒、具有肿瘤特异性且能高效负载抗肿瘤药物的肿瘤递药系统势在必行。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足,提供一种肿瘤靶向性金属配合物的合成方法。
本发明的另一目的在于提供通过所述合成方法得到的肿瘤靶向性金属配合物。
本发明的又一目的在于克服现有技术的缺点与不足,提供所述的肿瘤靶向性金属配合物的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现:一种肿瘤靶向性金属配合物的合成方法,将具有取代基团的配体通过连接具有靶向性的分子,配体与金属离子进行配位,合成肿瘤靶向性金属配合物。
所述的配体为菲咯啉衍生物、联吡啶衍生物、苯并咪唑类衍生物、苯基-吡啶类衍生物和噻吩-吡啶类衍生物中的一种。
所述的菲咯啉衍生物包括1,10-菲咯啉、5,6-二甲基-1,10-菲咯啉、5-硝基-6氨基-1,10-菲咯啉、5-硝基-1,10-菲咯啉、4-醛基-1,10-菲咯啉、1,10-菲咯啉-4-甲酸、2,9-二氯-1,10-菲咯啉、4,7-二苯基-1,10-菲咯啉、咪唑[4,5-f]-[1,10]菲咯啉、[1,2,5]硒二唑[3,4-f][1,10]菲咯啉等;优选为咪唑[4,5-f]-[1,10]菲咯啉和[1,2,5]硒二唑[3,4-f][1,10]菲咯啉。
所述的联吡啶衍生物包括2,2'-联吡啶、2,2'-联吡啶-3,3'-二羧酸、4,4'-二甲基-2,2'-联吡啶、4,4'-二氨基-2,2'-联吡啶、4,4'-二氯-2,2'-联吡啶、6,6'-二氰基-2,2'-联吡啶等;优选为4-甲基-2,2-联吡啶-4-甲酸。
所述的苯并咪唑类衍生物包括2-(2-吡啶)-苯并咪唑、2-(2-吡啶)-苯并咪唑-5-甲基、2-(2-吡啶)-苯并咪唑-5-羧酸等;优选为2-(2-吡啶)-苯并咪唑-5-羧酸。
所述的苯基-吡啶类衍生物包括2-(2-溴苯基)吡啶、2-(3-溴苯基)吡啶、2-(4-氯苯基)吡啶、2-(2-羟基苯基)吡啶、4-(2-吡啶基)-苯甲醛、2-(4-氨基苯基)吡啶、2-(4-甲基苯基) 吡啶、2-(2,4-二氟苯基)吡啶、2-(4-硝基苯基)吡啶、2-(2-噻吩)吡啶、2-(2-吡啶基)苯并噻吩;优选为2-(2-噻吩)吡啶。
所述的具有靶向性的分子为生物素、叶酸、整合素、转铁蛋白、穿膜肽、八聚精氨酸、MUC-1附膜蛋白(粘蛋白1)、半乳糖胺、新生血管靶向肽和粒细胞巨噬细胞刺激因子中的一种;优选为生物素。
所述的连接为配体直接或通过桥连分子与具有靶向性的分子连接。
所述的桥连分子为含有可供缩合反应的官能团的烷烃类衍生物或氨基酸分子,包括乙二胺,己二胺、4-氨基丁酸、戊二酸、1,5-戊二醇、3,6,9-三氧杂十一烷-1,11-二胺、甘氨酸、天冬氨酸等;优选为己二胺。
所述的可供缩合反应的官能团优选为氨基、羧基、羟基和巯基中的至少一种。
所述的金属离子为钌(II)、锇(II)、铑(III)和铱(III)离子中的一种。
所述的肿瘤靶向性金属配合物的合成方法,优选通过如下任一种方法实现:
S1:肿瘤靶向性钌配合物的合成
(1)将2-(2-吡啶)-苯并咪唑-5-羧酸(配体I)、EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)溶解于DMF(二甲基甲酰胺)中,加热至60℃进行反应,再加入产物A和三乙胺继续反应,然后加入冰水,抽滤,得到产物B,其中,2-(2-吡啶)-苯并咪唑-5-羧酸、EDC、NHS和产物A按摩尔比1:1~2:1~2:1~2进行配比;
(2)将金属化合物和配体II加入DMF中,于100~140℃进行反应,再加入丙酮析出沉淀,过滤、洗涤,烘干得到产物C,其中,金属离子和配体II按摩尔比1:2进行配比,配体II为咪唑[4,5-f]-[1,10]菲咯啉或[1,2,5]硒二唑[3,4-f][1,10]菲咯啉;
(3)将步骤(1)得到的产物B和步骤(2)得到的产物C加入乙二醇乙醚中,于90~130℃进行反应,冷却,再加入饱和高氯酸钠溶液,得到肿瘤靶向性金属配合物,其中,产物B和产物C按摩尔比1:1进行配比;
或者是:
S2:肿瘤靶向性铱配合物的合成
(a)将4-甲基-2,2-联吡啶-4-甲酸、EDC和NHS溶解于DMF中,加热至60℃进行反应,再加入产物A和三乙胺继续反应,然后加入冰水,抽滤,得到产物D,其中,4-甲基-2,2-联吡啶-4-甲酸、EDC、NHS和产物A按摩尔比1:1~2:1~2:1~2进行配比;
(b)将金属化合物和2-(2-噻吩)吡啶加入乙二醇乙醚和水的混合溶剂中,于90~130℃进行反应,冷却,抽滤,取固体,洗涤,烘干,得到产物E,其中,金属化合物和2-(2-噻吩)吡啶按摩尔比1:2进行配比;
(c)将步骤(a)得到的产物D和步骤(b)得到的产物E加入甲醇和二氯甲烷的混合溶剂中,于10~70℃进行反应,冷却,再加入六氟磷酸铵搅拌进行反应,然后蒸发溶剂,洗涤,得到肿瘤靶向性金属配合物,其中,产物D、产物E和六氟磷酸铵按摩尔比1:1:1~20进行配比;
步骤(1)和步骤(a)中所述的产物A通过如下方法制备得到:将己二胺溶解于DMF中,再加入生物素-N-琥珀酰亚胺基酯,常温反应,再加入冰水,抽滤,洗涤,得到产物A,其中,生物素-N-琥珀酰亚胺基酯和己二胺按摩尔比1:1~30进行配比。
所述的反应的时间优选为24h。
所述的冰水的用量优选为按冰水与DMF的体积比5:1配比计算。
所述的洗涤为用水洗涤两次。
所述的生物素-N-琥珀酰亚胺基酯和己二胺优选为按摩尔比1:6进行配比。
所述的生物素-N-琥珀酰亚胺基酯优选通过如下方法制备得到:将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和D-生物素混合在二甲基甲酰胺(DMF)中,于10~100℃反应2h~4h,再加入冰水,过滤、取沉淀,得到生物素-N-琥珀酰亚胺基酯,其中,EDC、NHS和D-生物素按摩尔比1:1~2:1~2进行配比。
所述的反应优选为常温条件下进行反应。
所述的的时间优选为4h。
