CN108373487B

CN108373487B - 双光子吸收钌配合物的制备方法及其作为肿瘤探针的应用

Info

Publication number: CN108373487B
Application number: CN201810304146.3A
Authority: CN
Inventors: 陈填烽; 招振楠
Original assignee: Jinan University
Current assignee: Jinan University
Priority date: 2018-04-04
Filing date: 2018-04-04
Publication date: 2020-04-14
Anticipated expiration: 2038-04-04
Also published as: CN108373487A

Abstract

本发明公开了一种双光子吸收钌配合物的制备方法及其作为肿瘤探针的应用。该双光子吸收钌配合物为Ru‑1和Ru‑RGD中的至少一种；其中，Ru‑1和Ru‑RGD的阳离子的结构式如式I和式II所示。本发明的双光子吸收钌配合物利用微波辐射的方法合成，将具有取代基团的配合物通过连接具有靶向性RGD多肽的分子，合成肿瘤靶向性钌配合物。本发明中高效地合成了钌配合物，减少了有机溶剂的消耗量和合成时间；所合成的钌配合物具有良好的单、双光子细胞成像能力以及靶向宫颈癌细胞的功能，能够同时实现对肿瘤的诊断和治疗，具有极大临床应用潜力。

Description

双光子吸收钌配合物的制备方法及其作为肿瘤探针的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，特别涉及一种双光子吸收钌配合物的制备方法及其作为肿瘤探针的应用。

背景技术

由于人口老年化、环境污染等因素，肿瘤现在威胁全球人类的健康。及时的诊断和治疗方案可有效地减低癌症死亡率，成为攻克癌症的重要手段。诊断治疗是一种新型的肿瘤治疗手段，合成同时具有肿瘤诊断和抗肿瘤活性的肿瘤诊疗剂成为研究热点。

在众多临床应用的抗肿瘤药物中，顺铂是第一个临床应用的金属抗肿瘤药物。顺铂的广谱抗肿瘤活性和高治愈率使之在当前仍被广泛地使用(N.J.Farrer，P.J.Sadler，Medicinal Inorganic Chemistry(Ed.：E.Alessio)，2011，PP.1-37.)。但是，无论是顺铂，还是第二、三代的铂类抗肿瘤药物，都会产生严重的毒副性。因此，寻找与铂类药物具有不同作用机理的抗肿瘤药物成为亟待解决的问题。此外，金属配合物在生物成像也有广泛的应用，如分子探针、生物成像和活体荧光成像。相对于有机荧光探针，独特的d电子构型使过渡金属配合物，如钌(II)、铱(III)、铑(III)和铂(II)等，能产生较高量子产率的三重激发态。这使金属配合物拥有较大的斯托克斯位移(Stokes shifts)，能有效避免荧光自淬灭和微秒级的荧光寿命可有效地避免生物体内的荧光。但是单光子发光成像的磷光探针的组织穿透性性差，难以对深层组织内部进行成像。此外，在活体成像中，小分子探针往往对肿瘤组织的选择性较低，难易实现对肿瘤组织成像。

金属钌配合物是开发新型肿瘤诊断治疗的材料。以NAMI-A为代表的金属钌配合物，能显著地抑制肿瘤的转移、粘附和迁移，展现出与铂类药物不同的作用机制并且进入临床研究中(L.Zeng，P.Gupta，Y.Chen，E.Wang，L.Ji，H.Chao，Z.S.Chen，Chem.Soc.Rev.2017，46， 5771-5804.)。具有六配位的结构，通过搭配不同性能的配体，可获得具有良好的抗肿瘤活性和光学性能的分子。当前，随着双光子显微成像技术的发展与应用，金属配合物在活体组织和3D生物成像领域得到更先进的应用。具有双光子发光特性的金属配合物可被近红外区光波激发(600-900nm)，具有高空间选择性、高穿透性、低光损伤和低光致毒性等优点。总而言之，金属配合物具有良好的抗肿瘤活性和生物荧光成像能力，使之在肿瘤的诊断和治疗中具有应用潜力(Chiu，H.Huang，Y.Lam，A.Habtemariam，T.Malcomson，M.J.Paterson，G.J. Clarkson，P.B.O＇Connor，H.Chao，Angew.Chem.Int.Ed.2017，56，14898-14902；K.Qiu，H. Huang，B.Liu，Y.Liu，Z.Huang，C.Yu，L.Ji，C.Hui，ACSAppl.Mater.Interfaces2016，20， 12702-12710.)。因此，开发具有良好抗肿瘤活性和双光子发光成像能力的钌配合物作为肿瘤的诊断治疗剂，具有重要的应用价值。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种双光子吸收钌配合物。

本发明的另一目的在于提供所述双光子吸收钌配合物的制备方法。

本发明的又一目的在于提供所述双光子吸收钌配合物作为肿瘤探针的应用。

本发明的再一目的在于提供所述双光子吸收钌配合物作为抗肿瘤药物的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种双光子吸收钌配合物，为Ru-1和Ru-RGD中的至少一种；其中，Ru-1和Ru-RGD的阳离子[Ru(MOP)₂(L)]²⁺(MOP为 2-(4-methoxyphenyl)-1H-imidazo[4，5-f][1，10]phenanthroline，L为2-(2-吡啶)苯并咪唑衍生物) 的结构式如式I和式II所示：

所述的Ru-1和Ru-RGD的阴离子为(ClO₄)^-、Cl^-或PF₆ ^-等无机盐离子。

所述的双光子吸收钌配合物利用微波辐射的方法合成，将具有取代基团的配合物通过连接具有靶向性RGD多肽的分子，合成肿瘤靶向性钌配合物；所述的双光子吸收钌配合物的制备方法，具体包括如下步骤：