所述的冰水的用量为按冰水与DMF的体积比5:1配比计算。
所述的EDC、NHS和D-生物素优选为按摩尔比1:1:1进行配比。
步骤(1)中所述的2-(2-吡啶)-苯并咪唑-5-羧酸优选通过如下方法制备得到:将3,4-二氨基苯甲酸溶于乙醇中,加入吡啶-2-甲醛进行反应,蒸发、加入冰水析出后过滤,得到2-(2-吡啶)-苯并咪唑-5-羧酸(配体I),其中,3,4-二氨基苯甲酸和吡啶-2-甲醛按摩尔比1:1进行配比。
所述的2-(2-吡啶)-苯并咪唑-5-羧酸(配体I)还可以进一步经硅胶柱层析纯化。
所述的反应的时间优选为2h。
所述的蒸发优选为蒸发部分乙醇至体系体积的一半。
所述的冰水的用量为按冰水与乙醇的体积比4:1配比计算。
步骤(1)和步骤(a)中所述的反应的时间优选为2h。
步骤(1)和步骤(a)中所述的加入产物A和三乙胺继续反应的时间优选为24h。
步骤(1)和步骤(a)中所述的三乙胺与DMF的体积比为1:10~60,优选为1:30。
步骤(1)中所述的产物B还可以进一步经硅胶柱层析纯化。
所述的硅胶柱层析为采用乙酸乙酯和甲醇的洗脱液进行洗脱。
所述的乙酸乙酯和甲醇的体积比为1:1。
步骤(1)中所述的2-(2-吡啶)-苯并咪唑-5-羧酸、EDC、NHS和产物A优选为按摩尔比1:1:1:1进行配比。
步骤(2)中所述的金属化合物为钌和锇化合物中的一种;优选为RuCl3。
步骤(2)中所述的咪唑[4,5-f]-[1,10]菲咯啉优选通过如下方法制备得到:将1,10-邻菲咯啉-5,6-二酮溶解于乙酸,加入醋酸铵和甲醛于110℃回流反应,调pH值至11,抽滤,得到咪唑[4,5-f]-[1,10]菲咯啉,其中,1,10-邻菲咯啉-5,6-二酮和甲醛按摩尔比1:1进行配比。
所述的咪唑[4,5-f]-[1,10]菲咯啉还可以进一步经硅胶柱层析纯化。
所述的反应的时间优选为6h。
所述的调pH值优选为加入氨水进行调pH值。
步骤(2)中所述的[1,2,5]硒二唑[3,4-f][1,10]菲咯啉优选通过如下方法制备得到:将1,10-邻菲咯啉-5,6-二胺溶解于乙醇中,加入二氧化硒,加热至90℃回流反应,旋转蒸发,得到[1,2,5]硒二唑[3,4-f][1,10]菲咯啉,其中,1,10-邻菲咯啉-5,6-二胺和二氧化硒按摩尔比1:1.2进行配比。
所述的[1,2,5]硒二唑[3,4-f][1,10]菲咯啉还可以进一步纯化。
所述的纯化优选通过如下方法实现:将[1,2,5]硒二唑[3,4-f][1,10]菲咯啉用乙醇洗涤,再用甲醇溶解、过滤、重结晶,得到纯化的[1,2,5]硒二唑[3,4-f][1,10]菲咯啉。
所述的洗涤的次数优选为2次。
所述的过滤为通过过滤除去不溶物。
所述的反应的时间优选为6h。
步骤(2)和步骤(b)中所述的反应优选为在惰性气体保护下进行反应。
所述的惰性气体优选为氩气。
步骤(2)中所述的反应的温度优选为140℃,反应的时间优选为8h。
步骤(2)中所述的加入丙酮析出沉淀的温度优选为-20℃。
步骤(2)中所述的洗涤为用-20℃的冻丙酮洗涤2次。
步骤(3)和步骤(c)中所述的反应的温度优选为130℃,反应的时间优选为6h。
步骤(3)和步骤(c)中所述的肿瘤靶向性金属配合物还可以进一步经氧化铝柱层析纯化。
所述的氧化铝胶柱层析为采用二氯甲烷和甲醇的洗脱液进行洗脱。
所述的二氯甲烷和甲醇的体积比为10~60:1,优选为30~60:1。
步骤(a)中所述的产物D还可以进一步经硅胶柱层析纯化。
所述的硅胶柱层析为采用乙酸乙酯和甲醇的洗脱液进行洗脱。
所述的乙酸乙酯和甲醇的体积比为1~10:1。
步骤(b)中所述的金属化合物为铑和铱化合物中的一种;优选为IrCl3。
步骤(b)中所述的混合溶剂中乙二醇乙醚和水体积比为1~6:1,优选为3:1。
步骤(b)中所述的反应的时间优选为12h。
步骤(c)中所述的混合溶剂中二氯甲烷和甲醇的体积比为1~6:1。
步骤(c)中所述的加入六氟磷酸铵搅拌进行反应的时间优选为10h。
一种肿瘤靶向性金属配合物,通过上述任一项所述的方法制备得到。
所述的肿瘤靶向性金属配合物优选为钌配合物和铱配合物中的至少一种;更优选为配合物Ru-Bio、Ru-Bse和Ir-Bty中的至少一种,所述的Ru-Bio、Ru-BSe和Ir-Bty的结构式如式I、式II和式III所示:
所述的肿瘤靶向性金属配合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
所述的肿瘤靶向性金属配合物在制备抗肿瘤药物中的应用,所述的肿瘤靶向性金属配合物在剂量为1~10μmol/Kg能有效抑制裸鼠荷瘤模型的肿瘤组织的增殖,优选为4~5μmol/Kg。
所述的肿瘤为人非小细胞肺癌、人宫颈癌、黑色素瘤、人成骨肉瘤、乳腺癌或脑胶质瘤。
所述的肿瘤靶向性金属配合物在分子探针、细胞成像和活体荧光成像等领域中应用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:
(1)本发明涉及金属配合物在抗肿瘤药物中的应用,具体公开了靶向性金属配合物和其配体的制备、表征及其在肿瘤诊断治疗方面的应用。制备方法如下:在配体上共价连接具有肿瘤靶向性的生物分子,合成具有磷光发光特性的过度金属配合物。本发明基于正常细胞和肿瘤细胞之间的差异,对传统的金属配合物进行修饰,提高抗肿瘤药物的利用度和降低毒副 性。同时利用金属配合物良好的磷光性质,有效地对肿瘤细胞和组织成像,实现诊断治疗的功效。对配合物的抗肿瘤机制进行探究,为开发新型的金属抗肿瘤药物提供了新思路。本发明原料价廉易得,制备方法简单易行,且制备的产物重复性和稳定性良好。
(2)本发明对传统的金属配合物进行肿瘤靶向性修饰,提高肿瘤组织对药物的吸收,减低了金属配合物在体内应用的毒副性。通过在配合物的配体上引入取代基,引入靶向基团对药物进行改性,该方法具有良好的可操作性和重现性。
(3)本发明所合成金属配合物具有良好的磷光发射性能,可以用于在生物成像和活体成像。利用荧光实时监控技术,为肿瘤的早期诊断提供诊断剂。
(4)在裸鼠荷瘤模型实验中,本发明所合成的药物对肿瘤组织的增殖具有明显的抑制效果,且对正常组织毒副性低。
(5)本发明所得产物的原料廉价易得,合成和纯化步骤可操作性强,可通过优化工艺,适当扩大合成规模,实现药物的商业化和应用。
(6)当前使用的小分子抗肿瘤药物和诊断剂,对肿瘤细胞的选择性较低。本发明合成肿瘤靶向性的金属配合物,基于肿瘤细胞和正常细胞的差异,有效地被肿瘤组织吸收,在裸鼠荷瘤模型中,实现对肿瘤的诊断和治疗。对比于传统的铂类抗肿瘤药物,具有更低的毒性和对肿瘤成像的能力。在其抗肿瘤作用机制研究,发现所合成的配合物能通过诱导肿瘤细胞的线粒体功能紊乱和内质网应激,提高了细胞内活性氧水平,激活肿瘤细胞内源性凋亡通路。
附图说明
图1为配体2-(2-吡啶)-苯并咪唑-5-羧酸的合成路线图。
图2为多吡啶配体的合成路线;其中,图a为配体咪唑[4,5-f]-[1,10]菲咯啉的合成路线图,图b[1,2,5]硒二唑[3,4-f][1,10]菲咯啉的合成路线图。
图3为靶向配体的合成路线图。
图4为肿瘤靶向性钌配合物的合成路线图。
图5为肿瘤靶向性铱配合物的合成路线图。
图6为所合成的配合物的结构式。
图7为配合物的紫外可见光吸收光谱和荧光发射光谱图;其中,图a为钌配合物的紫外可见光吸收光谱,图b为钌配合物的荧光发射光谱,图c为铱配合物的荧光发射光谱。
图8为宫颈癌细胞HeLa和人肝细胞L02对含硒药物的吸收图。
图9为靶向配合物Ru-BSe选择性诱导肿瘤细胞凋亡图。
图10为钌配合物对细胞内线粒体膜电位的影响图。
图11为钌配合物对线粒体凋亡通路和内质网应激通路相关蛋白的调控图。
图12为经系列钌配合物处理4h后,细胞内ROS水平的变化图。
图13为细胞内凋亡相关的Caspase家族蛋白的活性检测结果图;其中,图a为钌配合物激活Caspase-3和9蛋白的活性,图b为钌配合物诱导的肿瘤细胞凋亡。
图14为经过Ru-Se和Ru-BSe(4μmol/kg)注射后,钌(II)配合物在HeLa荷瘤裸鼠模型的体内不同时间段的荧光成像图。
图15为钌配合物经尾静脉注射72h后,在不同器官内的分布(脑、心、肝、脾、肺、肾和肿瘤)结果图。
图16为经含硒钌配合物Ru-Se和Ru-BSe(4μmol/kg)处理30天后,HeLa荷瘤裸鼠模型的(a)体重和(b)肿瘤体积的变化图;其中,图a为肿瘤体积变化,图b为体重变化。
图17为钌配合物在经历30天体内抗肿瘤活性研究后的体内分布图。
图18为H&E染色检测经含硒钌配合物处理后,裸鼠模型的脏器损伤情况图;其中,箭头标记强调正常器官组织的病理学变化和肿瘤组织的细胞异型性。
图19为经含硒钌(II)配合物注射72h后,裸鼠血清的生化指标图;其中。图a~h分别为:尿酸(UA)、尿素氮(BUN)、肌酐(CRE)、血清甘油三酯(TG)、谷草转氨酶(AST)、血清总蛋白(TP)、血清白蛋白(ALB)和肌酸激酶(CK)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。
实施例1肿瘤靶向性配合物的制备和表征
1、肿瘤靶向性钌配合物的制备
(1)配体1的合成:如图1所示,取3,4-二氨基苯甲酸3.04g(20mmol)溶于100mL无水乙醇在单口烧瓶中,使用分液漏斗于20min内滴加入吡啶-2-甲醛2.14g(20mmol)。室温反应2h后,蒸发部分乙醇至50mL,加入200mL冰水析出黄色固体,过滤得到固体,再使用硅胶柱层析(硅胶颗粒100~200目,购于阿拉丁试剂有限公司,柱径高为1cm×10cm,下同)提纯上述产物,用3mL乙酸乙酯溶解样品上样,每次上样量为1g,洗脱剂为乙酸乙酯和甲醇的混合溶剂,体积比为3~1:1,进行梯度洗脱,收集黄色洗脱液,蒸发溶剂得到黄色固体,为苯并咪唑类衍生物:2-(2-吡啶)-苯并咪唑-5-羧酸,产率:71.3%。
(2)配体2(IP)的合成:如图2所示,咪唑[4,5-f]-[1,10]菲咯啉的合成:称取2.51g(12mmol)1,10-邻菲咯啉-5,6-二酮溶解于60mL乙酸中,并加入3g醋酸铵和0.36g(12mmol)甲醛。反应加热至110℃回流搅拌6h。待反应结束后,向体系加入氨水,将pH值调至11,抽滤得到固体使用100~200目的硅胶进行柱层析提纯,使用3mL甲醇溶解样品上样,每次上样量为1g,洗脱剂为无水甲醇,得到黄色固体,为菲咯啉衍生物:咪唑[4,5-f]-[1,10]菲咯啉,产率:66.3%。
(3)配体3(PhenSe)的合成:如图3所示,称取2.1g(10mmol)1,10-邻菲咯啉-5,6-二胺于100mL的圆底烧瓶中,并加入300mL的乙醇超声溶解。常温搅拌下,往烧瓶加入2.1g(12mmol)二氧化硒,加热至90℃回流搅拌6h。待反应结束后,将圆底烧瓶内的液体旋转蒸发,得到粗产物。使用少量乙醇洗涤两次,并用200mL甲醇加热至60℃溶解,将不溶物过滤。重结晶后得到粉红色固体粉末,为菲咯啉衍生物:[1,2,5]硒二唑[3,4-f][1,10]菲咯啉;产率:67.3%。
(4)产物4的合成:如图4所示,1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)3.83g(20mmol),N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)2.30g(20mmol)和D-生物素(购于阿拉丁试剂有限公司)4.87g(20mmol)混合在40mL的二甲基甲酰胺(DMF)中。反应在常温下搅拌4小时后,加入200mL冰水中,过滤得到生物素-N-琥珀酰亚胺基酯。13.9g(120mmol)的己二胺溶解于40mL的DMF中,缓慢滴加上述生物素-N-琥珀酰亚胺基酯6.82g(20mmol),在常温反应24小时后,倒入加入200mL冰水中,抽滤得到淡黄色固体,并用100mL的水洗涤两次得到产物4,产率:77.1%。