(1)产物1的合成：将3，4-二氨基苯甲酸加入到无水乙醇中，再加入醋酸铜溶于水获得的醋酸铜溶液，搅拌反应，得到中间产物I；向中间产物I中滴加吡啶-2-甲醛，80℃回流搅拌反应，待反应结束后抽滤，洗涤，得到产物1；

(2)产物2的合成：将步骤(1)中得到的产物1、EDCI(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)溶于DMF(N，N-二甲基甲酰胺)中，并于 50℃条件下反应12h，待反应结束后将所得溶液倒入冰水中，析出白色固体A；再将白色固体A、4-氨基丁酸和三乙胺溶于DMF中，并于50℃条件下反应6h，待反应结束后将所得溶液倒入冰水中并抽滤，得到产物2；

(3)产物3(MOP)的合成：将1，10-邻菲咯啉-5，6-二酮溶于乙酸中，再加入醋酸铵和对甲氧基苯甲醛，110℃回流搅拌反应，待反应结束后将pH值调至11，抽滤，得到产物3；

(4)产物4的合成：将钌化合物与步骤(3)中得到的产物3加入到DMF中，在保护性气体氛围下加热至140℃搅拌反应，待反应结束后冷却至室温，再加入丙酮，放置于-20℃条件下过夜，最后将反应体系过滤、洗涤、烘干，得到产物4；

(5)配合物Ru-1的合成：将步骤(4)中得到的产物4与步骤(2)中得到的产物2溶于乙醇水溶液中，在保护性气体氛围下加热至80℃进行反应，反应结束后冷却至室温，然后浓缩溶剂并加入到NH₄PF₆溶液中，抽滤，得到配合物Ru-1；

(6)配合物Ru-RGD的合成：将步骤(5)中得到的配合物Ru-1、EDCI和NHS溶于 DMF中，室温条件下反应8h，待反应结束后将所得混合溶液倒入NH₄PF₆溶液中，抽滤，收集沉淀并干燥，得到中间产物II；然后将中间产物II加入到DMF中，并加入cRGD多肽和三乙胺，室温条件下反应24h，待反应结束后再加入NH₄PF₆溶液，抽滤，得到配合物Ru-RGD。

步骤(1)中所述的3，4-二氨基苯甲酸与醋酸铜的摩尔比优选为1∶1。

步骤(1)中所述的3，4-二氨基苯甲酸的用量优选为按每毫升(mL)无水乙醇配比0.6mmol 3，4-二氨基苯甲酸计算。

步骤(1)中所述的醋酸铜的的用量优选为按每毫升(mL)无水乙醇配比0.6mmol醋酸铜计算。

步骤(1)中所述的吡啶-2-甲醛与3，4-二氨基苯甲酸的摩尔比优选为5∶6。

步骤(1)中所述的80℃回流搅拌反应的时间优选为2h。

所述的双光子吸收钌配合物制备方法，还包括将步骤(1)中得到的产物除去铜离子的步骤，具体为：将产物1分散于乙醇中，然后加入Na₂S·9H₂O进行反应，待反应结束后抽滤，再将抽滤后获得的滤液浓缩，调pH＝1，并水浴加热至60℃以除去硫化氢气体，最后蒸发溶液，得到去除铜离子后的产物1。

所述的pH的调节剂优选为盐酸溶液。

所述的Na₂S·9H₂O与产物1的摩尔比优选为1∶1。

所述的反应的时间优选为2h。

所述的浓缩优选为浓缩至滤液体积的3/10左右。

步骤(1)中所述的产物1还可以进一步经氧化铝柱层析纯化。

所述的氧化铝柱层析为采用乙酸乙酯和甲醇的混合溶液作为洗脱液进行洗脱。

步骤(2)中所述的产物1、EDCI(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和NHS (N-羟基琥珀酰亚胺)的摩尔比优选为1∶3∶1。

步骤(2)中所述的白色固体A、4-氨基丁酸和三乙胺的摩尔比优选为1∶1∶3。

步骤(2)中所述的产物2还可以进一步经硅胶层析纯化。

步骤(3)中所述的1，10-邻菲咯啉-5，6-二酮、醋酸铵和对甲氧基苯甲醛的摩尔比优选为1∶ 3∶1。

步骤(3)中所述的1，10-邻菲咯啉-5，6-二酮的用量优选为按每毫升(mL)乙酸配比0.2mmol 1，10-邻菲咯啉-5，6-二酮计算。

步骤(3)中所述的搅拌反应的时间优选为6h。

步骤(3)中所述的pH值的调节剂优选为氨水。

步骤(3)中所述的产物2还可以进一步经硅胶层析纯化。

步骤(4)中所述的钌化合物优选为RuCl₃。

步骤(4)中所述的钌化合物与产物3的摩尔比为1∶2。

步骤(4)中所述的钌化合物用量优选为按每毫升(mL)DMF配比0.067mmol RuCl₃计算。

步骤(4)中所述的保护性气体优选为氩气。

步骤(4)中所述的搅拌反应的时间优选为8h。

步骤(4)中所述的DMF与丙酮的体积比为3∶20。

步骤(4)中所述的洗涤为用-20℃的冻丙酮进行洗涤；优选为用-20℃的冻丙酮洗涤两次。

步骤(5)中所述的产物4与产物2的摩尔比优选为1∶1。

步骤(5)中所述的乙醇水溶液为乙醇与水按体积比9∶1配比得到的溶液。

步骤(5)中所述的加热采用微波反应器进行加热。

所述的微波反应器加热的功率为180W。

步骤(5)中所述的反应的时间优选为30min。

步骤(5)中所述的浓缩为浓缩至体系总体积的1/4左右。

步骤(5)中所述的配合物Ru-1还可以进一步经高效液相色谱(HPLC)系统分离纯化：利用高效液相色谱(HPLC)系统，使用C18反相柱和乙腈/水体系进行洗脱，所得液体进行浓缩和干燥得到橙色的配合物Ru-1。

步骤(5)和(6)中所述的NH₄PF₆溶液的浓度优选为1mmol/L。

步骤(6)中所述的NH₄PF₆溶液优选为冻NH₄PF₆溶液。

步骤(6)中所述的配合物Ru-1、EDCI和NHS摩尔比优选为1∶3∶1。

步骤(6)中所述的配合物Ru-1的用量优选为按每毫升(mL)DMF配比0.01mmol配合物Ru-1计算。

步骤(6)中所述的中间产物II(沉淀)，cRGD多肽和三乙胺的摩尔比优选为1∶1.2∶3。

步骤(6)中所述的配合物Ru-1还可以进一步经高效液相色谱(HPLC)系统分离纯化：利用HPLC系统，使用C18反相柱和乙腈/水体系进行洗脱，所得液体进行浓缩和干燥得到橙色的配合物Ru-RGD粉末。

所述的双光子吸收钌配合物在细胞荧光成像或活体荧光成像领域中应用，钌配合物的细胞荧光成像或活体荧光成像可被单光子激光或近红外区双光子激光激发。

所述的双光子吸收钌配合物作为肿瘤探针的应用。

所述的双光子吸收钌配合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

所述的肿瘤包括人宫颈癌。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明利用微波辐射的方法，高效地合成了钌配合物，产率达到89.1％，减少了有机溶剂的消耗量和合成时间。合成的钌配合物可以应用于抗肿瘤药物以及肿瘤的诊断治疗方面。

(2)本发明对钌合物进行肿瘤靶向性修饰，提高肿瘤组织对药物的吸收，减低了金属配合物在体内应用的毒副性；通过在配合物的配体上引入取代基，引入靶向基团对药物进行改性，该方法具有良好的可操作性和重现性。

(3)本发明所合成的钌配合物具有良好的磷光发射性能，具有良好的单、双光子细胞成像能力，可以用于在生物成像和活体成像。并且在近红外光波激发下，有较大的双光子吸收横截面值，可以深入组织进行荧光成像。利用荧光实时监控技术，为肿瘤的早期诊断提供诊断剂。

(4)在裸鼠荷瘤模型实验中，本发明所合成的药物(钌配合物)对肿瘤组织的增殖具有明显的抑制效果，且对正常组织毒副性低；尤其是对宫颈癌具有良好的抗肿瘤活性。

(5)当前使用的小分子抗肿瘤药物和诊断剂，对肿瘤细胞的选择性较低；本发明合成肿瘤靶向性的钌配合物，基于肿瘤细胞和正常细胞的差异，有效地被肿瘤组织吸收，在裸鼠荷瘤模型中，同时实现对肿瘤的诊断和治疗。

(6)本发明所合成的钌配合物，能有效的对临床宫颈癌切片进行染色诊断，对宫颈癌切片的检测阳性率达到95％。相对于利用抗体实施的免疫荧光技术，本发明的钌配合物所提供的检测技术成本更低、耗时更短，具有极大的临床使用潜力。

附图说明

图1为钌配合物(Ru-1和Ru-RGD)的化学结构式示意图。

图2为配体和钌配合物的合成线路图；其中，图a为配体产物1和2的合成路线图；图b为配体产物3和钌配合物的合成路线图。

图3为钌配合物的光学性质测定结果图；其中，图a为电子吸收光谱；图b为荧光光谱；图c为荧光寿命测定。

图4为钌配合物在激发波长730-900nm下的双光子吸收截面图。

图5为CaSki的3D肿瘤球模型与配合物Ru-RGD培育3h后在单光子和双光子共聚焦显微镜的荧光成像图。

图6为宫颈癌细胞CaSki、SiHa和HeLa，以及正常细胞Ect1/E6E7对钌配合物的吸收量统计结果图。

图7为配合物Ru-RGD选择性地诱导CaSki-Ect1/E6E7共培养模型中肿瘤细胞凋亡图。

图8为经过Ru-1和Ru-RGD(4μmol/kg)注射后，钌配合物在CaSki荷瘤裸鼠模型的体内不同时间段的荧光成像图。

图9为钌配合物经尾静脉注射36h后，在不同器官内的分布(心、肝、脾、肺、肾和肿瘤)结果图。

图10为经钌配合物治疗25天后，在不同器官内(心、肝、脾、肺、肾和肿瘤)钌含量的分布图。

图11为经钌配合物治疗25天后，CaSki荷瘤裸鼠模型的体重、肿瘤体积和瘤重的变化图；其中，图a为肿瘤体积变化；图b为体重变化；图c为肿瘤组织的重量。

图12为H&E染色检测经钌配合物治疗后，裸鼠模型的脏器损伤情况图。

图13为经钌配合物注射25天后，裸鼠血清的生化指标图；其中，图a为尿素氮，图b为谷草转氨酶。

图14为经钌配合物染色的宫颈正常组织(Normal)和肿瘤组织(CAII)的荧光成像图。

图15为免疫荧光法检测肿瘤切片中配合物Ru-RGD与整合素结合情况图；其中，图a为Ru-RGD红色荧光(发射波长为650±20nm)；图b为抗体Intergin的绿色荧光(发射波长为520±20nm)；图c为图a和b的合并照片；图d为分析图c绿色和红色荧光相关性统计图，其相关性R＝0.85。

图16为经钌配合物Ru-RGD对不同的切片的染色情况图(包括正常组织(Normal)，宫颈上皮内瘤变(CINI～III)和癌变组织(CAI～II))。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1钌配合物的制备和表征