(5)产物5的合成:0.49g(2.05mmol)配体1,0.39g(2.05mmol)EDC,0.24g(2.05mmol)NHS溶解于30mL DMF,加热至60℃反应2h。0.7g产物4(2.05mmol)和1mL三乙胺加入至上述反应中,并保持反应24h。反应结束后,将溶液倒入100mL冰水中,抽滤得到黄色的粗产物。使用100-200目的硅胶进行柱层析提纯,使用3mL预制洗脱液(70%(v/v)乙酸乙酯、30%(v/v)甲醇)溶解样品上样,每次上样量为1g,洗脱液为体积比乙酸乙酯:甲醇为1:1的混合溶液,收集淡黄色的洗脱液,蒸发溶剂得到产物5,产率:54.1%。
(6)产物6的合成:如图5所示,将1mmol的RuCl3与2mmol配体2加入15mL的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中,反应在氩气保护下加热至140℃搅拌8h。待反应冷却至室温,加入100mL的丙酮放置-20℃过夜。将反应过滤,滤渣用20mL的-20℃的冻丙酮洗涤两次,烘干得到产物6,待用;产率:56.9%。
(7)配合物Ru-Bio的合成:如图5所示,将上述产物5(0.15g;0.25mmol)与产物6(0.14g;0.25mmol),溶解于30mL乙二醇乙醚中130℃反应6h,得到红色溶液。冷却至室温后,该溶液加入50mL饱和高氯酸钠溶液,得到红色沉淀,并用氧化铝柱层析纯化(氧化铝规格为200-300目,购于阿拉丁试剂有限公司,柱径高为1cm×10cm,下同),利用5mL二氯甲烷溶解样品,每次上样量为0.4g,洗脱剂为二氯甲烷和甲醇,体积比为30:1,蒸发溶剂,得到配合物Ru-Bio,产率:49.3%。
(8)配合物Ru-BSe的合成:参照步骤(7)中配合物Ru-Bio的合成,以等物质的量的配体3代替配体2进行同样的合成步骤,得到配合物Ru-Bse,产率37.1%。
所得钌配合物如结构式如图6所示。利用ESI-TOFMS质谱法、核磁共振氢谱和碳谱、CHN元素分析进行表征。
2、肿瘤靶向性铱配合物的制备
(1)参照实施例1肿瘤靶向性钌配合物的制备方法,合成产物4。
(2)产物7的合成:如图6所示,将0.44g(2.05mmol)4-甲基-2,2-联吡啶-4-甲酸、0.39g EDC(2.05mmol)和0.24g NHS(2.05mmol)溶解于DMF中,加热至60℃进行反应2h,再加入步骤(1)中得到的0.70g产物4(2.05mmol)和1mL三乙胺继续反应24h,然后加入冰水,抽滤,得到产物7,产率69.4%。
(3)产物8的合成:将0.70g三氯化铱(2mmol)和0.65g(4mmol)2-(2-噻吩)吡啶加入乙二醇乙醚与水的混合溶剂(乙二醇乙醚与水的体积比为3:1)中,反应温度为130℃,反应时间为12h。溶液冷却室温后,抽滤得到产物E,并用去离子水冲洗后,烘干固体,产率82.7%。
(4)配合物Ir-Bty的合成:将步骤(2)得到的0.27g产物7(0.5mmol)和步骤(3)得到的0.19g产物8(0.5mmol;按铱的物质的量计算)加入100mL甲醇和二氯甲烷的混合溶剂(甲醇和二氯甲烷的体积比为1:1~6)中,反应温度为60℃,反应时间为10h。溶液冷却室温后,加入1.64g六氟磷酸铵(10mmol)搅拌后,蒸发溶剂,得到的固体使用去离子水洗涤。粗产物使用200~300目的氧化铝进行柱层析纯化,用5mL二氯甲烷溶解样品,每次上样量为0.5g,洗脱剂为二氯甲烷和甲醇混合溶剂(体积比60:1)。蒸发溶剂,得到固体Ir-Bty,产率为67.3%。
所得铱配合物如结构式如图6所示。利用ESI-TOFMS质谱法、核磁共振氢谱、CHN元素分析进行表征。
3、非肿瘤靶向性钌配合物的制备
为了证明配合物的肿瘤靶向性功能,合成了无靶向分子修饰的钌配合物Ru-IP和Ru-Se进行对比。参照上述肿瘤靶向性钌配合物的的合成方法合成钌配合物Ru-IP和Ru-Se:
(1)参照实施例1肿瘤靶向性钌配合物的制备,得到产物6。
(2)配合物Ru-IP的合成:取上述0.15g产物6(0.25mmol)与0.05g 2-(2-吡啶)-苯并咪唑(0.25mmol)溶解于30mL乙二醇乙醚中,于130℃反应6h,得到红色溶液。冷却至室温后,该溶液加入50mL饱和高氯酸钠溶液,得到红色沉淀,并用200-300目的氧化铝进行柱层析纯化,用5mL二氯甲烷溶解样品,洗脱剂为二氯甲烷和甲醇(体积比为30:1),得到配合物Ru-IP。产率:43.7%。
(3)配合物Ru-Se的合成:参照配合物Ru-IP的合成,以等物质的量的配体3代替配体2进行同样的合成步骤,得到配合物Ru-Se,产率32.8%。
所得钌配合物如结构式如图6所示。利用ESI-TOFMS质谱法、核磁共振氢谱和碳谱、CHN元素分析进行表征。
Ru-Bio
Anal.Calcd for C55H53Cl2N15O11RuS(%):C,50.65;H,4.10;N,16.11Found(%):C,50.73;H,4.11;N,16.13.ESI-TOFMS(CH3OH):m/z 1104.7496[M-2ClO4-H+]+.1H NMR(DMSO-d6,δppm):13.48(d,1H),9.03(t,2H),8.97(t,2H),8.72(d,2H),8.64(s,1H),8.55-8.46(m,4H),8.33(d,1H),8.13(d,1H),7.92(d,1H),7.79(t,1H),7.73(t,2H),7.65(t,2H),7.57-7.34(m,5H),6.43(d,2H),4.48(t,1H),4.41(t,1H),3.64(q,2H),3.44(q,1H),3.39(q,2H),3.21(t,1H),2.98(d,2H),2.42(t,2H),1.99-1.79(m,6H),1.73(t,3H),1.63(m,6H).13C NMR(DMSO-d6,δppm):172.44,167.08,163.45,163.31,159.56,155.65,153.49,151.78,150.06,148.76,145.97,140.98,138.24,132.37,129.07,125.58,61.63,59.78,56.02,38.89,35.80,29.79,29.74,28.80,28.63,26.85,26.76,25.94.