(1)产物1的合成：如图2a所示，取3，4-二氨基苯甲酸4.56g(30mmol)悬浮于50mL无水乙醇于单口烧瓶中。使用50mL的纯水溶解5.5g(30mmol)醋酸铜粉末后，加入上述烧瓶并充分搅拌至深褐色固体。使用分液漏斗于20min内滴加入吡啶-2-甲醛2.68g(25mmol)后，反应温度加热至80℃回流搅拌反应2h。所得到深褐色固体抽滤后，用纯水洗涤并分散于100mL乙醇中。为了除去铜离子，加入7.20g(30mmol)的Na₂S·9H₂O的固体与上述溶液中，反应2h后抽滤去除黑色的固体。所得的滤液浓缩至30mL后加入盐酸溶液至pH＝1，并水浴加热至60℃以除去硫化氢气体。所得溶液蒸发溶液后得到深黄色粗产物，使用氧化铝柱层析(氧化铝颗粒100～200目，购于阿拉丁试剂有限公司，柱径高为3cm×10cm，下同)，并用乙酸乙酯和甲醇溶液，体积比为1∶1进行洗脱，收集黄色洗脱液并蒸发溶剂得到黄色固体，纯净的配体产物1，产率为79.1％。

(2)产物2的合成：如图2a所示，将产物1的固体(23.9mg，0.1mmol)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)(57.9mg，0.3mmol)，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(11.5mg，0.1mmol)溶解于5mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，并在50℃下反应12h。所得溶液倒入50mL的冰水中，所析出的白色产物A抽滤并用干抽，收率95％。上述产物A(30mg，0.1mmol)，4-氨基丁酸(10.3mg，0.1mmol)和0.1mL三乙胺(TEA)溶解于5mL的干燥DMF溶液中，并在50℃下反应6h。反应后溶液倒入50mL冰水中并抽滤得到淡黄色沉淀。所得粗产物使用硅胶层析(硅胶颗粒100～200目，购于阿拉丁试剂有限公司，柱径高为3cm×10cm，下同)，收集浅黄色洗脱液并蒸发溶剂后，得到黄色产物2，产率：60.0％。表征数据：¹H NMR(500MHz，DMSO-d⁶)δ13.38(s，1H)，8.78(d，J＝7.5Hz，1H)， 8.55(s，1H)，8.39(d，J＝7.5Hz，1H)，8.04(t，J＝7.5Hz，1H)，7.81(s，1H)，7.57(t，J＝7.5Hz，1H)， 3.36(t，J＝7.0Hz，2H)，2.35(t，J＝7.0Hz，2H)，1.84(m，J＝7.0Hz，2H).ESI-MS：m/z 325.127 ([M+H]⁺，calcd325.122).

(3)产物3(MOP)的合成：如图2b所示，称取2.51g(12mmol)1，10-邻菲咯啉-5，6- 二酮溶解于60mL乙酸中，并加入3g醋酸铵和1.63g(12mmol)对甲氧基苯甲醛。反应加热至110℃回流搅拌6h。待反应结束后，向体系加入氨水，将pH值调至11，抽滤得到固体进行硅胶柱层析提纯，使用3mL甲醇溶解样品上样，每次上样量为1g，洗脱剂为无水甲醇，蒸发溶剂后得到黄色固体产物3，产率：76.3％。

(4)产物4的合成：如图2b所示，将1mmol的RuCl₃与2mmol产物3加入15mL 的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，反应在氩气保护下加热至140℃搅拌8h。待反应冷却至室温，加入100mL的丙酮放置-20℃过夜。将反应过滤，滤渣用20mL的-20℃的冻丙酮洗涤两次，烘干得到紫黑色产物4，待用；产率：80.2％。

(5)配合物Ru-1的合成：如图2b所示，将上述产物4(0.249g，0.5mmol)与产物2(0.162g 0.5mmol)溶解于18mL乙醇和2mL纯水的混合溶剂，在氮气保护下使用微波反应器以180W功率加热至80℃反应30min。反应结束后，溶液由紫黑色变为橙红色，冷却至室温后浓缩溶剂至5mL后加入30mL的NH₄PF₆溶液(1mM)中，抽滤得到红色固体。上述固体利用高效液相色谱(HPLC)系统，使用C18反相柱和乙腈/水体系进行洗脱，所得液体进行浓缩和干燥得到橙色的配合物Ru-1，产率：89.1％。表征数据：元素分析C₅₇H₄₄F₁₂N₂₁O₅P₂Ru (％)：C，50.04；H，3.24；N，12.29.Found(％)：C，49.98；H，3.30；N，12.21.¹H NMR(600MHz， DMSO-d⁶)δ9.12(d，J＝8.2Hz，2H)，9.06(dd，J＝10.5，8.3Hz，2H)，8.72(d，J＝8.0Hz，1H)，8.40 (t，J＝5.7Hz，1H)，8.27(dd，J＝9.0，4.3Hz，6H)，8.16(d，J＝5.4Hz，2H)，8.04(d，J＝5.3Hz，1H)，7.98(dd，J＝8.4，5.2Hz，1H)，7.93(dd，J＝8.3，5.2Hz，1H)，7.83(dd，J＝8.3，5.4Hz，1H)，7.80- 7.74(m，2H)，7.45(t，J＝6.8Hz，1H)，7.35(d，J＝8.8Hz，1H)，7.22(dd，J＝8.6，6.2Hz，4H)，5.42 (d，J＝8.7Hz，1H)，3.89(d，J＝3.7Hz，6H)，3.20(q，J＝6.5Hz，2H)，2.19(t，J＝7.4Hz，2H)，1.66 (p，J＝7.2Hz，2H).MALDI-TOF-MS：m/z calcd for C₅₇H₄₄N₁₂O₅Ru[M-H]⁺1077.255；found： 1077.024.

(6)产物Ru-RGD的合成：如图2b所示，取配合物Ru-1(13.68mg，0.01mmol)，5.75 mgEDCI(0.03mmol)，1.15mg(0.01mmol)NHS溶解于1mLDMF，室温反应8h。所得溶液倒入20mL1mM的冻NH₄PF₆溶液中，抽滤收集并干燥沉淀。将上述沉淀加入1mL 的DMF中，加入6.88mgcRGD多肽(环状RGD多肽)和0.05mL的三乙胺后，室温反应 24h后再加入20mL 1mM的冻NH₄PF₆溶液。抽滤得到红色固体。上述固体利用HPLC系统，使用C18反相柱和乙腈/水体系进行洗脱，所得液体进行浓缩和干燥得到橙色的配合物 Ru-RGD，产率：80.5％。表征数据：Anal.Calcd for C₈₄H₈₃F₁₂N₂₁O₁₁P₂Ru(％)：C，51.64；H，4.28； N，15.06.Found(％)：C，51.58；H，4.38；N，15.11.¹H NMR(600MHz，DMSO-d⁶)δ9.11(dd，J＝ 8.5，3.9Hz，2H)，9.06(dd，J＝16.7，8.3Hz，2H)，8.70(d，J＝8.0Hz，1H)，8.42(d，J＝7.1Hz，1H)， 8.32-8.22(m，6H)，8.22-8.15(m，1H)，8.12(d，J＝8.5Hz，1H)，8.06(d，J＝7.3Hz，1H)，8.02- 7.90(m，3H)，7.78(dq，J＝20.8，6.5Hz，5H)，7.61(d，J＝8.1Hz，1H)，7.54(d，J＝5.9Hz，1H)， 7.44(t，J＝6.7Hz，1H)，7.21(ddd，J＝14.1，9.7，6.3Hz，6H)，7.12(d，J＝6.4Hz，3H)，6.17(s，1H)， 4.63(q，J＝7.9Hz，1H)，4.41(d，J＝8.0Hz，1H)，4.15(q，J＝7.6Hz，1H)，4.04(dd，J＝15.1，7.6 Hz，1H)，3.89(d，J＝7.0Hz，6H)，3.24(dd，J＝14.9，4.2Hz，1H)，3.08(s，2H)，2.99-2.86(m，3H)，2.81(s，1H)，2.73(td，J＝16.4，14.1，6.2Hz，1H)，2.38(dd，J＝16.1，5.3Hz，1H)，2.03(d，J＝7.9 Hz，2H)，1.75-1.58(m，3H)，1.57-1.43(m，1H)，1.37(s，3H)，1.24(s，2H)，0.96(d，J＝32.8Hz， 2H).MALDI-TOF-MS：m/z 1662.303[M-2PF₆]⁺.

实施例2钌配合物的双光子发光成像应用

本实施例测定了实施例1中所合成的钌配合物相关光学性质，作为其应用于生物荧光成像领域的依据。如图3所示：图3a中，钌(II)配合物在PBS溶液的紫外-可见光吸收光谱显示出两个吸收峰，270～382nm处较强的吸收峰为配体内部(IL)π→π^*跃迁，而407～547nm 的吸收峰为金属中心-配体跃迁(MLCT)dπ(Ru)→π^*(ligand)。当钌(II)配合物的PBS溶液在MLCT吸收段处λmax＝500nm激发，发射出3MLCT深红色的磷光λmax＝670nm(图 3b)。我们进一步测定了钌配合物的荧光寿命(图3c)，所合成的多吡啶钌(II)配合物Ru-1 和Ru-RGD的荧光寿命分别为0.64和0.69ns。同时，对配合物Ru-1和Ru-RGD的量子产率进行测试，分别为0.047和0.055。

表1合成的钌(II)配合物的磷光光学性质

钌配合物双光子吸收截面测定采用双光子诱导荧光法(上转换荧光法)，以罗丹明B的甲醇溶液作为参比标准(Opt.Express 2008，16，4029-4047.)。所合成的钌配合物溶于甲醇中，利用140-fs Ti-Sapphire激光器(80-MHz，范围680-1080nm，Coherent Chameleon)测定荧光数据。根据下面的计算公式(1)计算出双光子吸收截面。

公式(1)中Φ代表量子产率，C代表测试的浓度，I代表积分荧光强度，n代表折射率；下标“1”代表参比标准，“2”代表测试样品。

如图4所示，钌配合物Ru-1和Ru-RGD在激发波长为730-900nm都有明显的双光子吸收，且在800nm附近最大的双光子吸收截面值分别为86.1和107.9GM，比对照的钌联吡啶配合物([Ru(bpy)₃]²⁺)([Ru(bpy)₃]²⁺，其中bpy为联吡啶，其制备方法参照文献：WenxiangZhang，Bin Li，Heping Ma，Liming Zhang，Yunlong Guan，Yihe Zhang，Xindan Zhang，Pengtao Jing，and Shumei Yue.Acs Applied Materials&Interfaces，2016，8(33)：21465)的60.7GM 高。由此可见，所合成的钌配合物具有良好的光学性能，可应用于单光子和双光子荧光成像。

基于双光子生物成像技术具有良好的组织穿透能力，因此选用3D肿瘤球模型(直径约为400μm)观察了钌配合物Ru-RGD双光子发光成像能力。操作如下：将5000个对数生长的CaSki细胞(宫颈癌细胞，购于美国菌种保藏中心)加入含1.5％琼脂糖的96孔板，并生成使之肿瘤球达到直径约为400μm。然后将肿瘤球转移到35mm的玻璃底培养皿中，并加入终浓度为20μM Ru-RGD孵育。随后肿瘤球在共聚焦显微镜(LSM780，Zeiss)中分别使用单光子(488nm)和双光子(810nm)激光激发成像。肿瘤球荧光图像沿着Z轴方向每30μm前进拍摄。结果如图5所示，Ru-RGD均能有效在单光子和双光子激化下成像，但是双光子长波激光能有效地穿透肿瘤球内部，距离肿瘤球表面200μm处仍可明显地观察到红色荧光。相反地，单光子成像仅能在离肿瘤球表面60μm处成像。由此可见，具有双光子吸收性能的钌配合物Ru-RGD在生物体系具有良好的双光子发光特性。