Ru-BSe
Anal.Calcd for C53H49Cl2N15O11RuSe2S(%):C,44.39;H,3.44;N,14.65;Found(%):C,44.41;H,3.56;N,14.55.ESI-TOFMS(CH3OH):m/z 1234.7032[M-2ClO4-H+]+,628.8790[M-2ClO4+Na]2+,618.4017[M-2ClO4]2+.1H NMR(DMSO-d6,δppm):13.33(d,1H),8.77(d,1H),8.51(d,1H),8.35(d,1H),8.27(s,1H),8.03(m,1H),7.83(t,1H),7.74(q,1H),7.56(t,1H),6.40(d,2H),4.29(t,1H),4.13(t,1H),3.29(q,2H),3.09(q,1H),3.04(q,2H),2.80(dd,1H),2.57(d,1H),2.08(t,2H),1.65-1.40(m,9H),1.40-1.20(m,6H).13C NMR(DMSO-d6,δppm):177.58,171.88,168.16,165.92,161.65,159.57,157.08,156.47,154.62,152.33,142.41,139.29,134.16,133.80,132.98,130.00,129.60,126.54,126.04,67.24,63.13,61.21,57.33,36.46,30.22,30.20,29.03,27.20,27.11,26.26.
Ir-Bty
Anal.Calcd for C46H52F6IrN8O3PS3(%):C,46.11;H,4.37;N,9.35;Found(%):C,46.00;H,4.43;N,9.29.ESI-TOFMS(CH3OH):m/z 1053.2260[M-PF6]+.1H NMR(DMSO-d6,δppm):9.14(s,1H),9.05(t,1H),8.88(s,1H),8.01(d,1H),7.92(d,1H),7.84(s,1H),7.77-7.74(m,4H),7.65(t,4H),7.57(t,2H),7.52(d,1H),6.96(q,2H),6.40(d,2H),6.18(t,2H),4.30(s,1H),4.13(t,1H),3.10(q,1H),3.03(q,2H),2.81(dd,1H),2.58(s,3H),2.06(t,2H),1.53-1.44(m,6H),1.41-1.27(m,12H).
Ru-IP
Anal.Calcd for C38H25Cl2N11O8Ru(%):C,48.78;H,2.69;N,16.47.Found(%):C,48.68;H,2.66;N,16.39.ESI-TOFMS(CH3OH):m/z 736.5047[M-2ClO4-H+]+,368.8029[M-2ClO4]2+.1H NMR(DMSO-d6,δppm):9.03(d,2H),9.01(d,2H),8.94(d,1H),8.75(s,2H),8.94(d,2H),8.75(s,2H),8.73(s,1H),8.71(s,1H),8.06-8.04(dd,4H),7.95(s,4H),7.79-7.77(q,4H).13C NMR(DMSO-d6,δppm):173.35,159.72,155.79,151.17,150.37,149.94,149.51,149.45,147.83,146.85,146.54,146.34,146.08,145.70,144.88,144.65,137.62,129.49,129.37,129.04,126.29,126.18,126.12,125.65,125.02,124.66,124.44,124.17,124.07,121.92,121.11,120.31,119.59,112.90.
Ru-Se
Anal.Calcd for C36H21Cl2N11O8RuSe2(%):C,40.58;H,1.99;N,14.46;Found(%):C,40.46;H,2.05;N,14.27.ESI-TOFMS(CH3OH):m/z 866.4620[M-2ClO4-H+]+,433.8093[M-2ClO4]2+.1H NMR(DMSO-d6,δppm):9.00(m,4H),8.42(t,2H),8.32(d,1H),8.24(d,1H),8.01(t,1H),7.93(m,3H),7.81(q,1H),7.77(q,1H),7.65(d,1H),7.55(d,1H),7.22(t,1H),7.08(t,1H),6.87(t,1H),6.54(t,1H)13C NMR(DMSO-d6,δppm):173.39,159.76,155.83,151.20,150.41,149.97,149.55,149.49,147.87,146.88,146.57,146.38,137.66,129.52,129.40,129.07,126.32,126.21,126.16,125.69,125.06,121.96,121.14,120.34,119.63,112.94,173.39,144.92,144.69,124.69,124.48,124.11,124.20.
结果如图7所示,钌(II)配合物在PBS溶液的紫外-可见光吸收光谱显示出两个吸收峰,270~382nm处较强的吸收峰为配体内部(IL)π→π*跃迁,而407~547nm的吸收峰为金属中心-配体跃迁(MLCT)dπ(Ru)→π*(IP/phenSe)。当钌(II)配合物的PBS溶液在MLCT吸收段处λmax=467nm激发,发射出3MLCT红色的磷光λmax=594nm(Ru-IP和Ru-Bio)和λmax=596nm(Ru-Se和Ru-BSe)。我们进一步测定了钌配合物的荧光寿命,所合成的多吡啶钌(II)配合物Ru-IP和Ru-Bio的荧光寿命分别为0.64和0.69μs,而含硒钌(II)配合物Ru-Se和Ru-BSe的则为0.42和0.50μs。此外,绝对量子产率测试仪测定四个配合物的量子产率,发现多吡啶钌(II)配合物亦比含硒钌(II)配合物的具有更高的量子产率。铱配合物也在600nm处有荧光发射。综上所述,所合成的金属配合物有较大的Stokes位移和长波长的磷光发射,表明配合具备体内成像的潜力。
表1合成的钌(II)配合物的磷光光学性质