实施例2钌配合物的选择性吸收

本实施例从细胞层面检测钌配合物对肿瘤细胞的靶向性：

选用一系列肿瘤和正常细胞，包括CaSki、SiHa、HeLa、MCF-7肿瘤细胞和Ect1/E6E7正常人宫颈永生化鳞状细胞(均购于美国菌种保藏中心)，和L02正常肝细胞(购于南京凯基生物科技发展有限公司)研究药物的吸收。细胞在DMEM培养基(Gibco，含10％(v/v)的牛血清蛋白，100units/mL盘尼西林和50units/mL链霉素)中培养，放置于37℃细胞培养箱 (相对湿度为95％、含5％(v/v)CO₂)。

为了证明配合物的肿瘤靶向性的功效，我们利用电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)检测不同的宫颈细胞对钌配合物的吸收(图6)。细胞经钌配合物(终浓度为20μM)孵育后，使用PBS溶液(浓度为0.01M；pH＝7.4，下同)洗涤两次后，用胰酶(购于捷贝斯生物科技有限公司，工作液浓度为0.25％)重悬收集吸收，并计数。样品加入1mL的混酸(V_HNO3∶ V_HC1O4＝3∶1)，加热至180℃硝化1h。硝化后的溶液用Milli-Q纯水(美国Millipore公司)定容至5mL后，用ICP-MS检测硒的含量。结果表明，Ru-RGD能有效地被肿瘤细胞CaSki人宫颈癌上皮细胞、HeLa人宫颈癌细胞和SiHa人宫颈癌细胞，但被正常Ect1/E6E7人宫颈永生化鳞状细胞的量较低。进一步用过量的cRGD对细胞进行预处理，发现其能有效地抑制 Ru-RGD对肿瘤细胞的选择性，而对Ru-1的吸收无明显改变。由此可见，基于肿瘤细胞过度表达的整合素，Ru-RGD能有效通过整合素介导的吸收机制，提高其对肿瘤细胞的活性。

通过构建CaSki-Ect1/E6E7细胞共培养模型，我们进一步测定钌配合物对肿瘤细胞的靶向能力：将8×10⁴的Ectl/E6E7细胞加入35mm的细胞培养皿中，待细胞贴壁生长后，加入Cell tracker Blue染料(购于Thermo Fisher Scientific公司；工作浓度为1μg/mL)染色2h后，使Ectl/E6E7细胞标记为蓝色荧光，用PBS溶液洗涤两遍。加入等量无荧光标记的CaSki细胞，培养24h。共培养细胞经终浓度为20μM Ru-RGD孵育24h后，使用TUNEL试剂盒(罗氏(Roche)公司)检测细胞的凋亡情况。细胞处理后，利用流式细胞分析仪检测不同细胞的凋亡情况。在共培养模型中，Ru-RGD能选择性诱导CaSki细胞凋亡。流式细胞分析结果(图7)表明，对照组中没有发现细胞凋亡信号，而Ru-RGD处理后，蓝色荧光标记的CaSki细胞发生了凋亡，由控制组的0.2％上升至20.7％。但无荧光标记的正常Ectl/E6E7细胞则无明显变化。因此，靶向性的Ru-RGD能选择性地诱导肿瘤细胞凋亡。

实施例3钌配合物的抗肿瘤机制

1、细胞的存活率采用MTT法测定：

细胞培养方法参照实施例2。

取对数生长的上述各种细胞(CaSki、SiHa、HeLa、MCF-7肿瘤细胞和Ect1/E6E7正常人宫颈永生化鳞状细胞，以及L02正常肝细胞)，以2×10⁴cells/mL的浓度接种在96孔板，细胞在DMEM培养基中，放置于37℃细胞培养箱。孵育24h待细胞贴壁生长后，加入以浓度梯度为5～80μM的待测药物(Ru-1、Ru-RGD或顺铂)，孵育72h后加入20μL的5mg/mL 的MTT溶液继续孵育4h。结束后，抽走培养基，加入150μL二甲基亚砜(DMSO)，与570 nm出测定吸光度，计算半数抑制浓度IC₅₀。结果如表2所示，所合成的系列钌配合物对肿瘤细胞具有一定抗肿瘤活性，但差异较大。由Ru-l和Ru-RGD比较得知，RGD多肽的引入能有效地增加药物对肿瘤细胞的选择性，对CaSki细胞的IC₅₀值分别为5.1μM和3.8μM，但 Ru-RGD对正常细胞Ectl/E6E7的毒性较小，其安全系数(SI)由1.54提升到5.63。此外，靶向性Ru-RGD对整合素低表达的MCF-7肿瘤细胞和正常细胞活性较低(Y.Y.Yuan，R.T.K. Kwok，B.Z.Tang，B.Liu，J.Am.Chem.Soc.2014，136，2546-2554.)，以上结果均证明了靶向基团RGD的引入有效地提高钌配合物的吸收效率，进而提高其抗肿瘤活性。

表2系列钌(II)配合物与顺铂的体外抗肿瘤活性

注：表中SI表示药物的安全系数，反映了其低毒性，由公式SI＝IC₅₀(Ect1/E6E7)/IC₅₀(CaSki)得到。

实施例4靶向性钌配合物对人宫颈癌上皮细胞CaSki裸鼠异种移植瘤模型的诊断治疗效果

本发明应用CaSki裸鼠荷瘤模型去研究系列钌配合物的体内诊断治疗效应。CaSki荷瘤裸鼠模型：在6-8周龄雌性BALB/c裸小鼠(购于广东省医学实验动物中心)后肢腋皮下接种1×10⁶个CaSki细胞，待瘤块大小长到约200mm³时开始用药。

首先，我们使用荧光活体成像仪器检测36小时内钌配合物在裸小鼠体内的分布。荷瘤裸鼠分别经过尾静脉注射Ru-1和Ru-RGD(4μmol/kg)不同时间段后，经麻药麻醉固定后，在荧光活体成像仪内观察药物在体内的分布。如图8所示，尾静脉注射12h，Ru-RGD能在小鼠右侧前肢肿瘤区域附近聚集，而Ru-1则没有发现在肿瘤区域附近聚集。经过24和 36h的观测后，我们发现Ru-RGD依然能在肿瘤区域集聚，但是Ru-1测遍布裸鼠全身。注射后36h，我们将小鼠处死，将主要器官：心、肝、脾、肺、肾和肿瘤取出，用活体荧光成像仪观测配合物在各组织内积聚情况(图9)。值得注意的是，靶向性的Ru-RGD能够别肿瘤所吸收，而其它组织的积累则很少。相反，Ru-1则没能被肿瘤组织选择性吸收，而且在活体荧光成像仪中可以观测到在肝和肺组织有很强的荧光信号。

对已成瘤的CaSki裸鼠模型分成4组，每组6只，分别为：阴性控制组(生理盐水)、实验组I(4μmol/kg Ru-1)、实验组II(Ru-RGD 2μmol/kg)和实验组III(Ru-RGD 4μmol/kg)。按照对应的剂量隔天注射钌配合物(Ru-1或Ru-RGD)，共12次。隔天测量裸鼠的体重，和肿瘤的长(l)和宽(w)。肿瘤的体积通过公式V＝l×w²/2计算。图10所示，治疗25天后，我们利用ICP-AES检测Ru元素在体内组织的分布。通过对裸鼠的器官和肿瘤组织硝化和检测，发现Ru-RGD能特异性地被肿瘤组织所吸收，而在正常组织内的分布很少。与之相反的是，Ru-1则被肝和脾大量地吸收。特别的是，Ru-RGD在肿瘤组织的含量比Ru-1 高出3倍，证明RGD能有效提高配合物在体内的肿瘤靶向性。如图11所示，含钌配合物 Ru-1和Ru-RGD均能有效抑制肿瘤的生长，实验组I、II和III的抑制率分别为74.3％、57.9％和53.2％(抑制率的计算公式：抑制率＝m_实验组/m_控制组)，可见靶向性的钌配合物Ru-RGD 在体内具有更强的抗肿瘤活性。此外，所以组别的裸鼠均没有出现明显的体重变化。

为了综合评价含硒钌配合物对机体所产生的毒性，比较了药物注射25天后裸鼠心、肝、脾、肺、肾和肿瘤的组织切片变化和血液生化指标(血液生化分析仪)。将组织切片脱蜡至水后，在显微镜下观察组织状态，拍照。如图12所示，我们发现经Ru-1处理后的，出现了肝组织出血的症状，而同等剂量的Ru-RGD处理组的脏器则未出现损伤或炎症反应。

25天治疗结束后，对裸鼠进行取血并使用3000g/min离心10min，收集血清，并置于碎冰中。血液生化指标结果分析表明，经钌(II)配合物治疗后，有效降低肿瘤对小鼠血液生化指标的影响。其中，相对于Ru-1，靶向基团的引入使Ru-RGD能选择性地聚集在肿瘤组织，有效降低了钌配合物的肝和肾的毒性(图13)，如减轻了荷瘤模型对尿素氮(BUN) 和谷草转氨酶(AST)指标的改变。综上所述，RGD多肽靶向基团能提高钌配合物被肿瘤组织的吸收能力，从而提高其抗肿瘤活性和降低药物的肾肝毒性。肿瘤靶向性钌配合物 Ru-RGD能有效地实现了对体内肿瘤的诊断和治疗应用。

实施例5靶向性钌配合物对临床人宫颈癌病例的诊断

基于肿瘤靶向性的Ru-RGD在体内外实验中具有对宫颈癌肿瘤良好的成像能力，我们进一步利用Ru-RGD对不同恶化程度的临床宫颈癌切片样本进行检测。操作方法如下：宫颈癌病例切片由温州医科大学第二附属医院提供，且经过相关的病理学分析分为不同恶化程度的病例，依次为：正常组织(Normal)，宫颈上皮内瘤变(CINI～III)和癌变组织(CAI～II)。切片经二甲苯脱蜡后，用梯度的乙醇-水溶液浸泡，随后加入抗原修复液处理和血清进行封闭。然后，切片使用100μL的钌配合物(40μM)在室温的暗盒孵育1h。洗去配合物后，在加入Hoechst 33342染料孵育20min，洗涤后切片后在荧光显微镜下观察。当切片有10％的细胞被染上，则记录为阳性结果。

免疫荧光检测法切片经过上述的脱蜡至水和血清封闭后，加入1∶200稀释的anti-integrin αVβ₃抗体在4℃孵育过夜。洗涤后，在用1∶1000稀释的荧光二抗(AlexaFluor 488， GoatAnti-mouse IgG(H+L)SecondaryAntibody，Life technologies)在4℃孵育1h。切片洗涤后在荧光显微镜下观察，图像使用Image IPP pro 6.0分析。