实施例2钌配合物的选择性吸收
本实施例从细胞层面检测钌配合物对肿瘤细胞的靶向性:
选用肿瘤细胞生物素受体高表达的HeLa宫颈癌细胞(购于美国菌种保藏中心)和其低表达的L02正常肝细胞(购于南京凯基生物科技发展有限公司)研究药物的吸收。细胞在DMEM培养基(Gibco,含10%(v/v)的牛血清蛋白,100units/mL盘尼西林和50units/mL链霉素)中培养,放置于37℃细胞培养箱(相对湿度为95%、含5%(v/v)CO2)。
为了证明配合物的肿瘤靶向性的功效,我们利用ICP-MS(电感耦合等离子体质谱仪)检测对不同含硒药物的吸收。HeLa和L02细胞经不同的含硒化合物PhenSe(实施例1制备得到的配体3,终浓度为40μM)、Ru-Se(终浓度为20μM)或Ru-Bse(终浓度为20μM)孵育后,使用PBS溶液(浓度为0.01M;pH=7.4,下同)洗涤两次后,用胰酶(购于捷贝斯生物科技有限公司,工作液浓度为0.25%)重悬收集吸收,并计数。样品加入1mL的混酸(VHNO3:VHClO4=3:1),加热至180℃硝化1h。硝化后的溶液用Milli-Q纯水(美国Millipore公司)定容至5mL后,用ICP-MS检测硒的含量。结果表明,肿瘤细胞HeLa对生物素化的Ru-BSe有更高的吸收,而对PhenSe和Ru-Se的吸收较低。正常细胞L02对三种含硒化合物(PhenSe、Ru-Se或Ru-Bse)的吸收无明显的差别。为了证明生物素受体介导的主动吸收,我们对细胞加入终浓度为100μM生物素提前孵育细胞1h,更新DMEM培养基后,再分别加入药物(PhenSe、Ru-Se或Ru-Bse,方法同上)。但HeLa细胞经过量的生物素封闭后,Ru-BSe的吸收量明显下降。且这相同的实验条件下,生物素对受体的封闭对PhenSe和Ru-Se的吸收无显著变化。这表明Ru-BSe能通过生物素受体介导的途径进入细胞。
通过构建HeLa-L02细胞共培养模型,我们进一步测定钌配合物对肿瘤细胞的靶向能力:将8×104的L02细胞加入2cm的细胞培养皿中,待细胞贴壁生长后,加入Cell trackerBlue染料(购于Thermo Fisher Scientific公司;工作浓度为1μg/mL)染色2h后,使L02细胞标记为蓝色荧光,用PBS溶液洗涤两遍。加入等量无荧光标记的HeLa细胞,培养24h。共培养细胞经终浓度为20μM Ru-BSe孵育24h后,使用TUNEL试剂盒(罗氏(Roche)公司)检测细胞的凋亡情况。细胞处理后,利用流式细胞分析仪检测不同细胞的凋亡情况。在共培养模型中,Ru-BSe能选择性诱导HeLa细胞凋亡。流式细胞分析结果(图9)表明, 对照组中没有发现细胞凋亡信号,而Ru-BSe处理后,蓝色荧光标记的HeLa细胞发生了凋亡,由控制组的0.2%上升至20.7%。但无荧光标记的正常L02细胞则无明显变化。因此,靶向性的Ru-BSe能选择性地诱导肿瘤细胞凋亡。
实施例3钌配合物的抗肿瘤机制
1、细胞的存活率采用MTT法测定:
HeLa细胞、A549细胞、MCF-7细胞、MB231细胞和HepG2细胞,以上肿瘤细胞均购于美国菌种保藏中心;L02细胞购于南京凯基生物科技发展有限公司;上述细胞在DMEM培养基(含10%(v/v)的牛血清蛋白,100units/mL盘尼西林和50units/mL链霉素)中培养;
NCM460细胞,购于美国INCELL公司,并用INCELL’s enriched M3:10培养基培养;
所有细胞放置于37℃细胞培养箱(相对湿度为95%、含5%(v/v)CO2)。
取对数生长的上述各种细胞,以2×104cells/mL的浓度接种在96孔板,细胞在DMEM培养基中,放置于37℃细胞培养箱。孵育24h待细胞贴壁生长后,加入以浓度梯度为5~80μM的待测药物(Ru-IP、Ru-Se、Ru-Bio、Ru-Bse、Ir-Bty、PhenSe或顺铂),孵育72h后加入20μL的5mg/mL的MTT溶液继续孵育4h。结束后,抽走培养基,加入150μL二甲基亚砜(DMSO),与570nm出测定吸光度,计算半数抑制浓度IC50。结果如表2所示,所合成的系列钌配合物对肿瘤细胞具有一定抗肿瘤活性,但差异较大。由Ru-IP和Ru-Se比较得知,硒元素的引入能有效地增加药物的活性,如对A549细胞的IC50值由104.3μM下降至19.4μM,但对正常细胞L02和NCM460的毒性较大。由Ru-Se和Ru-BSe对比可知,而引入靶向基团生物素后,对药物的活性无明显影响,却大大提高了药物的选择性。靶向性配合物Ru-BSe和Ir-Bty的安全系数分别为4.24和5.47,远大于Ru-Se的0.97和临床的抗肿瘤药物顺铂的0.46。此外,靶向性Ru-BSe对生物素受体高表达的HeLa和A549细胞的活性高于其他肿瘤细胞和正常细胞,这证明了靶向基团的引入有效地提高钌配合物的吸收效率,进而提高其抗肿瘤活性。
2、(1)线粒体是为生命活动提供能量的主要器官,也与细胞的凋亡存在密切的联系。因此,我们用JC-1荧光探针(购于西格玛奥德里奇公司)检测了肿瘤HeLa细胞的线粒体膜电位耗散情况。HeLa细胞经不同药物(Ru-Bio或Ru-Bse,终浓度分别为10μM和20μM)孵育24h后,用2mL磷酸缓冲盐PBS溶液(浓度为0.01M;pH=7.4)洗涤两次后,用胰酶悬浮,后用JC-1染料染色30min后用流式细胞仪进行测试。结果如图10所示,所合成的钌配合物能不同程度地诱导线粒体膜电位耗散。其中含硒钌配合物Ru-BSe能剂量依赖性地造成线粒体功能紊乱,绿色的JC-1染料的比例由控制组的2.9%上升至40.9%。
(2)此外,用Western blot检测HeLa细胞内线粒体凋亡的信号通路。向贴壁细胞加入不同药物(终浓度为40μM的Ru-Bio或Ru-Bse,以不添加药物为对照)处理72h后,吸去培养基并用PBS溶液洗涤三次,在低温孵育下加入150μL的细胞裂解液(购于捷贝斯生物科技有限公司),作用5min后,收集蛋白。取等量的蛋白加入电泳槽,使用4%的浓缩胶和12%的分离胶进行电泳。电泳结束后,将分离好的蛋白质转移硝酸纤维膜上,然后使用5%(w/v)全脂牛奶(购于捷贝斯生物科技有限公司)的TBST缓冲溶液(每升含8g NaCl,0.2g KCl、3gTris-base和1mL吐温-20,pH=7.4,)进行封闭。在4℃下用1:1000的一抗(购于美国cellsignaling technology公司)孵育过夜,然后再用1:2000的二抗(购于美国cell signalingtechnology公司)孵育2h,高强的化学发光系统(Kodak)在X光片上蛋白的泳道显影。结果如图11所示,含硒钌配合物能有效的下调促生存蛋白Bcl-2和上调促凋亡蛋白Bax的表达水平。