结果如图14所示，在Ru-1处理后，正常组织和肿瘤切片均发现有红色荧光信号。但在Ru-RGD处理组中，仅肿瘤切片能观察红色荧光信号。与Ru-1相比，Ru-RGD通过RGD 多肽识别肿瘤切片中过度表达的整合素，对肿瘤切片具有更高选择性。进一步，我们通过免疫荧光法检测的Ru-RGD配合物对整合素识别的情况。如图15所示，我们分别Ru-RGD (图15a)和荧光标记的anti-integrin αvβ₃(图15b)对两片并列的肿瘤CAII组织切片染色，将对应观察得到红色和绿色荧光照片进行合并得到图15c，并分析红色和绿色荧光的相关性为R＝0.85。由此可见，Ru-RGD与anti-integrin αvβ₃有良好的相关性，钌配合物能识别肿瘤过度表达的整合素，有效地对肿瘤切片诊断。最后，使用Ru-RGD对不同恶化程度的切片进行染色，系统比较配合物对不同恶性程度的切片的区分能力。结果如图16所示，正常切片对Ru-RGD的染色呈阴性结果，对CINI～III切片染色效果随着其恶化程度呈正相关性，对CAI～II切片的染色效果明显。统计结果如表3所示，Ru-RGD对肿瘤组织切片的检测阳性率为95％，由此可见，Ru-RGD能识别不同恶化程度的肿瘤切片，具有潜在临床应用潜力。

表3.钌配合物对临床宫颈癌切片的检测情况统计表

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种双光子吸收钌配合物在制备细胞荧光成像或活体荧光成像的荧光成像剂中应用，其特征在于：所述的双光子吸收钌配合物为Ru-RGD；其中，Ru-RGD的阳离子的结构式如式II所示：

2.根据权利要求1所述的双光子吸收钌配合物在制备细胞荧光成像或活体荧光成像的荧光成像剂中应用，其特征在于：所述的Ru-1和Ru-RGD的阴离子为(ClO₄)^-、Cl^-或PF₆ ^-。

3.根据权利要求1所述的双光子吸收钌配合物在制备细胞荧光成像或活体荧光成像的荧光成像剂中应用，其特征在于：

所述的双光子吸收钌配合物通过如下方法制备得到：

(2)产物2的合成：将步骤(1)中得到的产物1、EDCI和NHS溶于DMF中，并于50℃条件下反应12h，待反应结束后将所得溶液倒入冰水中，析出白色固体A；再将白色固体A、4-氨基丁酸和三乙胺溶于DMF中，并于50℃条件下反应6h，待反应结束后将所得溶液倒入冰水中并抽滤，得到产物2；

(3)产物3的合成：将1,10-邻菲咯啉-5,6-二酮溶于乙酸中，再加入醋酸铵和对甲氧基苯甲醛，110℃回流搅拌反应，待反应结束后将pH值调至11，抽滤，得到产物3；

(6)配合物Ru-RGD的合成：将步骤(5)中得到的配合物Ru-1、EDCI和NHS溶于DMF中，室温条件下反应8h，待反应结束后将所得混合溶液倒入NH₄PF₆溶液中，抽滤，收集沉淀并干燥，得到中间产物II；然后将中间产物II加入到DMF中，并加入cRGD多肽和三乙胺，室温条件下反应24h，待反应结束后再加入NH₄PF₆溶液，抽滤，得到配合物Ru-RGD。

4.根据权利要求3所述的双光子吸收钌配合物在制备细胞荧光成像或活体荧光成像的荧光成像剂中应用，其特征在于：

步骤(5)中所述的加热采用微波反应器进行加热；所述微波反应器加热的功率为180W。

5.根据权利要求3所述的双光子吸收钌配合物在制备细胞荧光成像或活体荧光成像的荧光成像剂中应用，其特征在于：还包括将步骤(1)中得到的产物1除去铜离子的步骤；具体为：

将产物1分散于乙醇中，然后加入Na₂S·9H₂O进行反应，待反应结束后抽滤，再将抽滤后获得的滤液浓缩，调pH＝1，并水浴加热至60℃以除去硫化氢气体，最后蒸发溶液，得到去除铜离子后的产物1；其中，所述的Na₂S·9H₂O与产物1的摩尔比为1：1。

6.根据权利要求3所述的双光子吸收钌配合物在制备细胞荧光成像或活体荧光成像的荧光成像剂中应用，其特征在于：

步骤(1)中所述的3，4-二氨基苯甲酸与醋酸铜的摩尔比为1：1；

步骤(1)中所述的吡啶-2-甲醛与3，4-二氨基苯甲酸的摩尔比为5：6；

步骤(2)中所述的产物1、EDCI和NHS的摩尔比为1：3：1；

步骤(2)中所述的白色固体A、4-氨基丁酸和三乙胺的摩尔比为1：1：3；

步骤(3)中所述的1,10-邻菲咯啉-5,6-二酮、醋酸铵和对甲氧基苯甲醛的摩尔比为1：3：1；

步骤(4)中所述的钌化合物与产物3的摩尔比为1：2；

步骤(5)中所述的产物4与产物2的摩尔比为1：1；

步骤(6)中所述的配合物Ru-1、EDCI和NHS摩尔比为1：3：1；

步骤(6)中所述的中间产物II，cRGD多肽和三乙胺的摩尔比为1：1.2：3。

7.一种双光子吸收钌配合物在制备肿瘤探针中的应用，其特征在于：所述的双光子吸收钌配合物为Ru-RGD；所述的Ru-RGD的阳离子的结构式如权利要求1所示。

8.一种双光子吸收钌配合物作为肿瘤探针在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：所述的双光子吸收钌配合物为Ru-RGD；所述的Ru-RGD的阳离子的结构式如权利要求1所示。

9.根据权利要求8所述的双光子吸收钌配合物作为肿瘤探针在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：所述的肿瘤为人宫颈癌。