(3)基于配合物诱导线粒体功能紊乱的结果,我们进一步检测HeLa细胞内活性氧(ROS)水平。细胞经不同配合物(Ru-IP、Ru-Se、Ru-Bio和Ru-Bse,终浓度都为40μM,以不添加药物为对照)作用不同时间后,装在DCFH-DA探针(购于西格玛奥德里奇公司),用PBS溶液洗涤后,利用荧光酶标仪检测激活后的DCF探针(激活后DCFH-DA变为DCF)的荧光强度。结果如图12所示,含硒钌配合物能显著的提升了细胞内ROS的水平,Ru-BSe处理组4h内ROS的水平达到130%以上。而非硒钌配合物Ru-IP和Ru-Bio仅轻微上调ROS水平。由于靶向性的Ru-BSe能通过生物素受体有效地被HeLa细胞吸收,故能在细胞内产生最多的ROS。此外,经含硒配合物处理后,过量的ROS能引起内质网应激相关通路蛋白p-PERK和CHOP表达水平显著地上升。由此可得,含硒钌配合物能诱导肿瘤细胞线粒体功能紊乱,促使细胞内ROS上升,激活了ROS介导的内质网应激通路。
(4)我们检测了细胞内凋亡相关的Caspase家族蛋白的活性。取上述步骤(2)收集的细胞蛋白100μg加入Caspase蛋白底物荧光探针(Caspase-3:Ac-DEVD-AMC和Caspase-9:Ac-LEHD-AMC)(北京泰泽瑞达科技有限公司)在37℃孵育2h,在多功能荧光酶标仪测定探针的荧光强度(Ex=380nm,Em=440nm)。结果如图13(a)所示,含硒配合物Ru-BSe能有效地激活Caspase-3和Caspase-9蛋白的活性,而多吡啶钌配合物Ru-Bio经轻微激活蛋白的活性。
(5)最后,利用碘化丙啶(PI)染料(Sigma)检测细胞的周期分布。经过终浓度为20、40μM的钌配合物Ru-Bio和Ru-BSe处理72h的HeLa细胞,加入胰酶消化细胞。待收集悬浮与贴壁细胞后,加入70%(v/v)的冷冻乙醇在-20℃固定过夜。用PI染料在常温避光孵育1h。染料溶液经400目的筛网过滤后,用Beckman流式细胞分析仪测试。每个样品中的计数细胞数为10000,再用Multi Cycle软件分析肿瘤细胞的各周期分布比例。结果 显示,配合物能剂量依赖性上调凋亡细胞比例,其中经20、40μM的含硒钌配合物处理后,凋亡细胞的比例从控制组的1.1%分别上升至22.0%和62.9%。
综上所述,含硒钌配合物能激活线粒体介导的内源性凋亡通路,诱导细胞凋亡。
表2系列钌(II)配合物与顺铂的体外抗肿瘤活性
注:表中SI表示药物的安全系数,反映了药物的低毒性,由公式SI=IC50(L02)/IC50(HeLa)得到。
实施例4靶向性钌配合物对人宫颈癌细胞HeLa裸鼠异种移植瘤模型的诊断治疗效果
本发明应用HeLa裸鼠荷瘤模型去研究系列钌配合物的体内诊断治疗效应。HeLa荷瘤裸鼠模型:在6-8周龄BALB/c裸小鼠(购于广东省医学实验动物中心)后肢腋皮下接种1×106个HeLa细胞,将接种后的裸小鼠随机分成阴性对照组、Ru-Se实验组和Ru-BSe实验组(每组6只,雌雄鼠平均),待瘤块大小长到约200mm3时开始用药。首先,我们使用荧光活体成像仪器检测72小时内钌配合物在裸小鼠体内的分布(图14)。荷瘤裸鼠分别经过尾静脉注射Ru-Se和Ru-BSe(4μmol/kg)不同时间段后,经乙醚麻醉固定后,在荧光活体成像仪内观察药物在体内的分布。如图15所示,尾静脉注射24h,Ru-BSe能在肿瘤区域附近聚集,而Ru-Se则没有发现在肿瘤区域附近聚集。经过48和72小时的观测后,我们发现Ru-BSe依然能在肿瘤区域集聚,但是Ru-Se测遍布裸鼠全身。注射后72h,我们将小鼠处死,将主要器官:脑、心、肝、脾、肺、肾和肿瘤取出,用活体荧光成像仪观测配合物在各组织内积聚情况。值得注意的是,靶向性的Ru-BSe能够别肿瘤所吸收,而其它 组织的积累则很少。相反,Ru-Se则没能被肿瘤组织选择性吸收,而且在活体荧光成像仪中可以观测到在肝和脾组织有很强的荧光信号。
向已成瘤的HeLa裸鼠模型(n=6)按照4μmol/Kg的剂量隔天注射钌配合物(Ru-Se或Ru-BSe),阴性对照组注射生理盐水,共15次。隔天测量裸鼠的体重,和肿瘤的长(l)和宽(w)。肿瘤的体积通过公式V=l×w2/2计算。如图16所示,含硒钌配合物Ru-Se和Ru-BSe均能有效抑制肿瘤的生长,抑制率分别为55.7%和35.8%(抑制率的计算公式:抑制率=V 实验组/V对照组),可见靶向性的含硒钌配合物在体内具有更强的抗肿瘤活性。在Ru-Se注射组的裸鼠模型中,我们发现裸鼠的体重有轻微的下降,而Ru-BSe组的裸鼠的体重变化不大。如图17所示,利用ICP-AES检测Ru元素在体内的分布。通过对裸鼠的器官和肿瘤组织硝化,发现Ru-BSe内特异性地被肿瘤组织所吸收,而在正常组织内的分布很少。与之相反的是,Ru-Se则被肝和脾大量地吸收。特别的是,Ru-BSe在肿瘤组织的含量比Ru-Se高出3倍,证明其在体内也具有肿瘤靶向性。
为了综合评价含硒钌配合物对机体所产生的毒性,比较了药物注射30天后裸鼠心、肝、脾、肺、肾和肿瘤的组织切片变化和血液生化指标(血液生化分析仪)。将组织切片脱蜡至水后,在显微镜下观察组织状态,拍照。如图18所示,我们发现经Ru-Se处理后的,肝组织出血、肺泡腔出血和肾小球萎缩的变化,而Ru-BSe处理组的脏器则未出现损伤或炎症反应。
30天治疗结束后,对裸鼠摘除眼球取血。完成取血后,血液立即使用3000g/min离心10min,收集血清,并置于碎冰中。血液生化指标结果分析表明,经含硒钌(II)配合物治疗后,有效降低肿瘤对小鼠血液生化指标的影响。其中,相对于Ru-Se,靶向基团的引入使Ru-BSe能选择性地聚集在肿瘤组织,有效降低了含硒配合物的肾毒性(图19),如下调了尿酸(UA)、尿素氮(BUN)和肌酐(CRE)。同时,靶向钌配合物也降低了肝毒性,如减轻了血清总蛋白(TP)和血清白蛋白(ALB)的下降,但对谷草转氨酶(AST)无显著的改变。另外,含硒钌配合物具有有效避免血清甘油三酯(TG)的上升,且无明显心脏毒性,如肌酸激酶(CK)指标无显著差异。
综上所述,生物素靶向基团能提高含硒钌配合物被肿瘤组织的吸收能力,从而提高其抗肿瘤活性和降低药物的肾毒性和肝毒性;含硒配合物通过靶向分子修饰后,能在荷瘤裸鼠模型中有效地被肿瘤组织吸收,从而降低了对正常组织的毒副性,实现对金属配合物有效的改性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种肿瘤靶向性金属配合物的合成方法,其特征在于:将具有取代基团的配体通过连接具有靶向性的分子,配体与金属离子进行配位,合成肿瘤靶向性金属配合物;
所述的配体为菲咯啉衍生物、联吡啶衍生物、苯并咪唑类衍生物、苯基-吡啶类衍生物和噻吩-吡啶类衍生物中的一种;
所述的具有靶向性的分子为生物素、叶酸、整合素、转铁蛋白、穿膜肽、八聚精氨酸、MUC-1附膜蛋白、半乳糖胺、新生血管靶向肽和粒细胞巨噬细胞刺激因子中的一种。
2.根据权利要求1所述的肿瘤靶向性金属配合物的合成方法,其特征在于:所述的金属离子为钌(II)、锇(II)、铑(III)和铱(III)离子中的一种;所述的连接为配体直接或通过桥连分子与具有靶向性的分子连接;所述的桥连分子为含有可供缩合反应的官能团的烷烃类衍生物或氨基酸分子。
3.根据权利要求1或2所述的肿瘤靶向性金属配合物的合成方法,其特征在于通过如下任一种方法实现:
S1:肿瘤靶向性钌配合物的合成
(1)将2-(2-吡啶)-苯并咪唑-5-羧酸、EDC和NHS溶解于DMF中,加热至60℃进行反应,再加入产物A和三乙胺继续反应,然后加入冰水,抽滤,得到产物B,其中,2-(2-吡啶)-苯并咪唑-5-羧酸、EDC、NHS和产物A按摩尔比1:1~2:1~2:1~2进行配比;
(2)将金属化合物和配体II加入DMF中,于100~140℃进行反应,再加入丙酮析出沉淀,过滤、洗涤,烘干得到产物C,其中,金属离子和配体II按摩尔比1:2进行配比,配体II为咪唑[4,5-f]-[1,10]菲咯啉或[1,2,5]硒二唑[3,4-f][1,10]菲咯啉;
(3)将步骤(1)得到的产物B和步骤(2)得到的产物C加入乙二醇乙醚中,于90~130℃进行反应,冷却,再加入饱和高氯酸钠溶液,得到肿瘤靶向性金属配合物,其中,产物B和产物C按摩尔比1:1进行配比;
或者是:
S2:肿瘤靶向性铱配合物的合成
(a)将4-甲基-2,2-联吡啶-4-甲酸、EDC和NHS溶解于DMF中,加热至60℃进行反应,再加入产物A和三乙胺继续反应,然后加入冰水,抽滤,得到产物D,其中,4-甲基-2,2-联吡啶-4-甲酸、EDC、NHS和产物A按摩尔比1:1~2:1~2:1~2进行配比;
(b)将金属化合物和2-(2-噻吩)吡啶加入乙二醇乙醚和水的混合溶剂中,于90~130℃进行反应,冷却,抽滤,取固体,洗涤,烘干,得到产物E,其中,金属化合物和2-(2-噻吩)吡啶按摩尔比1:2进行配比;
(c)将步骤(a)得到的产物D和步骤(b)得到的产物E加入甲醇和二氯甲烷的混合溶剂中,于10~70℃进行反应,冷却,再加入六氟磷酸铵搅拌进行反应,然后蒸发溶剂,洗涤,得到肿瘤靶向性金属配合物,其中,产物D、产物E和六氟磷酸铵按摩尔比1:1:1~20进行配比;
步骤(1)和步骤(a)中所述的产物A通过如下方法制备得到:将己二胺溶解于DMF中,再加入生物素-N-琥珀酰亚胺基酯,常温反应,再加入冰水,抽滤,洗涤,得到产物A,其中,生物素-N-琥珀酰亚胺基酯和己二胺按摩尔比1:1~30进行配比。
4.根据权利要求3所述的肿瘤靶向性金属配合物的合成方法,其特征在于:
所述的生物素-N-琥珀酰亚胺基酯通过如下方法制备得到:将EDC、NHS和D-生物素混合在DMF中,于10~100℃反应2h~4h,再加入冰水,过滤、取沉淀,得到生物素-N-琥珀酰亚胺基酯,其中,EDC、NHS和D-生物素按摩尔比1:1~2:1~2进行配比。
5.根据权利要求3所述的肿瘤靶向性金属配合物的合成方法,其特征在于:
步骤(1)中所述的2-(2-吡啶)-苯并咪唑-5-羧酸通过如下方法制备得到:将3,4-二氨基苯甲酸溶于乙醇中,加入吡啶-2-甲醛进行反应,蒸发、加入冰水析出后过滤,得到2-(2-吡啶)-苯并咪唑-5-羧酸,其中,3,4-二氨基苯甲酸和吡啶-2-甲醛按摩尔比1:1进行配比;
步骤(2)中所述的咪唑[4,5-f]-[1,10]菲咯啉通过如下方法制备得到:将1,10-邻菲咯啉-5,6-二酮溶解于乙酸,加入醋酸铵和甲醛于110℃回流反应,调pH值至11,抽滤,得到咪唑[4,5-f]-[1,10]菲咯啉,其中,1,10-邻菲咯啉-5,6-二酮和甲醛按摩尔比1:1进行配比;
步骤(2)中所述的[1,2,5]硒二唑[3,4-f][1,10]菲咯啉通过如下方法制备得到:将1,10-邻菲咯啉-5,6-二胺溶解于乙醇中,加入二氧化硒,加热至90℃回流反应,旋转蒸发,得到[1,2,5]硒二唑[3,4-f][1,10]菲咯啉,其中,1,10-邻菲咯啉-5,6-二胺和二氧化硒按摩尔比1:1.2进行配比。
6.根据权利要求3所述的肿瘤靶向性金属配合物的合成方法,其特征在于:
步骤(1)和步骤(a)中所述的反应的时间为2h;
步骤(1)和步骤(a)中所述的加入产物A和三乙胺继续反应的时间为24h;
步骤(2)中所述的反应的时间为8h;
步骤(3)和步骤(c)中所述的反应的时间为6h;
步骤(b)中所述的反应的时间为12h;
步骤(c)中所述的加入六氟磷酸铵搅拌进行反应的时间为10h;
步骤(b)中所述的混合溶剂中乙二醇乙醚和水体积比为1~6:1;
步骤(c)中所述的混合溶剂中二氯甲烷和甲醇的体积比为1~6:1;
步骤(3)和步骤(c)中所述的肿瘤靶向性金属配合物可以进一步经氧化铝柱层析纯化。
7.一种肿瘤靶向性金属配合物,其特征在于:通过权利要求1~6任一项所述的方法制备得到。
8.权利要求7所述的肿瘤靶向性金属配合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的肿瘤靶向性金属配合物在制备抗肿瘤药物中的应用,其特征在于:所述的肿瘤为人非小细胞肺癌、人宫颈癌、黑色素瘤、人成骨肉瘤、乳腺癌或脑胶质瘤。
10.权利要求7所述的肿瘤靶向性金属配合物在分子探针、细胞成像和活体荧光成像领域中应用。
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